biofilmvorming en groei legionella

KS12 054-59
04-12-2006
13:32
Pagina 54
communicatie platform legionella
BIOFILMVORMING
EN GROEI
LEGIONELLABACTERIËN IN
LEIDINGWATERINSTALLATIES
Legionellabacteriën kunnen zich vermeerderen in de
afweercellen in de longblaasjes van de mens, waarna
ze in grote aantallen vrijkomen en ziekte kunnen veroorzaken. Het vermogen tot intracellulaire replicatie
speelt ook een cruciale rol bij de vermeerdering van
deze bacteriën in het aquatische milieu. Ondanks de
hoge voedingseisen blijken legionellabacteriën alom
aanwezig in zoetwatermilieus, omdat ze zich kunnen
vermeerderen in bepaalde vrijlevende protozoa. Deze
protozoa zijn eencellige diertjes die zich voeden zich
met bacteriën. Ze grazen bij voorkeur op oppervlakken
in contact met water, waarop bacteriën zich vermeerderen (biofilm). De groei van legionella in waterinstallaties hangt dus sterk af van de mate van biofilmvorming. De temperatuur is daarbij een belangrijke, selecterende factor.
De vorming van biofilms op oppervlakken in contact
met water is een samenspel van biologische en fysisch-chemische processen. Hechting van bacteriën
aan het oppervlak is de eerste fase van biofilmvorming, waarbij fysisch-chemische processen, zoals
transport, elektrostatische en Van der Waals krachten
Bestrijding van legionellabacteriën in waterinstallaties
een rol spelen. Een volgende fase is de onomkeerbare
verankering van de cellen aan het oppervlak door uit-
neemt een centrale plaats in bij de preventie van legio-
scheiding van polymere componenten, gevolgd door
vermeerdering van de bacteriën. Het tempo van ver-
nellapneumonie. Hierbij kan onderscheid worden ge-
meerdering is afhankelijk van de aanvoer en aard van
de voedingsstoffen en van de mate waarin de bacteri-
maakt in curatieve methoden (afdoding van de aan-
ën losraken van het oppervlak. Bij de groei worden echter verscheidene polymere componenten uitgeschei-
wezige legionellabacteriën) en preventieve methoden
den, waardoor een matrix ontstaat die de bacteriën
omgeeft en beschermt. Ophoping van anorganische
(verhindering van de groei van legionellabacteriën).
componenten, zoals ijzer, mangaan en kalk, versterkt
de biofilm.
Kennis van biofilmvorming en het gedrag van legionelInvloed watersamenstelling
la in biofilms is nodig voor het ontwikkelen en toepas-
Biofilmvorming in waterleidingen is afhankelijk van de
concentratie van afbreekbare stoffen in het aangevoer-
sen van efficiënte, doeltreffende maatregelen.
de leidingwater en van de afgifte van afbreekbare stoffen door het leidingmateriaal. In drinkwater is de concentratie aan afbreekbare stoffen laag door toepassing
van diverse zuiveringsprocessen, waarmee dergelijke
stoffen uit het water worden verwijderd. Het gehalte
organische koolstof van het behandelde water ligt in de
regel tussen 0,5 en 5 mg/l. Slechts een klein deel van
deze verbindingen is afbreekbaar. Daarom is een speciale methode ontwikkeld om het gehalte gemakkelijk
afbreekbare organische koolstof (AOC) in het drinkwater
te bepalen. Het
AOC-gehalte
wordt berekend uit het
maximum groeiniveau (koloniegetal) van de testbacteriën, waarbij gebruik wordt gemaakt van de groeiopTEKST: DICK VAN DER KOOIJ EN HARM R. VEENENDAAL FOTOGRAFIE: INDUSTRIE
54
Intech K&S
December ’06
brengst van deze organismen op acetaat (figuur 1). Het
KS12 054-59
04-12-2006
13:32
Pagina 55
Bacteriën in filters van actieve kool spelen een belangrijke rol bij de verwijdering van afbreekbare stoffen uit het water bij de drinkwaterbereiding.
1. AOC-gehalte van drinkwater. Groeicurven van teststammen (A) en
AOC-gehalte
(B) in filtraat van langzame zandfilters. AOC-gehalte van drie
drinkwatertypen bij distributie (C).
AOC-gehalte
wordt uitgedrukt in hoeveelheid acetaat-
snelle (enkele minuten) en gevoelige analyse
koolstof equivalenten per liter water en ligt in het
drinkwater in Nederland meestal ligt tussen 1 en 20 µg
(ca. 0,5 ng/l) worden uitgevoerd. De biofilmvormingssnelheid (BVS, pg ATP/cm2.d) kan worden berekend uit
C/l. Bij
beneden 10 µg C/l treedt vrijwel
de lineaire toename van de biomassaconcentratie op
op tijdens verblijf van het water in
de glazen ringen, gemeten als functie van de tijd (fi-
geen
AOC-gehalten
AOC-opname
het leidingnet (figuur 1.C) en blijven de koloniegetallen
guur 2.A).
van de bacteriën in het drinkwater laag.
