Invloed van bestraling op de adhesie en pathogeniciteit van

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2012 – 2013
Invloed van bestraling op de adhesie en pathogeniciteit
van bacteriën in de context van orale mucositis
Kevin De boel
Promotor: Prof. dr. ir. Tom Van de Wiele
Tutor: Ir. Tine De Ryck
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de bio-ingenieurswetenschappen: cel- en genbiotechnologie
Auteursrecht
‘De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron
te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie’.
Gent, 7 juni 2013
Promotor,
Auteur,
Prof. Dr. Ir. Tom Van de Wiele
Kevin De boel
Voorwoord
Ik zou van dit voorwoord gebruik willen maken om een aantal mensen te bedanken die mij
de kans hebben gegeven dit onderzoek te kunnen uitvoeren en het geheel mee tot een goed
einde hebben gebracht.
Allereerst zou ik mijn promotor Prof. Tom Van de Wiele willen bedanken om mij de kans te
geven om bij te dragen tot het onderzoek naar orale mucositis en het Laboratorium voor
Microbiële Ecologie en Technologie (LabMET) ter beschikking te stellen. Hij was altijd bereid
om feedback te geven bij bekomen resultaten en gaf genoeg ruimte om eigen input te
brengen in dit verhaal. Ook zou ik Tine willen bedanken voor de goede begeleiding die ik dit
jaar gehad heb gehad, zowel in het labo als bij het finaliseren van dit proefschrift. Het was
niet altijd evident maar zij zorgde ervoor dat tijdens het optimalisatieproces de moed niet in
de schoenen zakte. Bedankt!
Ook zou ik Prof. Marc Bracke en Prof. Olivier De Wever willen bedanken voor het ter
beschikking stellen van hun Laboratorium voor Experimenteel Kankeronderzoek (LECR).
Prof. Tom Boterberg zou ik willen bedanken om steeds bereid te zijn om de
bestralingsbehandeling te geven voor de experimenten. Stephanie en Marleen zou ik willen
bedanken voor het aanmaken van de algemeen gebruikte media en het autoclaveren. De
andere collega’s en thesisstudenten bij het LECR mogen zeker ook niet vergeten worden. Zij
zorgden voor een aangename sfeer op het labo en waren steeds bereid om te helpen.
Ik zou ook Karen willen bedanken om mij te helpen de flow cytometer te bedienen. Ook
Charlotte heeft mij goed geholpen bij de eerste analyse met de flow cytometer om te
proberen de achtergrondproblemen op te lossen. De andere collega’s bij LabMET zou ik
willen bedanken voor hun feedback gedurende de seminarie. Rosemarie heeft gezorgd voor
een mooie wending in het optimalisatieproces door een alternatief voor Triton X-100 voor te
stellen. Bedankt hiervoor! Ook zou ik Barbara nog willen bedanken om mijn literatuurstudie
grondig na te lezen en de nodige feedback te geven.
Tenslotte zou ik mijn vrienden willen bedanken om te zorgen voor de nodige
ontspanningsavonden gedurende een druk thesisjaar. Af en toe zot doen kan goed doen!
Ook mijn familie mag hier zeker niet ontbreken die de nodige frustraties hebben mogen
meemaken maar toch geduld hebben gehad. Zij zorgden ervoor dat ik toch altijd tot rust kon
komen als ik van Gent terug naar thuis kwam.
De boel Kevin
I.
Masterproef 2012-2013
Inhoudstabel
I.
Inhoudstabel ................................................................................................................ I
II.
Afkortingenlijst ........................................................................................................... IV
III.
Lijst van afbeeldingen ................................................................................................ VI
IV.
Lijst van tabellen ....................................................................................................... VII
V.
Samenvatting ........................................................................................................... VIII
VI.
Summary ................................................................................................................... IX
1.
Literatuurstudie ........................................................................................................... 1
1.1.
Orale mucositis ten gevolge van bestraling ............................................................. 1
1.1.1.
Inleiding............................................................................................................ 1
1.1.2.
Risicofactoren .................................................................................................. 3
1.1.3.
Ontwikkelingsmodel ......................................................................................... 4
1.1.4.
Nieuwe hypothese ............................................................................................ 5
1.2.
Orale microbiota ...................................................................................................... 6
1.2.1.
Orale omgeving ................................................................................................ 6
1.2.2.
Endogene orale microbiële gemeenschap........................................................ 6
1.3.
Celadhesie .............................................................................................................. 8
1.3.1.
Ontstaan biofilm ............................................................................................... 8
1.3.2.
Adhesines Streptococcus species .................................................................... 9
1.3.3.
Hydrofobiciteit en adhesie ...............................................................................10
1.4.
Pathogeniciteit........................................................................................................11
1.4.1.
Ongewervelde diermodellen ............................................................................11
1.4.2.
Het Galleria mellonella model..........................................................................12
1.5.
2.
Doelstelling masterproef .........................................................................................13
Materiaal en methode ................................................................................................14
2.1.
Gebruikte bacteriesoorten en bijhorende groeiculturen ..........................................14
2.1.1.
Bacteriesoorten en groeimedia ........................................................................14
2.1.2.
Aanmaak stock bacteriën ................................................................................14
I
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
2.2.
Gebruikte cellijn......................................................................................................15
2.3.
Pathogeniciteitstesten ............................................................................................15
2.3.1.
Injectiemethode ...............................................................................................15
2.3.2.
Scoretabel .......................................................................................................15
2.3.3.
Onderzochte behandelingen en condities........................................................16
2.3.4.
DNA extractie, DNA opzuivering en PCR ........................................................17
2.4.
Adhesietesten ........................................................................................................18
2.4.1.
Voorbereiding 6-well plaat ...............................................................................19
2.4.2.
Algemeen protocol ..........................................................................................19
2.4.3.
Protocoloptimalisatie .......................................................................................19
2.4.4.
Meest optimale protocol ..................................................................................21
2.4.5.
Analyse met uitplatingtechniek ........................................................................22
2.4.6.
Analyse met flow cytometer.............................................................................22
2.4.7.
Berekening van de verschillende ratio’s ..........................................................23
2.5.
Hydrofobiciteit: Bacterial Adherence To Hydrocarbons (BATH) ..............................23
2.6.
Statistiek ................................................................................................................24
3.
Resultaten .................................................................................................................25
3.1.
Pathogeniciteitstesten ............................................................................................25
3.1.1.
Scoretabel .......................................................................................................25
3.1.2.
Overleving van de larven: verloop tot vier dagen na injectie ............................26
3.1.3.
Overleving van de larven: één dag na injectie .................................................28
3.1.4.
DNA extractie uit larven: analyse met agarosegel ...........................................29
3.2.
Adhesietesten ........................................................................................................29
3.2.1.
Protocoloptimalisatie: adhesie aan agarmucine...............................................29
3.2.2.
Protocoloptimalisatie: adhesie aan cellen ........................................................32
3.2.3.
Celadhesietest met K. oxytoca ........................................................................42
3.3.
Hydrofobiciteit: Bacterial Adherence To Hydrocarbons (BATH) ..............................43
3.3.1.
8-uurs verloop van hydrofobiciteit ....................................................................43
3.3.2.
De 0-uurs metingen van hydrofobiciteit ...........................................................43
II
De boel Kevin
4.
Masterproef 2012-2013
Discussie ...................................................................................................................44
4.1.
Adhesie van bacteriën aan epitheliale cellen: optimalisatie van het in vitro model ..44
4.2.
Pathogeniciteit van orale bacteriën: wat is de oorzaak en wat doet bestraling? ......52
5.
Toekomstperspectieven .............................................................................................55
6.
Conclusie ...................................................................................................................57
7.
Referentielijst .............................................................................................................58
8.
Bijlagen ......................................................................................................................66
8.1.
Pathogeniciteit: scoretabel .....................................................................................66
8.2.
Pathogeniciteit: overlevingsverloop van de larven (tweede test) .............................67
8.3.
Pathogeniciteit: overlevingsverloop van de larven (derde test) ...............................68
8.4.
Pathogeniciteit: overleving van de larven een dag na injectie .................................69
8.5.
Pathogeniciteit: mobiliteit en melanisatie van de larven (eerste test) ......................70
8.6.
Pathogeniciteit: mobiliteit en melanisatie van de larven (tweede test) ....................71
8.7.
Pathogeniciteit: mobiliteit en melanisatie van de larven (derde test) .......................72
8.8.
Viabiliteit S. salivarius met flow cytometer analyse na 30 minuten..........................73
8.9.
Viabiliteit K. oxytoca met flow cytometer analyse na 30 minuten ............................74
8.10. BATH 8-uursopvolging: K. oxytoca.........................................................................75
8.11. BATH 8-uursopvolging: S. salivarius ......................................................................76
8.12. BATH 8-uursopvolging: L. salivarius ......................................................................77
III
De boel Kevin
II.
Masterproef 2012-2013
Afkortingenlijst
AD/ST
ratio aangehechte bacteriën tegenover startcultuur na incubatie
Ag I/II
antigeen I/II
AI2
auto-inducer 2
BATH
Bacterial Adherence To Hydrocarbons
BHI
Brain Heart Infusion
BMI
Body Mass Index
CFDA
carboxyfluoresceine diacetaat
kve
kolonievormende eenheden
CRAMP
chemo- or radiotherapy-associated molecular pattern
DAMP
damage-associated molecular pattern
DAPI
4',6-diamidino-2-fenylindool
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO
dimethylsulfoxide
DNA
deoxyribonucleïnezuur
dNTP
deoxyribonucleoside trifosfaat
ECM
extracellulaire matrix
EHEC
enterohaemorrhagische Escherichia coli
FBS
foetaal kalfsserum
Fw-primer
forward-primer
HMGB1
high-mobility group box 1
i.e.
id est
Ig
immunoglobuline
IU
internationale (farmaceutische) eenheid
MRS
deMan, Rogosa en Sharpe (medium)
NB
Nutrient Broth
NCI-CTC
National Cancer Institute Common Toxicity Criteria
NF-κβ
Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
o.a.
onder andere
OD
optische densiteit
PAMP
pathogen-associated molecular pattern
PBSD-
fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder Ca2+ en Mg2+
PCR
Polymerase Chain Reaction
PRR
pattern recognition receptor
qPCR
Quantitative Polymerase Chain Reaction
RNase
ribonuclease
IV
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
ROS
reactieve zuurstofmoleculen
RT-AF
altered fractionated radiotherapy
RT-C
conventioneel gefractrioneerde radiotherapie
Rv-primer
reversed primer
SDS
natriumdodecylsulfaat
sIgA
secretorisch immunoglobuline A
TBE
Tris/boraat/EDTA
TLR
Toll-like receptor
TNFα
tumor necrosis factor alfa
VBNC
viable but non-culturable
WHO
Wereldgezondheidsorganisatie
V
De boel Kevin
III.
Masterproef 2012-2013
Lijst van afbeeldingen
Figuur 1: Indeling orale mucositis .......................................................................................... 2
Figuur 2: Het ontwikkelingsmodel voor orale mucositis volgens Sonis (2004) ....................... 4
Figuur 3: Onderverdeling van streptococci ............................................................................ 7
Figuur 4: Vorming van een orale biofilm aan het tandoppervlak ............................................ 8
Figuur 5: De vijfhoekenting ...................................................................................................14
Figuur 6: Verpoppende Galleria mellonella larven ................................................................16
Figuur 7: Uitplatingstechniek met microdilutie .......................................................................22
Figuur 8: Overlevingscurve van de eerste pathogeniciteitstest met S. salivarius ..................26
Figuur 9: Kaplan-Meier curve van de pathogeniciteitstesten met S. salivarius ......................27
Figuur 10: Overleving van de larven een dag na de injectie .................................................28
Figuur 11: DAPI-kleuring bij een celadhesietest met drie Triton X-100 concentraties ...........34
Figuur 12: Flow cytometer analyse: aanhechting aan gedifferentieerde TR146 cellen ..........36
Figuur 13: Flow cytometer analyse: aanhechting aan confluente TR146 cellen. ...................38
Figuur 14: Viabiliteitstest met flow cytometer ........................................................................41
Figuur 15: Overlevingscurve van de tweede pathogeniciteitstest met S. salivarius ...............67
Figuur 16: Overlevingscurve van de derde pathogeniciteitstest met S. salivarius .................68
Figuur 17: Mobiliteits- en melanisatiecurve van de eerste pathogeniciteitstest. ....................70
Figuur 18: Mobiliteits- en melanisatiecurve van de tweede pathogeniciteitstest ....................71
Figuur 19: Mobiliteits- en melanisatiecurve van de derde pathogeniciteitstest. .....................72
Figuur 20: BATH-test met Klebsiella oxytoca........................................................................75
Figuur 21: BATH-test met Streptococcus salivarius. .............................................................76
Figuur 22: BATH-test met Lactobacillus salivarius ................................................................77
VI
De boel Kevin
IV.
Masterproef 2012-2013
Lijst van tabellen
Tabel 1: Viabiliteitstest met uitplatingstechniek .....................................................................40
Tabel 2: Viabiliteitstest van Streptococcus salivarius met de flow cytometer ........................40
Tabel 3: Viabiliteitstest van Klebsiella oxytoca met de flow cytometer ..................................41
Tabel 4: Recovery bij de celadhesietesten met K. oxytoca. ..................................................42
Tabel 5: Ratio AD/ST bij de celadhesietesten met K. oxytoca. .............................................42
Tabel 6: De 0-uurs metingen van hydrofobiciteit voor drie bacteriesoorten.. .........................43
Tabel 7: Scoretabel pathogeniciteitstesten. ..........................................................................66
Tabel 8: Overleving van de larven een dag na de injectie.....................................................69
Tabel 9: Viabiliteitstest van Streptococcus salivarius met de flow cytometer.. ......................73
Tabel 10: Viabiliteitstest van Klebsiella oxytoca met de flow cytometer.. ..............................74
VII
De boel Kevin
V.
Masterproef 2012-2013
Samenvatting
Orale mucositis is een acute ontstekingsreactie die optreedt bij de behandeling van
kankerpatiënten met radio- en/of chemotherapie. Het ontwikkelt zich voornamelijk bij
patiënten met hoofd- en halskanker en kan in sommige gevallen een zeer ernstige vorm
aannemen. Er werd eerder al een vijfstappenmodel opgesteld door Sonis et al. om de
pathobiologie van orale mucositis te verklaren. Er is op dit moment echter nog niet bekend
wat de rol van orale bacteriën hierin zou kunnen zijn.
In dit proefschrift werd onderzocht of bestraling een effect heeft op een aantal
eigenschappen
van
bacteriën.
Drie
bacteriesoorten
werden
onderzocht,
namelijk
Streptococcus salivarius, Klebsiella oxytoca en Lactobacillus salivarius. S. salivarius is een
oraal voorkomende bacteriesoort en behoort tot een van de pioniers in de vorming van orale
biofilmen. L. salivarius is eveneens een orale bacteriesoort behorende tot de endogene
microbiota. K. oxytoca werd getest vanwege zijn pathogene karakter. Een eerste kenmerk is
de adhesiecapaciteit aan mucus en epitheliale cellen, wat een eerste stap is van de bacterie
om zich te kunnen koloniseren op het mucosale oppervlakte. Dit werd onderzocht met de
TR146 cellijn, een humane epitheliale cellijn afkomstig van een plaveiselcelcarcinoom ter
hoogte van de hoofd- en halsregio. Het ontbreken van een algemeen geschikt protocol in de
beschreven literatuur en de gevoeligheid van S. salivarius aan Triton X-100 zorgden ervoor
dat de adhesie-experimenten eerst geoptimaliseerd moesten worden. Voor de adhesieexperimenten met S. salivarius is verdere optimalisatie nog steeds vereist. Testen met K.
oxytoca vertoonden geen significant effect van bestraling op de adhesie aan TR146 cellen.
Aangezien de hydrofobiciteit een rol kan spelen in de aspecifieke adhesie van bacteriën,
werd ook deze parameter onderzocht bij de drie bacteriesoorten. Hiervoor werd gebruik
gemaakt van Bacterial Adherence To Hydrocarbons (BATH) experimenten. De hydrofobiciteit
bleek zeer variabel te zijn gedurende de BATH experimenten en er kon vervolgens geen
besluit getrokken worden over een mogelijk effect van bestraling. S. salivarius, L. salivarius
en K. oxytoca bleken respectievelijk hydrofoob, intermediar hydrofoob en hydrofiel te zijn.
Tenslotte werd de pathogeniciteit van Streptococcus salivarius onderzocht met in vivo
experimenten met het niet-vertebrate diermodel Galleria mellonella. Hieruit bleek dat de
bestraling van de bacteriën een negatieve invloed had op de overleving van de larve. Verder
onderzoek naar het mechanisme is vereist.
Uit dit proefschrift blijkt er nog een verdere optimalisatie en bijkomende testen nodig zijn om
het effect van bestraling op bacteriële eigenschappen te kunnen onderzoeken en verklaren.
Zo zou dit tot een beter inzicht kunnen leiden van de ontwikkeling van orale mucositis en
kunnen bijdragen tot een efficiëntere behandeling van deze pijnlijke aandoening.
VIII
De boel Kevin
VI.
Masterproef 2012-2013
Summary
Oral mucositis is an acute inflammation of the mucosal surface in the oral environment. It
occurs when cancer patients are receiving radio- and/or chemotherapy. Especially for
patients with head- or neck cancers, oral mucositis is a common complication. Sometimes it
can develop into a very severe state. Sonis et al. proposed earlier a five-step model to
elucidate the pathobiology of oral mucositis. Until now, the potential role of the oral bacteria
in the development of this acute inflammation is still unknown.
For this masterthesis, the effect of irradiation on some bacterial characteristics was
investigated. Three bacterial species were studied: Streptococcus salivarius, Klebsiella
oxytoca en Lactobacillus salivarius. S. salivarius is a member of the indigenous oral
microbiota and belongs to the group of early colonizers of the mucosa. L. salivarius is also
one the oral, indigenous bacterial species. K. oxytoca was used because of its pathogenic
trait. Bacterial adhesion to mucus and epithelial cells is an important characteristic because it
is the first step in the colonization process of the mucosal surface. TR146 cells were used for
in vitro adhesion experiments. TR146 is an human epithelial celline derived from a squamous
cell carcinoma from the head and neck region. Due to the lack of a generalized protocol and
the sensitivity of S. salivarius to the detergent Triton X-100, the protocol needed to be
optimized. The adherence assays with S. salivarius were not completely optimized during
this research so further optimization is still needed. Experiments with K. oxytoca haven’t
shown a significant effect on the adhesion to TR146. Hydrophobicity may play a role in the
aspecific adhesion of the three bacterial strains. By use of the BATH assays, a clear
difference between the species was found. S. salivarius, L. salivarius and K. oxytoca are
apparently hydrophobic, intermediate hydrophobic and hydrophilic species respectively. Due
to the low reproducibility, no conclusions about the effect of irradiation could be made. The
third characteristic examined in this dissertation was the pathogenicity of the bacteria. A nonvertebrate animal model, Galleria mellonella, was used to look in vivo at the pathogenicity of
S. salivarius. Irradiation had a negative influence on this bacterial characteristic. Further
research is needed to elucidate the mechanism.
This dissertation concludes that further optimization and some new experiments are needed
to investigate the possible effect of irradiation on bacterial characteristics. This can lead to a
better insight on the development of oral mucositis and may contribute to a more efficient
treatment for this painful complication of radiotherapy.
.
IX
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
1. Literatuurstudie
1.1.
Orale mucositis ten gevolge van bestraling
1.1.1. Inleiding
Orale mucositis is een acute aandoening die vaak gerelateerd is aan chemotherapie en/of
een bestralingsbehandeling bij kankerpatiënten alsook aan hematopoëtische stamceltransplantatie (Scully et al., 2006). Deze masterproef focust op de ontwikkeling van
radiomucositis ten gevolge van een bestralingsbehandeling. Vooral patiënten waarbij de
kanker zich lokaliseert ter hoogte van het hoofd en de hals (mond, oropharynx, nasopharynx
en larynx) hebben een zeer grote kans op de ontwikkeling van orale mucositis. De oorzaak
hiervan is dat de bestraling gericht is op de orale regio (Duncan & Grant, 2003; Elting et al.,
2007; Scully et al., 2006; Shih et al., 2003; Trotti et al., 2003). Radiomucositis ontwikkelt zich
voornamelijk ter hoogte van oppervlakten met een snelle cel turnover. Om deze reden
worden voornamelijk de dorsale oppervlakte van de tong, het harde gehemelte en het
tandvlees aangetast (Dodd, 2004).
Er wordt intensief onderzoek verricht naar de ontwikkelingsgraad van orale mucositis bij
patiënten met hoofd- en halstumoren die stralingstherapie ondergaan, al dan niet met
aanvullende chemotherapie (Elting et al., 2007). Vele factoren beïnvloeden de ontwikkeling
van radiomucositis waaronder het bestralingsveld, de dosis en fractionering van de
behandeling. Algemeen varieert de incidentie van orale mucositis ten gevolge van een
bestralingsbehandeling tussen 50% en 96% (Delaney et al., 1995; Trotti, 2000; Vera-Llonch
et al., 2006). Altered fractionated bestralingstherapie (RT-AF) is een aangepaste vorm van
conventionele bestraling (RT-C). Bij RT-C wordt de totale benodigde stralingsdosis verdeeld
in kleine fracties, vaak 1.8 à 2Gy per fractie. Er wordt dagelijks een dosis gegeven, typisch
vijf dagen per week gedurende 6 à 7 weken. De fractionering zorgt ervoor dat er minder
acute bijwerkingen, zoals mucositis, kunnen optreden ten gevolge van hoge, toxische
dosissen (Bernier & Horiot, 2012; Marcu, 2010). Bij RT-AF worden deze fracties verkleind of
het aantal dagelijkse fracties per week verhoogd. Men spreekt dan respectievelijk van
hyperfractionering en versnelde fractionering. Bij hoofd- en halstumoren wordt versnelde
fractionering voornamelijk toegepast indien er geen bijkomende chemotherapie toegediend
wordt (Bernier & Horiot, 2012). Deze vorm van radiotherapie zorgt ervoor dat de tumorcel
repopulatie minder kans krijgt. De tumorcellen ontwikkelen zo minder snel resistentie tegen
bestraling, waarvan tumorcel repopulatie een van de belangrijke factoren is (Pajonk et al.,
2010). Versnelde fractionering bij hoofd- en halstumoren bestaat vaak uit 6 dagelijkse
dosissen per week (Marcu, 2010). Dit laatste fractioneringspatroon bleek voordelig te zijn
1
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
voor de behandeling van hoofd- en halstumoren (Overgaard et al., 2003). Zo wordt meer en
meer afgestapt van RT-C en wordt RT-AF de standaardbehandeling voor dit type tumoren.
Orale mucositis kan onderverdeeld worden in verschillende graden van ontwikkeling. Er
bestaan verschillende scoretabellen waarmee patiënten ingedeeld worden naar de ernst van
hun symptomen. De tabel opgesteld door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) en de
National Cancer Institute Common Toxicity Criteria (NCI-CTC) worden vaak gebruikt. De
WHO-tabel wordt onderverdeeld in vier graden (Figuur 1). In de eerste graad treedt
erythema en lichte pijn op. Bij de tweede graad ontstaan er ulceraties maar is orale inname
van vast voedsel nog mogelijk. In de derde graad nemen de ulceraties het hele orale,
mucosale oppervlakte in en is orale inname enkel nog mogelijk met vloeibaar voedsel. De
vierde graad wordt tenslotte gekenmerkt door ernstige bloedingen en orale inname van
voeding is niet meer mogelijk. Enterale of parenterale toediening is vereist en de
levenskwaliteit van de patiënt wordt sterk aangetast gedurende deze acute aandoening (Stiff,
2001; Trotti et al., 2003).
Figuur 1: Indeling orale mucositis volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). (Caphosol, n.d.)
Een literaire review van 33 studies (Trotti et al., 2003) heeft een aantal algemene cijfers
samengevat. De frequentie van mucositis was 100% bij patiënten die een RT-AF
ondergingen. Voor RT-C lag dit percentage tussen 90% en 97%. In het geval van RT-AF
ontwikkelden 57% van de patiënten een ernstige vorm van radiomucositis (graad 3-4). Bij
RT-C lag dit percentage iets lager, namelijk tussen 34% en 43%. Meer recente cijfers (2007)
toonden eenzelfde incidentieniveau aan. Bij de groep patiënten die een RT-AF ter hoogte
van hoofd en hals kregen, ontwikkelden 90% orale mucositis en 60% hiervan zelfs de
ernstige graad (graad 3-4 op CTC-schaal). Globale economische cijfers zijn niet terug te
vinden, maar een studie toonde aan dat orale mucositis zorgt voor een extra kost van $1700
tot $6000 voor de patiënt (Elting et al., 2007).
2
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Uit de voorgaande studies blijkt dus dat radiomucositis een niet te onderschatten probleem
is. De stralingsbehandeling dient zelfs in ernstige gevallen vroegtijdig onderbroken te worden
(Duncan & Grant, 2003; Elting et al., 2007). Dit leidt tot een minder efficiënte behandeling,
wat de genezing van de kankerpatiënt in het gedrang kan brengen. De patiënt kan
problemen ondervinden bij de voedselinname door het optreden van hyposalivatie, verlies
van smaak, verandering van de speekselviscositeit en het optreden van ernstige pijn tijdens
het kauwen en slikken (Vissink et al., 2003).
1.1.2. Risicofactoren
Orale mucositis is voornamelijk een probleem bij patiënten die een behandeling ondergaan
voor hoofd- en/of halstumoren. Afhankelijk van de behandeling zal er een grotere kans zijn
op de ontwikkeling van orale mucositis. Ook op de graad van orale mucositis heeft de keuze
van de behandeling een effect. Radiotherapie in combinatie met chemotherapie zorgt voor
een grotere incidentiegraad van radiomucositis (Raber-durlacher, 1999; Shih et al., 2003;
Trotti et al., 2003). Schade aan de mucosa blijkt al op te treden bij een dagelijkse
stralingsdosis van 200cGy (Shih et al., 2003). Bij een dagelijkse dosis van 2Gy kan de
patiënt erythema en pijnlijke irritatie ondervinden 1 à 2 weken na de start van de therapie. De
epitheliale schade kan 2 tot 4 weken na het stopzetten van de therapie aanhouden (Duncan
& Grant, 2003).
Orale hygiëne is een belangrijke factor voor het al dan niet ontwikkelen van orale mucositis.
Slechte orale hygiëne van de patiënt kan leiden tot het ontstaan van tandplak, mucosale
schade en ontstekingsreacties in de mond. Dit verhoogt de kans op de ontwikkeling van een
ernstige graad van orale mucositis bij chemo- of stralingstherapie (Duncan & Grant, 2003).
