University of Groningen Exogenous and endogenous gene

University of Groningen
Exogenous and endogenous gene regulation for specific and efficient cancer gene
therapy
Gommans, Willemijn Maria
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2006
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Gommans, W. M. (2006). Exogenous and endogenous gene regulation for specific and efficient cancer
gene therapy s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
Chapter
Samenvatting: Doelgerichte behandeling van kanker door
gentherapie
WM Gommans,1 PMJ McLaughlin,2 HJ Haisma1 en MG Rots1
1
Department of Therapeutic Gene Modulation, University Center for Pharmacy, University of Groningen,
Groningen, The Netherlands and 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical Biology
Section, University Medical Center Groningen, Groningen, The Netherlands
Tijdschrift ‘kanker’. 2006: 30(4):26-29
Chapter 9
Het toepassen van genetisch gemodificeerde virussen of het interfereren in het DNA van
menselijke cellen kan een krachtige nieuwe antikankertherapie opleveren. In dit proefschrift
worden twee manieren van genetische interventie besproken.
Introductie
Het grote verschil tussen kankercellen en normale menselijke cellen is dat
kankercellen geen controle meer hebben op de celdeling. Hierdoor blijven deze
kankercellen zich vermenigvuldigen en kunnen ze uitgroeien tot tumoren die schade
kunnen aanrichten aan de omliggende weefsels. De cellen van een tumor lijken in veel
opzichten op de cellen in de rest van het lichaam. Hierdoor worden ze door ons
afweersysteem niet meer herkend als een bedreiging. Ook maakt deze overeenkomst tussen
kankercellen en normale lichaamscellen het moeilijk om een behandeling te vinden die
specifiek is gericht tegen de tumor. Immers, de therapie zou juist op de eventuele unieke
eigenschappen van de kankercel moeten aangrijpen om specifiek te kunnen zijn.
Toch zijn er bruikbare verschillen tussen normale weefsels en tumoren. Zo is de
hoeveelheid van bepaalde eiwitten in kankercellen verlaagd of juist verhoogd. Vaak zijn dat
eiwitten die een rol spelen bij de celdeling. Ook de hoeveelheid van andere cellulaire
eiwitten kan zijn veranderd. Een voorbeeld van een dergelijk eiwit is het epitheliale
glycoproteïne-2 (EGP-2).1 Dit eiwit komt in de meeste normale weefsels nauwelijks meer
voor na het bereiken van de volwassen leeftijd. Echter, de aanwezigheid van dit eiwit is
duidelijk aan te tonen in de meeste tumoren. Zo kan dit eiwit vaak worden gedetecteerd in
borsttumoren, ovariumtumoren, prostaattumoren en in darmtumoren.
De verandering in de hoeveelheid EGP-2 in een cel is een gevolg van een
aanpassing in het productieproces van dit eiwit. Dit eiwit en alle andere eiwitten in onze
cellen hebben een ‘blauwdruk’ in het DNA in de vorm van een gen. Bij het juiste signaal
wordt een gen afgelezen en wordt er een eiwit geproduceerd. Het signaal dat zorgt voor de
eiwitproductie komt tot stand door een delicate wisselwerking tussen andere stukken DNA
en eiwitten. Als die eiwitten (‘transcriptiefactoren’) een interactie aangaan met een
transcriptiefactor
interactie met promoter DNA
promoter DNA
blauw-druk eiwit
humaan DNA
eiwit productie
eiwit
(bv. EGP-2)
Figuur 1: eiwitproductie in de cel.
Transcriptiefactoren binden aan een specifieke DNA-sequentie (in de promoterregio) van het genoom en kunnen vervolgens
de productie van een eiwit aan- of uitzetten.