Een tweede werkwijze die is ontwikkeld voor de bepa-
Nederland liggen meestal tussen 0,5 en circa 50 pg
ATP/(cm2.d) (figuur 2.B). Ook bij AOC-waarden beneden
ling van de groeibevorderende eigenschappen van
10 µg C/l treedt biofilmvorming op. Met doseerexperi-
drinkwater berust op het meten van de biofilmvor-
menten is vastgesteld dat een concentratie van 10 µg
ming in een biofilmmonitor. De biofilmmonitor be-
C/l van een gemakkelijk afbreekbare organische stof
staat uit een glazen kolom, gevuld met cilinders van
(acetaat) een biofilmvormingssnelheid geeft van circa
360 pg ATP/cm2.d. Hieruit kan worden afgeleid dat de
glas, die wordt doorstroomd met het te onderzoeken
BVS -waarden
van het drinkwater in
water. Op deze glazen cilinders treedt biofilmvorming
waargenomen
op. Periodiek worden enkele cilinders uit de kolom ge-
veroorzaakt door zeer lage concentraties aan afbreek-
nomen en wordt de concentratie van de biofilm geme-
bare stoffen.
BVS-waarden
van drinkwater worden
ten via de analyse van het gehalte adenosinetrifosfaat
(ATP). ATP speelt een rol bij de energieoverdracht in de
Invloed van leidingmaterialen
cel en is aanwezig in alle actieve (levende) organismen.
Leidingmaterialen zijn eveneens van invloed op de bio-
Met een specifieke enzymatische methode kan een
filmvorming, vooral wanneer deze materialen groei-
Intech K&S
December ’06
55
>
KS12 054-59
04-12-2006
13:32
Pagina 56
BIOFILMVORMING EN GROEI LEGIONELLABACTERIËN IN LEIDINGWATERINSTALLATIES
2. Biofilmvorming in de biofilmmonitor. A: bij drie typen drinkwater bereid uit grondwater (AOC < 10 µg C/l). B: biofilmvormingsnelheid (BVS) van
37 drinkwatertypen (DGW, drinkwater uit grondwater, DOW, drinkwater uit oppervlaktewater). De stippellijn geeft BVS-waarde bij dosering van 1
µg acetaat-C/l.
3. Bepaling van de biomassaproductiepotentie (BPP) van materialen in contact met (leiding-)water. A: invloed van de aanwezigheid van materialen op de concentratie van biomassa in het water (PB) in de BPP-test bij 30 ºC. B: het verband tussen de biofilmconcentratie op de materialen
(BFP) en PB. Controle: test zonder materiaal. BFP is de gemiddelde concentratie van de biomassa op de materialen (biofilm) gemeten op dagnummers 56, 84 en 112 (PVCp: zacht PVC).
bevorderende stoffen afgeven. Afgifte kan vooral op-
Het water wordt elke week ververst en na acht weken,
treden bij synthetische materialen, zoals plastic, rub-
twaalf weken en zestien weken incubatie worden test-
bersoorten en coatings. In 2004 is in Nederland een
stukjes verwijderd en de concentraties van biomassa in
werkwijze gestandaardiseerd voor de bepaling van de
het water en op het materiaal gemeten. Uit het ‘stabi-
biomassaproductiepotentie (BPP) van materialen. Deze
liteitsdiagram’ van figuur 3.B komt naar voren dat de
werkwijze berust op het meten van de vorming van
geteste materialen
biomassa op proefstukjes van het te onderzoeken ma-
versterking van de biofilmvorming veroorzaakten. Wel
teriaal die in leidingwater met een laag
AOC-gehalte
is in aanwezigheid van RVS gedurende circa vijf weken
worden geïncubeerd. De ATP-analyse wordt ook hier ge-
een verhoogde concentratie van biomassa in het water
bruikt voor de bepaling van de biomassaconcentratie.
waargenomen (figuur 3.A). Bij biofilmconcentraties
Om deze analyse mogelijk te maken wordt de biomas-
boven circa 100 pg
sa, die zich heeft gevormd op het oppervlak van het
biomassa in het water onder de testcondities hoger
materiaal, losgemaakt met ultrasone trillingen. De
dan in het water zonder materiaal (controle) of met
teststukjes van de materialen worden met een totale
glas.
externe oppervlakte van 150 cm2 geïncubeerd in 900
Tevens blijkt dat de waargenomen biofilmconcentra-
ml leidingwater bij 30 ºC (figuur 3).
