20 – Analyse van DNA

20 – Analyse van DNA
20.1 Overzicht
Mapping = het experimentele proces van bepaling van de relatieve locaties van genen of andere
DNA segmenten op een chromosoom.
1) Cytogenetic mapping: het bepalen van locaties van genen mbv een microscoop, Banding patronen.
2) Linkage mapping: gebruikt de frequentie van genetische recombinatie(kruisingen!) om tussen 2
genen hun relatieve afstand te bepalen.
3) Physical mapping: DNA-kloning technieken om de locatie en afstand tussen genen te bepalen. Het
DNA-sequencing.
Genetic map(cromosome map)= een map die de afstanden en plekken van genen op een
chromosoom weergeeft.
20.2 Cytogenetic Mapping
Meestal gebruikt bij eucaryoten. Onderscheiding gemaakt in: grootte, lactatie van centromeer,
banding patterns.
Cytogenetis mapping heeft een lage resolutie, alleen accuraat binnen grenzen van 15 miljoen bp.
In situ hybridization
indiceert dat de procedure wordt uitgevoerd met de chromosomen op een vaste plek. Een probe
wordt gebruikt om de locatie van een gen vast te leggen.
FISH; flurescence in situ hybridization. Biotin-labeled nucleotiden worden aan de probe vast
gemaakt. Vervolgens wordt gefluoresceerd advin toegevoegd die zich bindt aan de biotin.
Om het licht te detecteren wordt een fluorescence microscoop gebruikt. Deze heeft een filter en
alleen het geëmitteerde licht wordt weergegeven, de rest is donker. De genen worden door een
computer in kleurtjes weergegeven, door verving met DAPI (=chromosome painting).
20.3 Linkage Mapping
Linkage = so-seggregation
Genen die niet voor iets coderen kunnen gemarkeerd worden met een ‘molecular marker’.
Deze markers kunnen binnen een populatie sterk verschillen per individueel(=polymorphic).
Ook de lengte, van behandelde stukjes DNA met retrictie enzymen, kan polymorphic zijn.
Niet alle segmenten zijn polymorphic, wanneer niet -> monomorphic. Een DNA segment is pas
monomorphic wanneer bij meer dan 99% van de populatie deze identiek is.
De afstand tussen 2 RFLPs(=restriction fragment lenght polymorphism) kan bepaald worden door
kruisingen. Er wordt hierbij echter niet naar het fenotype gekeken, maar naar de DNA banden op een
gel.
Onderzoekers beginnen met 2 heterozygote karakters -> worden gekruist -> heterozygote
nakomeling -> deze wordt gekruist met een homozygoot -> het resultaat hiervan hangt af van hoe
dichtbij de RFLPs bij elkaar liggen(gelinked zijn).
Om te bepalen wat de kans is dat twee markers een bepaalde graad van linkage hebben wordt er
gebruikt gemaakt van ‘lod’:
Lod score = log10 Probability of a certain degree of linkage
probability of independent assortment
Wanneer de Lod score 3 of groter is, zijn de markers gelinked.
RFLP map = een linkage map bestaande uit RFLPs. Kan gebruikt worden om functionele genen te
lokaliseren.
Andere moleculaire markers worden vaker gebruikt, omdat ze makkelijker werken met PCR, zoals:
Microsatellites/short tandem repeats(STRs) = korte sequenties die veel en verspreid door het
genoom liggen. Deze kunnen erg verschillen van lengte.
Het meest voorkomende microsatellite in mensen is (CA)n (n kan verschillen van 5 tot meer dan 50).
Deze microsatalitte zit iedere 10,000 basen in het menselijk genoom.