DEEL 1 terreinstudie

DEEL 1 Genetica
Thema 2.4
Gentechnologie
1
Biotechnologie en
gentechnologie
 Klassieke biotechnologie  DNA wordt niet aangetast
• Selectief kruisen (fokken, veredelen)
• Gebruik van micro-organismen in voeding (bier,
brood, wijn, kaas, youhurt, …
 Beperkingen! Soortbarrière, duurt lang
 Moderne biotechnologie of gentechnologie
• Genetisch gemodificeerde organismen (ggo)
 Soortbarrière kan doorbroken worden
 Sneller
 Steeds de gewenste eigenschap
 Klassieke biotechnologie
 Gentechnologie
2
Natuurlijke
genenoverdracht
2.1 Genenoverdracht door bacteriën
2.1.1 Het genetisch materiaal van bacteriën
 Grote ringvormige DNA-molecule  vitale proteïnen
 Kleine ringvormige plasmiden (DNA)  niet-essentiële
proteïnen
 Kopieën van plasmiden kunnen door conjugatie
overgedragen worden naar andere bacteriën (via een
cytoplasmabrug of pilus)
Toepassing: overdracht van
antibiotica-resistentiegenen
2.1.2 Genenoverdracht van bacterie naar plant
 De bodembacterie Agrobacterium tumefaciens kan
planten via wondjes infecteren
 tumorvorming door Ti-plasmide
2.2 Genenoverdracht door virussen
2.2.1 Genetische afhankelijkheid bij virussen
 Virus  DNA of RNA omgeven door eiwitmantel
 geen eigen metabolisme
 voor voortplanting afhankelijk van gastheer
2.2.2 Genenoverdracht van virus naar bacterie
 Bacteriofagen (‘faag’)
 Levenscyclus van bacteriofagen:
 lytische en lysogene fase
2.2.3 Genenoverdracht van virus naar mens
 DNA-virussen
• rhino,
• hepatitis B
• wratten
• herpes, …
Herpes simplex
 RNA-virussen
1. Viraal RNA wordt rechtstreeks overgeschreven tot
virusproteïnen
• griep,
• polio,
• mazelen,
• ebola,
ebolavirus
• hondsdolheid, …
2. Viraal RNA wordt door omgekeerde transcriptie
omgezet tot viraal DNA (provirus) dankzij het
reverse-transcriptase enzyme. Het provirus wordt
dan geïntegreerd in het DNA van de gastheer.
 retrovirus bv. aids, deltaretrovirus (leukemie)
3
Kunstmatige
genenoverdracht
 DNA gericht overbrengen van ene naar andere
organisme
 ggo (genetisch gemodificeerd organisme) = transgeen
 Genetische modificatie
‘fluo-gen’
 DNA verkrijgen en manipuleren  rol restrictie-enzymen
 DNA transporteren  vectoren : plasmiden, virussen, …
3.1 Enzymen voor kunstmatige genoverdracht
3.1.1 Restrictie-enzymen
Bacteriën beschermen zich tegen fagen met restrictie-enzymen
‘moleculaire scharen’
Restrictie- of knipenzymen herkennen bepaalde DNAsequenties en knippen die door.
Sommige basen zijn na het knippen niet meer gepaard met
een complementaire base en vormen ‘sticky ends’
sticky-ends vormen een
palindroom
3.1.2 DNA-ligasen
 Geknipte DNA fragmenten (met sticky-ends) moeten
ingeplakt worden in een transportmiddel (bv. plasmide)
 Het transportmiddel wordt met hetzelfde restrictieenzyme open geknipt  complementaire sticky-ends
 DNA-ligase plakt nucleotiden aan elkaar
3.2 Transport van DNA bij kunstmatige
genoverdracht
 Vectoren: natuurlijk DNA als transportmiddel
 plasmiden
 recombinante virussen
 Liposomen: micro-vetdruppeltjes
 Micro-injectie: genen rechtstreeks in celkern
 Elektroportatie: korte stroomstoot
 Genenkanon: genen worden op goud-, wolfram of
zilverbolletjes geplakt
3.3 Verloop van kunstmatige genoverdracht
Probleem: gen tot
expressie brengen  het
regulatiemechanisme van
het gen moet het gen
vergezellen.
3.4 Genome editing
 ‘Bewerken’ van het genoom
 Stukjes DNA gericht veranderen  ‘gunstige mutatie’
(gebeurt ook in de natuur, maar veel trager en ongericht)
 Toepassing: wegknippen van hiv-DNA-fragmenten uit
cellen van seropositieve personen  herstel ipv
onderdrukken van aids
4
Toepassingen van
gentechnologie
4.1 Gentechnologie in de geneeskunde
 Productie van belangrijke proteïnen (bv. Insuline)
 Vroeger: uit weefsels
 Nu: door transgene cellen in vitro
 bacteriën
 gistcellen
 zoogdiercellen
 door transgene dieren in vivo
4.1.1 Productie van insuline door transgene
bacteriën en gisten
4.1.2 Productie van hepatitis B-vaccin door
transgene gisten
 1969: eerste vaccin  verzwakt virus  nog (klein)
risico op de ziekte
 1986: gentechnologisch vaccin  enkel één proteïne uit
de virusmantel die een immuunrespons oproept zit in
het vaccin  geen risico meer
4.1.3 Gentherapie: gentransplantatie bij de mens
 Inbrengen van een therapeutisch gen (via vector)
 Proteïne wordt aangemaakt door de patiënt zelf en niet
door transgene cellen
 Probleem: therapeutisch gen in voldoende doelwitcellen
brengen




