TENTAMEN BIOCHEMIE

Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
1
Insuline transport en recombinante expressie
(~30 minuten; 20 punten)
Het eiwit hormoon insuline wordt geproduceerd in de beta-cellen van de alvleeskier
(pancreas). Insuline bestaat uit 2 polypeptide ketens die met 2 zwavelbruggen aan elkaar zijn
verbonden. Insuline wordt in de beta-cellen opgeslagen in zogenaamde ‘secretory vesicles’.
a. De voorloper van insuline is het eiwit preproinsuline dat bestaat uit een enkele peptide
keten met 2 interne zwavelbruggen. In het Golgi-apparaat wordt proinsuline omgezet in
insuline. Beschrijf de verschillende processen die optreden nadat het mRNA voor
preproinsuline is gevormd en vanuit de kern in het cytosol terecht is gekomen. Bespreek
hierbij waar de synthese van het preproinsuline eiwit plaatsvindt, hoe dit gecontroleerd wordt,
waar de vouwing plaatsvindt en op welke manier de juiste vouwing wordt gecontroleerd, en
hoe uiteindelijk insuline in de secretory vesicles terecht komt. (5P)
- eiwit heeft n-terminale ER targeting sequenties
- cotranslationeel transport over ER membraan, eiwit synthese vindt dus plaats in ribosomen
op het ER membraan. (Na synthese wordt preproinsuline proteolytisch omgezet in
proinsluline; signaal sequentie wordt eraf geknipt).
- vouwing in ER lumen waarbij o.a. zwavelbruggen worden gevormd. Proces wordt
gekatalyseerd door Protein Disulfide Isomerases.
- Na controle correcte vouwing (glucose trimming) wordt eiwit via vesculair transport
getransporteerd naar de Golgi waar de proteolytische processing plaatsvindt. - Vandaar uit
(Trans Golgi) worden secretory vescicles gevormd waarin de insuline ligt opgeslagen.
b. Bij vesculair transport spelen de eiwitten SNARE, Rab en clathrine een belangrijke rol.
Beschrijf van elk van deze 3 eiwitten in circa 2 zinnen de rol(len) in vesculair transport. (6P)
SNARE: V-SNARE (op vesicle) en T-SNARE (op target membraan) vormen als de twee
membranen voldoende dicht bij elkaar komen bundels van a-helices. De vorming van deze
bundels levert de drijvende kracht voor membraan fusie.
Rab: Rab eiwitten zijn eiwitten aan de buitenkant van vesicles die voor de juiste adressering
van vesculair transport zorgen.
Clathrine: clathrine is een structureel eiwit met een 3-voudige symmetrie dat een belangrijke
rol speelt bij de vorming van vesicles. Clathrine assembleert dicht bij het membraan en vormt
een netwerk structuur met een bepaalde kromming. Deze kromming zorgt ervoor dat zich
vesicles kunnen vormen (budding).
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
Patienten met suikerziekte maken te weinig insuline aan en moeten daarom bij een lage
bloedsuikerspiegel zelf extra insuline injecteren. Om insuline te gaan produceren besluit u
het DNA dat codeert voor het humane gen met behulp van PCR uit het genomisch DNA van
een menselijke cel te amplificeren. Dit fragment kloneert u vervolgens in een plasmide voor
bacteriële expressie. Na transformatie van het plasmide in de bacterie, wordt echter alleen
een peptide geproduceerd met de eerst 18 aminozuren van insuline gevolgd door 4 niet in
insuline voorkomende aminozuren.
c. Geef een mogelijke verklaring voor deze mislukking en geef aan hoe u dit probleem zou
kunnen voorkomen. (4P)
Eukaryoot DNA bestaat uit intronen en exonen, waarbij de intronsequenties er na transcriptie
uit worden gespliced om mRNA te vormen. In bacteriën vindt dit proces niet plaats. Wat hier
waarschijnlijk is gebeurd is dat zich in het 1ste intron een stopcodon bevond, waardoor de
eiwitsynthese prematuur gestopt is. Dit probleem kan worden voorkomen door het mRNA dat
codeert voor insuline mbv reverse transcriptase om te zetten in cDNA en dit cDNA
vervolgens in het plasmide te kloneren.