Het preventief toepassen van een mondverzorgingsprotocol bij een patiënt tijdens een
chemokuur bleek de kans op het ontwikkelen van orale mucositis te verminderen. Ook bleek
de ernst van deze acute bijwerking verminderd te zijn bij het goed onderhouden van de orale
hygiëne (Cheng et al., 2001).
Een mogelijke risicofactor is de nutritionele status van de patiënt. Een slechte voeding zou
kunnen leiden tot een grotere kans op de ontwikkeling van orale mucositis (Barasch &
Peterson, 2003; Raber-durlacher, 1999). Een eerste studie heeft ook aangetoond dat een
lage BMI een risicofactor kan zijn voor deze acute aandoening (Saito et al., 2012). De lage
BMI kan veroorzaakt worden door ondervoeding, wat vaak kan optreden bij kankerpatiënten
ten gevolge van de therapie (Keefe et al., 2007). De ontwikkeling van een acute aandoening
zou gelinkt kunnen zijn aan een slechte nutritionele status die de cellulaire migratie en
vernieuwing ter hoogte van het mucosale oppervlakte negatief kan beïnvloeden. Dit effect
3
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
zou een gevolg kunnen zijn van een tekort aan glutamine, wat een substraat is voor snel
delende cellen (Raber-durlacher, 1999).
Verder blijkt chemotherapie en bestraling neutropenie te kunnen veroorzaken. Neutropenie,
gelinkt aan een falende immuniteit, kan de ontwikkeling van radiomucositis bevorderen
(Duncan & Grant, 2003; McCarthy et al., 1998).
Tenslotte zijn er nog andere patiënt-gerelateerde risicofactoren waaronder de leeftijd van de
persoon en de endogene orale flora, waarbij dit laatste gerelateerd is aan de persoonlijke
hygiëne (Barasch & Peterson, 2003; Duncan & Grant, 2003). Echter dienen deze
risicofactoren nog verder onderzocht te worden aangezien hun effecten nog niet eenduidig
verklaard zijn.
1.1.3. Ontwikkelingsmodel
Sonis beschreef in 2004 een ontwikkelingsmodel voor orale mucositis dat tot op heden nog
steeds standhoudt. Het model beschrijft de pathobiologie van orale mucositis, onderverdeeld
in vijf fasen (Figuur 2).
Figuur 2: Het ontwikkelingsmodel voor orale mucositis volgens Sonis (2004). De vijf fasen worden in
deze figuur weergegeven, waarbij de eerste fase geïnitieerd wordt door bestraling of chemotherapie.
Fase twee en drie zorgen voor de productie van pro-inflammatoire cytokines. In de vierde fase kunnen
bacteriën doorheen het epithelium penetreren en zo in contact komen met ontstekingsmediatoren van
de gastheer. Tenslotte kan het epitheel spontaan herstellen in een laatste fase, wat het acute karakter
van orale mucositis weerspiegeld. (Lalla et al., 2008)
4
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
De eerste fase, i.e. de initiële fase, bestaat uit de vorming van reactieve zuurstofmoleculen
(ROS) als gevolg van bestraling of chemotherapie. Dit kan het epitheliaal DNA beschadigen.
In de tweede fase worden transcriptiefactoren geactiveerd door o.a. de gevormde ROS uit de
eerste fase. NF-κβ, één van deze transcriptiefactoren, beïnvloedt vele genen gerelateerd aan
mucositis. Hiertoe behoren genen coderend voor pro-inflammatoire cytokines en celadhesie
moleculen. Ook zullen bepaalde genen voor enzymen, waaronder ceramide synthase,
opgereguleerd worden wat leidt tot een verhoogde apoptose van de epitheelcellen. Een
volgende fase in de ontwikkeling van orale mucositis is de signaalamplificatie. Dit is een
gevolg van feedback systemen die een stimulerende invloed hebben op de schadevorming.
Zo is bijvoorbeeld tumor necrosis factor-alfa (TNFα), een pro-inflammatoir cytokine, een
stimulans voor de activiteit van NF-κβ. Hierdoor wordt de productie van cytokines nog verder
opgedreven. Tot hier toe zijn er nog geen erge symptomen waar te nemen bij de persoon.
Een vierde fase wordt de ulceratie genoemd. Deze fase wordt gekarakteriseerd door het
verlies van de mucuslaag en de epitheliale integriteit. Hierdoor kunnen orale bacteriën dieper
in de cellaag penetreren. Vervolgens kunnen orale bacteriën de door ulceratie vrijgekomen
cellaag koloniseren, toxinen produceren en macrofagen activeren tot de productie van proinflammatoire cytokines. In dit stadium komen de klinische symptomen op waaronder pijn en
ontsteking. Deze fase kan ook leiden tot het ontstaan van systemische infecties doordat de
ulceratie een toegang tot de bloedbaan biedt aan micro-organismen (Sonalika et al., 2012).
Een vijfde en laatste fase uit het model van Sonis (2004) is het spontane helingsproces. De
symptomen worden zwakker en verdwijnen uiteindelijk indien de heling correct verloopt.
De vijf fasen zijn niet absoluut qua tijd en locatie maar kunnen overlappen. Tijdens de
stralings- of chemokuur kan het ontwikkelingsproces geïnitieerd worden op verschillende
tijdstippen op verschillende plaatsen van de orale mucosa.
1.1.4. Nieuwe hypothese
Gedurende het laatste decennium heeft onderzoek geleidt tot een nieuwe hypothese in
verband met het ontstaan van radiomucositis (Sonis, 2010). Het ontstaan van acute orale
mucositis werd al beschreven in het model uit de vorige paragraaf waarbij twee factoren
belangrijk zijn, namelijk de ontwikkeling van ROS en de clonogene celdood. Dit laatste wordt
veroorzaakt door de beschadiging van het DNA, o.a. onder invloed van ROS, in de basale
epitheliale cellen (Sonis, 2004, 2009). Het lichaam zal vervolgens gebruik maken van zijn
verdedigingsmechanisme bestaande uit de herkenning van PAMP’s (pathogen-associated
molecular patterns) en DAMP’s (damage-associated molecular patterns) met behulp van
PRR’s (pattern recognition receptors). DAMP’s worden geproduceerd door de beschadigde
en apoptotische cellen (Sonis, 2010). De hypothese van Sonis (2010) beschrijft nu ook de
ontwikkeling van zogenoemde CRAMP’s, oftewel chemo- or radiotherapy-associated
5
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
molecular patterns. Dit zijn moleculen die vrijgesteld worden door cellen onder invloed van
chemo- of stralingstherapie. Een voorbeeld hiervan is HMGB1, wat passief vrijgesteld wordt
bij necrotische celdood. Het blijkt ook vrijgesteld te worden door apoptotische cellen onder
invloed van chemo- en stralingstherapie (Sonis, 2010). De vrijstelling hiervan zou de
epitheliale beschadiging in de hand kunnen werken na binding aan PRR’s (Sonis, 2010;
Srikrishna & Freeze, 2009). Nieuwe studies zullen het bestaan en eventuele effecten van
CRAMP’s moeten bevestigen.
1.2.
Orale microbiota
1.2.1. Orale omgeving
De mondholte bestaat uit drie types van oppervlakten, namelijk gekeratiniseerd (30%) en
niet-gekeratiniseerd epitheel (50%) alsook tandoppervlakten (20%) (Van de Wiele, 2012). De
samenstelling van de orale microbiota is complex en divers waarbij tot meer dan 300 soorten
werden geïsoleerd uit deze omgeving (Marcotte & Lavoie, 1998). De kolonisatie van het
tandoppervlakte is beter gekend en beschreven dan het mucosale oppervlak. De kolonisatie
van dit laatste is moeilijker door de snelle turnover van de epitheliale cellen (Van de Wiele,
2012). Ook speelt het secretorisch IgA (sIgA) hierin een rol waarbij de adhesie van microorganismen kan verhinderd worden en bepaalde enzymen geneutraliseerd worden (Marcotte
& Lavoie, 1998). Een belangrijk aspect van de bacteriële kolonisatie is de biofilmvorming,
wat in 1.3.1 verder besproken wordt.
1.2.2. Endogene orale microbiële gemeenschap
De endogene microbiota in de mondholte bestaat voornamelijk uit viridans streptococci.
Viridans streptococci kunnen in zes groepen onderverdeeld worden, op basis van 16S rRNA
sequenties (Figuur 3). De pyogenische groep bevat een aantal pathogene streptococci., o.a.
S. pyogenes. Andere species zijn o.a. S. salivarius en S. oralis die respectievelijk tot de
Salivarius en Mitis groep behoren (Nobbs et al., 2009).
Viridans streptococci zijn de pioniers in de biofilmvorming op zowel het mucosale als het
tandoppervlak en bedragen ongeveer 80% van de samenstelling van de immature biofilm
(Avila et al., 2009). Dit zorgt voor een basis waarop successieve kolonisatie van andere
species kan plaatsvinden (Van de Wiele, 2012). Bij pasgeborenen bestaat de orale
microbiota voor 90% uit streptococci en worden ook kleine hoeveelheden van lactobacilli en
Neisseria spp. teruggevonden (Pearce et al., 1995). Detectie van viable but non-culturable
(VBNC) species gaf echter nog een probleem in de studies. Recenter onderzoek naar de
orale microbiële gemeenschap heeft dit kunnen oplossen door de 454 pyrosequencing
techniek toe te passen (Avila et al., 2009). Met deze methode worden VBNC species wel
gedetecteerd. Echter een probleem bij deze techniek is dat sommige species te nauw
6
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
gerelateerd zijn aan elkaar om van elkaar onderscheiden te worden. Dit leidt ertoe dat
individuele species nog niet optimaal onderzocht kunnen worden (Avila et al., 2009).
Figuur 3: Onderverdeling van streptococci. Deze kunnen onderverdeeld worden in zes groepen.
Pathogene streptococci bevinden zich in de pyogenische groep, terwijl de pioniers in de
biofilmvorming zich voornamelijk in de Mitis-groep bevinden. S. salivarius bevindt zich in de Salivariusgroep. (Nobbs et al., 2009)
Tijdens het ouder worden verandert de endogene samenstelling waarbij er grote aandelen
van o.a. Fusobacterium nucleatum verschijnen. Deze bacterie speelt een belangrijke rol in
de vorming en stabilisatie van de biofilmen (Van de Wiele, 2012). Deze bacterie fungeert als
een fysiologische brug tussen verschillende species en helpt ook bij de overleving van
obligaat anaerobe micro-organismen in de aerobe mondholte (Kolenbrander, 2000). De
biofilm kan op tandoppervlakten enkele bacterielagen dik worden. Dit is tegengesteld aan de
kolonisatie van het zachte mucosale weefsel waarop voornamelijk een monolaag gevormd
wordt ten gevolge van o.a. de continue turnover van de mucosale cellen (Filoche et al., 2010;
Kolenbrander, 2000). Een voorstelling van de vorming van een biofilm is terug te vinden in
Figuur 4. Deze figuur geeft de situatie weer voor de ontwikkeling van een biofilm op het
tandoppervlak, maar dit kan de mucosale situatie verduidelijken waarbij de pionier bacteriën
uit hetzelfde genus afkomstig zijn.
7
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Figuur 4: Vorming van een orale biofilm aan het tandoppervlak. Onderaan zijn verschillende
adhesiesubstraten weergegeven, waaronder salivary agglutinin (i.e. gp-340). De eerste kolonisten
behoren tot de streptococci. Nummer 14 stelt Fusobacterium nucleatum voor en er valt op dat deze
aan verschillende species en genera kan binden. Zo wordt een soort van fysiologische brug gevormd.
Biofilmen kunnen een zeer grote diversiteit aan micro-organismen bevatten. (Kolenbrander et al.,
2010)
De capaciteit van biofilmen om ontstekingsreacties te initiëren of te bevorderen is nog niet
duidelijk. De aanwezigheid van biofilmen bij ontstekingsreacties is waargenomen maar een
relatie is nog niet bewezen (Dongari-Bagtzoglou, 2008). Ook is het effect van bestraling op
de microbiële samenstelling in de mondholte nog niet voldoende onderzocht en uitgeklaard.
Men heeft in vorige studies ontdekt dat bestraling kan leiden tot candidiasis, wat een
verhoging is van het aantal Candida spp. in de orale omgeving, met C. albicans als
predominante vorm (Jham et al., 2007; Ramirez-Amador et al., 1997; Sonalika et al., 2012).
Dit effect wordt ook groter naarmate de bestralingsperiode vordert (Jham et al., 2007).
Echter de rol van Candidas spp. in de ontwikkeling van orale mucositis, alsook van andere
micro-organismen, is tot nog toe niet ontrafeld.
1.3.
Celadhesie
1.3.1. Ontstaan biofilm
Zoals eerder vermeld ontstaat de biofilm vanuit de adhesie van viridans streptococci aan een
gastheeroppervlak. Dit begint met een eerste fase waarbij minder intense, dynamische
interacties tussen de bacterie en gastheer ontstaan. De lossere interacties worden
8
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
uitgevoerd met o.a. pili (Nobbs et al., 2009). Deze structuren kunnen enerzijds de mucuslaag
penetreren, wat de adhesie aan de onderliggende epitheliale laag vergemakkelijkt.
Anderzijds kunnen pili ook binden aan in het speeksel aanwezige glycoproteïnen (gp-340),
wat leidt tot de verwijdering uit de mondholte. Zo wordt de bacterie een slachtoffer van één
van de verdedigingsmechanismen van de gastheer (Edwards et al., 2008).
Door expressie van meerdere adhesiemoleculen (adhesinen) op de celwand van een microorganisme kunnen in een tweede fase meervoudige, intensere bindingen worden aangegaan
met receptoren aanwezig op de gastheercellen (Nobbs et al., 2009; Van de Wiele, 2012).
Hieruit kunnen microkolonies gevormd worden waarin quorum sensing een belangrijke rol
speelt in de onderlinge communicatie. Een universele molecule dat zorgt voor onderlinge
communicatie is AI-2, wat bij picomolaire concentratie al een efficiënte werking heeft
(Kolenbrander et al., 2010). Doordat F. Nucleatum coaggregatie stimuleert en een
fysiologische brug vormt tussen verschillende species zal deze kunnen bijdragen tot het
vormen van een stabiele biofilm (He et al., 2012; Nobbs et al., 2009; Van de Wiele, 2012).
F. nucleatum bleek in onderzoek met verschillende bacteriesoorten te interageren. Echter is
deze waarneming afkomstig van studies zonder gebruik van complexe bacteriële
ecosystemen zoals biofilmen. Er is vervolgens nog weinig geweten over het effect van
interacties afkomstig van verschillende bacteriesoorten op hetzelfde tijdstip in complexe,
orale biosystemen (He et al., 2012).
Er werden studies uitgevoerd naar de membraanmoleculen van F. nucleatum om de vele
interactiepartners te kunnen verklaren. Interacties tussen bacteriële species komen vaak tot
stand door de binding van een lectine adhesine met een compatibele suikergroep (Wright et
al., 2013). Er zijn twee groepen adhesines ontdekt bij F. nucleatum, namelijk galactosegeïnhibeerde en arginine-geïnhibeerde adhesines. Deze zorgen voornamelijk voor de
interactie met respectievelijk Gram-negatieve late aanhechters en Gram-positieve vroege
aanhechters (Kaplan et al., 2009). Moleculair onderzoek naar deze moleculen ontbreekt
echter nog, al is er wel onderzoek naar een arginine-geïnhibeerde adhesine (RadD)
uitgevoerd geweest (Kaplan et al., 2009).
1.3.2. Adhesines Streptococcus species
Viridans streptococci zijn de pioniers in de kolonisatie van de mondholte en hun adhesie aan
de epitheelcellen is van uitermate belang voor de adhesie van andere micro-organismen,
waaronder pathogene species. Om te kunnen adheren aan oppervlakten bevatten viridans
streptococci
oppervlaktemoleculen
(adhesinen)
die
herkend
kunnen
worden
door
gastheerreceptoren. Adhesinen voor de viridans streptococci zijn welgekend en beschreven.
Verschillende
gastheeroppervlakten
bevatten
9
verschillende
receptoren,
voornamelijk
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
glycoproteïnen, op de celmembranen waardoor bepaalde species beter adheren aan deze
oppervlakten dan andere bacteriespecies. Micro-organismen hebben ook meerdere
adhesinetypes op hun celwand waardoor adhesie versterkt wordt door meervoudige
bindingen aan de gastheerreceptoren (Nobbs et al., 2009). De grote verscheidenheid in
adhesinen op de bacteriële celwanden tussen verschillende species leidt tot een specifieker
spectrum van aanhechtingssubstraten per bacteriesoort. Ook intraspecies diversiteit aan
adhesinemoleculen kan optreden waardoor de aanhechting tussen bacteriële stammen kan
variëren. De diversiteit ontstaat door het optreden van horizontale gentransfer tussen
bacteriën die zich op een kleine afstand van elkaar bevinden (Kolenbrander et al., 2010).
Een eerste groep adhesinemoleculen die ontdekt werd, zijn de antigeen I/II (AgI/II)
adhesinen. AgII is een afbraakproduct van AgI. De degradatie van AgI tot AgII alsook het
verschil in expressie van beide types kan leiden tot een ander aanhechtingsdoelwit. Zo
kunnen bepaalde bacteriële species beter aanhechten aan een specifiek gastheeroppervlak
dan andere species (Nobbs et al., 2009). Deze groep adhesinen kunnen net als de pili
binden aan gp-340, wat aanwezig is in het speeksel. Deze binding kan leiden tot de
verwijdering van het micro-organisme uit de mond. De interactie met gp-340 werd
waargenomen bij orale S. mutans (Prakobphol et al., 2000).
Naast AgI/II zijn ook andere celwandproteïnen beschreven waaronder Ig- en fibronectinebindende proteïnen (Mcnab et al., 1996; Nobbs et al., 2009). Streptococci spp. secreteren
ook adhesinen, zonder verankering in hun celwand. Deze hebben een enzymatische functie,
o.a. het degraderen van bepaalde extracellulaire matrix (ECM) proteïnen. Zo kunnen
potentiële adhesieplaatsen aan de gastheer bloot gesteld worden. Het is ook mogelijk dat ze
dienen als ‘verkennermoleculen’. Ze zouden kunnen binden aan bepaalde ECM
componenten en vervolgens als een complex met de bacterie interageren. Hierdoor verkrijgt
de bacterie een al dan niet gunstig signaal om op die plek aan te hechten (Nobbs et al.,
2009). Dit laatste dient nog verder onderzocht te worden.
1.3.3. Hydrofobiciteit en adhesie
Naast de specifieke interacties tussen bacteriële adhesines en gastheer receptoren kunnen
ook niet-specifieke interacties helpen bij de aanhechting van bacteriën. Hydrofobiciteit kan
een rol spelen in de adhesiecapaciteit van bacteriën aan bepaalde oppervlakten (Hahnel et
al., 2010; Van de Wiele, 2012). In vitro testen hebben een significante correlatie aangetoond
tussen de hydrofobiciteit van het aanhechtingssubstraat en de adhesiecapaciteit van
bacteriën. Deze testen werden uitgevoerd met substraten bestaande uit metaallegeringen.
Daaruit bleek dat hydrofobe bacteriën beter adheren aan hydrofobe oppervlakten in
tegenstelling tot hydrofiele bacteriën (Grivet et al., 2000). Hydrofobe interacties kunnen de
10
De boel Kevin
initiële
repulsieve
Masterproef 2012-2013
elektrostatische
krachten
tussen
de
bacteriële
cel
en
het
gastheeroppervlak overbruggen. Dit komt doordat deze in waterig milieu, zoals de met
speeksel bedekte orale mucosa, sterker zijn dan Van der Waals krachten. Zo zouden ze de
adhesie van bacteriën kunnen bevorderen. Al moet voorzichtig omgesprongen worden met
de rol van hydrofobiciteit op de bacteriële adhesiecapaciteit. Er bleek dat vele bacteriën geen
moeite hebben om zowel aan hydrofobe als hydrofiele oppervlakten aan te hechten
(McLandsborough et al., 2006). Er is verder onderzoek nodig naar de relatie tussen de
hydrofobiciteit en de adhesiecapaciteit van bacteriële species.
1.4.
Pathogeniciteit
Een tweede luik in deze masterproef bestaat uit het testen van de pathogeniciteit van
bacteriën. Het menselijk afweersysteem bestaat uit twee delen: de aangeboren en
verworven immuunrespons. Om de pathogeniciteit van micro-organismen te onderzoeken
zijn in vivo testen nodig. Er zijn echter belangrijke nadelen aan experimenten met
gewervelde proefdieren en -personen. Ze zijn tijdrovend, duur en het negatieve ethische
aspect speelt een grote rol. Er zijn daarom in de huidige wetenschap een aantal alternatieve
in vivo modellen beschikbaar waarvan het immuunsysteem vergelijkbaar is met het
menselijke aangeboren afweersysteem (Fuchs & Mylonakis, 2006).
1.4.1. Ongewervelde diermodellen
Fuchs & Mylonakis hebben in 2006 vijf mogelijke modellen besproken. Twee veel gebruikte
niet-vertebrate diermodellen voor onderzoek naar bacteriële en fungale pathogenese zijn
Drosophila melanogaster en Caenorhabditis elegans. Beide hebben het voordeel dat de
volledige genoomsequentie gekend is. D. melanogaster heeft een Toll-pathway die sterk lijkt
op de pathway met gelijkaardige eiwitten bij zoogdieren, de zogenaamde Toll-like receptoren
(TLRs) (Van Rompay, 2012a). C. elegans bevat de TIR-pathway (Toll/Interleukine 1
receptor), eveneens bij zoogdieren terug te vinden. De fruitvlieg, D. melanogaster, heeft
meerdere infectiemogelijkheden die gebruikt kunnen worden in experimenten. Dit kan
bijvoorbeeld door het injecteren van het inoculum of het bespuiten van de fruitvliegen. De
voeding kan ook gebruikt worden om D. melanogaster te infecteren.
Naast D. melanogaster en C. elegans hebben Fuchs en Mylonakis (2006) ook twee
amboebemodellen beschreven, namelijk Acanthamoeba castellanii en Dictyostelium
discoideum. Beide hebben een fagocytose-gebaseerd immuunsysteem. Een laatste model
besproken in dit artikel is Galleria mellonella. De larve van G. mellonella is een vaak gebruikt
model voor het testen van de pathogeniciteit van bacteriële species. Dit wordt in een
volgende paragraaf verder verduidelijkt.
11
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
1.4.2. Het Galleria mellonella model
G. mellonella, in de volksmond de grote wasmot genoemd, is een goed verkenningsmodel
voor het testen van de pathogeniciteit van bacteriën bij de mens. De larve van deze mot
heeft een aantal belangrijke gelijkenissen met het humane systeem. G. mellonella heeft een
groeioptimum bij 37°C, de gemiddelde menselijke lichaams-temperatuur, en kan tevens bij
kamertemperatuur bewaard worden zonder de verpopping in gang te zetten (NavarroVelasco et al., 2011). G. mellonella is eenvoudig te inoculeren met behulp van topicale
toediening of injectie. Orale toediening via voeding is eveneens mogelijk maar de beperking
hierbij is dat het aantal opgenomen micro-organismen niet exact te bepalen is (Fuchs &
Mylonakis, 2006; Lionakis, 2011). Deze larve heeft een gelijkaardig immuunsysteem aan het
aangeboren deel bij de mens. De immuunrespons van G. mellonella is een complex systeem
bestaande uit de coagulatie van hemolymfe, fenol oxidase-gebaseerde melanisatie en
cellulaire fagocytose. De gelijkenis met het humane systeem is terug te vinden bij het
afdoden van de pathogenen m.b.v. enzymen, reactieve zuurstofmoleculen en antimicrobiële
peptiden (Mukherjee et al., 2010). De hemolymfe van G. mellonella bevat een zestal
hemocyten. Deze hemocyten bevatten immunologisch gelijkaardige proteïnen aan humane
neutrofielen, wat aangetoond werd met western blot en immunoprecipitatie. Ze vervullen net
als de neutrofielen een fagocyterende functie (Bergin et al., 2005). Het injecteren van een
bacterieel inoculum in het hemocoel van de larve kan de werking van de hemocyten
stimuleren (Fedhila et al., 2006). De pathogeniciteit kan getest worden door het tellen van de
hoeveelheid aanwezige hemocyten of door de overleving van de larven op te volgen (Fuchs
& Mylonakis, 2006).
Het G. mellonella model heeft als nadeel dat het humane adaptieve immuunrespons, wat
belangrijk is bij de mens, niet getest kan worden. Hierdoor kunnen de pathogeniciteitsexperimenten met dit model enkel dienen als verkennende testen. Er kunnen geen sluitende
conclusies getrokken worden over de pathogeniciteit van de bacteriële species op het
humane systeem (Navarro-Velasco et al., 2011).
Indien er te hoge concentraties geïnoculeerd worden geven ook niet-pathogene bacteriën
aanleiding tot septische sterfte bij G. mellonella larven. Een injectie vanaf 107 kolonievormende eenheden (kve) per larve kan dit veroorzaken. Dit effect komt waarschijnlijk door
“de macht van het getal” waardoor het immuunsysteem te hard gestimuleerd wordt via
herkenning van PAMP’s (Mukherjee et al., 2010).
12
De boel Kevin
1.5.
Masterproef 2012-2013
Doelstelling masterproef
In deze masterproef worden drie luiken onderzocht met drie bacteriesoorten. Streptococcus
salivarius en Lactobacillus salivarius behoren beide tot de endogene, orale microbiota (Avila
et al., 2009; Nelun Barfod et al., 2011; Pearce et al., 1995). Een derde bacteriesoort,
Klebsiella oxytoca, wordt onderzocht vanwege zijn pathogene karakter (Kim et al., 2002;
Podschun & Ullmann, 1998). Het eerste luik van dit proefschrift tracht meer te weten te
komen over het effect van bestraling op de adhesiecapaciteit van orale bacteriën. Hiervoor
wordt gebruik gemaakt van in vitro proeven met een epitheliale TR146 cellijn. De
experimenten dienen eerst geoptimaliseerd te worden. Een tweede deel van deze thesis
onderzoekt de pathogeniciteit van orale bacteriën en welke invloed bestraling hierop heeft.
Dit wordt in vivo getest met Galleria mellonella larven. Een laatste luik onderzoekt de
hydrofobiciteit van de celwanden van verschillende bacteriesoorten en kijkt naar de
eventuele link met de adhesiecapaciteit.
13
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
2. Materiaal en methode
2.1.
Gebruikte bacteriesoorten en bijhorende groeiculturen
2.1.1. Bacteriesoorten en groeimedia
Streptococcus salivarius (LMG 11489T,BCCMTM) werd opgegroeid op een petriplaat met
Brain Heart Infusion (BHI)-agar (Sigma-Aldrich) in een incubator (Revco Ultima) op 37°C.