134
Samenvatting
specifiek stuk van ons DNA (de promoterregio) zal een eiwit worden geproduceerd (figuur
1). Voor elk eiwit bestaat er een specifieke promoterregio die zorgt voor de productie van
dat eiwit. Een promoterregio functioneert dus als het ware als een aan- en uitschakelaar die
de eiwitproductie reguleert, en de transcriptiefactoren zetten die schakelaar om. Bij
kankercellen is vaak die wisselwerking tussen de transcriptiefactoren en de promoterregio
verstoord, waardoor eiwitten worden gemaakt die in gezonde cellen niet of nauwelijks
aanwezig zijn.
Deze veranderingen in het productieproces zorgen er voor dat kankercellen zich
anders gedragen dan normale cellen. Zo is het eiwit EGP-2 geassocieerd met de
agressiviteit van de kankercel. Als door experimentele methodes de hoeveelheid EGP-2
eiwit in een cel wordt verminderd, wordt er een vermindering in de migratie, invasie en
proliferatiepotentieel van deze cellen waargenomen. Het reduceren van de hoeveelheid
EGP-2 in een kankercel kan dus een nieuwe methode zijn bij de behandeling van kanker.
Bovendien kunnen we gebruik maken van het verschil in de hoeveelheid EGP-2 in normale
cellen en kankercellen door een therapie te ontwikkelen die specifiek is gericht tegen EGP2-positieve cellen. Deze twee methodes (de therapie specifiek richten op EGP-2-positieve
kankercellen en het verminderen van de hoeveelheid EGP-2-eiwit in de kankercel) zullen in
de twee volgende secties meer gedetailleerd aan bod komen.
Adenovirus
Gentherapie kan worden omschreven als het introduceren van genetisch materiaal
in een cel om een therapeutisch effect te bewerkstelligen. Bij kanker zal het
geïntroduceerde genetische materiaal uiteindelijk voor de eliminatie van de kankercellen
moeten zorgen. Om het DNA op een efficiënte wijze in de kankercel te krijgen, kunnen
virale vectoren worden gebruikt. Een voorbeeld van een dergelijke vector is het
adenovirus,2 het virus dat bij mensen verkoudheid kan veroorzaken. Dit virus kan op een
efficiënte wijze onze lichaamscellen binnendringen en daar zijn DNA afgeven. Van deze
eigenschap kunnen we gebruikmaken om genetisch materiaal in de kankercel te brengen.
Hiertoe wordt het DNA van het adenovirus aangepast. Ook wordt er DNA verwijderd uit
het genoom van het virus waardoor het niet meer in staat is om zich te repliceren.
Voor de behandeling van kanker kan bijvoorbeeld het thymidine-kinase gen (TKgen) in het adenovirale genoom worden ingebracht. Thymidine-kinase is een enzym van het
Herpes Simplex Virus en kan de toegediende pro-drug Ganciclovir of Aciclovir omzetten in
een toxische stof. Deze stof zorgt er uiteindelijk voor dat de kankercel doodgaat.
Het adenovirus zal echter niet alleen kankercellen binnendringen. Zodra het virus
in de bloedbaan terechtkomt, gaat het vrijwel meteen naar de cellen van de lever. Als daar
nu TK wordt geproduceerd, zal na de toediening van Ganciclovir levertoxiciteit ontstaan.
Het is dus belangrijk om de productie van het TK-eiwit selectief te laten plaatsvinden in de
kankercellen.
Zoals gezegd; het eiwit EGP-2 wordt voornamelijk geproduceerd in kankercellen.
Dit houdt in dat er transcriptiefactoren aanwezig zijn in de kankercel die binden aan de
EGP-2-promoterregio (de aan-/uitschakelaar) en die er voor zorgen dat het EGP-2-eiwit
wordt geproduceerd. De EGP-2-promoterregio is uit het menselijke DNA geïsoleerd en
gekarakteriseerd.3 Wij hebben de EGP-2 promoterregio gebruikt om de productie van het
TK-eiwit aan of uit te zetten. Dit is gedaan door in plaats van het natuurlijke EGP-2-gen,
135
Chapter 9
EGP-2 promoter
codering voor EGP-2 eiwit
EGP-2 promoter
codering voor TK eiwit
humaan DNA
adenoviraal DNA
adenovirus
Figuur 2: genetisch gemodificeerde adenovirussen.
