RAG-/- muizen geconstitueerd met CD45RB high cellen

CD4+CD25+TR Cells Suppress Innate
Immune Pathology Through Cytokinedependent Mechanisms
Introduction
• Intestinale inflammatie wordt veroorzaakt door disregulatie van
de mucosale T cellen op bepaalde antigenen.
• De subpopulatie CD4+CD45RBhigh heeft de eigenschap om in
Immunodeficiënte muizen IBD te induceren
 Th1 gemedieerde respons
• De regulatoire T cellen (CD4+CD45RBlowCD25+) hebben dan
weer een inhiberende / regulerende functie.
Wijze van inhiberende werking :
- Inhibitie van andere T cellen door cel-cel contact
- Downregulatie van APC
- Immunosuppressieve cytokines : IL-10 en TGF-β, werken zowel
op T cellen als op cellen van het aangeboren immuunsysteem
Maar rol van Treg bij Niet-T-cel-gemedieerde immuunpathologie nog
niet onderzocht / bewezen.
• Microflora is van essentieel belang voor de ontwikkeling
van IBD
• Induceerbaar door bepaalde pathogene bacteriën
Vb Helicobacter Hepaticus : -gram-negatief en spiraalvormig
-koloniseert intestinale crypten van
caecum en colon
-levenslange infectie
• In immunodeficiënte muizen zoals IL-10-/- of in RAG-/muizen geconstitueerd met CD45RBhigh cellen.
Resultaten
1) Treg cellen verhinderen intestinale inflammatie, zowel de T-cel
afhankelijke als onafhankelijke weg, bij infectie met H.Hepaticus
Test: Isoleren van CD45RBlowCD25+ en
CD45RBlowCD25- en coïnjecteren met
CD4+CD45RBhigh in RAG2-/- muizen
 vervolgens infecteren met H.Hepaticus
• Reconstitutie met enkel CD4+CD45RBhigh T cellen veroorzaakte
slechts zeer milde collitis (vergelijk D en E)
 Infectie met H.Hepaticus
veroorzaakte wel ernstige
intestinale inflammatie (E)
 cel hyperplasie
 infiltratie
 goblet cel depletie
• cotransfer van de CD4+CD45RBlowCD25+ (Treg) zorgde voor
een inhibitie van de H.Hepaticus geïnduceerde ontsteking (F)
• cotransfer van
CD4+CD45RBlowCD25- had geen
inhiberend effect (G)
 zoals aangetoond in
voorgaande studies
• indien geen transfer en enkel infectie met H.Hepaticus
 toch ontwikkeling van ontsteking
• deze T-cel onafhankelijke pathologie heeft zelfde karakteristieken,
maar iets milder (B).
 cel hyperplasie
 weinig depletie
 minder infiltratie van mononucleairen
en polynucleair
• ook inhibitie door Treg (CD25+)
en niet door CD25-
2) T-cel onafhankelijke pathologie door infectie met
H.Hepaticus is gedreven door proinflammatoire cytokines
en wordt geassocieerd met lokale en systemische
activatie van het aangeboren immuunsysteem, dat kan
geïnhibeerd worden door de Treg cellen
• Test : Infectie van RAG-/- muizen met H.Hepaticus en toedienen van Ab
tegen IL-12p40 of TNF-α (belangrijke mediatoren van aangeboren
immuniteit)
Inhibitie van pathologie
 voorkomen van splenomegaly
Splenomegaly
• mbv FACS kijken welke
celpopulaties hiervoor
verantwoordelijk zijn
• A = Totaal # milt cellen
• B = Neutrofielen
• C = Monocyten/Macrofagen
• D = Dendritische cellen
• E = NK cellen
• F = IFN-y prod NK cellen
Samenvatting :
• grootste toename bij neutrofielen en monocyten/macrofagen
• lichte toename van dendritische cellen (2 x)
• lichte toename van NK cellen (2 x) , maar ook proportionele
toename van IFN-y producerende NK cellen (2 x) en dus een 4
maal grotere IFN-y productie
 duidt op sterkte activatie van het aangeboren