Genezende effecten door gentherapie
genadditie: ontbrekend gen toevoegen
gencorrectie: therapeutisch gen neemt functie defect gen over
gencontrole: gen blokkeert expressie van foute gen



 Voorbeeld van gencorrectie: behandeling van ADA-SCIDS (tekort
aan adenosine desaminase)
Severe Combined Immune
Deficiency Syndrome
4.2 Gentechnologie in de veeteelt
 Bij varkenspest worden alle varkens binnen een
perimeter van de besmettingshaard afgemaakt
 Ook gezonde en klassiek gevaccineerde varkens  ze
zijn niet te onderscheiden van besmette varkens
 Met nieuw merkervaccin kunnen gevaccineerde
varkens met een diagnostische test herkend worden
4.3 Gentechnologie in het milieubeheer
4.3.1 Afvalbeheer
 Bepaalde bacteriën kunnen
radioactieve stoffen uit grondwater
halen

bacteriegenen overgebracht in
bomen  nemen vervuild H2O op
 Genen van zoetwaterbacteriën die ruwe olie kunnen
afbreken kunnen overgebracht worden naar
zoutwaterbacteriën  kunnen ook olie afbreken
 Biologisch afbreekbare plastics door bacteriën of gisten
4.4 Gentechnologie in de landbouw en
voedingsindustrie
4.4.1 Insectenresistente gewassen
 Gen voor insectentoxine van Bacillus thuringiensis (Bt)
overbrengen naar planten via tumor-inducing-plasmide
(Ti) van Agrobacterium tumefaciens
(volgende dia)