Deze reincultuur werd gemaakt vanuit een stock (zie 2.1.2) door enting met een entnaald,
bijvoorbeeld aan de hand van de vijfhoekenting (zie Figuur 5). Na overnacht incubatie op
37°C kon de plaat bewaard worden in de ijskast (4°C).
Vanuit de reincultuur (agarplaat) werd een vloeibare bacteriecultuur gemaakt door het
oppikken van een kolonie met de entnaald en het overbrengen hiervan in 5mL BHI. Dit werd
geïncubeerd bij 37°C waarbij de incubatieduur afhankelijk was van het experiment.
Figuur 5: De vijfhoekenting.
Klebsiella oxytoca (LMG 3055T,BCCMTM) werd eveneens opgegroeid op BHI-agar zoals
hierboven beschreven.
Lactobacillus salivarius (LMG 9477T,BCCMTM) werd opgegroeid op een petriplaat met MRSagar (Sigma-Aldrich) bij 37°C. Een reincultuur en vloeibare suspensie konden gemaakt
worden met dezelfde methode als S. salivarius en K. oxytoca. Belangrijk te vermelden is dat
L. salivarius de bewaring bij 4°C niet overleefde waardoor er steeds gebruik gemaakt werd
van verse reinculturen uit de incubator om een vloeibare cultuur te maken.
2.1.2. Aanmaak stock bacteriën
Er werd een 1:1-verdunning gemaakt van de bacteriesuspensie (2.1.1) met 50% glycerol
(Vel) verdund in gedestilleerd water. Dit werd vervolgens bewaard bij -80°C.
14
De boel Kevin
2.2.
Masterproef 2012-2013
Gebruikte cellijn
In deze masterproef werd gebruik gemaakt van de TR146 cellijn (Clare Hall Laboratories,
Cancer
Research
U.K.).
Dit
is
een
humane
epitheliale
cellijn
afkomstig
van
plaveiselcelcarcinoom ter hoogte van de hoofd- en halsregio. De cellen zijn geïsoleerd uit
een lymfekliermetastase (Rupniak et al., 1985). TR146 heeft Dulbecco's Modified Eagle
Medium, DMEM (Gibco), als groeimedium nodig met een extra toevoeging van hittegeïnactiveerde 10% (v/v), foetaal kalfsserum (FBS, Greiner bio-one), 0.05% (w/v)
L-glutamine (Gibco), 100µg mL-1 Streptomycine (Gibco), 250IU mL-1 Penicilline (Gibco) en
Amphotericine B (Bristol-MyersSquibb).
Vanuit een moedercultuur (-80°C) werd een dochtercultuur opgestart en opgegroeid in 25cm²
en 75cm² cultuurflessen (Sarstedt) in de incubator (Binder) met verzadigde atmosfeer bij
37°C en 10% CO2.
2.3.
Pathogeniciteitstesten
Met deze test werd onderzocht of bestraling al dan niet een invloed heeft op de
pathogeniciteit van S. salivarius. Er werd gebruik gemaakt van Galleria mellonella larven (De
Papegaai, Sint-Niklaas). Deze werden tot vier dagen na de levering gewaard op
kamertemperatuur alvorens te test te starten.
2.3.1. Injectiemethode
Een vloeibare, bacteriële cultuur (5mL) van S. salivarius werd aangemaakt zoals beschreven
in 2.1 en overnacht opgegroeid in de incubator (37°C). Vervolgens werd de cultuur driemaal
gewassen met een equivalent volume fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder Ca2+ en Mg2+
(PBSD-) en telkens gecentrifugeerd (ALC® Centrifuge PK120) bij 2205g voor 10 minuten tot
er een pellet gevormd werd. De pellet werd na de laatste wasstap gesuspendeerd in 5mL
PBSD-. Hiervan werd per larve 20µL intrahemocoel geïnjecteerd ter hoogte van de
linkerachterpoot. Tijdens de test werden de larven bewaard bij 37°C. De larven werden
gedurende drie dagen opgevolgd en er werd een score toegekend aan elke larve (2.3.2). De
inoculumconcentratie werd bepaald met behulp van uitplatingen op BHI-agarplaten.
2.3.2. Scoretabel
Aan elke larve werd dagelijks een score toegekend. Hiervoor werden ze individueel
onderzocht en beoordeeld. De individuele scores werden per behandelingsgroep opgeteld
om een score per groep te bekomen. De opvolging gebeurde tot vier dagen na de injectie. Er
werd een score toegekend op basis van verschillende parameters:
15
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
-
Melanisatie: niet verkleurd, kleine vlekken, grote vlekken, volledig verkleurd
-
Mobiliteit: niet beweeglijk, minimale beweging na stimulatie, beweging na stimulatie,
beweging zonder stimulatie
-
Post-mobiliteit: al dan niet bewegend een minuut na de stimulatie
-
Levend/dood: aantal overlevenden op de verschillende tijdstippen
-
Cocon vorming: geen cocon, beginnende coconvorming, partiële coconvorming,
volledige cocon (Figuur 6)
De gebruikte scoretabel is terug te vinden in de bijlagen (8.1). Zodra de larve zich tot een
cocon had omgevormd, werden de andere parameters niet meer beschouwd.
Figuur 6: Verpoppende Galleria mellonella larven. Rechts en links werden respectievelijk als
’beginnende coconvorming’ en ‘partiële coconvorming’ waargenomen bij de opvolging van de
pathogeniciteit, beschreven in 2.3.2. Beginnende coconvorming werd waargenomen als de larve niet
meer rondkroop en de pootjes aan de kopstreek naar elkaar toe gingen samentrekken. Als er een
extra vlies rond de kopstreek ontstond en enkel het achterlijf nog kon bewegen werd deze als een
partiële cocon een score toegekend.
2.3.3. Onderzochte behandelingen en condities
De stralingsdosis bedroeg 10Gy (X-stralen, lineaire versneller) en werd eenmaal toegediend
aan de bacteriële cultuur alvorens deze werd ingespoten. Per groep werden 8 tot 10 larven
gebruikt per test. Verschillende groepen werden onderzocht:
-
Levende bacteriën:
Hier werd het eerder beschreven protocol (2.3.1) gevolgd.
-
Gefixeerde bacteriën:
Hier werd het eerder beschreven protocol gevolgd tot aan de laatste wasstap. Na de
laatste wasstap, vlak voor de injectie, werden de bacteriën gefixeerd met methanol
(Novolab). De bacteriën werden gesuspendeerd in 5mL methanol en 10 minuten op
ijs gezet. Vervolgens werden ze gecentrifugeerd (2205g, 10 minuten, ALC®
Centrifuge PK120) en eenmaal nagewassen met PBSD-. Dit werd tenslotte
ingespoten na het suspenderen in 5 mL PBSD-, conform het eerder beschreven
protocol (2.3.1).
16
De boel Kevin
-
Masterproef 2012-2013
Supernatans:
De overnacht opgegroeide bacteriële monocultuur werd eenmaal gecentrifugeerd
(2205g, 10 minuten, ALC® centrifuge PK120 ) en 20µL supernatans werd ingespoten
in de larve vier uur na bestraling van de bacteriecultuur (10Gy).
-
Controlelarven:
Als controle voor de groepen levende en gefixeerde bacteriën werden de
controlelarven ingespoten met 20µL PBSD-. Voor de groep larven ingespoten met
supernatans werden de controlelarven geïnjecteerd met 20µL BHI.
2.3.4. DNA extractie, DNA opzuivering en PCR
Er werd getracht het DNA te extraheren van de aangehechte bacteriën ter hoogte van het
hemocoel en de aanwezigheid hiervan te analyseren met een agarosegel.
2.3.4.1.
Isolatie van de aangehechte bacteriën
De larve werd ondergedompeld in 70% ethanol (Chem-lab NV) om het oppervlakte te
steriliseren waarna ze ventraal opengesneden werd van de achterzijde naar de kopstreek
toe. De larve werd driemaal gewassen door deze onder te dompelen in drie verschillende
PBSD--baden. Hierdoor werden de niet-geadheerde bacteriën en andere onzuiverheden
verwijderd uit het hemocoel. De larve werd samen met 1mL 0.5% Triton X-100 (Bio-rad
Laboratories Inc) 1 minuut gevortext en 5 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur om de
geadheerde bacteriën in het hemocoel los te maken. De larve werd verwijderd, het staal
gecentrifugeerd op 12100g gedurende 5 minuten (Eppendorf Mini Spin) en de pellet tenslotte
gesuspendeerd in 500µL PBSD-. Hier was een mogelijkheid tot invriezen (-20°C).
2.3.4.2.
DNA extractie en opzuivering
Voor de DNA extractie werd 500µL Tris-HCL (10mM op pH 9, Duchefa Biochemie)
toegevoegd aan het staal, het geheel goed gemengd en 20µL lysozymeoplossing (50mg mL1
in Tris-HCL, Amresco®) toegevoegd. Dit werd 10 minuten op de schudder geplaatst (37°C,
250rpm). Er werd 37.5µL SDS (20% v/v in gedestilleerd water, Fisher Scientific) toegevoegd
en 5 minuten traag handmatig gemengd. In de trekkast werd 500µL chloroformisoamylalcohol (24:1, Merck) toegevoegd en handmatig gemengd tot een melkachtige,
homogene oplossing ontstond. Na 5 minuten centrifugeren (Eppendorf Centrifuge 5417C) bij
4°C op 7000g werd de waterige fase overgebracht naar een nieuw eppendorfbuisje. Hierbij
werd een volume 100% isopropanol (Boom BV) toegevoegd, equivalent aan 0.8 keer het
staalvolume. Na handmatig mengen werd het DNA gedurende minimum 1 uur geprecipiteerd
bij -20°C. Vervolgens werd het staal gecentrifugeerd (Eppendorf Centrifuge 5417C) op
7000g bij 4°C gedurende 15 minuten. De pellet werd gedroogd door het afnemen van het
supernatans en 10 minuten omgekeerd op papier te laten uitlekken. Er werd 250µL
17
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
RNase-vrij gedestilleerd water (Sigma-Aldrich) toegevoegd aan de droge pellet. Hier was
tevens een mogelijkheid tot invriezen bij -20°C.
2.3.4.3.
PCR en analyse
De mastermix voor PCR analyse bestaat voor 20 reacties uit 50µL Extaqbuffer (10x), 20µL
Fw-primer, 20µL Rv-primer, 40µL dNTP’s, 2.5µL Extaq enzyme en 347.5µL RNase vrij
gedestilleerd water. De primers werden toegevoegd met een concentratie van 0.1nmol µL-1.
Alle componenten zijn afkomstig van TaKaRa Ex TaqTM (TaKaRa Bio Inc.), uitgezonderd de
primers. Per PCR staal werd 1µL DNA staal samengevoegd met 24µL mastermatrix.
Voor de Streptococcus salivarius-specifieke PCR reactie werden Ssa442F (5’-AAC GTT
GAC CTT ACG CTA GC-3’, Biolegio BV) als Fw-primer en Ssa2712R (5’-GAT TCT GTC
AAA AGG GCC AC-3’, Biolegio BV) als Rv-primer gebruikt (Igarashi et al., 2001).
Voor de PCR, uitgevoerd met de Thermocycler (Biometra, Wetsburg), werd gebruik gemaakt
van het volgende temperatuursprofiel: 1 minuut bij 94°C, 26 cycli bestaande uit 1 minuut bij
94°C, 1 minuut bij 55°C en 1 minuut bij 72°C en een slotfase van 5 minuten bij 72°C
(Igarashi et al., 2001).
Om na te kijken of de PCR reactie gelukt was, werd een analyse uitgevoerd op een 1%
agarosegel. De gel werd gemaakt door 1.25g UltrapureTM agarose (Invitrogen) op te lossen
in 125mL Tris/boraat/EDTA (TBE)-buffer (1X). Deze suspensie werd 3 minuten opgekookt.
Na kort schudden werd dit nog een extra minuut opgekookt. Vervolgens werd deze
suspensie gestold voor minimum 30 minuten tot een gel bekomen werd.
Er werd 2µL PCR-staal samengevoegd met 2µL ladingsbuffer. De ladingsbuffer bestond uit
0.05g broomfenolblauw (Fluka-Buchs) opgelost in 1mL RNase-vrij gedestilleerd water samen
met 1mL glycerol. Het totaal volume van 4µL werd geladen op de agarosegel nadat de gel
was ondergedompeld in TBE-buffer (1x). Nadat gedurende 45 minuten een spanning van
135 mV op de gel werd aangelegd werd de gel 30 minuten in een GelRed-bad gelegd. Het
GelRed-bad bestond uit 300mL TBE-buffer (1x) en 100µL GelRedTM (Biotium). Tenslotte
werd een foto genomen van de gel met UV-licht (GeneFlash, Westburg).
2.4.
Adhesietesten
In dit luik werd de invloed van bestraling getest op de aanhechting van bacteriën op cellen of
agarmucine. In dit hoofdstuk worden de testen meer algemeen beschreven en wordt dit
onderdeel beëindigd met het meest optimale protocol. Het algemene protocol is gebaseerd
op het onderzoek van Van den Abbeele et al. (2009) en Grootaert et al. (2011). Het proces
18
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
van protocoloptimalisatie wordt beschreven in het hoofdstuk Resultaten (3.2) met de
bijhorende aanpassingen aan het algemene protocol.
2.4.1. Voorbereiding 6-well plaat
De adhesietesten werden uitgevoerd in 6-well platen. Voor de celadhesietest werd gebruik
gemaakt
van
een
confluente
monolaag
van
TR146
cellen
(2.2).
Door
400 000 cellen in een well te brengen werd er na 3 dagen een confluente laag gevormd en
kon de adhesietest gestart worden.
Voor de mucineadhesietest werd gebruik gemaakt van mucineagar. Dit bestond uit 5%
mucine (varkensmaag, type III, Sigma-Aldrich) en 2% BactoTM agar (BD) , opgelost in
gedestilleerd water. Mucineagar werd de dag voor de adhesietest aangemaakt. Er werd vlak
na het autoclaveren van deze suspensie 3mL per well uitgegoten, 18 à 19 uur voor de start
van de test. De 6-well plaat werd vervolgens bij 4°C geplaatst om te laten stollen.
2.4.2. Algemeen protocol
Er werd per well een bacteriële cultuur voorzien en overnacht (18 à 19 uur) opgegroeid,
zoals beschreven in 2.1. De bacteriële suspensie werd eenmaal bestraald met een
stralingsdosis van 10Gy (X-stralen, lineaire versneller) vlak voor de start van de adhesietest.
De bacterieculturen werden vervolgens gecentrifugeerd (2205g, 10 minuten, ALC®
Centrifuge PK120) en de pellet werd driemaal gewassen met PBSD-. Na de laatste wasstap
werd de pellet gesuspendeerd in 3mL DMEM. Hiervan werd 2mL op de cellen of mucineagar
gebracht en de 6-wellplaat werd 2 uur bij 37°C op de schudder (50rpm) geplaatst. Na de
incubatie werden de niet-aangehechte en aangehechte bacteriën apart gecollecteerd.
Een negatieve controle werd uitgevoerd door 2mL DMEM op de cellaag of mucineagar in de
well te brengen in plaats van een bacteriesuspensie. Het verdere verloop van het protocol
verliep conform de vorige paragraaf.
2.4.3. Protocoloptimalisatie
2.4.3.1.
Aangepaste parameters van het algemene protocol
Dit proefschrift heeft geprobeerd een optimaal protocol te bekomen voor de adhesietesten.
Hierbij werden een aantal parameters aangepast en uitgetest:
1) Bacteriesoort:
De oorspronkelijke testen werden uitgevoerd met S. salivarius. Naar het einde toe
werden de adhesietesten uitgevoerd met K. oxytoca.
19
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
2) Agarmucine
Het volume agarmucine per well en het percentage van de agar werden verhoogd bij
de latere testen.
3) Losmaken van de aangehechte bacteriën:
Er werden drie mogelijkheden getest, namelijk het incuberen van de wells op de
schudder bij kamertemperatuur met Triton X-100 of met deoxycholaat (Janssen
Chimica) of het afschrapen van de cellen en de mucinelaag (de ‘schraapmethode’).
De behandeling met Triton X-100 werd getest met verschillende concentraties. De
incubatieduur met de twee oppervlakte-actieve stoffen werd ook aangepast alsook de
schudsnelheid van de schudder.
4) Telling van de niet-aangehechte en aangehechte bacteriën:
Twee technieken werden uitgetest om het aantal bacteriën te tellen, namelijk de
uitplatingstechniek en flow cytometer.
2.4.3.2.
Beide
Viabiliteitstest K. oxytoca en S. salivarius met uitplatingstechniek
bacteriesoorten
werden
getest
naar
hun
viabiliteit
na
incubatie
met
®
een filtersteriele (0.2µm, Whatman ) oplossing van Triton X-100 of deoxycholaat in PBSD-.
Voor Triton X-100 werden de concentraties 0.7% en 1.0% uitgetest en voor deoxycholaat
werd een concentratie van 0.1% gebruikt. Drie overnachtte culturen per bacteriesoort (2.1)
werden samengevoegd en verdeeld over eppendorftubes met een volume van 1mL per tube.
Per geteste conditie werd een tube bereid. De tubes werden gecentrifugeerd op 2247g
gedurende 5 minuten (Eppendorf Centrifuge 5417R). De pellets werden gesuspendeerd in
1mL 0.7% of 1.0% Triton X-100 of 1mL 0.1% deoxycholaatoplossing. De incubatieperiode
voor de vier condities bedroeg 15 minuten en 30 minuten. Na een incubatieperiode van 15
minuten werd 0.5mL vanuit elk eppendorfbuisje overgebracht naar een nieuw buisje en
opnieuw gecentrifugeerd op 2247g gedurende 5 minuten (Eppendorf Centrifuge 5417R). De
pellets werden gesuspendeerd in 1mL PBSD-. Na een incubatieperiode van 30 minuten
werden de overgebleven volumes (eveneens 0.5mL) gecentrifugeerd op 2247g gedurende 5
minuten
(Eppendorf
Centrifuge
5417R)
en
gesuspendeerd
in
1mL
PBSD-.
De
gesuspendeerde pellets werden vervolgens uitgeplaat op BHI-agarplaten en na overnachtte
incubatie (37°C) geteld.
2.4.3.3.
Viabiliteitstest K. oxytoca en S. salivarius met flow cytometer
De test met de flow cytometer werd uitgevoerd om de afdodingsgraad van de bacteriën door
Triton X-100 of deoxycholaat te testen alsook de betrouwbaarheid van de uitplatingen. Het
protocol verloopt conform de viabiliteitstest met uitplatingen (2.4.3.2) mits kleine
aanpassingen. Er werd een extra conditie getest, namelijk 0.2% Triton X-100. Voor elke
conditie werden twee eppendorftubes voorzien om in dubbel te kunnen analyseren.
20
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
De pellets bekomen na een incubatie periode van 15 en 30 minuten werden gesuspendeerd
in 1mL gefilterd (0.2µm) Evian water. Deze stalen werden voorbereid voor de analyse met de
flow cytometer. Elk staal werd 100 maal verdund en de volgende volumes worden
samengevoegd in een well van een 96well-plaat om te analyseren: 2µL staal, 198µL gefilterd
(0.2µm) Evian water, 2µL live/dead staining bestaande uit SYBR Green I (SYBR Green I
nucleic acid gel stain 10000x, Invitrogen) en propidium jodide (Propidium iodide FluorPure
Grade, Invitrogen) en 1µL EDTA. SYBR Green I werd 100 keer verdund in DMSO en
propidium jodide werd 50 maal verdund vanuit een stockoplossing met een concentratie van
20mM in DMSO. De analyse werd uitgevoerd op Accuri™ C6 (BD).
2.4.3.4.
DAPI kleuring
De efficiëntie van de behandeling met Triton X-100 van de verwijdering van de aangehechte
bacteriën werd nagegaan met een DAPI kleuring. Drie concentraties van een Triton X-100
oplossing in PBSD- werden getest, namelijk 0.7%, 1.0% en 1.5%. De celadhesietest werd
uitgevoerd in 24well-platen conform de test in een 6-well plaat (zie 2.4.2). Het toegevoegde
volume bacteriesuspensie per well werd aangepast naar 0.7mL. Na de incubatie van de
cellaag met 0.4mL Triton X-100 (30 minuten, kamertemperatuur, 150rpm) werden de
wellbodems verwijderd uit de plaat en gefixeerd in ijskoude methanol gedurende 10 minuten.
Vervolgens werd 2mL DAPI-kleurstof (0.4µg mL-1) per wellbodem toegediend nadat deze
een aantal minuten had kunnen drogen. Na 15 minuten werden de wellbodems tweemaal
gewassen met PBSD-. Tenslotte werden de wellbodems met een druppel glycerol op een
draagglaasje vastgemaakt om te analyseren met de fluorescentiemicroscoop (Leitz Dialux
20).
Met de DAPI kleuring werden de volgende condities uitgetest: de drie Triton X-100
concentraties, een blanco bestaande uit de incubatie van de cellen met DMEM zonder
gesuspendeerde bacteriën en een positieve controle. Deze laatste werd uitgevoerd door na
de collectie van de niet-aangehechte bacteriën geen Triton X-100 behandeling toe te passen
maar direct te fixeren en DAPI-kleuring toe te passen. Alle vijf condities werden uitgevoerd in
drievoud op dezelfde 24-well plaat.
2.4.4. Meest optimale protocol
De werkwijze tot en met de incubatie van de wells met de bacteriesuspensie verloopt
conform beschreven in het algemene protocol (2.4.2). Het meest geoptimaliseerde protocol
omvat de adhesie aan cellen. Na de incubatie werden de niet-aangehechte bacteriën
gecollecteerd door de well driemaal te wassen met PBSD-. De geadheerde bacteriën werden
gecollecteerd door 2mL 0.1% deoxycholaat, verdund in PBSD-, op de cellaag in de well
brengen en 15 minuten te laten incuberen (kamertemperatuur, 50rpm). Dit werd
21
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
gecollecteerd samen met drie nieuwe wasstappen met PBSD-. Het aantal bacteriën werd
tenslotte bepaald met de uitplatingstechniek of de flow cytometer.
2.4.5. Analyse met uitplatingtechniek
Er werd gebruik gemaakt van de microdilutie techniek (Figuur 7) om uit te platen op met BHIagar gevulde petriplaten. Per staal werd 40µL gepipetteerd op de plaat. De als ‘startculturen
voor incubatie’ vermelde stalen in de resultaten (3.2) zijn de bacteriële culturen na de drie
wasstappen, vlak voor de incubatie met cellen of mucineagar. De ‘startculturen na incubatie’
zijn de bacteriële culturen die in een apart epje (500µL) 2 uur mee geïncubeerd werden
samen met de 6-wellplaten. De niet-geadheerde en de geadheerde bacteriën werden
eveneens uitgeplaat vanuit de gecollecteerde volumes van de wasstappen (2.4.4). De
agarplaten werden overnacht in de incubator (37°C) opgegroeid om vervolgens geteld te
worden.
Figuur 7: Uitplatingstechniek met microdilutie. De agarplaat werd in 6 velden onderverdeeld en per
veld werd 40µL bacteriesuspensie gepipetteerd.
2.4.6. Analyse met flow cytometer
De geanalyseerde stalen zijn dezelfde als beschreven in 2.4.4, uitgezonderd de geadheerde
bacteriën. De stalen werden gecentrifugeerd op 1677g gedurende 5 minuten (Eppendorf Mini
Spin) en de pellets werden gesuspendeerd in 1mL gefilterd (0.2µm) Evian water. De
aangehechte bacteriën werden op een andere wijze gecollecteerd en voorbereid voor de
flow cytometer analyse. Na de collectie van de niet-aangehechte bacteriën werd 500µL
PBSD- toegevoegd per well. De cellaag werd afgeschraapt met de Cell Scraper (SPL Life
Sciences) en de well nagespoeld met 500µL PBSD-. Dit volume werd samen met de
afgeschraapte cellen naar een eppendorfbuisje overgebracht. Naar deze methode wordt in
dit proefschrift gerefereerd als de ‘schraapmethode’. Het totale volume (1mL) werd
gecentrifugeerd
en
de
pellet
gesuspendeerd
in
0.5mL
0.1%
deoxycholaat.
De
incubatieperiode bedroeg 10 minuten. Na centrifugatie op 1677g gedurende 5 minuten
(Eppendorf Mini Spin) werd de pellet gesuspendeerd in 1mL gefilterd (0.2µm) Evian water.
22
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Voor de live/dead kleuring met de flow cytometer werd gebruik gemaakt van SYBR Green I
en propidium jodide. Hiervoor werden dezelfde verdunningen gebruikt als bij de
viabiliteitstesten (2.4.3.3). De staalvoorbereiding werd uitgevoerd zoals beschreven in
Grootaert et al. (2011). De samenstelling bestond uit 10µL staal bekomen van de
adhesietest, 5µL EDTA, 10µL live/dead kleuring en 975 µL gefilterd (0.2µm) Evian water. De
analyse werd uitgevoerd met de Cyan ADP flow cytometer (Dako). De gebruikte flow
cytometer parameters voor de analyse staan eveneens beschreven in Grootaert et al.
(2011). De beads werden apart gemeten alvorens de echte stalen te analyseren. Hiervoor
werd 10µL van een beads-oplossing (1073 beads µL-1) samengebracht met 990µL gefilterd
(0.2µm) Evian water.
2.4.7. Berekening van de verschillende ratio’s
Naast het aantal bacteriën werden ook een aantal ratio’s bepaald. Een belangrijke parameter
in dit optimalisatieproces was de recovery. Dit werd bepaald door het aantal aangehechte en
niet-aangehechte bacteriën samen te tellen en te delen door het initieel aantal bacteriën
gebracht op de cel- of mucinelaag per well. De recovery werd uitgedrukt in een percentage.
Ook het percentage bacteriën dat aan de cellen of de agarmucine aanhechtte, werd bepaald
door de ratio te nemen van de hoeveelheid aangehechte bacteriën ten opzichte van de
startcultuur na incubatie (AD/ST). Dit laatste is het aantal bacteriën gebracht op de cel- of
mucinelaag waarbij de bacteriële groei tijdens de twee uur incubatie mee in acht genomen
werd. De bacteriële groei gedurende de twee uur incubatie met de cel- of mucinelaag werd
vervolgens bepaald door de hoeveelheid bacteriën in de startcultuur na incubatie te
vergelijken met de hoeveelheid bacteriën initieel gebracht op de cel- of mucinelaag, i.e.
startcultuur voor incubatie.
2.5.