Het genoom van het adenovirus kan zo worden veranderd, dat infectie kan zorgen voor tumorspecifieke productie van
toxische eiwitten.
het gen van het TK-eiwit achter de EGP-2-promoter te plaatsen (figuur 2). Dit eiwit kan nu
alleen worden geproduceerd in cellen waarin de eiwitten aanwezig zijn die de EGP-2schakelaar kunnen omzetten (transcriptiefactoren), dus in kankercellen. De EGP-2promoter met het TK-gen is in het adenovirale genoom geplaatst. Adenovirale infectie van
EGP-2-positieve kankercellen resulteerde in productie van het TK-eiwit, de omzetting van
Ganciclovir en celdood. In EGP-2-negatieve levercellen was geen celdood detecteerbaar na
infectie met dit virus en toevoeging van Ganciclovir. Dit is dus een heel specifieke manier
om kankercellen te doden.4
Ondanks het feit dat het adenovirus een van de meest efficiënte vectoren is om
genetisch materiaal af te leveren in een cel, is het niet efficiënt genoeg om alle kankercellen
te kunnen infecteren. Voor de behandeling van kanker is dit echter wel noodzakelijk,
aangezien anders de niet-geïnfecteerde en dus onbehandelde kankercellen weer verder gaan
delen en een groeiende tumor vormen. Zoals eerder gezegd: de genen die een adenovirale
vector nodig heeft voor de replicatie zijn verwijderd. Dit zorgt er voor dat het virus het
genetische materiaal aflevert in de cel, maar verder geen schade meer kan aanrichten door
replicatie. Het doel voor de behandeling van kanker is echter het specifiek aanrichten van
schade aan kankercellen. Daarom wordt momenteel veel onderzoek verricht om het
adenovirus specifiek te laten repliceren in kankercellen. Dit heeft een groot voordeel.
Replicatie zorgt er namelijk voor dat de cel uiteenvalt en nieuwe virusdeeltjes in de tumor
terechtkomen, die vervolgens nieuwe cellen kunnen infecteren (figuur 3). Op deze wijze
ontstaat er een cyclus van infectie en replicatie, waardoor veel meer kankercellen worden
geïnfecteerd en gelyseerd dan bij een niet-replicerend virus. Het is echter belangrijk om de
replicatie te beperken tot de kankercellen, aangezien replicatie in gezonde weefsels tot
ongewenste schade kan leiden. Om de replicatie te beperken tot de kankercellen kunnen we
opnieuw gebruik maken van de EGP-2-promoter. In plaats van TK reguleert de EGP-2promoter dan het E1-gen. Het adenovirus heeft het E1-eiwit nodig om te kunnen repliceren.
136
Samenvatting
gezonde cel
tumor cel
EGP-2 promoter
codering voor E1 eiwit
adenoviraal DNA
Figuur 3: specifieke replicatie van het adenovirus.
Doordat een gen, noodzakelijk voor adenovirale replicatie, wordt gecontroleerd door de EGP-2-promoter, zal replicatie alleen
plaatsvinden in EGP-2-positieve (tumor)cellen. Deze cellen lyseren en nieuwe virusdeeltjes komen vrij in het tumormilieu.
Gezonde cellen worden ook geïnfecteerd door het virus, maar in deze cellen zal het virus niet kunnen repliceren omdat de
EGP-2-promoter uitstaat.
Doordat de productie van het E1-eiwit nu wordt gereguleerd door de EGP-2-promoter, zal
dit eiwit alleen worden gemaakt in EGP-2-positieve (tumor)cellen met als gevolg dat
specifiek daar het virus wordt geproduceerd, de kankercellen lyseren en er nieuwe
virusdeeltjes vrijkomen in het tumorweefsel. Deze virusdeeltjes kunnen in principe ook de
omliggende weefsels infecteren. Maar deze zijn EGP-2-negatief, met als gevolg dat daar
het E1-eiwit niet wordt geproduceerd en er geen vorming van nieuwe virusdeeltjes
plaatsvindt. Wij hebben kunnen aantonen dat replicatie in tumorweefsel inderdaad met
dezelfde efficiëntie plaatsvindt als bij replicatie van natuurlijke adenovirussen. Echter, de
replicatie in gezond humaan levermateriaal is tot een factor 10.000 minder groot in
vergelijking met virusproductie van natuurlijke adenovirussen. De replicatie is dus heel
specifiek gericht tegen de kankercellen.