d. U wilt nu in zoogdiercellijnen insuline produceren en daarvoor gebruik maken van de
nieuwe technologie, CRISPR-CAS9. Leg uit hoe u met deze technologie een stabiele cellijn
kunt produceren waarin 10 kopieën van het insuline gen onder controle van een
reguleerbare promotor op een goed gedefinieerde plaats in het genoom zijn ingebouwd. (5P)
Antwoord moet ingaan op transfectie, selectie om een stabiele cellijn te creëren,
mechanisme waarmee CAS9 specifiek een dubbelstrands breuk kan creëren met behulp van
guide RNA, reparatie van ds breuk op basis van homoloog DNA met een insert met de 10
kopieën van het insuline gen.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
2
Therapeutische antilichamen en gerelateerde technieken
(~30 minuten; 20 punten)
Therapeutische antilichamen vormen een belangrijk groep van medicijnen in de oncologie en
immunologie. Nadelen van deze medicijnen zijn de kostprijs en het feit dat ze niet bij alle
patiënten werken. Een voorbeeld is Trastuzumab, een monoclonaal antilichaam dat wordt
gebruikt in de behandeling van borstkanker en bindt aan de HER2 receptor. Dit middel is
alleen effectief bij vormen van borstkanker die voor hun groei afhankelijk zijn van een
verhoogde expressie van de groeifactor receptor HER2.
a. Wat is het verschil tussen monoclonale antilichamen en polyclonale antilichamen? Hoe
worden monoclonale antilichamen in het laboratorium gemaakt? Leg dit kort puntsgewijs uit?
(5P)
Polyclonal: mixture of different antibodies targeting the same antigen, but binding to different
epitopes. Monoclonal: single antibody protein targeting a single epitope on an antigen.
Monoclonal antibodies are obtained using the hybridoma technology (immunization of
mouse, isolation of B-cells, fusion of primary B-cells with myeloma cell to generate
hybridomas cells, identification of clones that produce the best antibody, amplify this clone
and use it to produce antibody in cell culture.
In 25% van alle vormen van borstkanker zijn er meerdere kopieën van het HER2 gen
ontstaan (HER2 gen amplificatie). Hierdoor maken de tumorcellen teveel van het HER2 eiwit
aan (overexpressie). Een manier om te testen of een tumor gevoelig is voor Trastuzumab is
daarom om de hoeveelheid HER2 mRNA te bepalen.
b. Leg uit met welke techniek u de concentratie HER2 mRNA kunt kwantificeren en hoe deze
techniek werkt. (5P)
See slides 39-40 lecture 11. Explain the principle that it is based on PCR, that one is
measuring the formation of dsDNA in real-time using a dsDNA fluorescent probe. First mRNA
is converted to cDNA using reverse transrptase. DNA is amplified exponentially. The cycle
after which a certain threshold fluorescence is reached is used as a measure of the
concentration.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
Een andere techniek die steeds vaker wordt gebruikt om de genetische samenstelling van
een tumor te kunnen bepalen is ‘next generation’ DNA sequencing. In dit geval zou ‘next
generation’ DNA sequencing gebruikt kunnen worden om te zien of de HER2 gen amplificatie
heeft plaatsgevonden. Tegelijkertijd kunnen tevens andere genetische karakteristieken in
kaart worden gebracht.
c. Next-generation sequencing is een verzameling van verschillende DNA seqencing
technieken. Wat hebben deze technieken gemeenschappelijk, noem daarnaast 2 aspecten
waarin ze verschillen van dideoxy sequencing. (5P)
In next generation sequencing millions of sequences are determined at the same time in
parallel, whereas dideoxy sequencing is done on a single sequence. In both cases a single
strand DNA template is used and a DNA polymerase reaction is carried out, but in NGS the
sequence of the DNA that is synthesized is monitored during synthesis, whereas in dideoxy
sequencing the sequence is determined afterwards by analyzing all the different fragments
that have been synthesized using os chromatographic separation. For this reason NGS is
much more efficient and cheaper than dideoxy sequencing. NGS typically yields smaller
sequences than dideoxy sequencing, however (100 vs 800 bp)
d. Beschrijf het principe van 1 van de next generation sequencing technieken. Bespreek
daarbij de manier waarop het DNA wordt geprocesseerd, voordat de daadwerkelijke
sequencing reactie plaatsvindt, de sequencing reactie zelf, en de manier waarop de
uiteindelijk DNA sequentie van een heel chromosoom of genoom wordt bepaald. (5P)
Keuze uit meerdere technieken.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
3
Signalering
(~30 minuten; 20 punten)
a. GAPs (GTPase-activating proteins) controleren de activiteit van monomere G-eiwitten.