Hydrofobiciteit: Bacterial Adherence To Hydrocarbons (BATH)
Het protocol voor deze testen werd gebaseerd op het onderzoek van Rosenberg (1984). Een
bacteriële cultuur werd overnacht gegroeid zoals beschreven in 2.1. De bacteriële suspensie
werd eenmalig bestraald met 10Gy (X-stralen, lineaire versneller) alvorens het Bacterial
Adherence To Hydrocarbons (BATH) experiment start. De bacteriecultuur werd vervolgens
gecentrifugeerd (2205g, 10 minuten, ALC® Centrifuge PK120) en de pellet driemaal
nagewassen met PBSD-. Na de laatste wasstap werd de optische densiteit gemeten bij
620nm (Paradigm, Beckman Coulter®) in drievoud in een 96-wellplaat, 100µL per well.
Vervolgens werd 2mL van de suspensie samengevoegd met 0.5mL hexadecaan (SigmaAldrich) en gedurende 1 minuut gevortext. Na 10 minuten te laten rusten werd de optische
densiteit van de waterige fase (onderste fase) in drievoud gemeten bij 620nm (Paradigm,
Beckman Coulter®). Als blanco werd de densiteit van PBSD- in drievoud bepaald.
23
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
De hydrofobiciteit (%) werd bepaald met volgende formule:
(
2.6.
)
Statistiek
Voor alle uitgevoerde testen werd een significantieniveau (α) van 0.05 gebruikt. Bij het
onderdeel van de pathogeniciteitstesten werd voor de Kaplan-Meier curve de Breslow test
uitgevoerd. De test werd uitgevoerd in SPSS Statistics 21. Voor de vergelijking van de
overleving na één dag tussen de injectie met bestraalde en niet-bestraalde, levende
bacteriën werd een tweezijdige Student’s t-test uitgevoerd. Normaliteit werd getest met de
Kolmogorov-Smirnov test en de gelijkheid van varianties met de Levene’s test. De test werd
uitgevoerd in R versie 2.15.3. Voor alle andere vergelijkingen bij de overleving na één dag
werd de niet-parametrische Mann-Whitney U test uitgevoerd. Deze werd uitgevoerd in R
versie 2.15.3. Voor de analyse van de adhesie-experimenten werd een tweezijdige Student’s
t-test. De normaliteit van de data werd nagegaan met Kolmogorov-Smirnov en de gelijkheid
van varianties werd getest met Levene’s test. Dit werd uitgevoerd in R versie 2.15.3.
24
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
3. Resultaten
3.1.
Pathogeniciteitstesten
De experimenten met Galleria mellonella larven (2.3) omtrent de pathogeniciteit werden
uitgevoerd met Streptococcus salivarius. Er werden ook testen uitgevoerd met Klebsiella
oxytoca en Lactobacillus salivarius maar de larven waren respectievelijk allemaal al na een
dag dood, uitgezonderd de controlelarven of bleven gezond tot drie dagen na injectie. Testen
met deze twee bacteriesoorten zullen nog verder geoptimaliseerd moeten worden, waarbij
voornamelijk de hoeveelheid in te spuiten bacteriën aangepast dient te worden. De
resultaten omvatten daarom enkel de testen met S. salivarius.
3.1.1. Scoretabel
Er werden vier kenmerken dagelijks opgevolgd na injectie gedurende vier dagen. Bij de
latere testen werd de observatieduur verkort tot drie dagen. Elke larve kreeg een dagelijkse
score, waarmee een groepsscore werd bepaald. De tabel is terug te vinden in de bijlagen
(8.1).
De belangrijkste parameter in deze test was de overleving van de larven. Bij elke observatie
werden de dode larven geteld en verwijderd van de proef. In de resultaten worden zowel de
overleving na een dag vergeleken tussen de verschillende condities alsook het
overlevingsverloop gedurende vier dagen.
Een tweede parameter in de test was de mobiliteit van de larven. De post-mobiliteit van de
larven werd ook onderzocht. In de praktijk bleek deze parameter de ‘beweging zonder
stimulatie’ en ‘beweging na stimulatie’ van de mobiliteit zwaarder te laten doorwegen in de
eindscore.
Melanisatie van de larven was de derde parameter in deze test. Naarmate larven minder
gezond werden, verkleurden zij van hun natuurlijk gele kleur naar bruin tot zwart. De
grafieken voor zowel melanisatie als mobiliteit worden weergegeven in bijlagen 8.5, 8.6 en
8.7. Voor zowel mobiliteit als melanisatie bleken de larven geïnjecteerd met bestraalde,
levende S. salivarius een lagere score te hebben ten opzichte van onbestraalde levende
bacteriën. De controlelarven, geïnjecteerd met PBSD-, hadden over het algemeen de hoogst
mogelijke score. Gelijkaardige patronen aan de overleving van de larven bleken op te treden
(3.1.2). De eerste, tweede en derde test zijn dezelfde experimenten als respectievelijk de
eerste, tweede en derde test voor de overleving van de larven.
25
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Uit verkennende experimenten waarbij larven tot zeven dagen na injectie opgevolgd werden
bleek dat de coconvorming pas na vier dagen startte. Hierbij was geen eenduidig verschil op
te merken tussen de injectie met bestraalde en niet-bestraalde bacteriën. Er trad variatie op
tussen de verschillende uitgevoerde testen. Om deze reden wordt de coconvorming, een
vierde parameter, niet verder besproken in de resultaten.
3.1.2. Overleving van de larven: verloop tot vier dagen na injectie
In deze paragraaf worden de testen weergegeven waarbij drie condities werden getest:
larven geïnjecteerd met PBSD- (controlelarven), een bestraalde en een niet-bestraalde S.
salivarius monocultuur. De resultaten van drie onafhankelijke testen waarbij de larven
dagelijks werden geobserveerd gedurende vier dagen worden hieronder besproken.
De controlelarven overleefden de hele observatieperiode. Bij larven ingespoten met 20µL
van een bacteriële suspensie met een concentratie van 107 kve mL-1 stierven verscheidene
larven gedurende de eerste dag. De groep larven ingespoten met bestraalde S. salivarius
hadden een overlevingspercentage van 63% na de eerste dag en na drie dagen bleek nog
maar net de helft in leven te zijn. De groep larven geïnjecteerd met niet-bestraalde bacteriën
vertoonden een overleving van 75% en 63% na respectievelijk de eerste en derde dag na
injectie. Het overlevingspatroon bleek voor beide groepen eenzelfde verloop te ondergaan.
Het verschil tussen de bestraalde en niet-bestraalde conditie ontstond voornamelijk bij de
eerste observatie op te merken, i.e. een dag na injectie (Figuur 8).
120
Overleving (%)
100
80
60
0Gy
40
10Gy
20
Blanco
0
0
1
2
3
4
Tijd (dagen)
Figuur 8: Overlevingscurve van de eerste pathogeniciteitstest met S. salivarius (8 larven per groep).
Larven werden dagelijks opgevolgd gedurende vier dagen en deze grafiek geeft het percentage
overlevende larven per groep weer per observatie. De x-as geeft het aantal dagen na de injectie weer,
de y-as het percentage overlevende larven. Larven in de groepen ‘0Gy’ en ‘10Gy’ werden
7
-1
geïnjecteerd met 20µL bestraalde en niet-bestraalde bacteriesuspensie (10 kve mL ) respectievelijk.
‘Blanco’ stelt de controlelarven voor, ingespoten met 20µL PBSD .
26
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
De andere twee testen vertoonden hetzelfde patroon. Het effect van bestraling bleek zich
ook hier in de eerste 24 uur van de test te manifesteren waarbij de larven geïnjecteerd met
bestraalde S. salivarius een lager overlevingspercentage vertoonden. De overlevingscurven
voor beide testen zijn terug te vinden in de bijlagen (8.2 en 8.3).
Als we de drie testen samen beschouwen, weergegeven met een Kaplan-Meier curve, blijkt
dit hetzelfde patroon te geven (Figuur 9). Zo blijkt dat alle controlelarven de hele
observatieperiode hebben overleefd, terwijl een deel van de larven ingespoten met bacteriën
gedurende de eerste dag al gestorven waren. Zowel de bestraalde als niet-bestraalde
conditie vertoonden een significant verschil met de controle situatie met voor elk een pwaarde kleiner dan 0.001. De bestraalde en niet-bestraalde situatie vertoonden eenzelfde
patroon. Er was geen significant effect van bestraling op de overleving van de larven (pwaarde = 0.243)
Figuur 9: Kaplan-Meier curve van de pathogeniciteitstesten met Streptococcus salivarius. Drie testen
werden samen geanalyseerd wat leidde tot een totaal van 27 larven per conditie. Larven in de
groepen ‘0Gy log 7’ en ‘10Gy log 7’ werden geïnjecteerd met 20µL niet-bestraalde en bestraalde
7
-1
bacteriesuspensie (10 kve mL ) respectievelijk. ‘Blanco’ stelt de groep van de controlelarven voor,
ingespoten met 20µL PBSD . De censored larven zijn de overlevende larven op het einde van de test.
Deze larven werden na de laatste observatie gedood. De x-as geeft het aantal dagen na de injectie
weer waarop de observatie werd uitgevoerd. De y-as geeft de cumulatieve probabiliteit van de
overleving van de larven weer.
27
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
3.1.3. Overleving van de larven: één dag na injectie
Omdat het verschil tussen de bestraalde en niet-bestraalde situatie zich voornamelijk bij de
eerste observatie manifesteerde, werden de overlevingspercentages bij de eerste observatie
bepaald met extra testen. Ook werden andere condities mee opgenomen in de testen.
120,00
100,00
*°
*
Blanco PBSD-
°
SS 0Gy log 7
80,00
SS 10Gy log 7
Fix 0Gy log 7
60,00
Fix 10Gy log 7
Blanco BHI
40,00
SN 0Gy
20,00
SN 10Gy
0,00
Figuur 10: Overleving van de larven een dag na de injectie, samengevat over alle uitgevoerde testen.
De y-as geeft het gemiddelde overlevingspercentage weer met bijhorende standaarddeviaties.
Overleving werd bestudeerd na injectie van larven met verschillende substanties. ‘Blanco PBSD ‘ =
injectie met PBSD (6 testen, 56 larven in totaal); ‘SS 0Gy log 7’ en ‘SS 10Gy log 7’ = ingespoten met
respectievelijk niet-bestraalde en bestraalde Streptococcus salivarius monocultuur met concentratie
7
-1
10 kve mL (6 testen, per conditie een totaal van 56 larven); ‘Fix 0Gy log 7’ en ‘Fix 10Gy log 7’ =
ingespoten met gefixeerde bacteriën afkomstig van respectievelijk een niet-bestraalde en bestraalde
7
-1
S. salivarius monocultuur met concentratie 10 kve mL (2 testen, per conditie een totaal van 20
larven); ‘Blanco BHI’ = injectie met BHI (2 testen, 19 larven in totaal); ‘SN 0Gy’ en ‘SN 10Gy’ = injectie
van supernatans afkomstig van respectievelijk een niet-bestraalde en bestraalde S. salivarius
monocultuur overnacht opgegroeid bij 37°C (2 testen, per conditie een totaal van 19 larven). * en °
duiden op een onderling significant verschil (α=0.05).
Er trad bij de injectie van levende bacteriën een afdoding van de larven op, terwijl alle
controlelarven geïnjecteerd met PBSD- de eerste dag overleefden. Er was echter geen
significant verschil op te merken tussen de injectie met een bestraalde en niet-bestraalde
bacteriële suspensie (p=0.53). Het effect van het injecteren van levende bacteriën bleek wel
significant te verschillen met de controlelarven zowel voor de bestraalde (p<0.001) als nietbestraalde conditie (p=0.006) (Figuur 10). Dit werd bepaald met zes onafhankelijke
experimenten met een totaal van 56 larven per conditie.
Verder bleek dat de injectie van gefixeerde bacteriën, i.e. afgedode bacteriën maar met
behouden celvorm, geen afdoding van de larven teweeg bracht. Ze vertoonden eenzelfde
overleving als de controlelarven ingespoten met PBSD-. Dit werd bepaald met twee
onafhankelijke experimenten waarbij in elke test 10 larven per conditie werden gebruikt. Bij
28
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
de larven geïnjecteerd met het supernatans trad geen afdoding van de larven op. Hiervoor
werden twee onafhankelijke experimenten uitgevoerd, met in totaal 19 larven per conditie
(Figuur 10). Onderlinge vergelijkingen tussen levende en gefixeerde bacteriën bleken geen
significantie te vertonen. Hetzelfde was op te merken bij onderlinge vergelijkingen tussen
levende bacteriën en het supernatans. De waarden behorende tot Figuur 10 zijn terug te
vinden in de bijlage (8.4).
3.1.4. DNA extractie uit larven: analyse met agarosegel
Er werd nagegaan hoeveel bacteriën (S. salivarius) geadheerd waren aan de hemocoelwand
op de verschillende observatietijdstippen in de larven. De aanwezigheid van S. salivarius
werd met een species-specifieke PCR nagegaan met behulp van een agarosegel. Er was
echter geen DNA van S. salivarius terug te vinden met de geteste extractie- en PCRmethode (data niet weergegeven).
3.2.
Adhesietesten
Dit onderdeel van de resultaten kan opgesplitst worden in twee delen. Het eerste en
overgrote deel bestaat uit de optimalisatieprocedure van de adhesietesten. Er zijn nog geen
adhesietesten beschreven voor S. salivarius en K. oxytoca. Ook werden er tot nog toe geen
adhesie-experimenten uitgevoerd met bestraling. Hierdoor was er optimalisatie van deze
testen nodig. Het tweede deel behandelt de resultaten van de adhesietesten, uitgevoerd met
K. oxytoca.
Het optimalisatieproces wordt in dit hoofdstuk stap voor stap opgebouwd en omvat het
voornaamste onderzoekswerk van dit proefschrift. Het proces wordt onderverdeeld in cel- en
mucineadhesietesten om het onderscheid duidelijker te maken. Elk onderdeel wordt
chronologisch behandeld. In de praktijk werd de adhesie aan cellen en aan agarmucine
parallel getest met een wisselende focus op een van de twee testen. Het algemeen protocol
beschreven in 2.4.2 geldt voor het hele optimalisatieproces. De parameters die aangepast
werden staan kort beschreven in 2.4.3 en worden hier meer in detail behandeld.
3.2.1. Protocoloptimalisatie: adhesie aan agarmucine
Bij de start van het onderzoek werden nog geen bestralingen uitgevoerd.
-
Bacteriesoort:
S. salivarius (108 kve per well) werd geselecteerd om de adhesie-experimenten aan
agarmucine uit te testen.
29
De boel Kevin
-
Masterproef 2012-2013
Agarmucine:
Zowel 2mL als 3mL agarmucinesuspensie per well werd voorzien. Dit werd twee uur
voor het begin van de adhesietest toegevoegd per well, waarna deze kon stollen bij
4°C.
-
Losmaken van de aangehechte bacteriën:
Na het wegwassen van de niet-aangehechte bacteriën met PBSD- werd per well 1mL
0.7% Triton X-100 toegevoegd. Er werden vier wells voorzien, gelijk verdeeld over
twee 6-wellplaten. Een plaat werd 15 minuten geïncubeerd op kamertemperatuur op
de shaker op 150rpm en de tweede plaat 30 minuten op 100rpm. Vervolgens werden
de aangehechte bacteriën gecollecteerd samen met de drie volgende wasstappen
met PBSD-.
-
Telling van de niet-aangehechte en aangehechte bacteriën:
De analyse van het aantal geadheerde en niet-geadheerde bacteriën gebeurde met
de uitplatingstechniek (2.4.5).
Uit dit experiment bleek dat de agarmucinelaag zeer fragiel is. Gedurende de
incubatieperiode met de bacteriën kwamen de mucinelagen in alle wells los van de
wellbodems. Verder leidde de Triton X-100 behandeling en de daaropvolgende wasstappen
tot een verbrokkeling van de mucinelaag. Bij een groter volume agarmucine (3mL) bleek de
mucinelaag beter stand te houden. Een lagere schudsnelheid met langere behandelingstijd
met Triton X-100 had ook een positief effect op de rigiditeit van de agarmucinelaag. De
tragere schudsnelheid met een langere incubatieduur met Triton X-100 leek ook minder
verzuring te veroorzaken indien de gewassen mucinelaag overnacht geïncubeerd werd met
DMEM. De verzuring is een maat voor de bacteriële metabolisatie waarbij actieve bacteriën
zuurvorming vertonen. Deze observatie leidde tot het aanpassen van de volgende
parameters:
-
Agarmucine:
Er werd 3 mL agarmucine per well voorzien.
-
Losmaken van de aangehechte bacteriën:
De concentratie Triton X-100 werd behouden (0.7%). De schudsnelheden en
incubatieperioden werden veranderd naar 75 en 100rpm gedurende respectievelijk
40 en 30 minuten.
De agarmucine hield nu beter stand tijdens de incubatie met de bacteriesuspensie. Ook was
er geen afbrokkeling meer op te merken tijdens de Triton X-100 behandeling. De mucinelaag
kwam echter wel los tijdens deze behandeling bij beide schudsnelheden waardoor de Triton
X-100 suspensie onder de laag terecht kwam. Zo kwam de bovenlaag van de agarmucine
30
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
droog te liggen. Hierdoor werd de bovenlaag niet efficiënt behandeld met Triton X-100 en
nagewassen met PBSD-. Ook in deze test leek een tragere schudsnelheid (75rpm) met
langere Triton X-100 incubatie (40 minuten) minder verzuring te veroorzaken bij een
overnachtte incubatie van de mucinelaag met DMEM na de adhesietest. De Triton X-100
behandeling bleek nu het zwakke punt aan de test en daarom werd de test als volgt
aangepast:
-
Losmaken van de aangehechte bacteriën:
Drie behandelingen werden elk met twee wells getest. Een eerste protocol testte een
Triton X-100 concentratie van 1.0% gedurende een incubatie van 30 minuten bij
75rpm. Op dezelfde plaat werden uit twee andere wells de agarmucine geschraapt na
het wegwassen van de niet-aangehechte bacteriën (‘schraapmethode’). Aan deze
collectie werd 6mL PBSD- toegevoegd en het geheel werd 20 seconden gevortext. Dit
werd vervolgens uitgeplaat. Een tweede plaat testte eveneens een Triton X-100
behandeling met een concentratie van 1.0% gedurende 30 minuten bij 100rpm.
De mucinelaag kwam in deze test terug los van de wellbodem gedurende de incubatie met
bacteriesuspensie. Ook in de blanco wells, geïncubeerd met DMEM zonder bacteriën,
kwamen de mucinelagen los gedurende deze periode. De ‘schraapmethode’ bleek een hoger
aantal geadheerde bacteriën te vertonen met 3x107 en 4x107 bacteriën per well. Beide Triton
X-100 behandelingen gaven geen aangehechte bacteriën volgens de tellingen van de
uitplatingen. Er werd een nieuwe poging ondernomen om het protocol te optimaliseren door
de volgende parameters te veranderen:
-
Agarmucine:
Er werd nog steeds 3mL agarmucine per well toegevoegd. De agarconcentratie werd
echter verhoogd van 0.8% naar 1.5% agar. De agarmucine kreeg nu overnacht (18 à
19 uur) de tijd om te stollen bij 4°C.
-
Losmaken van de geadheerde bacteriën:
Er werd enkel verder gewerkt met de ‘schraapmethode’ (2 wells).
De agarmucinelaag bleek nu terug volledig stand te houden gedurende de volledige
adhesietest. Het aantal aangehechte bacteriën had een waarde van 3x106 en 1x106 voor de
twee geteste wells. Op vlak van recovery bleek dat er een sterke groei optrad van de
bacteriën gedurende de adhesietest. De recovery bedroeg 481%. De groei werd getest door
de ‘startcultuur voor incubatie’ te vergelijken met de ‘startcultuur na incubatie’ en bedroeg
760%.
31
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Het protocol leek voor de mucineadhesietest goed te werken. Om meer informatie te krijgen
over het protocol en het effect hiervan op de leefbaarheid van de bacteriën werd
overgeschakeld naar de analyse met de flow cytometer. Cellen zouden minder achtergrond
kunnen geven dan agarmucine bij flow cytometer. Om deze reden werd de focus verschoven
naar de optimalisatie van de celadhesietest die parallel met de mucineadhesietest verliep.
Er werd tenslotte nog een test uitgevoerd met uitplatingen waarbij de ‘schraapmethode’
vervangen werd door een behandeling met deoxycholaat. Dit zou een eventueel
achtergrondprobleem bij flow cytometer kunnen oplossen doordat er geen agarmucine in de
stalen van de geadheerde bacteriën terecht komt. De volgende parameters werden
veranderd:
-
Losmaken van de geadheerde bacteriën:
Conform de Triton X-100 behandeling werd 0.1% deoxycholaat gebruikt waarbij de
schudder werd ingesteld op 50rpm gedurende 15 minuten.
Ondanks eerdere positieve resultaten met het gebruik van de hogere agarconcentratie,
kwam de agarmucinelaag bij deze test toch terug los gedurende de incubatie met een
bacteriesuspensie. Dit was het geval voor alle wells, inclusief de blanco’s. De test bleek dus
technisch niet reproduceerbaar. Het verder verhogen van de agarconcentratie was geen
optie meer om de adhesie aan mucines niet te laten beïnvloeden door de aanwezige agar.
Een groter volume agarmucine per well werd ook moeilijk, omdat er nog ruimte moest zijn
om een bacteriesuspensie toe te voegen. Er werden geen testen meer uitgevoerd met
agarmucine en het optimalisatieproces werd volledig gefocust op de adhesie aan cellen.
3.2.2. Protocoloptimalisatie: adhesie aan cellen
De eerste testen werden uitgevoerd volgens een protocol zonder bestraling. De
experimenten werden uitgevoerd op confluente cellagen (2.4.1).
3.2.2.1.
-
Analyse met de uitplatingstechniek
Bacteriesoort:
S. salivarius (108 kve per well) werd geselecteerd om de adhesie-experimenten aan
epitheliale cellen uit te testen.
-
Losmaken van de geadheerde bacteriën:
Dit werd door Van den Abbeele et al. (2009) uitgevoerd met een incubatie van de
cellaag met 0.5% Triton X-100. Na het uittesten van deze concentratie werd de
cellaag in de well overnacht geïncubeerd met DMEM. Er bleek nog te veel verzuring
op te treden. De concentratie Triton X-100 werd vervolgens verhoogd naar 0.7%
32
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
en 1.0%. Beide concentraties werden 30 minuten geïncubeerd op de schudder
(150rpm) bij kamertemperatuur.
-
Telling van de aangehechte en niet-aangehechte bacteriën:
De analyse werd uitgevoerd met de uitplatingstechniek.
De recovery lag bij deze experimenten zeer laag. Voor zowel 0.7% als 1.0% Triton X-100
bedroeg deze maar 37% in plaats van de gewenste 100%. Het aantal niet-aangehechte
bacteriën bleek ongeveer 107 kve per well te bedragen. De aangehechte bacteriën zouden
rond 103 kve per well uitkomen. De cellen werden initieel geïncubeerd met 108 kve per well.
Om de efficiëntie van het losmaken van de aangehechte bacteriën na te gaan werd ook een
DAPI-kleuringstest parallel uitgevoerd (2.4.3.4). Er werd in deze test naast 0.7% en 1.0%
ook een derde concentratie Triton X-100 getest, namelijk 1.5%. De positieve controle
vertoonde een veel hoger aantal aanwezige bacteriën op de cellaag in vergelijking met de
Triton X-100 behandelingen. Bij de blanco wells waren er geen bacteriën te bespeuren bij de
DAPI kleuring. Een hogere concentratie Triton X-100 leidde tot een verminderd aantal
bacteriën dat achterbleef op de cellaag, al bleek dit verschil niet zo groot tussen de drie
concentraties (Figuur 11).
Uit deze resultaten werd besloten om een aantal parameters van de celadhesietest aan te
passen. In de testen die nu volgen werd er ook bestraling (10Gy) van de bacteriën
uitgevoerd (2.4.2). Zo kon er ook gekeken worden naar het verschil tussen de bestraalde en
niet-bestraalde conditie.
De aangepaste parameters zijn:
-
Bestraling:
De bacteriële suspensie werd eenmaal bestraald vlak voor het adhesie-experiment
gestart werd (10Gy).
-
Losmaken van de aangehechte bacteriën:
Twee methoden werden vergeleken waarbij de eerste procedure bestond uit de
hierboven beschreven incubatie met 1.0% Triton X-100 (30 minuten, 150rpm). De
tweede methode werd uitgevoerd door na het wegwassen van de niet-aangehechte
bacteriën de cellaag af te schrapen in 500µL PBSD- en te collecteren. De well werd
nog eenmaal nagewassen met 500µL PBSD- en samen bij de gecollecteerde cellaag
gevoegd. Dit werd kort gevortext alvorens uit te platen.
33
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
De recovery lag bij beide methoden nog steeds laag, variërend tussen 20% en 40%. Ook
hier zat het aantal niet-aangehechte bacteriën rond 107 kve per well. De ‘schraapmethode’
bleek echter wel een hoger aantal aangehechte bacteriën op te leveren bij de bacterietelling
dan de Triton X-100 behandeling, respectievelijk 105 kve en 103 kve bacteriën per well.
Figuur 11: DAPI-kleuring bij een celadhesietest met drie Triton X-100 concentraties. De Streptococcus
salivarius bacteriën zijn zichtbaar als kleine, blauwe puntjes (witte pijlen) tussen de epitheliale
celkernen (grote, blauwe structuren). De foto’s zijn afkomstig van verschillende behandelingen om de
aangehechte bacteriën los te maken waarbij de incubatieduur 30 minuten bedroeg bij 150rpm. A =
0.7% Triton X-100; B = 1.0% Triton X-100; C = 1.5% Triton X-100; D = blanco (geen bacteriën op de
cellaag gebracht); E = positieve controle waar PBSD gebruikt werd in plaats van Triton X-100.
34
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Een Triton X-100 behandeling bleek een negatieve invloed te hebben op de overleving van
de bacteriën (3.2.2.4), waardoor de ‘schraapmethode’ de standaardprocedure voor de
celadhesie experimenten werd. Er werden twee nieuwe testen uitgevoerd met deze methode
om het effect van bestraling te onderzoeken. Per test werden voor de bestraalde en nietbestraalde conditie elk twee wells voorzien. Echter bleek er geen consistent verschil tussen
de bestraalde en niet-bestraalde conditie te zijn. Een eerste test gaf aan dat de ratio
aangehechte bacteriën tegenover de ‘startcultuur na incubatie’ (AD/ST) groter was bij de
bestraalde conditie dan bij de niet-bestraalde conditie, respectievelijk 0.10% en 0.01%. De
tweede test gaf een tegengesteld resultaat waarbij de AD/ST 0.07% en 0.11% bedroeg voor
respectievelijk de bestraalde en niet-bestraalde conditie. Het aantal aangehechte bacteriën
lag bij de eerste en tweede test respectievelijk rond 104 kve en 105 kve per well voor beide
condities. Het grootste probleem bij dit protocol bleek nog steeds de recovery te zijn waarbij
deze voor de eerste test 8% tot 32% bedroeg. Bij de tweede test had deze ook maar een
waarde tussen 8% en 15%. Er werd van de uitplatingstechniek overgeschakeld op de
analyse met de flow cytometer.
