Genetica Gen-technologie Thema 4
advertisement
DEEL 2 Genetica Thema 4 Gentechnologie 1 Biotechnologie en gentechnologie Klassieke biotechnologie DNA wordt niet aangetast • Selectief kruisen (fokken, veredelen) • Gebruik van micro-organismen in voeding (bier, brood, wijn, kaas, youhurt, … Beperkingen! Soortbarrière, duurt lang Moderne biotechnologie of gentechnologie • Genetisch gemodificeerde organismen (ggo) Soortbarrière kan doorbroken worden Sneller Steeds de gewenste eigenschap Klassieke biotechnologie Gentechnologie 2 Natuurlijke genenoverdracht 2.1 Genenoverdracht door bacteriën 2.1.1 Het genetisch materiaal van bacteriën Grote ringvormige DNA-molecule vitale proteïnen Kleine ringvormige plasmiden (DNA) niet-essentiële proteïnen Kopieën van plasmiden kunnen door conjugatie overgedragen worden naar andere bacteriën (via een cytoplasmabrug of pilus) Toepassing: overdracht van antibiotica-resistentiegenen 2.1.2 Genenoverdracht van bacterie naar plant De bodembacterie Agrobacterium tumefaciens kan planten via wondjes infecteren tumorvorming door Ti-plasmide 2.2 Genenoverdracht door virussen 2.2.1 Genetische afhankelijkheid bij virussen Virus DNA of RNA omgeven door eiwitmantel geen eigen metabolisme voor voortplanting afhankelijk van gastheer 2.2.2 Genenoverdracht van virus naar bacterie Bacteriofagen (‘faag’) Levenscyclus van bacteriofagen: lytische en lysogene fase 2.2.3 Genenoverdracht van virus naar mens DNA-virussen • rhino, • hepatitis B • wratten • herpes, … Herpes simplex RNA-virussen 1. Viraal RNA wordt rechtstreeks overgeschreven tot virusproteïnen • griep, • polio, • mazelen, • ebola, ebolavirus • hondsdolheid, … 2. Viraal RNA wordt door omgekeerde transcriptie omgezet tot viraal DNA (provirus) dankzij het reverse-transcriptase enzyme. Het provirus wordt dan geïntegreerd in het DNA van de gastheer. retrovirus bv. aids, deltaretrovirus (leukemie) 3 Kunstmatige genenoverdracht DNA gericht overbrengen van ene naar andere organisme ggo (genetisch gemodificeerd organisme) = transgeen Genetische modificatie ‘fluo-gen’ DNA verkrijgen en manipuleren rol restrictie-enzymen DNA transporteren vectoren : plasmiden, virussen, … 3.1 Enzymen voor kunstmatige genoverdracht 3.1.1 Restrictie-enzymen Bacteriën beschermen zich tegen fagen met restrictie-enzymen ‘moleculaire scharen’ Restrictie- of knipenzymen herkennen bepaalde DNAsequenties en knippen die door. Sommige basen zijn na het knippen niet meer gepaard met een complementaire base en vormen ‘sticky ends’ sticky-ends vormen een palindroom 3.1.2 DNA-ligasen Geknipte DNA fragmenten (met sticky-ends) moeten ingeplakt worden in een transportmiddel (bv. plasmide) Het transportmiddel wordt met hetzelfde restrictieenzyme open geknipt complementaire sticky-ends DNA-ligase plakt nucleotiden aan elkaar 3.2 Transport van DNA bij kunstmatige genoverdracht Vectoren: natuurlijk DNA als transportmiddel plasmiden recombinante virussen Liposomen: micro-vetdruppeltjes Micro-injectie: genen rechtstreeks in celkern Elektroportatie: korte stroomstoot Genenkanon: genen worden op goud-, wolfram of zilverbolletjes geplakt 3.3 Verloop van kunstmatige genoverdracht Probleem: gen tot expressie brengen het regulatiemechanisme van het gen moet het gen vergezellen. 