Veronderstel een mutatie in het G-eiwit welke er voor zorgt dat GAPs niet meer kunnen
binden aan het G-eiwit. Hoe zal deze mutatie de signaleringsactiviteit van het G-eiwit
veranderen? Leg kort uit. (3P)
Het gemuteerd G-eiwit zou constant / veel meer actief zijn. Omdat de GAPs niet meer
kunnen binden zal de hydrolyse van GTP naar GDP door het G-eiwit (veel) langzamer
verlopen en daarom zal het G-eiwit (veel) langer signaleren / actief zijn.
b. Cyclisch AMP (cAMP) is een secondary messenger voor GPCR signalering. Wat is er
eigenlijk cyclisch aan cAMP? Beschrijf (of teken) dit kort. (2P)
Het cyclische refereert aan de ringstructuur van de fosfaat groep welke als di-ester
verbonden is aan zowel de 5’-OH en de 3’-OH van de ribose suiker van adenosine.
c. Signalering via GPCRs kan uiteindelijk leiden tot activatie van protein kinase C (PKC).
Hiervoor zijn calcium ionen en diacylglycerol moleculen nodig als “secondary messengers”.
Beschrijf kort de stappen welke doorlopen worden na ligand binding door de GPCR die
leiden tot activatie van PKC door calcium ionen en diacylglycerol. Ga daarbij in op het
fosfoinositide PI(4,5)P2, welke een belangrijke rol speelt in deze signaalcascade. N.B.
Beschrijf kort de belangrijkste stappen / processen welke optreden (wat gebeurt er
moleculair) vanaf de activatie van de GPCR. (5P)
Activatie van de GPCR leidt tot activatie van de intracellulaire trimere G-eiwitten door
uitwisseling van GDP voor GTP. Deze G-eiwitten binden en activeren een enzym
(fosfolipase) welke het PI(4,5)P2 hydrolyseert in diacylglycerol en inositol (1,4,5)-trifosfaat
(IP3). Dit IP3 bindt aan een calcium release kanaal in het ER wat leidt tot excretie van Ca2+
uit het lumen. Samen met diacylglycerol bindt het Ca2+ aan PKC en activeert deze.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
d. Het onder 3c genoemde fosfoinositide PI(4,5)P2 speelt ook een belangrijke rol in
signalering via enzym-gekoppelde cel-oppervlakte receptoren zoals receptor tyrosine
kinasen (RTKs). Hierbij wordt PI(4,5)P2 gefosforyleerd. Welke product wordt hierbij gevormd
en wat is de rol van dit molecuul in de verdere signaleringscascade? (5P)
Het fosfatidylinositol (3,4,5)-trisfosfaat / PI(3,4,5)P3 / PIP3 fungeert als docking site /
herkenningsplatform in het celmembraan voor eiwitactivatie.
Verdere uitleg (niet strikt noodzakelijk): Na fosforylering is het een moleculair
herkenningspatroon voor specifieke signaal eiwitten (eg PDK1 en Akt), waardoor deze
eiwitten dicht bij elkaar in de buurt komen en signalen (fosforylering) aan elkaar doorgeven.
De membraanlocalisatie verhoogt de lokale concentratie van de eiwitten, lokaliseert het
signaleringsproces tot een specifiek compartiment en brengt de juiste interactiepartners bij
elkaar.
e. Onderstaand is schematisch de signaleringsroute van een enzym-gekoppelde receptor
klasse (cytokine receptoren) gegeven. Beschrijf kort (1 zin per punt) wat er tijdens de
stappen A-E gebeurt. (5P)
A
B
C
D
E
A. Binden van de cytokine leidt tot dimerizatie van de receptor en cross-fosforylatie van de
JAKs.
B. (Geactiveerde) JAKs fosforyleren de receptor.
C. STATs docking aan de receptor en worden gefosforyleerd door de JAKs.
D. STATs dissociëren van de receptoren en dimerizeren (via hun SH2 domein).
E. STAT dimeer transloceert naar de nucleus (bind aan DNA en andere eiwitten) en activeert
gen transcriptie.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
4
De cel-cyclus en kanker
(~30 minuten; 20 punten)
a. Plaats de correcte term bij de correcte definitie (er blijven dus termen over). (5P)
anaphase-promoting complex or cyclosome (APC/C)
Cdc25
EGF
cyclin-dependent kinase (Cdk)
Golfo
G1-CDK
Cdk-activating kinase (CAK)
interphase cycline
Cdk inhibitor protein (CKI)
Wee1
Cdt1
I – Een lid van de familie van kinasen welke gecomplexeerd moeten zijn met een cycline om
actief te zijn.
Cdk
II – Een ubiquitine ligase welke de afbraak van een specifieke set van eiwit induceert,
waardoor in de M-fase de zusterchromatiden uit elkaar kunnen gaan.