3.2.2.2.
Analyse met de flow cytometer
In de eerstvolgende beschreven test werd er op alle stalen een live/dead-kleuring (2.4.6)
uitgevoerd.
-
Bacteriesoort: S. salivarius (108 kve per well)
-
Losmaken van de aangehechte bacteriën:
Hiervoor werd de ‘schraapmethode’ gebruikt door na het wegwassen van de nietaangehechte bacteriën de cellaag af te schrapen in 500µL PBSD- en te collecteren.
De well werd eenmaal nagewassen met 500µL PBSD- en samen bij de
gecollecteerde cellaag gevoegd. Het totale volume, 1mL, werd gecentrifugeerd en de
pellet gesuspendeerd in 0.5mL 0.2% Triton X-100. De incubatieperiode bedroeg 10
minuten.
-
Telling van de aangehechte en niet-aangehechte bacteriën:
De analyse werd uitgevoerd met de Cyan ADP flow cytometer.
Om een totaalbeeld van het aantal geadheerde bacteriën te krijgen, werden deze enkel
gekleurd met SYBR Green I. Propidium jodide werd voor deze stalen niet gebruikt. Uit deze
test bleek dat de geadheerde bacteriën niet konden gedetecteerd worden, omdat de
hoeveelheid bacteriën te laag was of de achtergrond een te hoge waarde aannam.
Voor de verdere optimalisatie werd voorlopig geen bestraling meer toegepast. Bij de nieuwe
test werd het S. salivarius inoculum op de cellaag verhoogd. Dit werd gedaan door per well
twee overnacht opgegroeide vloeibare culturen te voorzien, waardoor het aantal
35
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
aangehechte bacteriën hopelijk bij een minimale waarde van 105 kve per well uitkwam. Met
de uitplatingstechniek werd eerst gekeken of het verhogen van het inoculum zowel bij de
start van de test als bij de (niet-)aangehechte bacteriën leidde tot een verhoging van het
aantal bacteriën. Deze methode bleek een 10-maal verhoging van het aantal bacteriën te
geven bij alle stalen in tegenstelling tot het normale inoculum. De ‘startcultuur na incubatie’
(2.4.6) had een waarde van 109 kve. De niet-geadheerde bacteriën zaten op 108 kve en de
geadheerde bacteriën op 105 kve.
Vervolgens werd een volgende test opgesteld, uitgevoerd met de flow cytometer. Zoals
beschreven in de vorige alinea werd een hogere inoculumconcentratie gebruikt. Een extra
toevoeging aan het experiment was het testen van het verschil tussen een normale,
confluente cellaag en een gedifferentieerde cellaag. In het laatste geval werd de 6-well plaat
twee weken, nadat een confluente cellaag gevormd was, in de incubator (37°C) gehouden
met regelmatige verversing van het medium (DMEM). Per plaat werden twee wells
geïncubeerd met een bacteriesuspensie en twee wells geïncubeerd met bacterieloze DMEM,
i.e. blanco wells.
Figuur 12: Flow cytometer analyse van aangehechte Streptococcus salivarius aan gedifferentieerde
TR146 cellen in een 6-well plaat. De ‘schraapmethode’ werd gebruikt om de geadheerde bacteriën los
te krijgen van de cellaag. Op y-as staat de sidescattering, uitgedrukt in de logschaal. Op x-as staat de
SYBR Green I fluorescentie, uitgedrukt in de logschaal. R1 = gebied waar S. salivarius terug te vinden
is; ‘Bacteria AD (Sybr/PI)’ = gebied waar geadheerde bacteriën terug te vinden zijn bij live/dead
kleuring (SYBR Green I en propidium jodide); ‘Bacterie AD (only Sybr)’ = gebied waar geadheerde
bacteriën terug te vinden zijn bij SYBR Green I kleuring. Links: Resultaat van kleuring van de
geadheerde bacteriën met live/dead kleuring. Rechts: Resultaat van kleuring van de geadheerde
bacteriën met SYBR Green I. De test werd uitgevoerd op de Cyan ADP flow cytometer.
In Figuur 12 valt op dat bij een SYBR Green I kleuring de geadheerde bacteriën (rechtse
plot) beter detecteerbaar zijn in vergelijking met een live/dead-kleuring (linkse plot). In de
36
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
volgende flow cytometer experimenten werden de aangehechte bacteriën dus steeds
gekleurd met SYBR Green I.
De recovery bij de gedifferentieerde cellaag bleek nog steeds laag te liggen. De waarde
hiervoor lag tussen 27% en 32%. Het aantal aangehechte bacteriën had een waarde van
104 kve per well bij de gedifferentieerde cellaag. Voor de niet-gedifferentieerde cellaag lag
het aantal geadheerde bacteriën per well maar bij 102 kve met een recovery tussen 22% en
34%. De recovery voor de niet-gedifferentieerde cellaag is niet betrouwbaar omdat het aantal
geadheerde bacteriën nog steeds onder de waarde van de blanco stalen lag. De hogere
inoculumconcentratie bleek in deze test niet de gewenste verhoging van het aantal
aangehechte bacteriën te geven zoals in de vorige test.
Er werden twee nieuwe celadhesie experimenten uitgevoerd met de flow cytometer, beide
met een aangepast protocol. Omdat de gedifferentieerde plaat geen verbetering van de
recovery gaf werd er terug gewerkt met een niet-gedifferentieerde cellaag. De uitvoering
werd als volgt opgesteld:
-
Bestraling:
Vergelijking bestraalde (10Gy) en niet-bestraalde bacteriesuspensie. Per well werd
een bacteriële monocultuur voorzien.
-
Losmaken aangehechte bacteriën:
Bij deze experimenten werd eveneens de ‘schraapmethode’ toegepast.
-
Kleuring van de stalen voor flow cytometer analyse:
De live/dead kleuring werd gebruikt uitgezonderd voor de aangehechte bacteriën.
Deze groep werd gekleurd met SYBR Green I.
In beide testen kwam het probleem van de hoge achtergrond terug. Hierdoor konden de
aangehechte bacteriën niet duidelijk onderscheiden worden van de achtergrond. Het aantal
aangehechte bacteriën en de ratio AD/ST konden door het achtergrond-probleem niet
bepaald worden.
Het probleem van de achtergrond staat geïllustreerd in Figuur 13. De linkse plot geeft het
resultaat weer van een well geïncubeerd met een bestraalde S. salivarius monocultuur. De
rechtse plot is het resultaat van een controle well, wat geïncubeerd werd met bacterieloze
DMEM. Beide plots zijn afkomstig van de analyse van de aangehechte bacteriën. De
geadheerde bacteriën in de linkse plot zijn niet overduidelijk aanwezig indien relatief bekeken
tegenover de controle plot, i.e. rechtse grafiek. Deze figuur geeft het probleem goed weer
voor alle uitgevoerde testen.
37
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Figuur 13: Flow cytometer analyse van aangehechte Streptococcus salivarius aan TR146 cellen. De
‘schraapmethode’ werd gebruikt om de geadheerde bacteriën los te krijgen van de cellaag gevolgd
door een incubatie met 0.2% Triton X-100 gedurende 10 minuten. De geadheerde bacteriën werden
gekleurd met SYBR Green I. Op y-as staat de sidescattering, uitgedrukt in een logschaal. Op x-as
staat de SYBR Green I fluorescentie, uitgedrukt in een logschaal. R1 = gebied waar S. salivarius terug
te vinden is; Bacteria AD = gebied waar geadheerde bacteriën terug te vinden zijn. Links: Resultaat
van een well geïncubeerd met bestraalde (10Gy) S. salivarius. Rechts: Resultaat van een controle
well, geïncubeerd met DMEM zonder S. salivarius. De test werd uitgevoerd op de Cyan ADP flow
cytometer.
Er werd getracht de achtergrond te verminderen om de aangehechte bacteriën duidelijker
zichtbaar te maken. Dit zou het tellen van het aantal bacteriën vergemakkelijken. In een
volgend experiment werden daarom de bekomen stalen nog extra gefilterd met een 0.45µm
filter (Whatman®) alvorens de staalvoorbereiding voor analyse uit te voeren. De rest van het
protocol werd volledig overgenomen van de laatst uitgevoerde proeven, zoals hierboven
beschreven. De bekomen stalen uit de adhesietest werden tweemaal gemeten waarbij
eenmaal de filtering (0.45µm) uitgevoerd werd. Deze test werd niet volledig geanalyseerd.
Na het meten van de ‘startcultuur na incubatie’ bleek al gauw dat de filter ook de bacteriën
gedeeltelijk tegenhield. Er viel op dat er vooral een sterk verschil optrad bij de levende
regio’s tussen de niet en wel gefilterde stalen. In de dode regio bleken veel minder bacteriën
tegengehouden te worden door de filter ten opzichte van de levende regio.
3.2.2.3.
Terug naar uitplatingstechniek: deoxycholaat
Door een technisch defect met de flow cytometer werden vervolgens geen testen meer
uitgevoerd met dit toestel en werd er terug overgeschakeld naar de uitplatingstechniek.
38
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Een alternatief voor Triton X-100 werd uitgetest om de aangehechte bacteriën los te maken,
namelijk deoxycholaat (De Weirdt et al., 2012). Er werden eerst testen uitgevoerd met
S. salivarius. De opstelling van de test was als volgt:
-
Bestraling:
Er werd geen bestraling uitgevoerd.
-
Losmaken van de aangehechte bacteriën:
In het artikel van De Weirdt et al. (2012) werd 0.1% deoxycholaat gebruikt. Deze
concentratie werd overgenomen. Twee methoden werden uitgetest. De eerste manier
was analoog aan de incubatie met Triton X-100. De cellen werden 15 minuten
geïncubeerd met 0.1% deoxycholaat op de schudder (50rpm) bij kamertemperatuur.
Bij de tweede methode werd 2mL 0.1% deoxycholaat toegevoegd aan de well na het
wegwassen van de niet-aangehechte bacteriën. Er werd een aantal keer stevig op en
neer gepipetteerd met de deoxycholaatoplossing op de cellaag. Het volume werd
overgebracht naar een eppendorfbuisje en de pellet werd na centrifugatie (2247g,
5 minuten, Eppendorf Centrifuge 5417R) gesuspendeerd in 2mL PBSD-.
-
Telling van de aangehechte en niet-aangehechte bacteriën:
De bacterietelling gebeurde met de uitplatingstechniek.
De recovery lag ook hier laag met een waarde tussen 15% en 17% voor beide methoden. Er
werd verder gewerkt met het incubatieprotocol. Een viabiliteitstest werd uitgevoerd om het
effect van deoxycholaat en Triton X-100 op de leefbaarheid van de bacteriën te bekijken. De
resultaten staan beschreven in de volgende paragaaf.
3.2.2.4.
Viabiliteitstest met uitplatingstechniek en flow cytometer analyse
De viabiliteitstesten werden uitgevoerd met monoculturen van S. salivarius en K. oxytoca.
Twee types van viabiliteitstesten werden uitgevoerd. Bij de eerste test werd de
uitplatingstechniek gebruikt (2.4.3.2).
De resultaten in Tabel 1 tonen dat zowel S. salivarius als K. oxytoca gevoelig zijn voor de
incubatie met Triton X-100. Na 15 minuten bleek S. salivarius dit detergent beter te
verdragen dan K. oxytoca. Terwijl bij K oxytoca niet zo’n sterke daling in het
overlevingspercentage te zien was na een verdubbeling van de incubatieduur bleek dit voor
S. salivarius echter wel het geval. K. oxytoca bleek een deoxycholaatoplossing beter te
verdragen dan Triton X-100. Na 30 minuten incubatie met deoxycholaat bleek nog 79% van
de bacteriën te leven. Bij S. salivarius bleek na 15 minuten incubatie 79% in leven te zijn,
terwijl dit na 30 minuten sterk gedaald was tot 56%.
39
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Tabel 1: Viabiliteitstest met uitplatingstechniek. Twee bacteriesoorten, namelijk Streptococcus
salivarius en Klebsiella oxytoca, werden onderzocht naar hun leefbaarheid na incubatie met
deoxycholaat en Triton X-100. De incubatieperiode bedroeg 15 minuten en 30 minuten. De
leefbaarheid staat uitgedrukt als het percentage overlevende bacteriën na de incubatieperiode
vergeleken met het aantal levende bacteriën voor de incubatie. De concentratie bacteriën van de
7
-1
9
-1
startculturen bedroeg 9.8x10 kve mL en 1.1x10 kve mL voor respectievelijk S. salivarius en
K. oxytoca.
0,1 % deoxycholaat
0,7% Triton X-100
1,0% Triton X-100
Overleving (%)
Overleving (%)
S. salivarius
K. oxytoca
15 minuten 30 minuten 15 minuten 30 minuten
78.5
56.4
80.5
79.0
92.3
72.3
54.8
51.4
66.6
63.6
55.2
44.3
Er werd ook een viabiliteitsexperiment uitgevoerd met de flow cytometer (Accuri™ C6).
Eveneens werden S. salivarius en K. oxytoca onderzocht naar hun leefbaarheid na incubatie
met Triton X-100 en deoxycholaat (2.4.3.3).
In Tabel 2 staan de resultaten voor S. salivarius met een incubatieduur van 15 minuten.
Deze bacterie bleek sterk gevoelig te zijn voor zowel deoxycholaat als Triton X-100 waarbij
er nog maar 7 tot 10% levende fractie overbleef tegenover 80% bij de startcultuur. Er is geen
groot onderscheid te maken tussen de behandeling met deoxycholaat en Triton X-100. De
verschillende concentraties Triton X-100 vertoonden een gelijkaardige afdoding. Indien er 30
minuten geïncubeerd werd bracht dit geen grote veranderingen. De resultaten hiervan staan
in de bijlagen (8.8).
Tabel 2: Viabiliteitstest van Streptococcus salivarius met de flow cytometer. S. salivarius werd
onderzocht naar de leefbaarheid na de incubatie met deoxycholaat en Triton X-100. De incubatieduur
bedroeg 15 minuten. De leefbaarheid staat uitgedrukt als het percentage bacteriën behorende tot de
groep ‘levend’, ‘dood’ of ‘beschadigd’ met bijhorende standaarddeviaties (SD). Per staal werden twee
herhalingen getest. ‘Startcultuur’ staat voor het staal genomen voor de test plaatsvond, i.e. 0 minuten
incubatie. De gebruikte flow cytometer was het type Accuri™ C6 (BD).
0,1% deoxycholaat
0,2% Triton X-100
0,7% Triton X-100
1,0% Triton X-100
Startcultuur
Percentage (%)
Levend
Dood
Beschadigd Levend
10.4
44.3
45.3
1.7
7.0
38.5
54.5
0.6
8.5
42.3
49.2
0.1
7.3
41.4
51.3
1.3
80.5
2.9
16.6
5.7
40
SD (%)
Dood
Beschadigd
2.0
0.3
0.6
1.2
0.1
0.1
0.3
1.0
1.8
4.0
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
In Tabel 3 staan de resultaten voor K. oxytoca met een incubatieduur van 15 minuten. Deze
bacterie bleek zowel Triton X-100 als deoxycholaat zeer goed te verdragen. Er was amper
afdoding waar te nemen na 15 minuten incubatie. Dit was ook te zien bij de analyse na een
incubatieduur van 30 minuten. De resultaten hiervan zijn terug te vinden in de bijlagen (8.9).
Tabel 3: Viabiliteitstest van Klebsiella oxytoca met flow cytometer. De leefbaarheid van K. oxytoca
werd onderzocht met deoxycholaat en Triton X-100. De incubatieduur bedroeg 15 minuten. De
leefbaarheid staat uitgedrukt als het percentage bacteriën behorende tot de groep ‘levend’, ‘dood’ of
‘beschadigd’ met bijhorende standaarddeviaties (SD). Per staal werden twee herhalingen getest.
‘Startcultuur’ staat voor het staal genomen voor de test plaatsvond, i.e. 0 minuten incubatie. De
gebruikte flow cytometer was het type Accuri™ C6 (BD).
0,1% deoxycholaat
0,2% Triton X-100
0,7% Triton X-100
1,0% Triton X-100
Startcultuur
Percentage (%)
Levend
Dood
Beschadigd
97.9
1.4
0.7
96.2
2.4
1.4
96.3
2.4
1.3
95.5
2.5
2.0
98.8
0.9
0.3
Levend
0.4
0.3
0.2
0.3
0.1
SD (%)
Dood Beschadigd
0.1
0.5
0.4
0.1
0.0
0.2
0.1
0.4
0.1
0.1
Er was nog een opvallend verschil op te merken tussen de twee bacteriesoorten bij de flow
cytometer analyse. Bij S. salivarius waren drie duidelijke groepen te onderscheiden van
elkaar, namelijk de dode, beschadigde en levende fractie. Bij K. oxytoca vloeiden de drie
groepen over in elkaar (Figuur 14).
Figuur 14: Viabiliteitstest met flow cytometer. Dit is het resultaat na 15 minuten incubatie met 1.0%
Triton X-100. De stalen werden gekleurd met live/dead fluorescente kleurstof. Op de x-as staat de
fluorescentie van SYBR Green I en op de y-as de fluorescentie van propidium jodide. Beide assen zijn
opgesteld volgens de log-schaal. ‘Live’ bevat de levende bacteriën, ‘damaged’ bevat de beschadigde
bacteriën en ‘Dead’ bevat de dode bacteriën. Links: incubatie met Klebsiella oxytoca. Rechts:
incubatie met Streptococcus salivarius. De gebruikte flow cytometer was het type Accuri™ C6 (BD).
41
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
3.2.3. Celadhesietest met K. oxytoca
Tenslotte zijn de laatste celadhesietesten uitgevoerd met K. oxytoca. Het gebruikte protocol
staat beschreven in 2.4.4, waarbij de analyse uitgevoerd werd met de uitplatingstechniek.
Hiervoor werden BHI-agarplaten gebruikt. Drie onafhankelijke celadhesie-experimenten
werden uitgevoerd.
De recovery lag hoger dan bij de experimenten met S. salivarius (Tabel 4). Deze waarde lag
tussen 80% en 118%, een aantal uitschieters buiten beschouwing gelaten.
De ratio aangehechte bacteriën ten opzichte van het aantal bacteriën in de ‘startcultuur na
incubatie’ (AD/ST) staan in Tabel 5. Bestraling van de bacteriesuspensie leidde tot een
hogere AD/ST-ratio bij de eerste en derde test, al was dit verschil niet zo groot. Het aantal
geadheerde bacteriën (106 kve per well) lag ook veel lager dan het aantal bacteriën dat
initieel op de cellaag gebracht werd (109 kve per well) waardoor de ratio’s AD/ST lage
percentages gaven. Bij de tweede test lagen de ratio’s bij de twee condities rond dezelfde
waarde, namelijk 0.03%. Het lage AD/ST percentage volgt uit dezelfde reden als bij de
andere twee testen. Er zijn geen standaarddeviaties beschikbaar omdat elke well maar
eenmaal werd uitgeplaat. Er is geen significant verschil tussen de AD/ST-ratio’s van de
bestraalde en niet-bestraalde conditie als de drie testen samen beschouwd worden
(p = 0.16).
Tabel 4: Recovery bij de celadhesietesten met K. oxytoca. De waarden staan uitgedrukt in
percentages. Drie onafhankelijke testen werden uitgevoerd, met drie geteste wells per conditie per
test. Incubatie van de cellaag met een bestraalde bacteriesuspensie (10Gy) werd vergeleken met een
niet-bestraalde bacteriesuspensie (0Gy). De bacterietelling gebeurde met de uitplatingstechniek.
Test 1
Test 2
Test 3
Recovery (%) 0 Gy
Well 1
Well 2
Well 3
64
91
174
249
220
90
96
80
84
Recovery (%) 10 Gy
Well 1
Well 2
Well 3
72
54
69
115
118
85
115
87
104
Tabel 5: Ratio AD/ST bij de celadhesietesten met K. oxytoca. AD/ST staat voor de ratio van het aantal
aangehechte bacteriën tegenover de startcultuur na incubatie. De waarden staan uitgedrukt in
percentages. Drie onafhankelijke testen werden uitgevoerd, met drie geteste wells per conditie per
test. Incubatie van de cellaag met een bestraalde bacteriesuspensie (10Gy) werd vergeleken met een
niet-bestraalde bacteriesuspensie (0Gy). De bacterietelling gebeurde met de uitplatingstechniek.
Test 1
Test 2
Test 3
Well 1
0.011
0.032
0.049
AD/ST (%) 0 Gy
Well 2
Well 3
0.028
0.033
0.036
0.045
0.055
0.059
42
AD/ST (%) 10 Gy
Well 1
Well 2
Well 3
0.041
0.040
0.046
0.055
0.033
0.033
0.068
0.065
0.054
De boel Kevin
3.3.
Masterproef 2012-2013
Hydrofobiciteit: Bacterial Adherence To Hydrocarbons (BATH)
3.3.1. 8-uurs verloop van hydrofobiciteit
Drie bacteriesoorten werden onderzocht naar hun hydrofobiciteit en het effect van bestraling
hierop. De geteste bacteriën zijn Streptococcus salivarius, Klebsiella oxytoca en
Lactobacillus salivarius. Per bacteriesoort werden drie onafhankelijke testen uitgevoerd.
Voor alle drie de bacteriesoorten was er geen duidelijk 8-uurspatroon op te merken bij zowel
de bestraalde als niet-bestraalde conditie. Ook was er geen duidelijk consistent verschil
tussen de twee condities op te merken. De standaardfouten van de absorbantiemetingen
waren relatief groot. De bijhorende grafieken zijn terug te vinden in de bijlagen (8.10 tot
8.12).
3.3.2. De 0-uurs metingen van hydrofobiciteit
Voor alle drie de bacteriesoorten was er geen verschil tussen de bestraalde en nietbestraalde conditie te zien vanwege de grote standaardfouten.
Er kunnen wel drie gradaties van hydrofobiciteit opgemerkt worden (Tabel 6). De hoogste
waarde van hydrofobiciteit is terug te vinden voor S. salivarius, namelijk rond 100%.
L. salivarius heeft een intermediaire hydrofobiciteit en K. oxytoca is eerder hydrofiel van aard
met een hydrofobiciteit rond 0%.
Tabel 6: De 0-uurs metingen van hydrofobiciteit voor drie bacteriesoorten. De geteste bacteriën zijn
Streptococcus salivarius, Lactobacillus salivarius en Klebsiella oxytoca. De waarden in deze tabel
worden voor de drie onafhankelijke testen weergegeven. Samen met de hydrofobiciteit worden de
standaarddeviaties weergegeven per bacteriesoort. Deze standaarddeviaties werden bepaald op
basis van de drie herhaalde metingen per test.
Test 1
Test 2
Test 3
S. salivarius
Hydrofobiciteit
SD
(%)
(%)
107.5
12.6
99.3
4.9
104.2
32.3
L. salivarius
Hydrofobiciteit
(%)
23.3
8.5
37.8
43
SD
(%)
3.8
2.4
8.5
K. oxytoca
Hydrofobiciteit
(%)
1.5
1.2
-0.5
SD
(%)
5.2
5.3
-5.5
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
4. Discussie
4.1.
Adhesie van bacteriën aan epitheliale cellen: optimalisatie van het in
vitro model
De focus in deze masterproef ligt bij het optimaliseren van de adhesie-experimenten. Er zijn
in het afgelopen decennium al meerdere onderzoeken uitgevoerd naar de adhesie van
bacteriën aan het intestinale epitheel. Hiervoor kunnen in vitro experimenten uitgevoerd
worden met epitheliale cellijnen. Het optimalisatieproces werd in dit proefschrift voornamelijk
uitgevoerd met de bacterie Streptococcus salivarius. Aangezien dit een veel voorkomende
bacterie is in de orale omgeving is het zeer nuttig om de adhesiecapaciteit hiervan te
onderzoeken.
De stam S. salivarius K12 werd eerder onderzocht naar zijn mogelijkheid tot toediening als
een probioticum voor de orale omgeving (Burton et al., 2006, 2011). S. salivarius heeft
bijgevolg een potentieel bij het (preventief) behandelen van orale mucositis.
Om de hoeveelheid aangehechte bacteriën te bepalen kunnen verschillende technieken
gebruikt worden. In deze thesis was de uitplatingstechniek de standaardmethode. Het tellen
van het aantal bacteriën met de uitplatingstechniek kan een kwantitatieve benadering zijn om
de adhesie te onderzoeken. Het adhesiepercentage kan bepaald worden door het aantal
aangehechte bacteriën te vergelijken met de hoeveelheid bacteriën toegevoegd aan de
cellaag voor de incubatie. Deze techniek blijkt een veelgebruikte methode om het percentage
aangehechte bacteriën te bepalen. Adhesie-experimenten met cellijnen van orale afkomst
zijn moeilijk terug te vinden. Cellijnen afkomstig van het darmstelsel waaronder Caco-2 en
HT-29 (Grootaert et al., 2011; Kaushik et al., 2009; Turpin et al., 2012), longepitheel (Ruiz et
al., 2011) en de maagklieren (Geethangili et al., 2010) zijn wel al onderzocht geweest. Een
eerder kwalitatief gerichte methode is het gebruik van microscopie. Na het wegwassen van
de niet-geadheerde bacteriën kan de cellaag met de aangehechte bacteriën gefixeerd
worden met methanol en vervolgens gekleurd worden met een Giemsa-kleuring. Deze stalen
kunnen vervolgens geanalyseerd worden met behulp van lichtmicroscopie. Op basis van
tellingen
in
gerandomiseerde
microscopische
velden
kunnen
bacteriële
species
onderverdeeld worden in niet-adherent, adherent en sterk adherent (Jacobsen et al., 1999).
Ramírez et al. (2009) heeft eveneens de adhesie onderzocht met behulp van een Giemsakleuring. Hier werden bij 50 cellen per well (24-well plaat) het aantal aangehechte bacteriën
geteld met behulp van lichtmicroscopie. Een beperking aan microscopie is dat een
adhesiepercentage niet bepaald kan worden, omdat de initiële hoeveelheid bacteriën
gebracht op de cellen niet gekend is. Het initiële aantal bacteriën kan eventueel wel bepaald
worden door een extra uitplating uit te voeren van het bacteriële inoculum voor de incubatie.
