Praatje IC dec15 Moleculaire diagnostiek

Moleculairediagnostiek
vaninfectieziekten
ArjandeJong
8december2015
Moleculairediagnostiek
• Diagnostiekopbasisvanmoleculairbiologische(DNA/RNA)technieken
Moleculairediagnostiekvaninfecties
• Diagnostiekopbasisvanmoleculairbiologische(DNA/RNA)technieken
• Hetaantonenvandeaan- ofafwezigheidvanDNAofRNAvanmicroorganismen
• RNA:veelalRNA-virussen,dusvirussenmetRNAalsgenoom
• DNA:alleanderemicro-organismen,inclusiefvirussenmetDNAals
genoom
• RNA:wanneerwegeïnteresseerdzijninexpressie
Moleculairbiologische technieken
• PCR
• Reverse transcriptase PCR(RT-PCR) voorRNAtargets
• ConventionelePCR
• PCRwaarbijdedetectievaneenPCRproductpost-PCR plaatsvindt
• PCRwaarbijpost-PCR handelingennoodzakelijkzijn
• Real-time PCR
• PCRwaarbijdedetectievaneenPCRproducttijdensdereactie
plaatsvindt
• ‘gesloten’reacties,
dusgeenpost-PCR handelingen
Moleculairbiologische technieken
• LiPA
• LineProbe Assay,meestalgebruiktvoorgeno- ofresistentiebepaling
• Sequening
• Bepalenvandesequentievaneenspecifiekstukjegenoom
• Next generation sequencing (NGS)/Whole genomesequencing (WGS)
• Bepalenvandesequentievan(eengrootdeelvan)eenheel
(micro)organisme
PCR|polymerase kettingreactie
• NabootsenvannatuurlijkeprocesvanDNAreplicatie/vermenigvuldiging
• Basis:tweespecifiekeprimers
• Passenop‘target’DNAalssleutelinslot
• 40-50cyclivan:
• UitsmeltenDNAstrengen
• Bindenprimers
• Verlengenvandeprimers
• Na30cycli109 moleculen
Monster→PCRuitslag
• Nucleïnezuurisolatie(voorbehandeling)
• PCRmixenberekening,PCRsetup
• PCRreactie(postPCRhandelingen)
• Analyse
• InvoerenconfirmatieinGLIMS
• Autorisatie,beschikbaarheidinEPIC
Kwaliteitsinstrumenten bijMolDiag
• Foutnegativiteit
• Doorremmendestoffeninmonster
• Doornietoptimaalverlopenvanhetproces
• Controles:isolatiecontrolesEAV/PhHV
• Foutpositiviteit
• Doorcontaminatie
• Controles:negatieveisolatiecontrole
negatievePCRcontrole
• Ruimtescheiding:pre- enpost-PCR handelingen
inverschillenderuimtesmeteenrichtingsverkeer
Verdereverbetering
kwaliteiten/ofsnelheid
• Automatiseringvan
home-brewdiagnostiek
• AuroraFLOW
• Verminderenvan:
werklast
manuelehandelingen
overschrijfmomentenenresultaatinvoermomenten
• Implementatiemoleculairesneltesten(GeneXpert)
• Influenza/RSV
• MRSA
• HCV
• HIV(cito)
• Clostridium difficile
(semi)Kwantitatieve PCR
• Kwantitatief:PCRmetijklijn vanbekendestandaarden
• Semi-kwantitatief:PCRzonderijklijn,matevanpositiviteit geschatopbasis
vanCt/Cp/Cq waardet.o.v. historieofvastepositievecontrole
• Kwantitatief:
• CE/IVD:
• HIV,HCV,HBV
• Home-brew:
• CMV,EBV,BKV
• Semi-kwantitatief:
• HSV,PCP
Multiplexing enpanels
• Multiplexing:meerderreacties(targets/pathogenen)indezelfdereactie
• Doorgebruikvanverschillendelabels(kleurstoffen)
Multiplexing enpanels
• Multiplexing:meerderreacties(targets/pathogenen)indezelfdereactie
• Doorgebruikvanverschillendelabels(kleurstoffen)
• Panels:‘syndroomdiagnostiek’
• Meerdere(multiplex)reactiesomdeaanwezigheidvaneenaantal
potentiëleverwekkerstegelijkaantetonen
• Respiratoirediagnostiek
• Virale,bacteriëleenparasitairefaecesdiagnostiek
• Kosten:panelsgoedkoperdanlosse,individueletargets
• Kostenvoorverwerking,isolatie,PCRplaatjeetc.algemaakt
• Hands-on-time neemtminimaaltoebijmeertargetsopbestaandmonster
Workflow
• Huidigeworkflow
• BeperktpakketnietopFLOW:
Startom12:30|PCRO/N|uitslagvolgendeochtend
• ‘bulkroutine’opFLOW
Startom9:00|FLOWrunoverdag|uitslag2e helftmiddag
• Respiratoirediagnostiek+viralefaecesdiagnostiek:
Startom9:00|handmatigoverdag|uitslageindevandedag
• Bacteriëleenparasitairefeacesdiagnostiek:
Startom12:00|FLOWrunoverdag|uitslageindevandedag
Workflow |CITOdiagnostiek
• CITOdiagnostiekmogelijk,maarnietwenselijk
• Drukkebezettingvanapparatenmethuidigeworkflow
• Analisteningeplandbinnenhuidigeworkflow
• InbehandelingnemenvanCITOleidtaltijdtot
eenverstoringvanderestvanworkflow
• Indiennoodzakelijkaltijdinoverlegmetarts-microbioloog
16SPCR
• Identificatievanstammenofdetectie/identificatieindirectematerialen
• 16SrRNA isdebouwsteenvanribosomen,inallebacteriënaanwezig
• Geconserveerde envariabeledelen
16SPCR
• Identificatievanstammenofdetectie/identificatieindirectematerialen
• Geconserveerde envariabeledelen
• PCR+sequentieanalyse
• Databasevergelijking
• Contaminatiegevoelig
Sequencing: Sanger sequencing
• ‘old-school’sequencing,fragmententot± 800basen
• Sequence by synthesis,inbouwvangelabeldenucleotiden =stopreactie
Sequencing: Sanger sequencing
• ‘old-school’sequencing,fragmententot± 800basen
• Sequence by synthesis,inbouwvangelabeldenucleotiden =stopreactie
Lee SH,et.al.,AmJClin Pathol. 2010Apr;133(4):569-76.
Next generation sequencing
• Nieuwetechnischeontwikkelingen
• Sequencing zondervoorkennisvanwateraanwezigis
• Verschillendeapproach vanverschillendefabrikanten
• Kortestukjessequencen
• Langerstukjesstukjes sequencen
• Alignment aanreferentiegenoom
• Denovo assembly
Next generation sequencing
• Technischeontwikkelingengaandoor
• Kostengaanomlaag
• Workflow nognietgeautomatiseerd
• Metnameanalysetijdlang
• Interpretatie?
• Hetkanalwel….