Door het genetisch modificeren van het adenovirus kan dus een heel specifieke
manier worden gevonden voor de behandeling van kanker. Momenteel worden andere
adenovirussen die uitgaan van hetzelfde principe als hierboven beschreven, getest in
patiënten. In de volgende sectie zal worden beschreven hoe een ander type gentherapie,
namelijk het direct beïnvloeden van de EGP-2-eiwitproductie zelf, kan bijdragen aan een
middel tegen kanker.
Zinkvinger
De hoeveelheid EGP-2-eiwit heeft in kankercellen invloed op de agressiviteit van
de tumorcel. Als met behulp van experimentele methodes die hoeveelheid EGP-2-eiwit in
de cel wordt verlaagd, dan gaat de cel zich minder als een kankercel gedragen: de snelheid
van de celdeling neemt af en de cel is minder goed in staat om naar omliggende structuren
te migreren. Het verlagen van de hoeveelheid EGP-2 in een kankercel kan dus een nieuwe
methode zijn bij de behandeling van kanker.
137
Chapter 9
Zoals vermeld kunnen DNA-promoterregios worden gezien als de aan- en
uitschakelaar van de eiwitproductie. Maar het zijn de transcriptiefactoren die uiteindelijk de
schakelaar kunnen omzetten. Transcriptiefactoren zijn eiwitten die specifieke stukken DNA
herkennen en daaraan binden. Daarnaast bevatten transcriptiefactoren een domein dat
ervoor zorgt dat de eiwitproductie wordt aan- of uitgezet. Doordat transcriptiefactoren aan
een specifieke sequentie in het DNA binden, zal alleen voor dat gen de eiwitproductie
worden gemoduleerd.
Een voorbeeld van een transcriptiefactor is de zinkvingerproteïne-transcriptiefactor
(ZFP-TF) (figuur 4).5 Het eiwit heeft de vorm van een vinger, en deze structuur ontstaat
door de interactie met een zinkatoom. Een ZFP-TF kan een specifiek stuk DNA herkennen
en op die plaats de eiwitproductie beïnvloeden.
C
-1
N
β
C
3
T
6
G
H
β
α
Zink
atoom
C
H
C
Zinc vinger proteine
Figuur 4: zinkvingerproteïne.
De aminozuren van het zinkvingerproteïne (ZFP) hebben op specifieke plaatsen in het eiwit contact met de bouwstenen van
het DNA.
De herkenning van het DNA door de ZFP-TF is dus het gevolg van de interactie
tussen de aminozuren van het ZFP-TF en de bouwstenen van het DNA. Het is bekend
welke aminozuurvolgorde in de ZFP-TF welke DNA-bouwstenen herkennen. Door nu die
specifieke aminozuren te veranderen, herkent de ZFP-TF een andere DNA-sequentie. Op
deze manier is het mogelijk om de ZFP-TF aan een ander stuk DNA te laten binden, met als
gevolg dat een andere promoterregio wordt gereguleerd en de productie van een ander eiwit
wordt beïnvloed.
Elke ZFP herkent drie DNA-bouwstenen en deze DNA-volgorde zal heel vaak
voorkomen in het humane genoom. Het is mogelijk om meerdere ZFP’s aan elkaar te
koppelen. Omdat elke ZFP drie DNA-bouwstenen herkent, zal de herkende DNA-sequentie
zich met elke ZFP met drie bouwstenen uitbreiden. Een eiwit bestaande uit zes ZFP’s kan
dus een sequentie binden van 18 DNA-bouwstenen. Deze sequentie zal rekenkundig gezien
maar eenmaal in ons genoom voorkomen.