ties liggen tussen circa 30 pg ATP/cm2 (glas) en 30.000
56
Intech K&S
December ’06
RVS
en
PVCc
ATP/cm2
in de test vrijwel geen
is de concentratie van de
KS12 054-59
04-12-2006
13:32
Pagina 57
pg ATP/cm2 (zacht PVC, rubber) en dus een range omvat-
grazen op de biofilm; (iii) groei van deze bacteriën in de
ten van ongeveer een factor 1.000. Deze gegevens il-
amoeben die vervolgens te gronde gaan, waarbij de le-
lustreren dat de groeibevorderende eigenschappen
gionellabacteriën zich verspreiden. Deze keten van
van een materiaal in contact met leidingwater met
processen wordt beïnvloed door de concentratie van
een relatief eenvoudige werkwijze kunnen worden be-
voedingsstoffen, de watertemperatuur, de samenstel-
paald. Een volgende stap is het definiëren van toela-
ling en de concentratie van de biofilm. Aanwezigheid
tingscriteria voor de groeibevorderende eigenschap-
van amoeben is ook een voorwaarde. Uit onderzoek
pen van de materialen. In opdracht van Vrom voert
met moleculaire technieken is naar voren gekomen
Kiwa Water Research onderzoek uit, dat gericht is op
dat H. vermiformis algemeen voorkomt in oppervlak-
het verkrijgen van informatie die nodig is voor het de-
tewater en ook uit verder onderzoek blijkt dat proto-
finiëren van dergelijke criteria.
zoa van nature in allerlei watertypen aanwezig zijn.
Sinds enkele jaren bestaan de distributieleidingen in
Nederland voor het grootste deel uit hard PVC. Dit materiaal is vrijwel niet groeibevorderend, dus de biofilm
op de wand van deze leidingen is gevormd door groei
van bacteriën die afbreekbare stoffen uit het leidingwater opnemen. Uit onderzoek van enkele tientallen
leidingsegmenten, afkomstig uit verschillende leidingnetten, is naar voren gekomen dat de biofilmconcentratie op de buiswand meestal ligt tussen circa 50 en
5.000 pg
ATP/cm2.
Evenals bij de
BVS-waarden
zijn de
hoogste biofilmconcentraties circa honderdmaal
hoger dan de laagste waarden. Uit de gegevens kan
worden afgeleid dat waarden van 250 – 750 pg ATP/cm2
A A R D V A N M AT E R I A A L I S
VA N I N V L O E D O P H E T
A A N TA L L E G I O N E L L A B A C T E R I Ë N I N W AT E R
als normaal kunnen worden beschouwd en nagroeiproblemen veroorzaken in het leidingnet.
Groei legionellabacteriën in biofilms
Prooibacteriën en biofilmconcentratie
Enkele jaren na de ontdekking van Legionella pneu-
Het is te verwachten dat er meer protozoa in biofilms
mophila bleek dat het organisme in laboratoriumex-
voorkomen bij hogere biofilmconcentraties. Niet alle
perimenten pathogeen is voor bepaalde vrijlevende
bacteriesoorten vormen een geschikte voedselbron
amoeben. Inmiddels is duidelijk dat soorten van ten
(prooibacterie) voor protozoa. De amoebe H. vermifor-
minste zes verschillende geslachten van amoeben, een
mis heeft een voorkeur voor bepaalde bacteriesoorten,
ciliaat en een slijmzwam als natuurlijke gastheer kun-
waaronder bacteriën van de coligroep. Gepigmen-
nen dienen. In 1988 is aangetoond dat groei van L.
teerde bacteriën daarentegen zijn niet aantrekkelijk
pneumophila in water alleen optreedt in aanwezig-
als voedingsbron. Onlangs is aangetoond dat Limno-
heid van een filtreerbare groeifactor, die werd geïden-
bacter thiooxidans en een Acidovorax-soort in biofilms
tificeerd als de amoebe Hartmannella vermiformis. Uit
als prooibacteriën dienen voor H. vermiformis.
onderzoek, uitgevoerd met biofilms gevormd op stuk-
Een toename of een afname van het aantal prooibac-
jes zacht
kwam eenduidig naar voren dat L.
teriën door veranderingen van de populatiesamenstel-
pneumophila zich ook in biofilms uitsluitend vermeer-
ling van de biofilm, kan dus leiden tot een verandering
dert in protozoa. H. vermiformis is ook bij dit onder-
van het aantal (gastheer-)amoeben, en indirect meer
zoek geïdentificeerd als gastheer.