APC/C
III – Lid van een familie van eiwitten wiens concentratie verandert gedurende de
eukaryotische celcyclus, waardoor de activiteit van kinases gereguleerd wordt en daarmee
de celcyclus.
Cycline
IV – Een kleine kinase welke middels fosforylering de activiteit van M-Cdk kan blokkeren.
Wee1
V – Kinase welke middels fosforylering de activiteit van een Cdk kan activeren.
CAK
b. Het tumorsuppressoreiwit Rb (Retina blastoma eiwit) controleert een belangrijk punt in de
cel cyclus; de start van de S-fase. De cel gaat pas de S-fase in als het Rb eiwit inactief
gemaakt wordt door fosforylering van twee van zijn serines. In een experiment muteert u nu
deze beide serines van Rb tot asparagine zuren (Asp, D). Het blijkt dat hierdoor het Rb eiwit
constant inactief is en er geen controle over de cel cyclus meer mogelijk is. Als u echter deze
twee serines in een tweede experiment beide muteert tot asparagines (Asn, N) is het Rb
eiwit constant actief. Legt u uit hoe dit uw inziens komt (wat gebeurt er moleculair door de
mutaties). (5P)
(De fosforyleringsstatus van de serines corroleert met de activiteit van het Rb eiwit.) Door de
fosforylering wordt het eiwit voorzien van negatieve ladingen (welke een
conformatieverandering induceren, welke inactief is). De asparagine zuren bootsen de
negatieve ladingen van de fosfoserines na en induceren daarmee de inactieve conformatie.
De asparagines zijn (polair en) neutraal (en kunnen niet gefosforyleerd worden) en
stabiliseren dus de actieve conformatie van het Rb eiwit.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
c. Verklaar kort het volgend fenomeen: Personen die 1 inactieve kopie van een
tumorsuppressorgen (zoals Rb) erven hebben een grotere kans om kanker te ontwikkelen
dan personen met 2 niet gemuteerde kopieën. (3P)
Een geerde predispositie tot kanker is vaak gekoppeld aan de mutatie van 1 kopie van een
tumorsuppressorgen. Heterozygote cellen, welke nog 1 wild-type kopie van het gen hebben
zijn in principe in orde, maar hebben een verhoogd risico voor kanker omdat met slecht 1
mutatie (in plaats van twee bij een ‘normaal’ persoon), een inactivate van de overgebleven
goede kopie hoeft plaats te vinden. (Dus waar een tumorsuppressor eiwit in principe
moeilijker te inactiveren is omdat beide genen inactief moeten worden gemaakt, is dit bij een
heterozygote cel makkelijker, omdat er maar 1 kopie nog gemuteerd hoeft te worden).
d. Het oncogene eiwit Ras kan in twee vormen voorkomen, actief en inactief, afhankelijk van
de aan- of afwezigheid van extracellulaire signalen. Wat is het moleculaire verschil tussen de
actieve en inactieve toestand van Ras? (2P)
Actief: GTP gebonden. Inactief GDP gebonden.
e. Het Arf eiwit inhibeert het Mdm2 eiwit,
welke weer het p53 eiwit inhibeert. De relatie
tussen deze 3 eiwitten is gerepresenteerd in
de figuur hiernaast. Dit is een voorbeeld van
een “dubbel-negatief” mechanisme: Arf is
een inhibitor van een inhibitor van p53. U wilt
een genetisch gemodificeerde muis maken
met een verhoogde gevoeligheid voor het ontwikkelen van een tumor dan een normale muis.
Wat voor muis moet u daarvoor maken: (1) een Arf-knockout muis, (2) een Mdm2-knockout
muis, of (3) een muis met een gemuteerd Mdm2 eiwit welke niet meer bindt aan p53? Leg
uw antwoord kort uit. (5P)
Een Arf-knockout muis zal naar verwachting meer gevoelig zijn voor de ontwikkeling van een
tumor dan een wild-type muis. In de afwezigheid van Arf zal het Mdm2 meer actief
zijn/worden. Dit overactieve Mdm2 zal vervolgens de p53 meer onderdrukken dan normaal.
De consequentie van een Arf knockout is dus gereduceerde p53 activiteit. Hierdoor zal p53
minder in staat zijn abnormale cellen tot een cel cyclus arrest of apoptose te laten overgaan.
Als gevolg zullen meer “pre-kanker” cellen van de celdood ontsnappen en worden meer
tumoren gevormd.