Bt-tabak
BT-maïs ( stengelboorder)
Bt-katoen ( rups)
Bt-aardappel ( coloradokever)
 Gen voor Bt-toxine van B. thuringiensis naar plasmide van E. coli
4.4.2 Herbicidentolerante gewassen
 Planten (o.a. soja) ongevoelig maken voor bepaald herbicide
4.5 Pro en contra gentechnologie
pro
•
•
•
•
•
•
•
Betere geneesmiddelen
Veiligere vaccins
Betere voedselopbrengst
Milieuvriendelijker landbouw
Ziekten opsporen makkelijker
Milieubeheer
…
contra
• Beursgenoteerde bedrijven
• Wensen van ouders i.v.m.
geslachtbepaling, fysieke
eigenschappen, …
• Biodiversiteit?
• Ontstaan van resistentie?
• Dure technologieën  arme
landen en boeren?
• …
5
Gentechnologische
technieken
 Basistechnieken in de biotechnologie
•
•
•
•
•
•
•
PCR: polymersase chain reaction
DNA-sequencing
DNA fingerprinting
Southern blotting
In situ hybridisatie
Klonen
Knock-outmodel
5.1 Polymerase chain reaction (PCR)
Repetitief aanmaken van een welbepaald DNA-fragment
 Een specifiek gekozen DNA-fragment kan massaal
vermenigvuldigd worden (in PCR-cycler)
 De aanmaak van de complementaire ketens start telkens
vanaf een primer (korte stukjes enkelstrengs-DNA)
 De techniek verloopt in 3 opeenvolgende
temperatuurcycli:
denaturatie
renaturatie
polymerisatie
± 95 °C
scheiden van
DNA-strengen
40-60 °C
aanhechten van
primers
± 72 °C
aanmaak nieuwe
DNA-streng
 Denaturatie:
Dubbelstreng wordt enkelstreng
door t° op 95°C te brengen
H-bruggen verbroken
 Renaturatie:
t° daalt tot 40-60°C
 Aanhechten van forward en
reverse primer (5’  3’)
 Polymerisatie:
t° naar 72°C
Toevoegen van Taq-polymerase
 Aanhechten van vrije
nucleotiden vanaf startpunt
(primer)
 Van DNA-fragmenten met
overtollig DNA naar gewenste
DNA-dubbelstrengen

na 15 cycli is al meer dan 99,9%
gewenst DNA

totaal aantal cycli: 30-40
(60° C)
na 30 cycli:
± 1 073 741 824
fragmenten
:
5.2 DNA-gelelektroforese
 DNA-fragmenten sorteren op lengte
 Gel gieten in elektroforesekamer + kam plaatsen  slotjes
 DNA-stalen opzetten + laadbuffer (met bv. Orange G)
 Migratie van DNA door spanningsverschil (fosfaatgroep neg. geladen)
 DNA zichtbaar maken met positief geladen kleurstof + lengte van de
fragmenten kan geschat worden door te vergelijken met DNA-ladder
A
B
C
D
E
5.3 DNA-sequencing
 Bepalen van de basensequentie in een DNA-fragment
(na PCR en gelelektroforese)
5.3.1 Klassieke ketenterminatiemethode
• Vergelijkbaar met PCR, maar er worden gekende stopnucleotiden
toegevoegd (ddA-ddC-ddG-ddT) (zonder OH-groep aan 3’)
• Waar het kopiëren van de enkelstreng stopt zit een gekende
stopnucleotide  de nucleotide op de oorspronkelijke streng is
dan ook gekend (bv. stop met ddA  T in oorspronkelijke streng)
• Toepassing: basensequentie van het onderzochte gen vergelijken
met een normaal, ’gezond’ gen  opsporen van genmutaties
5.3.2 Automatische basensequentiebepaling
 Stopnucleotiden worden gemerkt met een fluorescente
merker
 Merker wordt tijdens de elektroforese (in capillairen)
gededecteerd door een sensor  elektroferogram
5.4 DNA fingerprinting
5.4.1 Short tandem repeats (STRs)
 Korte stukjes repetitief DNA
 Aantal herhalingen (repeats) is verschillend per individu:
DNA-polymorfismen
 Vb:
AATG
7 herhalingen
8 herhalingen
Het aantal herhalingen is variabel voor verschillende personen.
5.4.2 Restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)