44
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Maar de nauwkeurigheid van de telling kan verschillend zijn tussen de uitplatingstechniek en
microscopie. Dit kan de berekening van de recovery beïnvloeden, wat net zeer belangrijk
was voor het optimalisatieproces in deze masterproef. Het is beter om bij eenzelfde techniek
te blijven gedurende het adhesie-experiment. Een ander nadeel van de microscopische
techniek ten opzichte van de uitplatingen is dat het tellen met de lichtmicroscoop zeer
arbeidsintensief is en het niet altijd even eenvoudig is om de bacteriën te onderscheiden van
de achtergrond. Dit probleem kwam ook naar boven bij de uitgevoerde DAPI-kleuring (Figuur
11, 3.2.2.1). De kleuring kon het verschil tussen de positieve controle en de Triton X-100
behandeling weergeven, maar eerder als een zwart-wit beeld. Een echte kwantificatie van de
bacteriën was echter zeer moeilijk met het DAPI-experiment. Het fixeren, kleuren en tellen
van de aangehechte bacteriën met behulp van microscopie is dus geen interessante
methode.
Alternatieve methoden voor microscopie vereisen het losmaken van de cellaag en de
aangehechte bacteriën. Er werden gedurende het optimalisatieproces verschillende
methoden toegepast om de aangehechte bacteriën los te maken van de cellaag en deze te
kwantificeren. De startmethode was het losmaken van de aangehechte S. salivarius met
behulp van een incubatieperiode met Triton X-100. Dit is een oppervlakte-actieve stof en
werd ook in eerder onderzoek gebruikt om aangehechte bacteriën los te maken van een
substraat. Het verbreken van de contacten tussen bacteriën en hun substraat met behulp
van oppervlakte-actieve stoffen bleek twee decennia geleden al nuttig te zijn bij de
verwijdering van biofilmen in technische systemen (Neu, 1996). Na het wegwassen van de
niet-aangehechte bacteriën gebruikte Krachler et al. (2012) 0.5% Triton X-100 om de
geadheerde bacteriën los te maken van epitheliale Hela-cellen. Hetzelfde detergent en
percentage werd ook gebruikt in het onderzoek van Van den Abbeele et al. (2009) met
adhesie aan agarmucine. Triton X-100 bleek in dit proefschrift de agarmucinelaag te
verbrokkelen, wat niet het geval bleek te zijn bij Van den Abbeele et al. (2009). Dit zou
kunnen doordat in dat onderzoek 12-well platen gebruikt werden en in deze masterproef 6well platen. Een kleinere welloppervlakte zou de agarmucine steviger kunnen binden, zodat
deze minder snel loskomt van de wellbodem. Een andere reden zou misschien de versheid
van de agarmucine kunnen zijn. Van den Abbeele et al. (2009) maakte dit steeds vers op de
dag van het experiment zelf. Maar de initiële testen in deze masterproef werden uitgevoerd
met agarmucine dat een paar uur voor het experiment werden uitgegoten in de wells, waar
ook verbrokkeling van de mucinelaag bij optrad. Het effect van de versheid van de
agarmucine op de rigiditeit van de mucinelaag is daarom twijfelachtig.
De gebruikte Triton X-100 behandeling in dit proefschrift is gebaseerd op het onderzoek van
Van den Abbeele et al. (2009), waarbij o.a. de Triton-concentratie uiteindelijk aangepast
45
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
werd gedurende het optimalisatieproces. Uit de resultaten van deze thesis blijkt echter dat
Streptococcus salivarius sensitief is voor de Triton X-100 behandeling. Uit de viabiliteitstest
met de uitplatingstechniek (Tabel 1, 3.2.2.4) bleek voor een lagere Triton X-100 concentratie
(0.7%) de leefbaarheid nog mee te vallen met een waarde van 92% na 15 minuten incubatie.
Bij een hogere concentratie (1.0%) en langere incubatieduur (30 minuten) bleek dit al gauw
te dalen tot een waarde van 64%. Dit zorgt voor een weinig betrouwbaar resultaat na het
tellen van de agarplaten, omdat de door Triton afgedode bacteriën niet geteld worden. De
gevoeligheid aan Triton X-100 blijkt uit de resultaten met de uitplatingstechniek bij Klebsiella
oxytoca eveneens een probleem te geven (Tabel 1, 3.2.2.4). Er bleek na 15 minuten
incubatie nog maar 55% van de bacteriën te overleven voor beide Triton X-100
concentraties. Dit is in tegenspraak met de resultaten van de viabiliteitstest uitgevoerd met
de flow cytometer (Tabel 3, 3.2.2.4). Hier bleek er amper een afdoding plaats te vinden ten
gevolge van de incubatie met Triton X-100 gedurende 15 minuten, waarbij nog 95 à 96% van
de K. oxytoca bacteriën de behandeling overleefden. Een reden voor de discrepantie tussen
de twee methoden zou kunnen gevonden worden bij de viable but non-culturable (VBNC)
status. Dit kan veroorzaakt worden bij bacteriën onder stresscondities zoals een
nutriëntentekort of een incubatietemperatuur gelegen buiten de tolerantiegrenzen. Hierdoor
blijven de bacteriën de bacteriën wel in leven, maar zullen ze niet meer delen en een
minimale metabolische activiteit vertonen. Zo zijn ze niet meer detecteerbaar met behulp van
uitplatingen (Dewi Puspita et al., 2012; Oliver, 2005; Trevors et al., 2012). Er zijn al een
aantal species VBNC condities ontdekt maar voor K. oxytoca en S. salivarius werd dit nog
niet eerder beschreven. Echter bij andere Klebsiella species en Streptococcus faecalis
werden wel al eerder een VBNC status ontdekt (Oliver, 2005). Een behandeling met een
detergent zou kunnen zorgen voor een stressconditie, wat een VBNC status zou kunnen
induceren bij de bacteriën. Er moet vervolgens bij de uitplatingstechniek rekening mee
gehouden worden met een eventuele beïnvloeding van de resultaten door een VBNC status.
Indien de resultaten van de overleefbaarheid gemeten met de flow cytometer vergeleken
werden tussen S. salivarius en K. oxytoca, bleek dat de Triton X-100 gevoeligheid een groter
probleem vormt voor de eerste bacteriesoort. Voor S. salivarius bleek de overleving bij de
flow cytometer analyse maar een magere 7 à 8.5% te bedragen na een incubatie gedurende
15 minuten met Triton X-100. Eerder onderzoek heeft de gevoeligheid voor Triton X-100 van
de door hun gebruikte bacteriesoorten niet getest (Kaushik et al., 2009; Krachler et al., 2012;
Ruiz et al., 2011; Turpin et al., 2012). Van den Abbeele et al. (2009) deed dit wel voor de
gemengde bacterieculturen gebruikt in de mucineadhesietest maar bleek geen problemen te
ondervinden met de leefbaarheid na incubatie met 0.5% Triton X-100. Bij experimenten met
monoculturen bestaande uit intestinaal voorkomende bacteriën bleek Triton X-100 voor o.a.
46
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Bifidobacterium breve de viabiliteit wel aan te tasten (Grootaert et al., 2011). De gevoeligheid
van streptococci en in het bijzonder S. salivarius voor detergenten zoals Triton X-100 werd
nog niet eerder onderzocht. De toxiciteit die optreedt zou kunnen verklaard worden door de
membraanschade die de detergenten en maagzouten met detergenteigenschappen
veroorzaken. Dit werd reeds vastgesteld bij eukaryote cellen (Ignacio Barrasa et al., 2011;
Neu, 1996). Dit zou ook een effect kunnen hebben op de celmembranen en –wanden van
bacteriën. Een oppervlakte-actieve stof genaamd benzalkoniumchloride zou een penetratie
doorheen de lipide dubbellaag veroorzaken bij bacteriën. De cytoplasmatische membraan en
buitenste bacteriële membraan zou
zo
een
lekkende structuur
worden,
waaruit
cytoplasmatisch materiaal naar de omgeving kan vloeien. Dit zou kunnen leiden tot een
bacteriële celdood (Jaramillo et al., 2012). S. salivarius en K. oxytoca zijn respectievelijk een
gram-positieve en gram-negatieve bacteriesoort. Gram-positieve micro-organismen hebben
een dikkere peptidoglycaanwand zonder een extra buitenste celmembraan (Slonczewski &
Foster, 2009). Het verschil in de celwandsamenstelling tussen beide bacteriën zou aan de
basis kunnen liggen van het verschil in gevoeligheid voor Triton X-100. Deze gevoeligheid
zorgt ervoor dat er een alternatief nodig is voor de behandeling met dit detergent,
voornamelijk voor de experimenten met S. salivarius.
Een aantal alternatieve methoden om de aangehechte bacteriën los te maken zijn al eerder
beschreven. Een alternatief voor de Triton X-100 behandeling is de incubatie met een 0.25%
trypsine/EDTA-oplossing (Kaushik et al., 2009). Een extra incubatie met 0.025% Triton X100 nadat de cellaag losgemaakt werd van de well met 0.25% trypsine en 0.02% EDTA werd
ook al eerder uitgevoerd (Ruiz et al., 2011). De methode van Ruiz et al. (2011) is echter
geen optie voor adhesie-experimenten met S. salivarius omwille van het gebruik van Triton
X-100. Trypsine wordt voornamelijk gebruikt om de cellaag los te maken van het substraat
(o.a. cultuurflessen) en om onderlinge celcontacten te verbreken (Van Rompay, 2012b; Ruiz
et al., 2011). Kaushik et al. (2009) gebruikten enkel trypsinisatie tussen het wegwassen van
de niet-aangehechte bacteriën en het uitplaten van de aangehechte bacteriën. Er werd niet
besproken of de geadheerde bacteriën al dan niet loskwamen van de cellen. Het effect van
trypsine op de binding tussen de bacterie en de epitheliale cel is nog niet onderzocht
geweest, evenals ook experimenten naar de gevoeligheid van streptococci aan trypsine tot
nog toe ontbreken. Trypsine werd wel al toegepast om oppervlakte-moleculen te verwijderen
van de bacteriële celwand van Staphylococcus aureus (Solis et al., 2010). Dit zou de
verbinding tussen de bacterie en de epitheliale cel kunnen verbreken bij S. salivarius en zo
de bacteriën kunnen losmaken van de cellen. Trypsinisatie kan vervolgens een alternatief
bieden voor de Triton X-100 behandeling maar het effect van trypsine op de viabiliteit van de
bacterie dient eerst nog onderzocht te worden.
47
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Het gebruik van gedestilleerd water is terug te vinden om de cellaag te lyseren en dit lysaat
vervolgens uit te platen. Dit werd toegepast om geïnvadeerde Helicobacter pylori te kunnen
collecteren (Geethangili et al., 2010). Ook het in vitro lyseren van endotheliale cellen met
gedestilleerd water werd gebruikt om geïnvadeerde Streptococcus mutans te kunnen
onderzoeken (Abranches et al., 2011). Deze methode zou ook gebruikt kunnen worden om
epitheliale cellen osmotisch te lyseren, maar over het breken van de bindingen tussen de
bacteriën en cellen is nog niets gekend. Ook het effect van gedestilleerd water op de
leefbaarheid van de bacterie moet nog onderzocht worden. Gedestilleerd water zou dus een
alternatief kunnen bieden in het adhesieverhaal bij S. salivarius, mits bijkomend onderzoek
naar de efficiëntie van het protocol en de leefbaarheid van de bacterie gedurende de
behandeling.
In deze masterproef werd getracht de Triton X-100 behandeling te omzeilen door het
afschrapen van de cellaag met PBSD-. Deze ‘schraapmethode’ werd eerder gebruikt in de
literatuur. Het schrapen werd daar echter verricht met 0.1% Triton X-100 en de suspensie
van afgeschraapte cellen werd tweemaal door een 21gauche naald geduwd (Turpin et al.,
2012). Het effect van de gevormde wrijvingskracht door de naalden werd eerder onderzocht
met erythrocyten afkomstig uit bloedstalen. Hier bleken 22gauche naalden een hogere
hemolysegraad te vertonen dan 14gauche en 18gauche naalden (Sharp & Mohammad,
1998). De naald zou dus voor een extra wrijvingskracht kunnen zorgen op de epitheliale
cellen waardoor er cellyse kan optreden. Opnieuw verschijnt in de ‘schraapmethode’ van
Turpin et al. (2012) het detergent Triton X-100 in het protocol en kan dit vervolgens niet
toegepast worden bij adhesieproeven met S. salivarius.
Tenslotte werd de ‘schraapmethode’ tijdens de protocoloptimalisatie vervangen door de
behandeling met deoxycholaat. Natrium deoxycholaat is van nature uit een humaan,
secundair maagzout en heeft een anionisch, amfifiel karakter (Dejan et al., 2012).
Deoxycholaat heeft hierdoor ook detergentachtige eigenschappen en kan zich als een
oppervlakte-actieve stof gedragen (Ignacio Barrasa et al., 2011). S. salivarius bleek ook
gevoelig te zijn aan een deoxycholaat behandeling om de aangehechte bacteriën los te
maken. Er bleek bij de viabiliteitstest met uitplatingen dat er slechts 78% van de bacteriën
een incubatie van 15 minuten met deze stof overleefd hadden. Met de flow cytometer bleek
44% dezelfde behandeling niet te overleven, wat een nog lager overlevingspercentage gaf
dan de uitplatingen (Tabel 2, 3.2.2.4). K. oxytoca bleek de deoxycholaatbehandeling beter te
verdragen dan de detergent Triton X-100. Na 15 minuten incubatie bleek nog 80% en 98% te
overleven bij respectievelijk de uitplatingen en de flow cytometer. Het toxische effect van
deoxycholaat, voornamelijk manifesterend bij S. salivarius zou een gevolg kunnen zijn van
de detergentachtige kenmerken van deoxycholaat. Zoals eerder vermeld bij Triton
48
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
X-100 zou er membraanschade kunnen optreden gedurende de incubatie met deoxycholaat,
wat de viabiliteit van de bacteriën kan aantasten (Ignacio Barrasa et al., 2011). Het verschil
in leefbaarheid tussen Triton X-100 en deoxycholaat is tot nog toe niet uitgeklaard maar deze
detergenten zijn respectievelijk niet-ionisch en anionisch van aard (Lichtenberg et al., 1983).
Dit chemische structuurverschil zou mogelijk kunnen leiden tot een verschil in de sterkte van
de
membraanschade
dat
deze
oppervlakte-actieve
stoffen
kunnen
veroorzaken.
Deoxycholaat blijkt toch niet de ideale behandeling te zijn en verdere optimalisatie zal nodig
zijn om een meer betrouwbare test te kunnen uitvoeren.
Doordat bij de initiële adhesie-experimenten de recovery te laag lag om betrouwbare
uitplatingsresultaten te bekomen, werd er tijdelijk overgeschakeld naar testen met de flow
cytometer. Viabiliteitstesten van S. salivarius met een flow cytometer toonden, zoals reeds
aangehaald, aan dat er een sterke beschadiging optreedt bij een incubatie met Triton X-100.
De beschadiging bleek in 7 à 8% van de bacteriën zo sterk dat ze in de dode regio terecht
kwamen met een live/dead kleuring (Tabel 2, 3.2.2.4). Indien de viabiliteitstesten van S.
salivarius met de flow cytometer en de uitplatingen met elkaar vergeleken worden, blijkt het
percentage overlevenden sterk te verschillen bij hetzelfde percentage Triton X-100. Dit effect
werd ook al reeds besproken voor K. oxytoca. Er bleek 92.3% en 8.5% van de initiële
hoeveelheid K. oxytoca 0.7% Triton X-100 te overleven voor de testen met respectievelijk
uitplatingen en flow cytometer. De beschadigde bacteriën kunnen propidium jodide opnemen
waardoor deze verschuiven richting de dode regio. Uit een vorig onderzoek blijkt dat bij
Saccharomyces
cerevisiae
de
beschadiging
transiënt
kan
zijn
waardoor
de
membraanintegriteit na een korte incubatieperiode hersteld is (Davey & Hexley, 2011). De
mogelijkheid bestaat dat dit fenomeen ook optreedt bij S. salivarius en hierdoor het
percentage ‘beschadigd’ (49.2%) kan opgeteld worden bij de levende fractie zodat de nietdode fractie uitkomt op 57.7%. Maar dit blijkt enkel het verschil tussen de twee verschillende
viabiliteitstesten te verkleinen en niet volledig te overbruggen (57.7% en 92.3% niet-doden bij
respectievelijk flow cytometer en uitplatingen). Omdat bij de analyse met de flow cytometer
het aantal dode en beschadigde bacteriën ook in rekening gebracht kan worden, werd in de
protocoloptimalisatie overgeschakeld van uitplatingen naar flow cytometer.
De experimenten uitgevoerd met de flow cytometer bleken steeds een hoge achtergrond te
geven. De aangehechte bacteriën waren niet duidelijk te onderscheiden van de achtergrond,
wat de analyse sterk bemoeilijkte. In deze thesis werd een live/dead-kleuring gebruikt om het
aantal bacteriën te tellen. De geadheerde bacteriën werden in latere experimenten enkel
gekleurd met SYBR Green I omdat deze kleuring een beter resultaat gaf in vergelijking met
de combinatie van SYBR Green I en propidium jodide ( Figuur 12, 3.2.2.2). Alternatieve
kleuringen kunnen nog verder getest worden om de bekomen achtergrond niet meer te laten
49
De boel Kevin
overlappen
Masterproef 2012-2013
met
de
regio
waar
de
bacteriën
terug
te
vinden
zijn.
Carboxyfluoresceïnediacetaat (CFDA) zou een alternatief kunnen bieden voor de live/deadkleuring om een lagere achtergrond te bekomen. CFDA-kleuring meet de esterase activiteit
van cellen en kan zo metabolisch actieve en inactieve bacteriën van elkaar onderscheiden.
Er is echter tot nog toe geen informatie beschikbaar over het effect van Triton X-100 op de
metabolische activiteit van bacteriën. Indien er een invloed is van Triton X-100 op de
activiteit, zal de telling van de bacteriën niet meer betrouwbaar zijn met een CFDA-kleuring
omdat enkel metabolisch actieve cellen fluorescent gekleurd worden. De kans is reëel dat
Triton X-100 ook de metabolische activiteit van S. salivarius en K. oxytoca negatief
beïnvloedt aangezien dit detergent de leefbaarheid van deze bacteriën aantast. Bij Grootaert
et al. (2011) bleek de kleuringsefficiëntie van CFDA lager en variabeler te zijn dan deze voor
de live/dead kleuring bestaande uit SYBR Green I en propidium jodide voor bacteriële
monoculturen en intestinale microbiële mengsels. Een ander onderzoek toonde aan dat
Helicobacter pylori wel een consistente CFDA-labelingsefficiëntie bleek te vertonen (Logan
et al., 1998). Berney et al. (2007) concludeerde dat de combinatie van SYBR Green I en
propidium jodide een goede kleuringsmethode is voor bacteriële monoculturen. Voor orale
bacteriën zijn fluorescente kleuringen met bijhorende flow cytometer analysen nog niet
voldoende onderzocht. Een zeer recent artikel vergeleek bij orale biofilmen afkomstig van het
tandoppervlak
tien
verschillende
fluorescente
kleuringen
op
basis
van
hun
scheidingscapaciteit tussen levende en dode bacteriën. Een live/dead-kleuring bestaande uit
Syto 9 en propidium jodide en een kleuring voor metabolische activiteit bestaande uit Calcein
AM en Sytox red bleken de beste resultaten te geven waarbij er geen over- of onderschatting
van de dode bacteriën te zien was. De test werd echter geanalyseerd met epifluorescentie
microscopie en niet met de flow cytometer (Tawakoli et al., 2013). De kleuringen zouden nog
onderzocht moeten worden naar het achtergrondprobleem bij de flow cytometer adhesieexperimenten.
Er werd ook een filteringsmethode (0.45µm) uitgetest om te achtergrond bij de flow
cytometer analysen te verlagen. S. salivarius heeft een sferische celgrootte van 0.5-1.0µm
en kan nog vergroten doordat deze bacterie ketens kan vormen (Slonczewski & Foster,
2009). De bacteriële cel is dus groter dan 0.45µm en bleek dan ook tegengehouden te
worden (3.2.2.2) bij de filtermethode. Wat opviel was dat vooral de levende bacteriën werden
tegengehouden door de filter. De dode bacteriën bleken grotendeels door de filter te kunnen
passeren. Dit zou kunnen verklaard worden door de ketenvorming die optreedt bij S.
salvarius, wat bij het merendeel van de dode bacteriën ontbreekt. Ook zou schade aan de
bacteriële cel ertoe kunnen leiden dat de cel een kleinere omvang vertoont. Zo zouden een
50
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
deel van de dode bacteriën toch de filter kunnen passeren indien hun grootte bij de
ondergrens van ongeveer 0.5µm ligt.
In deze thesis werd gewerkt met een cellijn afkomstig van een humaan plaveiselcelcarcinoom t.h.v. de hoofd- en halsregio (TR146 cellijn). Flow cytometer experimenten
uitgevoerd met TR146 cellen zijn nog niet beschreven. Over de achtergrondvorming door
TR146 celdebris bij dit soort experimenten is dus tot nog toe niets gekend. De TR146 cellijn
blijkt een goede optie voor onderzoek naar het niet-gekeratiniseerd humaan epitheel en is
uitvoerig getest naar zijn permeabiliteit (Patel et al., 2012). Er zijn echter nog geen
experimenten beschreven over de adhesie van bacteriën aan de orale mucosa met in vitro
modellen, waaronder de TR146 cellijn. Kaushik et al. (2009) heeft een adhesie-experiment
uitgevoerd met een Caco-2 cellijn die 20 dagen werd onderhouden nadat een confluente
laag gevormd was. In deze thesis werd ook een test uitgevoerd met een gedifferentieerde
cellaag waarbij de 6-well plaat gedurende twee weken in de incubator bleef staan nadat een
confluente cellaag gevormd werd (3.2.2.2). De test werd uitgevoerd met de flow cytometer.
Het aantal aangehechte bacteriën lag bij een waarde van 104 kve per well, maar de recovery
lag te laag (27-32%). Het aantal geadheerde bacteriën kon niet vergeleken worden met de
parallel uitgevoerde test met een verse, confluente cellaag omdat het aantal aangehechte
bacteriën bij deze laatste een lagere waarde vertoonde dan de blanco waarde. De
gedifferentieerde plaat
had echter geen voordeel
ten opzichte
van
voorgaande
experimenten, waar het aantal aangehechte bacteriën eveneens rond een waarde van 104
kve per well lag. Het bekomen resultaat weegt daarom niet op tegen het onderhoudswerk om
een plaat twee weken in cultuur te houden. Een nieuw model genaamd EpiOralTM (MatTek
Corporation, USA) is reeds commercieel beschikbaar waarbij het buccale weefsel in vitro
wordt nagebootst. Dit bestaat uit een basaal membraan en een meerlagig, nietgekeratiniseerd buccaal epitheel waardoor een driedimensionaal model ontstaat (Patel et al.,
2012). Het gebruik van EpiOralTM zou als voordeel hebben dat het minder onderhoudswerk
vereist dan de reeds besproken testen met zelf in cultuur gebrachte gedifferentieerde
cellagen. Ook zou het de realiteit beter benaderen dan eenlagige confluente cellijnen, wat
een voordeel kan bieden bij het onderzoek naar de pathogenese van bepaalde orale ziekten
waaronder orale mucositis.
Ondanks de problemen die de kop op staken tijdens het optimalisatieproces werd er toch in
geslaagd de recovery naar de gewenste 100% te krijgen bij adhesie-experimenten met
K. oxytoca (Tabel 4, 3.2.3). Bij deze experimenten werden de aangehechte bacteriën
losgemaakt met een deoxycholaatbehandeling en het aantal bacteriën geanalyseerd met de
uitplatingstechniek. Er bleek een tendens te zijn, indien per test geanalyseerd, waarbij
bestraling (X-stralen, 10Gy) kan leiden tot een hoger adhesiepercentage (AD/ST). Maar het
51
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
verschil bleek niet significant te zijn indien de 9 wells per conditie als een geheel
geanalyseerd werden. Er zijn tot nog toe geen experimenten beschreven die het effect
onderzoeken van bestraling op de adhesiecapaciteiten van bacteriën aan epitheliale cellen.
Een ander type van stressbehandeling werd wel al eerder onderzocht met een
enterohaemorrhagische Escherichia coli stam (EHEC O157:H7). Adhesie aan epitheliale
cellen (CaCo-2 en HEp-2) bleek versterkt te worden wanneer zuurstress werd geïnduceerd
(House et al., 2009). Staphylococcus aureus bleek uit een ander onderzoek een verhoogde
adhesie te vertonen aan een A549 cellaag (humane, longepitheelcellen) bij een behandeling
met sigarettenrook. Deze rook bevat onder andere reactieve zuurstofmoleculen (ROS), die
oxidatieve stress kunnen veroorzaken. Het is mogelijk dat deze oxidatieve stress de
adhesiecapaciteit van Staph. aureus zou kunnen verhogen (Kulkarni et al., 2012). Dit doet
vermoeden dat stresstolerante bacteriën een hogere adhesiegraad kunnen vertonen bij
X-bestraling om zo een effect te kunnen uitoefenen op de ontwikkeling van orale mucositis.
Echter moet het bestralingseffect op orale bacteriën verder onderzocht worden om geen
voorbarige conclusies te trekken.
Adhesie kan verklaard worden door twee types interacties, namelijk de specifieke binding
tussen receptoren en liganden en de niet-specifieke bindingen gebaseerd op fysicochemische interacties, waaronder de hydrofobiciteit (Grivet et al., 2000). Naast mogelijke
effecten van bestraling op de specifieke adhesie zou de adhesiecapaciteit van bacteriën ook
beïnvloed kunnen worden door de hydrofobiciteit van de bacteriële celwand. Dit bacteriële
kenmerk zou voornamelijk gedurende de vroege fase van adhesie een rol kunnen spelen
(Hahnel et al., 2010). Experimenten met drie bacteriesoorten bleken geen duidelijk patroon
te geven in de hydrofobiciteit gedurende een 8-uursopvolging (3.3.1). Er bleek veel variatie
tussen de verschillende testen voor te komen alsook binnen eenzelfde experiment. Deze
lage reproduceerbaarheid leidt er dan ook toe dat er geen besluit gevormd kan worden over
een mogelijk effect van bestraling op de hydrofobiciteit van de bacteriën. Er werd
daarentegen wel een duidelijk verschil waargenomen in de initiële hydrofobiciteit van de
bacteriën. De hoogste waarde bleek weggelegd te zijn voor S. salivarius, namelijk rond
100%. L. salivarius bleek een intermediaire hydrofobiciteit te vertonen en K. oxytoca zou een
eerder hydrofiel karakter hebben (3.3.2).
4.2.
Pathogeniciteit van orale bacteriën: wat is de oorzaak en wat doet
bestraling?