of minder groei van legionella tot gevolg hebben. De
In alle natuurlijke watermilieus en in watersystemen
samenstelling van de biofilm is echter lastig te beïn-
die door de mens zijn aangelegd (distributieleidingen,
vloeden, terwijl beperking van biofilmvorming kan
leidingwaterinstallaties, koeltorens, whirlpools en der-
worden gerealiseerd door de concentratie van afbreek-
gelijke) zijn biofilms aanwezig op oppervlakken in con-
bare stoffen in het water en de selectie van materialen
tact met water. De aanwezigheid van L. pneumophila
die (vrijwel) geen afbreekbare stoffen afgeven te be-
in (leiding-)water is dus een gevolg van een keten van
perken. Uit batchtesten met diverse materialen, waar-
drie processen: (i) hechting en vermeerdering van bac-
bij het water wekelijks werd ververst, is gebleken dat
teriën die de aanwezige afbreekbare stoffen benutten,
de aard van het materiaal van invloed is op het aantal
(ii) opname van legionellabacteriën door amoeben die
legionellabacteriën in het water.
PVC,
>
Intech K&S
December ’06
57
KS12 054-59
04-12-2006
13:32
Pagina 59
BIOFILMVORMING EN GROEI LEGIONELLABACTERIËN IN LEIDINGWATERINSTALLATIES
4. Invloed van materialen op groei van Legionella pneumophila. A: materialen in leidingwater (batchtest) bij 37 ºC met wekelijks verversen (NR:
natuurrubber). B: biofilmconcentraties in leidingen van een experimentele warmtapwaterinstallatie. C: legionellaconcentraties in biofilms op leidingen van een experimentele warmtapwaterinstallatie.
In aanwezigheid van het materiaal dat het sterkste
slechts in enkele gevallen van legionellapneumonie
biofilmvormend was, zijn de hoogste aantallen L.
aangetroffen en is niet waargenomen bij gevallen van
pneumophila waargenomen (figuur 4.A). In een expe-
beginselloze, gerapporteerd in Europa.
rimentele warmtapwaterinstallatie (boiler met leidingen van circa 6 m, watertemperatuur circa 37 ºC) met
Bestrijding van Legionella
een huishoudelijk tappatroon vermeerderden legio-
De groei van L. pneumophila kan worden beperkt door
nellabacteriën zich in de biofilms in de leidingen van
handhaving van een hoge (>60 ºC ) of lage (<25 ºC) wa-
roestvast staal, koper en
PE-X
tertemperatuur. Beperking van de vorming van biofilm
en koper. Zelfs bij biofilmcon-
en sediment, en het voorkomen van stagnatie dragen
centraties beneden 500 pg ATP/cm2 was L. pneumophi-
eveneens bij aan beheersing van de groei van legionel-
la aanwezig in de biofilm (figuur 4.B, C).
la in watersystemen. Gebruik van water en materialen
De invloed van de relatie tussen biofilmconcentratie
met een geringe biofilmvormingspotentie moet
en de groei van legionellabacteriën wordt nader
onderdeel zijn van een structurele aanpak (meervoudi-
onderzocht om na te gaan in welke mate beperking
ge barrière) gericht op beperking van de groei van
van de biofilmvorming onder invloed van water en ma-
legionella en andere ongewenste micro-organismen in
terialen kan leiden tot beperking van de groei van deze
(leiding-)waterinstallaties. In situaties waarbij deze be-
bacteriën.
nadering niet uitvoerbaar is, is toepassing van een al-
was sterker dan op
RVS
PE-Xa.
Biofilmvorming op
ternatieve beheersmaatregel nodig.
<
Temperatuur
Bij temperaturen beneden 25 ºC groeit L. pneumophila
Meer over legionella: www.intechks.nl
traag en gaan andere soorten legionellabacteriën
overheersen. Gebleken is dat in drinkwater bij een lage
AUTEURS
temperatuur (<15 ºC) een grote variëteit van legionella-
Dick van der Kooij en Harm R. Veenendaal, Kiwa Water
bacteriën kan worden aangetoond met moleculaire
Research
technieken. Deze bacteriën zijn niet kweekbaar en het
merendeel behoort tot soorten die nog niet zijn beschreven. Er zijn geen aanwijzingen dat dergelijke
legionellasoorten ziekteverwekkend zijn. Een legionellasoort die vaak met de kweekmethode wordt aangetroffen is L. anisa. Dit organisme is ondermeer waarge-
VERANTWOORDING
nomen in zestien van vierhonderd onderzochte wo-
De beschreven informatie is grotendeels gebaseerd op onder-
ninginstallaties. Er zijn aanwijzingen dat L. anisa zich
zoek dat in het kader van het bedrijfstakonderzoek (BTO) is uit-
bij lagere watertemperaturen vermeerdert en hand-
gevoerd bij Kiwa Water Research.
haaft dan L. pneumophila. L. anisa is wereldwijd echter
Intech K&S
December ’06
59