DNA-stalen knippen met specifieke restrictie-enzymen
Fragmenten vermeerderen met PCR
Fragmenten scheiden o.b.v. lengte met elektroforese
Bandenpatroon is voor ieder individu uniek
Toepassingen:
• dader-identificatie
 speeksel
 haar
 bloed
 sperma
AmpFlSTR®
Identifiler™
6FAM
(blue)
D8S1179
D3S1358
D7S820
D21S11
TH01
D13S317
D16S539
VIC
(green)
TPOX
NED
(yellow)
D19S433
AMEL
PET
(red)
D18S51
VWA
D5S818
FGA
Geslachtsmerker: MAN
In DNA profiel AMEL: X , Y
GS500 LIZ size standard
LIZ
(orange)
CSF1PO
D2S1338
• vaderschapsbepaling
 fingerprint kind, moeder, mogelijke vaders
 overeenkomstige banden van moeder en kind identificeren
 resterende banden moeten van de biologische vader zijn
5.5 Southern blotting
 Techniek om een specifiek DNA-fragment op te sporen in
een massa DNA
 Uitvinder: Edwin Southern
 Gebruikt om o.a. erfelijke diagnoses te stellen
 Verschillende technieken worden gecombineerd
•
•
•
•
•
•
DNA knippen met restrictie-enzymen
Gelelektroforese van de fragmenten
Denaturatie van de fragmenten (enkelstrengig maken)
Fragmenten vastzetten op nitrocellulosemembraan
Hybridisatie met radioactieve probe met een complementaire
basensequentie aan het op te sporen DNA-fragment
Enkel de radioactieve DNA-fragmenten worden vastgelegd op
gevoelige film
5.6 In situ hybridisatie
 Lokalisatie van een specifiek gen of DNA-fragment
 FISH: fluorescentie in situ hybridisatie
 Prenatale diagnostiek bv. trisomie 21
 Opsporen van deleties, duplicaties of translokaties
5.7 Therapeutisch klonen
 Lichaamscellen produceren, uitgaande van stamcellen
 Persoonsspecifieke weefsels maken die na transplantie geen
afstotingsverschijnselen zullen vertonen
5.7.1 Stamcellen
Totipotente stamcellen
Pluripotente stamcellen
Embryonale stamcellen
Multipotente stamcellen
Adulte stamcellen
• Zygote en blastomeren na
eerste klievingsdelingen
• Cellen uit de embryoblast
(na ivf uit ‘restembryo’)
• Aanwezig in veel weefsels
voor weefselherstel (bv. in
beenmerg)
• Kunnen uitgroeien tot
volledig organisme
• Kunnen differentiëren tot
alle celtypes
• Genereren alleen celtypes
van het eigen weefsel
5.7.2 Multipotente Adulte Progenitorcellen (MAP)
 Voorlopercellen in spieren, hersenen, beenmerg,
botweefsel en pancreas
 Kunnen geherprogrammeerd worden zodat ze
embryonale stamcellen vervangen
 Minder morele bezwaren (geen embryo’s nodig)
 Ontdekt door prof. Catherine Verfaillie
5.7.3 Verloop van therapeutisch klonen
 Mogelijke (toekomstige) toepassingen
•
•
•
•
•
huidtransplanten bij brandwonden
ß-cellen in pancreas
neuronen aanmaken om Alzheimer te behandelen
hartspiercellen aanmaken na hartinfarct
beenmergcellen aanmaken tegen leukemie
5.7.4 Synthese van stamcellen uit lichaamscellen
 Eigen lichaamscellen worden geherprogrammeerd tot
geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)
 Er moeten dan geen stamcellen meer worden ‘geoogst’
 Nog in onderzoeksfase (klinische studies)
 Zouden toch niet zo ongedifferentieerd zijn als
embryonale stamcellen
 Men zou op termijn ei- en zaadcellen op deze manier
kunnen produceren (onvruchtbaarheidsproblemen)
 lukt al bij muizen
5.7.5 Het knock-outmodel
 De functie van één gen achterhalen door het gen (in
proefdieren) uit te schakelen
 Belangrijk om erfelijke ziekten te bestuderen
Knock-outgen injecteren in
blastocyst van een muis
 Knock-outmuizen