Een tweede luik in dit onderzoek omvat de pathogeniciteit van bacteriën. De testen werden
uitgevoerd met Streptococcus salivarius. De pathogeniciteit werd getest door het injecteren
van Galleria mellonella larven met bacteriële monoculturen. Dit non-vertebrate diermodel
bleek
een
opvallende
gelijkenis
te
vertonen
52
met
het
menselijke,
aangeboren
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
immuunsysteem. De hemocyten bij G. mellonella blijken net als bij humane neutrofielen een
fagocyterende functie uit te oefenen (Bergin et al., 2005; Lionakis, 2011). De gelijkenis
tussen het humane immuunsysteem en deze van de larven geeft de mogelijkheid om de
pathogeniciteit van bacteriën te testen bij G. mellonella (Navarro-Velasco et al., 2011). Deze
experimenten moeten eerder aanschouwd worden als een verkennende test aangezien het
volledige humane immuunsysteem niet aanwezig is bij deze larven. Het geeft wel een
indicatie over hoe het menselijk afweersysteem zou reageren op de aanwezigheid van deze
bacteriën (Olsen et al., 2011).
De larven werden voor verschillende kenmerken dagelijks opgevolgd en een score
toegekend. De belangrijkste parameter in dit onderzoek bleek de overleving van de larven.
Er was duidelijk een negatief effect van het injecteren van een bacteriële suspensie op de
overlevingskans van de larve (Figuur 9, 3.1.2). Er werd ook in elk experiment eenzelfde
verschil waargenomen, waarbij larven geïnjecteerd met niet-bestraalde S. salivarius een
hogere overleving vertoonden dan larven geïnjecteerd met bestraalde bacteriën gedurende
de eerste 24 uur. Dit was op te merken bij de Kaplan-Meier curve en bij de
overlevingscurven voor de drie individuele testen. Echter bleek er geen significantie op te
treden. Uit een onderzoek naar de pathogeniciteit van groep A streptococci, waartoe
pathogene species zoals Streptococcus pyogenes behoren, bleek het effect zich ook
voornamelijk gedurende de eerste 24 uur te manifesteren. De testen werden ook uitgevoerd
met G. mellonella (Olsen et al., 2011). Een verschil in overleving van G. mellonella larven na
inoculatie met verschillende niet-invasieve en invasieve Streptococcus mutans stammen
bleek zich eveneens voornamelijk te manifesteren gedurende de eerste 24 uur (Abranches
et al., 2011). Een diepere screening van de eerste 24 uur na inoculatie blijkt vervolgens zeer
nuttig voor de pathogeniciteitstesten.
Vervolgens werden extra experimenten uitgevoerd en voornamelijk gekeken naar de
overleving één dag na de injectie (3.1.3). Testen met het injecteren van gefixeerde bacteriën
gaven een overleving van 100%, wat niet geval was bij de injectie met levende S. salivarius.
Dit zou kunnen duiden op het veroorzaken van een ziektestatus bij de larven door de
levende bacteriën. De aanwezigheid van S. salivarius, zonder dat deze levend en/of
metabolisch actief is, zou een minder belangrijke rol spelen in de pathogeniciteit van de
bacterie. Uit experimenten met het injecteren van supernatans afkomstig van S. salivarius
monoculturen bleek dat dit supernatans geen larven doodde, voor zowel de bestraalde als
niet-bestraalde conditie. Het zou kunnen dat de pathogeniciteit van S. salivarius niet door
excretie van bepaalde eiwitten of moleculen wordt veroorzaakt, maar door een onderling
contact tussen de bacteriële cel en de gastheercel. Eerder onderzoek met Staphylococcus
aureus gaf eenzelfde resultaat bij virulentietesten met G. mellonella. Staph. aureus is net als
53
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
S. salivarius een gram-positieve bacteriesoort en kan ook de orale omgeving koloniseren.
Zowel bacterievrij filtraat als door warmtebehandeling gedode bacteriën bleken geen
significant effect te vertonen op de overleving van de larven (Desbois & Coote, 2011). Het
bacterievrij filtraat en de warmtebehandeling zijn analoog aan respectievelijk de inoculatie
van het supernatans en gefixeerde bacteriën in deze masterproef. Dit proefschrift bevestigt
de bevindingen van Desbois & Coote (2011), al zijn de effecten van levende bacteriën hier
niet significant ten opzichte van supernatans en afgedode bacteriën. Er werden echter maar
twee experimenten uitgevoerd in dit proefschrift met de injectie van gefixeerde bacteriën en
supernatans.
Ook andere parameters werden opgevolgd gedurende de pathogeniciteitstesten. De
melanisatie en mobiliteit van de larven bleken eenzelfde patroon te vertonen als de
overleving van de larven (3.1.1). De mobiliteit werd meegenomen als parameter met het idee
dat het een indicatie geeft over de leefbaarheid van de larven. Een goede beweeglijkheid
zou gelinkt kunnen zijn aan een gezondere larve. Dit was ook te zien uit de resultaten
waarbij gezonde larven nog zeer beweeglijk waren en de zieke larven nog weinig tot niet
meer bewogen. Mobiliteit is echter een eerder subjectieve parameter, wat de besluittrekking
uit experimenten kan bemoeilijken. Melanisatie werd eerder al gelinkt aan de aangeboren
immuunreacties bij insectenlarven. De verkleuring van de larve is een gevolg van
melanineproductie en de accumulatie van dit pigment in het hemolymfe na de activatie van
het profenoloxidase-systeem (Cerenius et al., 2008; Söderhäll & Cerenius, 1998). Een sterke
immuunrespons leidt tot de verkleuring van de larve tot een zwarte kleur (Söderhäll &
Cerenius, 1998). Dit zou gelinkt kunnen worden aan de overleving waarbij zieke larven een
sterkere immuunrespons vertonen om de pathogene bacteriën alsnog onschadelijk te maken
en hierdoor een zwartere kleur vertonen.
De laatste parameter, de coconvorming, werd bij de verwerking van de resultaten niet
beschouwd. Dit kenmerk kon een indicatie zijn van de gezondheidsstatus van de larve,
waarbij een gezonde larve zijn metamorfose verder kon zetten. Er is echter nog geen eerder
onderzoek verricht naar de coconvorming bij G. mellonella. De vorming van cocons begon
na vier dagen bij larven van een zeer goede kwaliteit, maar in de meeste testen vond dit in
een nog verder verloop van de test plaats. Het kon vervolgens niet nauwkeurig opgevolgd
worden door de timing van de proefopzet. Algemeen kan dan ook besloten worden dat de
overleving en melanisatie eerder al werden gebruikt en beschreven in de literatuur. Door hun
meer objectieve karakter kunnen ze dienen als een van de meest betrouwbare parameters
om de pathogeniciteit te onderzoeken met dit model.
54
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
5. Toekomstperspectieven
Uit de adhesie-experimenten met Streptococcus salivarius blijkt dat er een verdere
optimalisatie van het protocol vereist is. De behandeling met Triton X-100 of deoxycholaat
heeft een negatief effect op de viabiliteit van deze bacteriesoort. Alternatieven voor het
losmaken van de aangehechte bacteriën kunnen een incubatie zijn met trypsine of
gedestilleerd water. Er kan gezocht worden naar een andere cellijn die meer compatibel is
met S. salivarius om de adhesie te testen. EpiOralTM (MatTek Corporation, USA) zou een
alternatief kunnen bieden waarbij dit in vitro model de in vivo omgeving beter kan nabootsen
(Patel et al., 2012). Het gebruik van de flow cytometer kan ten opzichte van de uitplatingen
als voordeel bieden dat het zowel de levende als dode bacteriën kan tellen bij het gebruik
van een life/dead kleuring. De achtergrond blijkt echter een probleem en er zal verder
onderzocht moeten worden hoe dit probleem kan opgelost worden. De gevormde
achtergrond van de gebruikte cellijn dient in kaart te worden gebracht en er kunnen
verschillende kleuringen onderzocht worden naar de methode die het celdebris en de
bacteriën het beste kan onderscheiden. De achtergrondcorrectie zal voor iedere gebruikte
cellijn apart moeten uitgevoerd worden.
De adhesie aan agarmucine dient ook verder geoptimaliseerd te worden. De mucinelaag is
een eerste barrière die de micro-organismen tegenkomen om tot aan de epitheelcellen te
geraken. Adhesie aan agarmucine kan daarom een belangrijke rol spelen om vervolgens bij
te dragen tot de ontwikkeling van orale mucositis. De experimenten uitgevoerd in deze thesis
bleken niet te lukken door het loskomen van de agarmucine van de wellbodems. Een 12-well
plaat kan een oplossing bieden vanwege het kleinere welloppervlak. De incubatieduur
verkorten zou het loskomen ook kunnen voorkomen, maar er moet rekening gehouden
worden met de tijd die nodig is om de bacteriën te kunnen laten adheren.
Er kan extra onderzoek verricht worden naar de oppervlaktemoleculen aanwezig op de
celwanden van S. salivarius. Dit kan door de proteïnemoleculen te verwijderen van de
celwand met behulp van proteasen (trypsine of proteïnase K), te collecteren en vervolgens te
analyseren met tandem massaspectrometrie. Cell shaving, zoals dit ook wel genoemd wordt,
werd al eerder uitgevoerd bij Streptococcus pyogenes (Rodríguez-Ortega et al., 2006) en
Staphylococcus aureus (Solis et al., 2010). Het effect van bestraling op de organisatie van
deze oppervlaktemoleculen kan onderzocht worden met deze techniek. Ook kunnen
bacteriën zonder oppervlaktemoleculen en een bacterieloze suspensie bestaande uit deze
moleculen geïnjecteerd worden in Galleria mellonella larven om zo hun rol in de
pathogeniciteit van de bacteriën te ontrafelen.
55
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
De pathogeniciteit kan verder onderzocht worden door het hemolymfe te collecteren, wat al
in eerder onderzoek toegepast werd (Lionakis, 2011; Shaik & Sehnal, 2009). Zowel de
immuniteitscellen (hemocyten) van de larven alsook aanwezige bacteriële proteïnen kunnen
gecollecteerd en geanalyseerd worden. Bevindingen kunnen vervolgens gelinkt worden aan
de gezondheidsstatus van de larven. Ook het aantal aangehechte bacteriën kunnen
gecollecteerd worden om zo de adhesie van bacteriën en de pathogeniciteit te kunnen linken
aan elkaar. Dit werd al geprobeerd in deze masterproef maar er was geen DNA te
detecteren na een S. salivarius specifieke PCR. Het protocol in deze masterproef dient
vervolgens geoptimaliseerd te worden om kwantificatie met qPCR mogelijk te maken. In een
verder stadium van dit onderzoek kan ook het gebruik van vertebrate diermodellen,
bijvoorbeeld muizen, overwogen worden om een meer realistische link te kunnen leggen
naar de mens.
In deze thesis werden de experimenten voornamelijk uitgevoerd met S. salivarius.
Toekomstig onderzoek kan echter ook toegespitst worden op andere orale bacteriesoorten.
Andere orale streptococci die het mucosale oppervlakte koloniseren, waaronder S. mitis en
S. oralis zijn kandidaten. Pathogene bacteriën, zoals Klebsiella oxytoca en S. pyogenes,
kunnen ook interessant zijn voor verder onderzoek. De mogelijke rol van zowel endogene als
pathogene bacteriën in de ontwikkeling van orale mucositis is nog niet gekend, maar de
ulceratiefase kan wel leiden tot een nauwer contact tussen bacteriën en humane
immuniteitscellen (Sonis, 2004). Het effect van bestraling op zowel commensale als
pathogene soorten dient daarom onderzocht te worden. Potentiële probioticumstammen
kunnen eveneens onderzocht worden om een beter beeld te kunnen krijgen om een goede
kandidaat te kunnen kiezen in de toekomst. Momenteel ontwikkelt ActoGenix NV
(Zwijnaarde) een genetisch gemodifieerde Lactococcus lactis stam (AG013) die Trefoil
Factor 1 (TFF1) produceert en die toegediend kan worden bij orale mucositis patiënten om
deze acute ontsteking te onderdrukken. Dit zou de epitheliale schade, veroorzaakt in de
ulceratiefase, kunnen herstellen (Caluwaerts et al., 2010). AG013 zou zich op dit moment in
de tweede klinische fase bevinden. Door de oorzaak van orale mucositis verder te
onderzoeken zouden nieuwe probiotica ontwikkeld kunnen worden die kunnen inspelen op
bacteriële eigenschappen en virulentiefactoren die een rol zouden kunnen spelen in het
ontwikkelingsproces van orale mucositis.
56
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
6. Conclusie
Het ontstaan van orale mucositis door bestraling is nog niet volledig opgehelderd. De
mogelijke rol van bacteriën in de ontwikkeling van deze acute ontsteking is nog niet bekend.
Orale mucositis als neveneffect van de kankerbehandeling kan nochtans leiden tot hevige
pijnen, het niet meer oraal kunnen opnemen van voeding en tot het uitstellen van de
stralingstherapie. Orale mucositis wordt momenteel voornamelijk palliatief behandeld.
Pijnstillende middelen, voeding via katheters en het onderhouden van een goede orale
hygiëne zijn op dit moment de voornaamste methoden om de symptomen te onderdrukken.
Preventieve behandelingen zijn nog niet beschikbaar. Het is daarom belangrijk om het
ontwikkelingsproces van orale mucositis verder te onderzoeken.
Adhesie aan het mucosale oppervlakte is de eerste stap naar de vorming van biofilmen en
het veroorzaken van infecties. In dit proefschrift werd geprobeerd de adhesie-experimenten
te optimaliseren. Bestraling bleek een klein, positief effect op de adhesiecapaciteit van
Klebsiella oxytoca uit te oefenen, al was dit niet significant. De adhesie-experimenten dienen
nog verder geoptimaliseerd te worden om vervolgens het effect van bestraling beter te
kunnen onderzoeken. Experimenten met verschillende bacteriesoorten zouden interessante
informatie kunnen bieden.
De mogelijkheid tot het veroorzaken van ontstekingen in de orale omgeving is een tweede
kenmerk dat zeker van belang is in dit onderzoek. Galleria mellonella blijkt een goed
diermodel te zijn om de pathogeniciteit te onderzoeken. Er bleek dat de levende bacteriën
zorgden voor de afdoding van de larven. Bestraling verhoogde de pathogeniciteit van S.
salivarius, al was dit effect niet significant. Er moet wel rekening mee gehouden worden dat
het diermodel sterke gelijkenissen vertoont met het aangeboren, humane immuunsysteem
maar niet identiek is. De pathogeniciteit is zeker ook een bacteriële eigenschap waar
onderzoek naar nodig is om een betere kijk te kunnen hebben op de ontwikkeling van orale
mucositis. Indien de oorzaak van orale mucositis en de rol van bacteriën hierbij gekend is
kunnen toekomstige therapieën hierop inspelen en er zo voor zorgen dat kankerpatiënten
geen
overlast
meer
ondervinden
van
de
bestralingstherapie.
57
voor
hun
mogelijks
levensreddende
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
7. Referentielijst
Van den Abbeele, P., Grootaert, C., Possemiers, S., Verstraete, W., Verbeken, K. & Van de
Wiele, T. (2009). In vitro model to study the modulation of the mucin-adhered bacterial
community. Applied microbiology and biotechnology 83, 349–59.
Abranches, J., Miller, J. H., Martinez, A. R., Simpson-Haidaris, P. J., Burne, R. A. & Lemos,
J. A. (2011). The collagen-binding protein Cnm is required for Streptococcus mutans
adherence to and intracellular invasion of human coronary artery endothelial cells.
Infection and immunity 79, 2277–84.
Avila, M., Ojcius, D. M. & Yilmaz, O. (2009). The oral microbiota: living with a permanent
guest. DNA and cell biology 28, 405–11.
Barasch, A. & Peterson, D. E. (2003). Risk factors for ulcerative oral mucositis in cancer
patients: unanswered questions. Oral oncology 39, 91–100.
Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B. & Kavanagh, K. (2005). Superoxide
production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the
NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infection and immunity 73, 4161–70.
Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H.-U. & Egli, T. (2007). Assessment
and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in
combination with flow cytometry. Applied and environmental microbiology 73, 3283–90.
Bernier, J. & Horiot, J.-C. (2012). Altered-fractionated radiotherapy in locally advanced head
and neck cancer. Current opinion in oncology 24, 223–8.
Burton, J. P., Cowley, S., Simon, R. R., McKinney, J., Wescombe, P. a & Tagg, J. R. (2011).
Evaluation of safety and human tolerance of the oral probiotic Streptococcus salivarius
K12: a randomized, placebo-controlled, double-blind study. Food and chemical
toxicology 49, 2356–64. Elsevier Ltd.
Burton, J. P., Wescombe, P. A., Moore, C. J., Chilcott, C. N. & Tagg, J. R. (2006). Safety
Assessment of the Oral Cavity Probiotic Streptococcus salivarius K12. Applied and
Environmental Microbiology 72, 3050–3053.
Caluwaerts, S., Vandenbroucke, K., Steidler, L., Neirynck, S., Vanhoenacker, P., Corveleyn,
S., Watkins, B., Sonis, S., Coulie, B. & Rottiers, P. (2010). AG013, a mouth rinse
formulation of Lactococcus lactis secreting human Trefoil Factor 1, provides a safe and
efficacious therapeutic tool for treating oral mucositis. Oral oncology 46, 564–570.
Elsevier Ltd.
Caphosol. (n.d.). Evaluation of the severity of oral mucositis. Geraadpleegd op 16 mei 2013
via www.caphosolcare.com/en/healthcare-professionals/about-oral-mucositis/
symptoms-of-oral-mucositis/
Cerenius, L., Lee, B. L. & Söderhäll, K. (2008). The proPO-system: pros and cons for its role
in invertebrate immunity. Trends in immunology 29, 263–71.
58
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Cheng, K. K. F., Molassiotis, A., Chang, A. M., Wai, W. C. & Cheung, S. S. (2001).
Evaluation of an oral care protocol intervention in the prevention of chemotherapyinduced oral mucositis in paediatric cancer patients. European journal of cancer
(Oxford, England : 1990) 37, 2056–63.
Davey, H. M. & Hexley, P. (2011). Red but not dead? Membranes of stressed
Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environmental
microbiology 13, 163–71.
Dejan, M. C., Pos, M. M. & Krstonos, V. S. (2012). Interactions between Sodium Cholate or
Sodium Deoxycholate and Nonionic Surfactant ( Tween 20 or Tween 60 ) in Aqueous
Solution. Industrial & Engineering Chemistry Research 51, 3670–3676.
Delaney, G. P., Fisher, R. J., Smee, R. I., Hook, C. & Barton, M. B. (1995). Split-course
accelerated therapy in head and neck cancer: an analysis of toxicity. International
journal of radiation oncology, biology, physics 32, 763–8.
Desbois, A. P. & Coote, P. J. (2011). Wax moth larva (Galleria mellonella): an in vivo model
for assessing the efficacy of antistaphylococcal agents. The Journal of antimicrobial
chemotherapy 66, 1785–90.
Dewi Puspita, I., Kamagata, Y., Tanaka, M., Asano, K. & Nakatsu, C. H. (2012). Are
Uncultivated Bacteria Really Uncultivable? Microbes and Environments 27, 356–366.
Dodd, M. (2004). The pathogenesis and characterization of oral mucositis associated with
cancer therapy. Oncology nursing forum 31, 5–11.
Dongari-Bagtzoglou, A. (2008). Mucosal biofilms: challenges and future directions. Expert
review of anti-infective therapy 6, 141–4.
Duncan, M. & Grant, G. (2003). Review article : oral and intestinal mucositis — causes and
possible treatments. Aliment Pharmacol Ther 18, 853–874.
Edwards, A. M., Manetti, A. G. O., Falugi, F., Zingaretti, C., Capo, S., Buccato, S., Bensi, G.,
Telford, J. L., Margarit, I. & Grandi, G. (2008). Scavenger receptor gp340 aggregates
group A streptococci by binding pili. Molecular microbiology 68, 1378–94.
Elting, L. S., Cooksley, C. D., Chambers, M. S. & Garden, A. S. (2007). Risk, outcomes, and
costs of radiation-induced oral mucositis among patients with head-and-neck
malignancies. International journal of radiation oncology, biology, physics 68, 1110–20.
Fedhila, S., Daou, N., Lereclus, D. & Nielsen-LeRoux, C. (2006). Identification of Bacillus
cereus internalin and other candidate virulence genes specifically induced during oral
infection in insects. Molecular microbiology 62, 339–55.
Filoche, S., Wong, L. & Sissons, C. H. (2010). Oral biofilms: emerging concepts in microbial
ecology. Journal of dental research 89, 8–18.
Fuchs, B. B. & Mylonakis, E. (2006). Using non-mammalian hosts to study fungal virulence
and host defense. Current opinion in microbiology 9, 346–51.
59
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Geethangili, M., Fang, S.-H., Lai, C.-H., Rao, Y. K., Lien, H.-M. & Tzeng, Y.-M. (2010).
Inhibitory effect of Antrodia camphorata constituents on the Helicobacter pyloriassociated gastric inflammation. Food Chemistry 119, 149–153. Elsevier Ltd.
Grivet, M., Morrier, J. J., Benay, G. & Barsotti, O. (2000). Effect of hydrophobicity on in vitro
streptococcal adhesion to dental alloys. Journal of materials science Materials in
medicine 11, 637–42.
Grootaert, C., Boon, N., Zeka, F., Vanhoecke, B., Bracke, M., Verstraete, W. & Wiele, T. Van
De. (2011). Adherence and viability of intestinal bacteria to differentiated Caco-2 cells
quantified by flow cytometry. Journal of Microbiological Methods 86, 33–41. Elsevier
B.V.
Hahnel, S., Henrich, A., Rosentritt, M., Handel, G. & Bürgers, R. (2010). Influence of artificial
ageing on surface properties and Streptococcus mutans adhesion to dental composite
materials. Journal of materials science Materials in medicine 21, 823–33.
He, X., Hu, W., Kaplan, C. W., Guo, L., Shi, W. & Lux, R. (2012). Adherence to streptococci
facilitates Fusobacterium nucleatum integration into an oral microbial community.
Microbial ecology 63, 532–42.
House, B., Kus, J. V, Prayitno, N., Mair, R., Que, L., Chingcuanco, F., Gannon, V.,
Cvitkovitch, D. G. & Barnett Foster, D. (2009). Acid-stress-induced changes in
enterohaemorrhagic Escherichia coli O157 : H7 virulence. Microbiology (Reading,
England) 155, 2907–18.
Igarashi, T., Yano, Y., Yamamoto, A., Sasa, R. & Goto, N. (2001). Identification of
Streptococcus salivarius by PCR and DNA probe. Letters in Applied Microbiology 32,
394–397.
Ignacio Barrasa, J., Olmo, N., Pérez-Ramos, P., Santiago-Gómez, A., Lecona, E., Turnay, J.
& Antonia Lizarbe, M. (2011). Deoxycholic and chenodeoxycholic bile acids induce
apoptosis via oxidative stress in human colon adenocarcinoma cells. Apoptosis 16,
1054–67.
Jacobsen, C. N., Nielsen, V. R., Hayford, A. E., Michaelsen, K. F., Pærregaard, A.,
Sandström, B., Jakobsen, M. & Møller, P. L. (1999). Screening of Probiotic Activities of
Forty-Seven Strains of Lactobacillus spp . by In Vitro Techniques and Evaluation of the
Colonization Ability of Five Selected Strains in Humans Screening of Probiotic Activities
of Forty-Seven Strains of Lactobacillus. Applied and environmental microbiology 65,
4949–4956.
Jaramillo, D. E., Arriola, A., Safavi, K. & Chávez de Paz, L. E. (2012). Decreased bacterial
adherence and biofilm growth on surfaces coated with a solution of benzalkonium
chloride. Journal of endodontics 38, 821–825.
Jham, B. C., França, E. C., Oliveira, R. R., Santos, V. R., Kowalski, L. P. & Da Silva Freire,
A. R. (2007). Candida oral colonization and infection in Brazilian patients undergoing
head and neck radiotherapy: a pilot study. Oral surgery, oral medicine, oral pathology,
oral radiology, and endodontics 103, 355–8.
60
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Kaplan, C. W., Lux, R., Haake, S. K. & Shi, W. (2009). The Fusobacterium nucleatum outer
membrane protein RadD is an arginine-inhibitable adhesin required for inter-species
adherence and the structured architecture of multispecies biofilm. Molecular
microbiology 71, 35–47.
Kaushik, J. K., Kumar, A., Duary, R. K., Mohanty, A. K., Grover, S. & Batish, V. K. (2009).
Functional and probiotic attributes of an indigenous isolate of Lactobacillus plantarum.
PloS one 4, e8099.
Keefe, D. M., Rassias, G., O’Neil, L. & Gibson, R. J. (2007). Severe mucositis: how can
nutrition help? Current opinion in clinical nutrition and metabolic care 10, 627–31.
Kim, B. N., Ryu, J., Kim, Y. S. & Woo, J. H. (2002). Retrospective analysis of clinical and
microbiological aspects of Klebsiella oxytoca bacteremia over a 10-year period.
European journal of clinical microbiology & infectious diseases 21, 419–26.
Kolenbrander, P. E. (2000). Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic
systems. Annual review of microbiology 54, 413–37.
Kolenbrander, P. E., Palmer, R. J., Periasamy, S. & Jakubovics, N. S. (2010). Oral
multispecies biofilm development and the key role of cell-cell distance. Nature reviews
Microbiology 8, 471–80. Nature Publishing Group.
Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C. & Orth, K. (2012). In vitro characterization of
multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated
from wounded military personnel. Virulence 3, 389–99.
Kulkarni, R., Antala, S., Wang, A., Amaral, F. E., Rampersaud, R., Larussa, S. J., Planet, P.
J. & Ratner, A. J. (2012). Cigarette smoke increases Staphylococcus aureus biofilm
formation via oxidative stress. Infection and immunity 80, 3804–11.
Lalla, R. V, Sonis, S. T. & Peterson, D. E. (2008). Management of oral mucositis in patients
who have cancer. Dental clinics of North America 52, 61–77.
Lichtenberg, D., Robson, R. J. & Dennis, E. A. D. (1983). Solubilization of phospholipids by
detergents: structural and kinetic aspects. Biochimica et biophysica acta 737, 285–304.
Lionakis, M. S. (2011). Drosophila and Galleria insect model hosts: new tools for the study of
fungal virulence, pharmacology and immunology. Virulence 2, 521–7.
Logan, R. P., Robins, a, Turner, G. a, Cockayne, a, Borriello, S. P. & Hawkey, C. J. (1998). A
novel flow cytometric assay for quantitating adherence of Helicobacter pylori to gastric
epithelial cells. Journal of immunological methods 213, 19–30.