immuunsysteem
• Transfer van Treg zorgde voor een zichtbare reductie
• Test : Beoordelen van het aangeboren immuunsysteem op plaats van
infectie
 isoleren van leukocyten thv lamina propria (LPL) en thv
senterische lymfe knopen (MLN)
 samenstelling mbv flow cytometry bepalen
 weinig leukocyten, dus gepoolde LPL en MLN populaties
gebruiken van verschillende muizen
Samenvatting
LPL :
MLN :
Treg beïnvloeden dus zowel andere T cellen als cellen van het
aangeboren immuunsysteem
Werken zowel systemisch als lokaal ,inhibitie van accumulatie en
activatie
3) Treg cellen hebben geen invloed op kolonisatie van H.Hepaticus
• Test : RT-PCR voor detectie van H.Hepaticus levels in colon en caecum
• 5 tot 10 maal grotere concentraties in caecum tov colon
• Geen verschil bij muizen zonder en met reconstitutie met Treg (CD25+)
 protectief effect van Treg is dus niet
te wijten aan vermindering van
kolonisatie van H.Hepaticus
4) Protectie door Treg cellen tegen T-cel onafhankelijke pathologie is
cytokine afhankelijk
• Belang van IL-10 en TGF-β reeds aangetoond in
vorige studies
• ontstaan van intestinale inflammatie in IL-10-/muizen
Test : geïnfecteerde muizen reconstitueren met Treg
en vervolgens toedienen van monoklonale Ab tegen
IL-10R of TGF-β
 volledig verlies van inhibitie en bevestiging
belang van IL-10
Discussie
• Het aangeboren immuunsysteem verantwoordelijk bij pathogenese
afkomstig van pathogeen organisme (H.Hepaticus)
• T-cel onafhankelijke inflammatie:
• gedreven door pro-inflammatoire cytokines
• zowel lokaal als systemisch
• CD4+CD25+ Treg cellen immuun suppressieve werking op T-cel
afhankelijk en T-clonafhankelijke inflammatie
Mechanisme van inhibitie door Treg cellen
• verschillende in vivo modellen tonen verschillende patronen van
immuun suppressieve cytokinen
• Cel-contact afhankelijke mechanismen
• Regulator activiteit door ale T-cellen die strijden voor plaats en
overlevingsfactoren tegen pathogene T-cellen
 In onze studie enkel de CD25+ subpopulatie
inhibitie van T-cel onafhankelijke infammatie
Suppressie van T-cel onafhankelijke pathology was afhankelijk
van IL-10 en TGF-β.
• IL-10:
• heeft een cruciale rol, zowel in T-cel afhankelijke als
onafhankelijke inflammatie (voorgaande studies)
• Inhibitie van pro-inflammatoire cytokinen
• Inhibitie van chemokine producerende monocyten/
macrofagen en neutrophielen
Karakteristieken van H.Hepaticus geïnduceerde inflammatie
• Epitheliale cel hyperplasie
• Infiltratie van granulocyten en mononucleairen
• Kolonisatie voornamelijk in het caecum
• Pro-inflammatoire cytokines noodzakelijk (IL-12p40 en TNF-α) en ook
andere verhoogde concentraties van cytokines
Tegenstelling met voorgaande studies
Voor het ontstaan van intestinale colitis was infectie met H.Hepaticus
noodzakelijk, reconstitutie met CD4+CD45RBhigh T-cellen was niet
voldoende
Reden:
• Genetische verschillen
• Intestinale flora
• Omgevingsfactoren
Inflammatie door H.Hepaticus:
• lokaal (mucosa)
• systemisch (splenomegaly)
Reconstitutie met Treg cellen inhibeert de patogenese op beide
plaatsen, lokaal bij infectie als systemisch ter preventie.
CD4+CD25+ Treg cellen hebben de mogelijkheid om de pathogenese
te onderdrukken zonder voorgaand contact met de peptiden van de
pathogene bacterie.