herpes simplex virus 1-2 semi-kwantitatieve pcr

ACTIVITEITENCENTRUM
MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
LABA-AL041-AN42
M04
HERPES SIMPLEX VIRUS 1-2 SEMI-KWANTITATIEVE PCR
INHOUD







Indicaties
Kostprijs en terugbetalingsmodaliteiten.
Uitvoerfrequentie.
Kwaliteitscontrole
Beproevingsmethode
Interpretatie resultaat
Referenties
INDICATIES
Indicaties opgenomen in art. 24 bis:
 Patiënten met neurologische symptomen: encephalitis, meningo-encephalitis, meningitis,
myelitis.
 Patiënten met opthalmologische aandoeningen: keratitis, uveïtis, acute retinitis.
 Herpes neonatorum.
 Immuungecompromiteerde patiënten met slokdarm- of darmletsel of letsel ademhalingswegen.
Andere indicaties niet terugbetaald door RIZIV:
 Enkel na telefonisch contact met labo (016/347942)
KOSTPRIJS EN TERUGBETALINGSMODALITEITEN
Zie labogids:



Voorwaarden voor RIZIV terugbetaling
RIZIV Nomenclatuurnummer
‘Extra - per formulier en aanvraag’ (diagnoseregels/prijs)
UITVOERINGSFREQUENTIE
Zie labogids: items ‘uitvoerfrequentie’ en ‘antwoordtijd’


stalen dienen uiterlijk, op de dag van uitvoering van de test, s’morgens om 8.00u in het
laboratorium beschikbaar te zijn
resultaten zijn op de dag van uitvoering van de test beschikbaar vanaf 17.00u
KWALITEITSCONTROLE


Staalsoorten onder accreditatie: CSV en BAL
Niet geaccrediteerde staalsoorten: vitreum/voorkamervocht, hersenbiopt en EDTA-bloed
CEMOL/LabA
Toepassingsdatum zie metadata MuzliDoc
1/3
ACTIVITEITENCENTRUM
MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
LABA-AL041-AN42
M04
Bij elke run worden telkens positieve en negatieve eerstelijnscontrole stalen mee geanalyseerd. Indien
de waarden voor deze eerstelijnscontrole stalen binnen vooraf vastgestelde acceptatielimieten liggen
worden de staalresultaten van deze run aanvaard.
Aan elk staal wordt tevens een heterogene interne controle (IC) toegevoegd voorafgaand aan de
nucleïnezuurextractie. Het resultaat van deze IC controleert de kwaliteit van het nucleïnezuurextract en
de afwezigheid van inhibitoren.
Jaarlijks wordt deelgenomen aan een tweede- of derdelijnscontrole (externe kwaliteitscontrole). De
resultaten van deze controles kunnen worden opgevraagd.
BEPROEVINGSMETHODE
DNA-extractie van het staal gevolgd door in-huis real-time PCR Taqman op QuantStudio Dx

CSV,vitreum/voorkamervocht: DNA-extractie via NucliSens easyMAG (BioMérieux) (semigeautomatiseerde methode)
Lysis van het staal in een GUSCN-buffer gevolgd door binding van het vrijgestelde nucleïnezuur
aan silica gecoate magnetische beads. De beads worden vervolgens gewassen via 2
wasbuffers om onzuiverheden te verwijderen en in een laatste stap wordt het nucleïnezuur van
de beads geëlueerd in elutiebuffer.
In één extractierun kunnen 1-24 stalen geëxtraheerd worden in een tijdsduur van 1 uur.

EDTA-bloed: DNA-extractie via QIAsymphony SP (QIAGEN) (geautomatiseerde methode)
Lysis van het staal in een GUSCN-buffer gevolgd door binding van het vrijgestelde nucleïnezuur
aan silica gecoate magnetische beads. De beads worden vervolgens gewassen via 2
wasbuffers om onzuiverheden te verwijderen en in een laatste stap wordt het nucleïnezuur van
de beads geëlueerd in elutiebuffer.
In één extractierun kunnen 1-24 stalen geëxtraheerd worden in een tijdsduur van 1.5 uur.

Hersenbiopt: DNA-extractie via QIAamp DNA Mini Kit (manuele methode)
Lysis van het staal in een GUSCN-buffer in aanwezigheid van een proteïnase gevolgd door
binding van het vrijgestelde nucleïnezuur aan een silica gecoate matrix in een Qiagen Mini
kolom. De matrix wordt vervolgens gewassen via 2 wasbuffers om onzuiverheden te
verwijderen en in een laatste stap wordt het nucleïnezuur van de matrix geëlueerd in
elutiebuffer.
In één extractierun kunnen 1 tot 24 stalen geëxtraheerd worden in een tijdsduur van 1.5 tot 2
uur, afhankelijk van de gebruikte kit en het aantal stalen in de run.

In huis Real-time PCR Taqman (QuantStudio Dx – Life technologies)
Het via species-specifieke primers geamplificeerd DNA wordt tijdens de amplificatie
gedetecteerd via een species specifieke probe. Bij positieve stalen resulteert dit in een realtime
PCR amplificatiecurve met bijhorende Ct (Cycle treshold) – waarde. Deze Ct-waarde is
omgekeerd evenredig met de hoeveelheid species DNA aanwezig in de reactie.
Voor elk staal (nucleïnezuurextract) wordt één reactie uitgevoerd met de gelijktijdige detectie
van HSV-1 DNA, HSV-2 DNA en van het aan het staal toegevoegde IC-DNA.
In één PCR-run kunnen 1-96 stalen geamplificeerd worden in een tijdsduur van 1 tot 2 uur,
afhankelijk van het gebruikte protocol en het aantal stalen in de run.
INTERPRETATIE RESULTAAT
De test geeft semi-kwantitatieve resultaten voor zowel herpes simplex virus type 1 als herpes simplex
virus type 2.
De gerapporteerde antwoorden zijn gebaseerd op de ‘treshold cycle’ (Zie meetprincipe) Op basis van
een herpes simplex DNA kalibratie-reeks kunnen deze gerapporteerde antwoorden ook vertaald worden
CEMOL/LabA
Toepassingsdatum zie metadata MuzliDoc
2/3
ACTIVITEITENCENTRUM
MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
LABA-AL041-AN42
M04
naar de aanwezigheid van een aantal genoomequivalenten in het oorspronkelijk staal. Opgepast: dit is
enkel een indicatieve waarde en is afhankelijk van de staalsoort en de gebruikte standaard

Negatief: geen herpes simplex DNA gedetecteerd; treshold cycle > 44 of minder dan 100
genoomequivalenten/ml.

Positief :
o sterk positief : treshold cycle ≤ 27 of meer dan 100.000 genoomequivalenten/ml
o positief : 27 < treshold cycle ≤ 35 of tussen 300 en 100.000 genoomequivalenten/ml
o zwak positief : 35 < treshold cycle ≤ 44 of tussen 300 en 100 genoomequivalenten/ml

Bij inhibitie: ‘Onbeslist door inhibitie van de reactie, indien opportuun graag nieuw staal’.
REFERENTIES
CEMOL/LabA
Toepassingsdatum zie metadata MuzliDoc
3/3