Marcotte, H. & Lavoie, M. C. (1998). Oral Microbial Ecology and the Role of Salivary
Immunoglobulin A Oral Microbial Ecology and the Role of Salivary Immunoglobulin A.
Microbiology and molecular biology reviews 62, 71–109.
Marcu, L. G. (2010). Altered fractionation in radiotherapy: from radiobiological rationale to
therapeutic gain. Cancer treatment reviews 36, 606–14. Elsevier Ltd.
61
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
McCarthy, G. M., Awde, J. D., Ghandi, H., Vincent, M. & Kocha, W. I. (1998). Risk factors
associated with mucositis in cancer patients receiving 5-fluorouracil. Oral oncology 34,
484–90.
McLandsborough, L., Rodriguez, a., Pérez-Conesa, D. & Weiss, J. (2006). Biofilms: At the
Interface between Biophysics and Microbiology. Food Biophysics 1, 94–114.
Mcnab, R., Holmes, A. R., Clarke, J. M., Tannock, G. W., Nab, R. M. C., Holmes, A. N. N. R.,
Clarke, J. M. & Tannock, G. W. (1996). Cell surface polypeptide CshA mediates binding
of Streptococcus gordonii to other oral bacteria and to immobilized fibronectin . Cell
Surface Polypeptide CshA Mediates Binding of Streptococcus gordonii to Other Oral
Bacteria and to Immobilized Fibronectin. Infection and immunity 64, 4204–4210.
Mukherjee, K., Altincicek, B., Hain, T., Domann, E., Vilcinskas, A. & Chakraborty, T. (2010).
Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and
environmental microbiology 76, 310–7.
Navarro-Velasco, G. Y., Prados-Rosales, R. C., Ortíz-Urquiza, A., Quesada-Moraga, E. & Di
Pietro, A. (2011). Galleria mellonella as model host for the trans-kingdom pathogen
Fusarium oxysporum. Fungal genetics and biology : FG & B 48, 1124–9.
Nelun Barfod, M., Magnusson, K., Lexner, M. O., Blomqvist, S., Dahlén, G. & Twetman, S.
(2011). Oral microflora in infants delivered vaginally and by caesarean section.
International journal of paediatric dentistry / the British Paedodontic Society [and] the
International Association of Dentistry for Children 21, 401–6.
Neu, T. R. (1996). Significance of bacterial surface-active compounds in interaction of
bacteria with interfaces. Microbiological reviews 60, 151–66.
Nobbs, A. H., Lamont, R. J. & Jenkinson, H. F. (2009). Streptococcus adherence and
colonization. Microbiology and molecular biology reviews 73, 407–450.
Oliver, J. D. (2005). The viable but nonculturable state in bacteria. Journal of microbiology
(Seoul, Korea) 43 Spec No, 93–100.
Olsen, R. J., Watkins, M. E., Cantu, C. C., Beres, S. B. & Musser, J. M. (2011). Virulence of
serotype M3 Group A Streptococcus strains in wax worms ( Galleria mellonella larvae).
Virulence 2, 111–119.
Overgaard, J., Hansen, H. S., Specht, L., Overgaard, M., Grau, C., Andersen, E., Bentzen,
J., Bastholt, L., Hansen, O. & other authors. (2003). Five compared with six fractions per
week of conventional radiotherapy of squamous-cell carcinoma of head and neck:
DAHANCA 6 and 7 randomised controlled trial. Lancet 362, 933–40.
Pajonk, F., Vlashi, E. & McBride, W. H. (2010). Radiation resistance of cancer stem cells: the
4 R’s of radiobiology revisited. Stem cells (Dayton, Ohio) 28, 639–48.
Patel, V. F., Liu, F. & Brown, M. B. (2012). Modeling the oral cavity: in vitro and in vivo
evaluations of buccal drug delivery systems. Journal of controlled release : official
journal of the Controlled Release Society 161, 746–56. Elsevier B.V.
62
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Pearce, C., Bowden, G. H., Evans, M., Fitzsimmons, S. P., Johnson, J., Sheridan, M. J.,
Wientzen, R. & Cole, M. F. (1995). Identification of pioneer viridans streptococci in the
oral cavity of human neonates. Journal of medical microbiology 42, 67–72.
Podschun, R. & Ullmann, U. (1998). Klebsiella spp. as Nosocomial Pathogens :
Epidemiology, Taxonomy, Typing Methods, and Pathogenicity Factors. Clinical
Microbiology Reviews 11, 589–603.
Prakobphol, A., Xu, F., Hoang, V. M., Larsson, T., Bergstrom, J., Johansson, I., Frängsmyr,
L., Holmskov, U., Leffler, H. & other authors. (2000). Salivary agglutinin, which binds
Streptococcus mutans and Helicobacter pylori, is the lung scavenger receptor cysteinerich protein gp-340. The Journal of biological chemistry 275, 39860–6.
Raber-durlacher, J. E. (1999). Current practices for management of oral mucositis in cancer
patients. Supportive Care in Cancer 7, 71–74.
Ramirez-Amador, V., Silverman, S., Mayer, P., Tyler, M. & Quivey, J. (1997). Candidal
colonization and oral candidiasis in patients undergoing oral and pharyngeal radiation
therapy. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics 84,
149–53.
Ramírez, R. M., Almanza, Y., García, S. & Heredia, N. (2009). Adherence and invasion of
avian pathogenic Escherichia coli to avian tracheal epithelial cells. World Journal of
Microbiology and Biotechnology 25, 1019–1023.
Rodríguez-Ortega, M. J., Norais, N., Bensi, G., Liberatori, S., Capo, S., Mora, M., Scarselli,
M., Doro, F., Ferrari, G. & other authors. (2006). Characterization and identification of
vaccine candidate proteins through analysis of the group A Streptococcus surface
proteome. Nature biotechnology 24, 191–7.
Van Rompay, D. (2012a). Immunologie. Cursus Universiteit Gent.
Van Rompay, D. (2012b). Biotechnologie van de dierlijke cel. Cursus Universiteit Gent.
Rosenberg, M. (1984). Bacterial adherence to hydrocarbons - a useful technique for studying
cell-surface hydrophobicity. FEMS Microbiology Letters 22, 289–295.
Ruiz, V., Rodríguez-Cerrato, V., Huelves, L., Del Prado, G., Naves, P., Ponte, C. & Soriano,
F. (2011). Adherence of Streptococcus pneumoniae to polystyrene plates and epithelial
cells and the antiadhesive potential of albumin and xylitol. Pediatric research 69, 23–7.
Rupniak, H. T., Rowlatt, C., Lane, E. B., Steele, J. G., Trejdosiewicz, L. K., Laskiewicz, B.,
Povey, S. & Hill, B. T. (1985). Characteristic of 4 new human cell-lines derived from
squamous-cell carcinomas of the head and neck. Journal of the National Cancer
Institute 75, 621–635.
Saito, N., Imai, Y., Muto, T. & Sairenchi, T. (2012). Low body mass index as a risk factor of
moderate to severe oral mucositis in oral cancer patients with radiotherapy. Supportive
care in cancer : official journal of the Multinational Association of Supportive Care in
Cancer 20, 3373–7.
63
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Scully, C., Sonis, S. & Diz, P. D. (2006). Oral mucositis. Oral diseases 12, 229–41.
Shaik, H. A. & Sehnal, F. (2009). Hemolin expression in the silk glands of Galleria mellonella
in response to bacterial challenge and prior to cell disintegration. Journal of insect
physiology 55, 781–7.
Sharp, M. K. & Mohammad, S. F. (1998). Scaling of hemolysis in needles and catheters.
Annals of biomedical engineering 26, 788–97.
Shih, A., Miaskowski, C., Dodd, M. J., Stotts, N. a & MacPhail, L. (2003). Mechanisms for
radiation-induced oral mucositis and the consequences. Cancer nursing 26, 222–9.
Slonczewski, J. L. & Foster, J. W. (2009). Microbiology: an evolving science, 1st edn.
London: W.W. Norton & Company.
Solis, N., Larsen, M. R. & Cordwell, S. J. (2010). Improved accuracy of cell surface shaving
proteomics in Staphylococcus aureus using a false-positive control. Proteomics 10,
2037–49.
Sonalika, W. G., Amsavardani Tayaar, S., Bhat, K. G., Patil, B. R. & Muddapur, M. V. (2012).
Oral microbial carriage in oral squamous cell carcinoma patients at the time of diagnosis
and during radiotherapy - a comparative study. Oral oncology 48, 881–6. Elsevier Ltd.
Sonis, S. T. (2010). New thoughts on the initiation of mucositis. Oral diseases 16, 597–600.
Sonis, S. T. (2004). Oral mucositis in cancer therapy. The journal of supportive oncology 2,
3–8.
Sonis, S. T. (2009). Mucositis: The impact, biology and therapeutic opportunities of oral
mucositis. Oral oncology 45, 1015–20. Elsevier Ltd.
Srikrishna, G. & Freeze, H. H. (2009). Endogenous damage-associated molecular pattern
molecules at the crossroads of inflammation and cancer. Neoplasia (New York, NY) 11,
615–28.
Stiff, P. (2001). Mucositis associated with stem cell transplantation: current status and
innovative approaches to management. Bone marrow transplantation 27 Suppl 2, S3–
S11.
Söderhäll, K. & Cerenius, L. (1998). Role of the prophenoloxidase-activating system in
invertebrate immunity. Current Opinion in Immunology 10, 23–28.
Tawakoli, P. N., Al-Ahmad, A., Hoth-Hannig, W., Hannig, M. & Hannig, C. (2013).
Comparison of different live/dead stainings for detection and quantification of adherent
microorganisms in the initial oral biofilm. Clinical oral investigations 17, 841–50.
Trevors, J. T., Van Elsas, J. D. & Bej, A. K. (2012). The Molecularly Crowded Cytoplasm of
Bacterial Cells: Dividing Cells Contrasted with Viable but Non-culturable (VBNC)
Bacterial Cells. Current issues in molecular biology 15, 1–6.
Trotti, A. (2000). Toxicity in head and neck cancer: a review of trends and issues.
International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics 47, 1–12.
64
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
Trotti, A., Bellm, L. a, Epstein, J. B., Frame, D., Fuchs, H. J., Gwede, C. K., Komaroff, E.,
Nalysnyk, L. & Zilberberg, M. D. (2003). Mucositis incidence, severity and associated
outcomes in patients with head and neck cancer receiving radiotherapy with or without
chemotherapy: a systematic literature review. Radiotherapy and Oncology 66, 253–262.
Turpin, W., Humblot, C., Noordine, M.-L., Thomas, M. & Guyot, J.-P. (2012).
Lactobacillaceae and cell adhesion: genomic and functional screening. PloS one 7,
e38034.
Vera-Llonch, M., Oster, G., Hagiwara, M. & Sonis, S. (2006). Oral mucositis in patients
undergoing radiation treatment for head and neck carcinoma. Cancer 106, 329–36.
Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R. & Coppes, R. P. (2003). Oral
Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine
14, 199–212.
De Weirdt, R., Crabbé, A., Roos, S., Vollenweider, S., Lacroix, C., Van Pijkeren, J. P.,
Britton, R. a, Sarker, S., Van de Wiele, T. & Nickerson, C. a. (2012). Glycerol
supplementation enhances L. reuteri’s protective effect against S. Typhimurium
colonization in a 3-D model of colonic epithelium. PloS one 7, e37116.
Van de Wiele, T. (2012). Microbe-gastheer interfase processen. Cursus Universiteit Gent.
Wright, C. J., Burns, L. H., Jack, A. A., Back, C. R., Dutton, L. C., Nobbs, A. H., Lamont, R. J.
& Jenkinson, H. F. (2013). Microbial interactions in building of communities. Molecular
oral microbiology 28, 83–101.
65
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
8. Bijlagen
8.1.
Pathogeniciteit: scoretabel
Deze bijlage bevat de gebruikte scoretabel in de pathogeniciteitstesten met de Galleria
mellonella larven. Vier parameters werden gebruikt om de larven een score te geven. De
beweeglijkheid van de larven werd onderverdeeld in ‘mobiliteit’ en ‘post-mobiliteit’. In de
uiteindelijke resultaten is vooral de parameter ‘overleving’ de belangrijkste.
Tabel 7: Scoretabel pathogeniciteitstesten. Op de eerste rij staat de beschouwde parameter. De cijfers
geven de score weer die individueel werd toegekend aan elke larve. Onder elke score staat een korte
beschrijving over de gerelateerde toestand van de larve.
Mobiliteit
0
Geen
beweging
1
Minimale
beweging na
stimulatie
2
Beweging na
stimulatie
Melanisatie
1
2
Grote
Kleine
vlekken
vlekken
0
Volledige
verkleuring
0
Geen
coconvorming
3
Beweging
zonder stimulatie
Post-mobiliteit
1
Beweging na 1
minuut
Overleving
4
Geen
verkleuring
1
Levende larve
Cocon vorming
4
6
Beginnende
Partiële cocon
coconvorming
66
8
Volledige
cocon
0
Dode larve
De boel Kevin
8.2.
Masterproef 2012-2013
Pathogeniciteit: overlevingsverloop van de larven (tweede test)
120
100
Overleving (%)
80
60
40
0Gy
20
10Gy
Blanco
0
0
1
2
Tijd (dagen)
3
4
Figuur 15: Overlevingscurve van de tweede pathogeniciteitstest met Streptococcus salivarius met 10
larven per groep. Larven werden dagelijks opgevolgd gedurende vier dagen en deze grafiek geeft het
percentage overlevende larven per groep weer per observatie. De x-as geeft het aantal dagen na de
injectie weer, de y-as het percentage overlevende larven. Larven in de groepen ‘0Gy’ en ‘10Gy’
werden geïnjecteerd met 20µL respectievelijk niet-bestraalde en bestraalde bacteriesuspensie
7
-1
(10 kve mL ). ‘Blanco’ stelt de controlelarven voor, ingespoten met 20µL PBSD .
67
De boel Kevin
8.3.
Masterproef 2012-2013
Pathogeniciteit: overlevingsverloop van de larven (derde test)
120
100
Overleving (%)
80
60
40
0Gy
20
10Gy
Blanco
0
0
1
2
3
4
Tijd (dagen)
Figuur 16: Overlevingscurve van de derde pathogeniciteitstest met Streptococcus salivarius met 9
larven per groep. Larven werden dagelijks opgevolgd gedurende vier dagen en deze grafiek geeft het
percentage overlevende larven per groep weer per observatie. De x-as geeft het aantal dagen na de
injectie weer, de y-as het percentage overlevende larven. Larven in de groepen ‘0Gy’ en ‘10Gy’
werden geïnjecteerd met 20µL respectievelijk niet-bestraalde en bestraalde bacteriesuspensie
7
-1
(10 kve mL ). ‘Blanco’ stelt de controlelarven voor, ingespoten met 20µL PBSD .
68
De boel Kevin
8.4.
Masterproef 2012-2013
Pathogeniciteit: overleving van de larven een dag na injectie
Tabel 8: Overleving van de larven een dag na de injectie, samengevat voor alle uitgevoerde testen.
De onderzochte bacteriesoort was Streptococcus salivarius. In de eerste kolom staan de gemiddelden
van de overlevingspercentages van alle testen, uitgedrukt in percentage per groep. De tweede kolom
heeft de standaarddeviatie (SD) weer, eveneens uitgedrukt in percentage. Verschillende groepen
werden getest waarbij larven met verschillende substanties geïnjecteerd werden. Het injectievolume
bedroeg 20µL. ‘Blanco PBSD ‘ = injectie met PBSD (5 testen, 46 larven in totaal); ‘SS 0Gy log 7’ en
‘SS 10Gy log 7’ = ingespoten met respectievelijk niet-bestraalde en bestraalde S. salivarius
7
-1
monocultuur met concentratie 10 kve mL (5 testen, 46 larven in totaal); ‘Fix 0Gy log 7’ en ‘Fix 10Gy
log 7’ = ingespoten met gefixeerde bacteriën afkomstig van respectievelijk een niet-bestraalde en
7
-1
bestraalde S. salivarius monocultuur met concentratie 10 kve mL (2 testen, 20 larven in totaal);
‘Blanco BHI’ = injectie met BHI medium (2 testen, 19 larven in totaal); ‘SN 0Gy’ en ‘SN 10Gy’ = injectie
van supernatans afkomstig van respectievelijk een niet-bestraalde en bestraalde S. salivarius
monocultuur overnacht opgegroeid bij 37°C (2 testen, 19 larven in totaal).
Blanco PBSDSS 0Gy log 7
SS 10Gy log 7
Fix 0Gy log 7
Fix 10Gy log 7
Blanco BHI
SN 0Gy
SN 10Gy
Gemiddelde overleving (%)
100.0
78.8
72.6
100.0
95.0
89.5
100.0
100.0
69
SD overleving (%)
0.0
16.9
15.4
0.0
7.1
15.7
0.0
0.0
De boel Kevin
8.5.
Masterproef 2012-2013
Pathogeniciteit: mobiliteit en melanisatie van de larven (eerste test)
4,5
Gemiddelde score per larve
A
4
3,5
3
2,5
2
1,5
0Gy
1
10Gy
0,5
Blanco
0
0
1
2
3
4
3
4
Tijd (dagen)
3,5
B
Gemiddelde score per larve
3
2,5
2
1,5
0Gy
1
10Gy
0,5
Blanco
0
0
1
2
Tijd (dagen)
Figuur 17: Mobiliteits- en melanisatiecurve van de eerste pathogeniciteitstest met Streptococcus
salivarius met 8 larven per groep. Larven werden dagelijks opgevolgd gedurende vier dagen. Grafiek
A geeft de gemiddelde mobiliteitsscore per groep per observatie weer. Grafiek B geeft de gemiddelde
melanisatiescore per groep per observatie weer. De gemiddeld score werd bepaald door alle scores
van de individuele larven per groep op te tellen en te delen door het aantal larven per groep. De x-as
geeft het aantal dagen na de injectie weer, de y-as de gemiddelde score per larve. Larven in de
groepen ‘0Gy’ en ‘10Gy’ werden geïnjecteerd met 20µL niet-bestraalde en bestraalde
7
-1
bacteriesuspensie (10 kve mL ) respectievelijk. ‘Blanco’ stelt de controlelarven voor, ingespoten met
20µL PBSD .
70
De boel Kevin
8.6.
Masterproef 2012-2013
Pathogeniciteit: mobiliteit en melanisatie van de larven (tweede test)
4,5
A
Gemiddelde score per larve
4
3,5
3
2,5
2
1,5
0Gy
1
10Gy
0,5
Blanco
0
0
1
2
3
4
3
4
Tijd (dagen)
3,5
Gemiddelde score per larve
B3
2,5
2
1,5
0Gy
1
10Gy
0,5
Blanco
0
0
1
2
Tijd (dagen)
Figuur 18: Mobiliteits- en melanisatiecurve van de tweede pathogeniciteitstest met Streptococcus
salivarius met 10 larven per groep. Larven werden dagelijks opgevolgd gedurende vier dagen. Grafiek
A geeft de gemiddelde mobiliteitsscore per groep per observatie weer. Grafiek B geeft de gemiddelde
melanisatiescore per groep per observatie weer. De gemiddeld score werd bepaald door alle scores
van de individuele larven per groep op te tellen en te delen door het aantal larven per groep. De x-as
geeft het aantal dagen na de injectie weer, de y-as de gemiddelde score per larve. Larven in de
groepen ‘0Gy’ en ‘10Gy’ werden geïnjecteerd met 20µL niet-bestraalde en bestraalde
7
-1
bacteriesuspensie (10 kve mL ) respectievelijk. ‘Blanco’ stelt de controlelarven voor, ingespoten met
20µL PBSD .
71
De boel Kevin
8.7.
Masterproef 2012-2013
Pathogeniciteit: mobiliteit en melanisatie van de larven (derde test)
4,5
Gemiddelde score per larve
A
4
3,5
3
2,5
2
1,5
0Gy
1
10Gy
0,5
Blanco
0
0
1
2
Tijd (dagen)
3
1
2
Tijd (dagen)
3
4
3,5
B
Gemiddelde score per larve
3
2,5
2
1,5
0Gy
1
10Gy
0,5
Blanco
0
0
4
Figuur 19: Mobiliteits- en melanisatiecurve van de derde pathogeniciteitstest met Streptococcus
salivarius met 9 larven per groep. Larven werden dagelijks opgevolgd gedurende vier dagen. Grafiek
A geeft de gemiddelde mobiliteitsscore per groep per observatie weer. Grafiek B geeft de gemiddelde
melanisatiescore per groep per observatie weer. De gemiddeld score werd bepaald door alle scores
van de individuele larven per groep op te tellen en te delen door het aantal larven per groep. De x-as
geeft het aantal dagen na de injectie weer, de y-as de gemiddelde score per larve. Larven in de
groepen ‘0Gy’ en ‘10Gy’ werden geïnjecteerd met 20µL niet-bestraalde en bestraalde
7
-1
bacteriesuspensie (10 kve mL ) respectievelijk. ‘Blanco’ stelt de controlelarven voor, ingespoten met
20µL PBSD .
72
De boel Kevin
8.8.
Masterproef 2012-2013
Viabiliteit S. salivarius met flow cytometer analyse na 30 minuten
Tabel 9: Viabiliteitstest van Streptococcus salivarius met de flow cytometer. S. salivarius werd
onderzocht naar de leefbaarheid na de incubatie met deoxycholaat en Triton X-100. De incubatieduur
bedroeg 30 minuten. De leefbaarheid staat uitgedrukt als het percentage bacteriën behorende tot de
groep ‘levend’, ‘dood’ of ‘beschadigd’. De standaarddeviaties staan eveneens in de tabel onder de
hoofding ‘SD (%)’, uitgedrukt in percentage. Per staal werden twee herhalingen getest. ‘Startcultuur’
staat voor het staal genomen voor de test plaatsvond, i.e. 0 minuten incubatie. De gebruikte flow
cytometer was het type Accuri™ C6 (BD).
0,1% deoxycholaat
0,2% Triton X-100
0,7% Triton X-100
1,0% Triton X-100
Startcultuur
Percentage (%)
Levend
Dood Beschadigd
8.4
42.7
48.9
11.6
55.5
33.0
9.3
50.2
40.5
6.8
52.8
40.4
80.5
2.9
16.6
73
Levend
1.4
1.0
0.7
1.0
5.7
SD (%)
Dood Beschadigd
9.3
10.7
2.9
3.9
4.1
4.8
3.1
2.0
1.7
3.9
De boel Kevin
8.9.
Masterproef 2012-2013
Viabiliteit K. oxytoca met flow cytometer analyse na 30 minuten
Tabel 10: Viabiliteitstest van Klebsiella oxytoca met de flow cytometer. K. oxytoca werd onderzocht
naar de leefbaarheid na de incubatie met deoxycholaat en Triton X-100. De incubatieduur bedroeg 30
minuten. De leefbaarheid staat uitgedrukt als het percentage bacteriën behorende tot de groep
‘levend’, ‘dood’ of ‘beschadigd’. De standaarddeviaties staan eveneens in de tabel onder de hoofding
‘SD (%)’, uitgedrukt in percentage. Per staal werden twee herhalingen getest. ‘Startcultuur’ staat voor
het staal genomen voor de test plaatsvond, i.e. 0 minuten incubatie. De gebruikte flow cytometer was
het type Accuri™ C6 (BD).
0,1% deoxycholaat
0,2% Triton X-100
0,7% Triton X-100
1,0% Triton X-100
Startcultuur
Percentage (%)
Levend
Dood
Beschadigd
98.0
1.4
0.6
94.6
3.0
2.5
95.1
2.9
2.1
95.2
3.0
1.8
98.8
0.9
0.3
74
Levend
0.1
1.4
0.2
0.0
0.1
SD (%)
Dood
Beschadigd
0.0
0.1
0.6
0.7
0.1
0.1
0.5
0.5
0.0
0.1
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
8.10. BATH 8-uursopvolging: K. oxytoca
40,00
0Gy
30,00
40,00
A
0Gy
10Gy
10Gy
30,00
20,00
20,00
10,00
10,00
0,00
B
0,00
0
2
4
6
8
0
-10,00
2
4
6
8
-10,00
40,00
0Gy
C
10Gy
30,00
20,00
10,00
0,00
0
2
4
6
8
-10,00
Figuur 20: BATH-test met Klebsiella oxytoca. Drie onafhankelijke testen werden uitgevoerd met een
8-uursopvolging. Deze worden voorgesteld door grafiek A, B en C. De y-as geeft het percentage
hydrofobiciteit weer en de x-as het aantal uur na de bestraling werd toegediend aan de helft van het
aantal K. oxytoca monoculturen. De foutenvlaggen stellen de standaardfouten voor. De nietbestraalde conditie (0Gy) wordt weergegeven de blauwe staven. De bestraalde conditie (10Gy) wordt
voorgesteld door de rode staven.
75
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
8.11. BATH 8-uursopvolging: S. salivarius
150,00
125,00
150,00
0Gy
0Gy
A
10Gy
10Gy
125,00
100,00
100,00
75,00
75,00
50,00
50,00
25,00
25,00
0,00
B
0,00
0
2
4
6
150,00
8
0
0Gy
2
4
6
8
C
10Gy
125,00
100,00
75,00
50,00
25,00
0,00
0
2
4
6
8
Figuur 21: BATH-test met Streptococcus salivarius. Drie onafhankelijke testen werden uitgevoerd met
een 8-uursopvolging. Deze worden voorgesteld door grafiek A, B en C. De y-as geeft het percentage
hydrofobiciteit weer en de x-as het aantal uur na de bestraling werd toegediend aan de helft van het
aantal S. salivarius monoculturen. De foutenvlaggen stellen de standaardfouten voor. De nietbestraalde conditie (0Gy) wordt weergegeven de blauwe staven. De bestraalde conditie (10Gy) wordt
voorgesteld door de rode staven.
76
De boel Kevin
Masterproef 2012-2013
8.12. BATH 8-uursopvolging: L. salivarius
60,00
A
0Gy
50,00
60,00
50,00
10Gy
B
0Gy
40,00
40,00
30,00
30,00
20,00
20,00
10,00
10,00
0,00
10Gy
0,00
0
2
4
6
8
0
-10,00
2
4
6
8
-10,00
60,00
C
0Gy
50,00
10Gy
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
0
2
4
6
8
-10,00
Figuur 22: BATH-test met Lactobacillus salivarius. Drie onafhankelijke testen werden uitgevoerd met
een 8-uursopvolging. Deze worden voorgesteld door grafiek A, B en C. De y-as geeft het percentage
hydrofobiciteit weer en de x-as het aantal uur na de bestraling werd toegediend aan de helft van het
aantal L. salivarius monoculturen. De foutenvlaggen stellen de standaardfouten voor. De nietbestraalde conditie (0Gy) wordt weergegeven de blauwe staven. De bestraalde conditie (10Gy) wordt
voorgesteld door de rode staven.
77