Om de eiwitproductie te kunnen beïnvloeden, moet aan het DNA-bindende ZFP
een effectordomein worden gekoppeld. Een dergelijk effectordomein kan vervolgens de
eiwitproductie aan- of uitzetten. De ZFP brengt dus in principe het effectordomein naar de
juiste promoterregio om daar de eiwitproductie te kunnen beïnvloeden (figuur 5). Het
DNA-bindende ZFP plus het effectordomein wordt de ZFP-TF genoemd.
138
Samenvatting
effector domein
remming of activering
van eiwit productie
humaan DNA
eiwit
(bv. EGP-2)
Figuur 5: zinkvingerproteïnetranscriptiefactoren.
Verschillende ZFP-DNA-bindende domeinen kunnen aan elkaar worden gekoppeld waardoor een langere en daardoor ook
specifiekere DNA-sequentie wordt herkend. Vervolgens kan aan het DNA-bindende domein een effectordomein worden
gekoppeld waardoor de eiwitproductie aan of uit wordt gezet.
Deze ZFP-TF’s zijn ook gemaakt om specifiek aan een sequentie in de EGP-2promoter te binden. Aan het DNA-bindende ZFP-domein hebben we een inhibitiedomein
gekoppeld, waardoor we specifiek de EGP-2-promoter konden uitzetten.
Het is dus mogelijk om de eiwitproductie in een cel te moduleren door het maken
van artificiële ZFP-TF’s. Naast het EGP-2-eiwit zijn er nog veel meer cellulaire eiwitten
die ook een rol spelen bij kanker. Ook tegen deze eiwitten zouden artificiële
transcriptiefactoren kunnen worden ontwikkeld. Door deze ZFP-TF’s heel specifiek de
eiwitproductie te laten beïnvloeden, kunnen deze artificiële modulators van het humane
genoom bijdragen aan een specifieke therapie tegen kanker.
Samenvatting
In dit proefschrift zijn twee mogelijkheden besproken waarop gentherapie kan
bijdragen aan een middel tegen kanker. Enerzijds kunnen eiwitten specifiek worden
geproduceerd in kankercellen, waardoor er een toxisch product ontstaat of virale replicatie
plaatsvindt die beperkt blijft tot de kankercellen. Anderzijds kunnen eiwitten die een rol
spelen bij kanker specifiek wel of niet worden geproduceerd, door interventie met artificiële
transcriptiefactoren. Deze twee uiteenlopende voorbeelden van genetische modificatie laten
zien hoe dergelijke benaderingen kunnen bijdragen aan een mogelijk krachtige nieuwe
therapie tegen kanker.
139
Chapter 9
Referenties
1. Balzar M, Winter MJ, de Boer CJ, Litvinov SV. The biology of the 17-1A antigen
(Ep-CAM). J Mol Med. 1999; 77:699-712.
2. Verma IM, Weitzman MD. Gene therapy: twenty-first century medicine. Annu Rev
Biochem. 2005; 74:711-738.
3. McLaughlin PM, Trzpis M, Kroesen BJ, Helfrich W, Terpstra P, Dokter WH,
Ruiters MH, de Leij LF, Harmsen MC. Use of the EGP-2/Ep-CAM promoter for
targeted expression of heterologous genes in carcinoma derived cell lines. Cancer
Gene Ther. 2004; 11:603-612.
4. Gommans WM, van Eert SJ, McLaughlin PM, Harmsen MC, Yamamoto M, Curiel
DT, Haisma HJ, Rots MG. The carcinoma-specific epithelial glycoprotein-2
promoter controls efficient and selective gene expression in an adenoviral context.
Cancer Gene Ther. 2006; 13:150-158.
5. Gommans WM, Haisma HJ, Rots MG. Engineering zinc finger protein transcription
factors: the therapeutic relevance of switching endogenous gene expression on or off
at command. J Mol Biol. 2005; 354:507-519.
140