polyomavirus jc/bk kwantitatieve pcr

ACTIVITEITENCENTRUM
MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
LABA-AL041-AN27
M04
POLYOMAVIRUS JC/BK KWANTITATIEVE PCR
INHOUD







Indicaties
Kostprijs en terugbetalingsmodaliteiten.
Uitvoerfrequentie.
Kwaliteitscontrole
Beproevingsmethode
Interpretatie resultaat
Referenties
INDICATIES
 Diagnose PML (Progressieve Multifocale Leuco-encephalopathie) op bloed (EDTA), CSV of
hersenbiopsie( = diversen)
 Diagnose van late langdurende hemorragische cystitis bij beenmergtransplantatie of patiënten
behandeld voor acute refractaire lymfoblastische leukemie op bloed en/of urine.
KOSTPRIJS EN TERUGBETALINGSMODALITEITEN
Zie labogids:



Voorwaarden voor RIZIV terugbetaling
RIZIV Nomenclatuurnummer
‘Extra - per formulier en aanvraag’ (diagnoseregels/prijs)
UITVOERINGSFREQUENTIE
Zie labogids: items ‘uitvoerfrequentie’ en ‘antwoordtijd’


stalen dienen uiterlijk, op de dag van uitvoering van de test, s’morgens om 8.00u in het
laboratorium beschikbaar te zijn
resultaten zijn op de dag van uitvoering van de test beschikbaar vanaf 17.00u of de dag erna
voor 17.00 uur.
KWALITEITSCONTROLE


Staalsoorten onder accreditatie: EDTA-bloed (plasma), CSV en urine
Niet geaccrediteerde staalsoorten: biopt (diversen)
Bij elke run worden telkens positieve en negatieve eerstelijnscontrole stalen mee geanalyseerd. Indien
de waarden voor deze eerstelijnscontrole stalen binnen vooraf vastgestelde acceptatielimieten liggen
worden de staalresultaten van deze run aanvaard.
Aan elk staal wordt tevens een heterogene interne controle (IC) toegevoegd voorafgaand aan de
nucleïnezuurextractie. Het resultaat van deze IC controleert de kwaliteit van het nucleïnezuurextract en
CEMOL/LabA
Toepassingsdatum zie metadata MuzliDoc
1/3
ACTIVITEITENCENTRUM
MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
LABA-AL041-AN27
M04
de afwezigheid van inhibitoren.
Jaarlijks wordt deelgenomen aan een tweede- of derdelijnscontrole (externe kwaliteitscontrole). De
resultaten van deze controles kunnen worden opgevraagd.
BEPROEVINGSMETHODE
DNA-extractie van het staal gevolgd door in-huis real-time PCR Taqman op QuantStudio Dx

CSV, urine en plasma (EDTA-bloed): DNA-extractie via NucliSens easyMAG (BioMérieux)
(semi-geautomatiseerde methode)
Lysis van het staal in een GUSCN-buffer gevolgd door binding van het vrijgestelde nucleïnezuur
aan silica gecoate magnetische beads. De beads worden vervolgens gewassen via 2
wasbuffers om onzuiverheden te verwijderen en in een laatste stap wordt het nucleïnezuur van
de beads geëlueerd in elutiebuffer.
In één extractierun kunnen 1-24 stalen geëxtraheerd worden in een tijdsduur van 1 uur.

Biopsie: DNA-extractie via QIAamp DNA Mini Kit (manuele methode)
Lysis van het staal in een GUSCN-buffer in aanwezigheid van een proteïnase gevolgd door
binding van het vrijgestelde nucleïnezuur aan een silica gecoate matrix in een Qiagen Mini
kolom. De matrix wordt vervolgens gewassen via 2 wasbuffers om onzuiverheden te
verwijderen en in een laatste stap wordt het nucleïnezuur van de matrix geëlueerd in
elutiebuffer.
In één extractierun kunnen 1 tot 24 stalen geëxtraheerd worden in een tijdsduur van 1.5 tot 2
uur, afhankelijk van het aantal stalen in de run.

In huis Real-time PCR Taqman (QuantStudio Dx – Life technologies)
Het via species-specifieke primers geamplificeerd DNA wordt tijdens de amplificatie
gedetecteerd via een species specifieke probe. Bij positieve stalen resulteert dit in een realtime
PCR amplificatiecurve met bijhorende Ct (Cycle treshold) – waarde. Deze Ct-waarde is
omgekeerd evenredig met de hoeveelheid species DNA aanwezig in de reactie. Via een
standaardcurve kan de kwantiteit van het species DNA/RNA bepaald worden.
Voor elk staal (nucleïnezuurextract) wordt één reactie uitgevoerd met de gelijktijdige detectie
van het polyomavirus (JC/BK) DNA en de aan het staal toegevoegde IC-DNA.
In één PCR-run kunnen 1-96 stalen geamplificeerd worden in een tijdsduur van 1 tot 2 uur,
afhankelijk van het aantal stalen in de run.
Een staal positief voor polyomavirus DNA kan in een tweede consecutieve reactie getypeerd
worden (JCV en BKV) door gebruik te maken van een JCV-specifieke en een BKV-specifieke
probe.
INTERPRETATIE RESULTAAT
De test geeft kwantitatieve resultaten.

Negatief: Geen Polyomavirus DNA gedetecteerd.

Positief:
o De test geeft kwantitatieve resultaten met als onderste detectiegrens (LOD95) 300
copies/mL (2,48 log(10) copies/ml). Bij een positief resultaat van minder dan 2.7 log
(10) copies/ml wordt er geantwoord : zwak positief, < 300 copies/ml (< 2.48 log
copies/ml)
o Boven deze detectiegrens wordt het resultaat kwantitatief weergegeven zowel in
copies/mL als in log(10) copies/ml tot een maximum van 8.0 log(10) copies/ml of 108
copies/ml.
CEMOL/LabA
Toepassingsdatum zie metadata MuzliDoc
2/3
ACTIVITEITENCENTRUM
MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK
LABA-AL041-AN27
o

M04
Bij een resultaat van meer dan 8.0 log (10) copies/ml wordt er geantwoord: sterk
positief, > 8.0 log (10) copies/ml.
Bij inhibitie wordt volgend antwoord gegeven: ‘onbeslist door inhibitie van de reactie, indien
opportuun graag nieuw staal’.
Bij gebrek aan een internationale standaard voor de kwantificatie van polyomavirus is het aangewezen
om voor de opvolging van patiënten steeds dezelfde test te gebruiken.
REFERENTIES
CEMOL/LabA
Toepassingsdatum zie metadata MuzliDoc
3/3