Het weglaten vallen of inactief worden van Mdm2 (opties 2 en 3) zorgen juist voor een
actiever p53, wat beschermt tegen tumorontwikkeling.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
5
Het immuunsysteem
(~30 minuten; 20 punten)
a. Beschouw de gegeven figuur.
Leg in een paar zinnen uit hoe
het hier weergegeven proces
bijdraagt aan de diversificatie
van antilichamen. (5P)
Bij de vorming van het variabele
deel van antilichamen worden
gen segmenten (V, D, J) geknipt
en aan elkaar geplakt. Dit
plakken
gaat
bewust
onnauwkeurig,
om
zo
diversificatie te genereren in de
gedifferentieerde
cellen.
De
uiteinden van de segementen (V
en J in dit geval) worden random wat ingekort en aan elkaar geplakt. Hier door is de
basevolgorde op dit punt diverser. (Gevolg is wel dat 2/3 van de processen leiden tot
problemen met het reading frame).
b. Veel immunologische processen vinden plaats middels contactafhankelijke signalering
(bijvoorbeeld T of B cel activatie, of herkenning van geïnfecteerde cellen door T cellen).
Noem twee verschillende redenen waarom dit zich uw inziens evolutionair zo heeft
ontwikkeld in plaats van, bijvoorbeeld, via paracrine signalering. (5P)
2 van e.g. -Door contactafhankelijke signalering kunnen selectief alleen die cellen herkend of
geactiveerd worden welke de juiste complementaire componenten bevatten.
-Door contactafhankelijke signalering kan een signaal veel sterker doorgegeven worden
middels interacties van coreceptoren en middels multivalente effecten: Er zijn altijd meerdere
signalen nodig om over een activeringsdrempel heen te komen. Door direct cel contact wordt
dit lokaal heel effectief gedaan.
-Door contactafhankelijke signalering kunnen selectief alleen geïnfecteerde cellen gedood
worden. Paracrine signalering zal leiden tot veel “collateraal schade”.
-Door contactafhankelijke signalering wordt eventuele additionele paracrine signalering
efficiënter en selectiever.
Naam:
Studentnummer:
Opleiding:……..
c. Een T-cel receptor (TCR) en een major histocompatibility complex eiwit (MHC) kunnen
gelijktijdig binden aan hetzelfde peptide fragment. Deze TCR doet dit heel specifiek voor een
bepaalde sequentie, terwijl het MHC eiwit ook aan bijna alle andere peptide fragmenten met
ongeveer dezelfde lengte kan binden. Verklaart u op moleculair niveau deze ogenschijnlijke
paradox. Met andere woorden, op wat voor manier binden TCRs heel selectief aan peptide
fragmenten en MHC eiwitten heel aselectief. (5P)
De TCR herkent / bindt voornamelijk de zijstaarten decoratie van het peptide en zorgt op die
manier voor selectiviteit.
Het MHC eiwit herkent / bindt voornamelijk de hoofdketen (backbone) van het peptide (de
amides) welke uniform is en daardoor aselectief. (De lengte is in algemene zin wel belangrijk
voor de binding aan MHC eiwitten, maar voor peptides van dezelfde lengte is dit niet
differentiërend.)
d. Proteasoom-inhibitoren worden gebruikt voor de behandeling van bepaalde tumoren.
Proteasoom-inhibitoren hebben echter ook potentie voor de behandeling van bepaalde autoimmuun ziektes en ter ondersteuning van orgaantransplantaties. Legt u uit welk principe ten
grondslag ligt aan de toepassing van proteasoom-inhibitoren bij auto-immuun ziektes en
orgaantransplantaties. (5P)
Zowel auto-immuun ziekten als orgaantransplantaties hebben “last” van ons eigen
immuunsysteem, waarbij ons immuunsysteem onze eigen cellen of die van de orgaandonor
herkent en aanvalt. Herkenning van deze cellen door het immuunsysteem gebeurt met
behulp van MHC eiwitten van onze cellen die korte stukjes peptide van pathogenen, maar
ook van onze eigen cellen aan de buitenkant van de cel tentoonspreiden ter
herkenning/screening door T-cellen. Deze korte stukjes peptide worden in de cel gemaakt
door afbraak van pathogene en endogene eiwitten in het proteasoom. Inhibitie van het
proteasoom voorkomt dus de presentatie van die peptides aan de buitenkant van de cel en
daarmee de activatie van het immuunsysteem.
Bonusvraag
(~5 minuten; max. 5 punten extra)
Waarvoor is in 2015 de nobelprijs voor de chemie toegekend? (5P)
for mechanistic studies of DNA repair