3.4 Genome editing ‘Bewerken’ van het genoom Stukjes DNA gericht veranderen ‘gunstige mutatie’ (gebeurt ook in de natuur, maar veel trager en ongericht) Toepassing: wegknippen van hiv-DNA-fragmenten uit cellen van seropositieve personen herstel ipv onderdrukken van aids 4 Toepassingen van gentechnologie 4.1 Gentechnologie in de geneeskunde Productie van belangrijke proteïnen (bv. Insuline) Vroeger: uit weefsels Nu: door transgene cellen in vitro bacteriën gistcellen zoogdiercellen door transgene dieren in vivo 4.1.1 Productie van insuline door transgene bacteriën en gisten 4.1.2 Gentherapie: gentransplantatie bij de mens Inbrengen van een therapeutisch gen (via vector) Proteïne wordt aangemaakt door de patiënt zelf en niet door transgene cellen Probleem: therapeutisch gen in voldoende doelwitcellen brengen Voorbeeld van gencorrectie: behandeling van ADA-SCIDS (tekort aan adenosine desaminase) Severe Combined Immune Deficiency Syndrome 4.2 Gentechnologie in de landbouw en voedingsindustrie Insectenresistente gewassen Gen voor insectentoxine van Bacillus thuringiensis (Bt) overbrengen naar planten via tumor-inducing-plasmide (Ti) van Agrobacterium tumefaciens (volgende dia) Bt-tabak BT-maïs ( stengelboorder) Bt-katoen ( rups) Bt-aardappel ( coloradokever) Gen voor Bt-toxine van B. thuringiensis naar plasmide van E. coli Herbicidentolerante gewassen Planten (o.a. soja) ongevoelig maken voor bepaald herbicide 4.3 Gentechnologie in de veeteelt Bij varkenspest worden alle varkens binnen een perimeter van de besmettingshaard afgemaakt Ook gezonde en klassiek gevaccineerde varkens ze zijn niet te onderscheiden van besmette varkens Met nieuw merkervaccin kunnen gevaccineerde varkens met een diagnostische test herkend worden 4.4 Pro en contra gentechnologie pro • • • • • • • Betere geneesmiddelen Veiligere vaccins Betere voedselopbrengst Milieuvriendelijker landbouw Ziekten opsporen makkelijker Milieubeheer … contra • Beursgenoteerde bedrijven • Wensen van ouders i.v.m. geslachtbepaling, fysieke eigenschappen, … • Biodiversiteit? • Ontstaan van resistentie? • Dure technologieën arme landen en boeren? • … 5 Gentechnologische technieken Basistechnieken in de biotechnologie • • • • • • • PCR: polymersase chain reaction DNA-sequencing DNA fingerprinting Southern blotting In situ hybridisatie Klonen Knock-outmodel 5.1 Polymerase chain reaction (PCR) Repetitief aanmaken van een welbepaald DNA-fragment Een specifiek gekozen DNA-fragment kan massaal vermenigvuldigd worden (in PCR-cycler) De aanmaak van de complementaire ketens start telkens vanaf een primer (korte stukjes enkelstrengs-DNA) De techniek verloopt in 3 opeenvolgende temperatuurcycli: denaturatie renaturatie polymerisatie ± 95 °C scheiden van DNA-strengen 40-60 °C aanhechten van primers ± 72 °C aanmaak nieuwe DNA-streng Denaturatie: Dubbelstreng wordt enkelstreng door t° op 95°C te brengen H-bruggen verbroken Renaturatie: t° daalt tot 40-60°C Aanhechten van forward en reverse primer (5’ 3’) Polymerisatie: t° naar 72°C Toevoegen van Taq-polymerase Aanhechten van vrije nucleotiden vanaf startpunt (primer) Van DNA-fragmenten met overtollig DNA naar gewenste DNA-dubbelstrengen na 15 cycli is al meer dan 99,9% gewenst DNA totaal aantal cycli: 30-40 (60° C) na 30 cycli: ± 1 073 741 824 fragmenten : 5.2 DNA-gelelektroforese DNA-fragmenten sorteren op lengte Gel gieten in elektroforesekamer + kam plaatsen slotjes DNA-stalen opzetten + laadbuffer (met bv. Orange G) Migratie van DNA door spanningsverschil (fosfaatgroep neg. geladen) DNA zichtbaar maken met positief geladen kleurstof + lengte van de fragmenten kan geschat worden door te vergelijken met DNA-ladder A B C D E 5.3 DNA-sequencing Bepalen van de basensequentie in een DNA-fragment (na PCR en gelelektroforese) 5.3.1 Klassieke ketenterminatiemethode • Vergelijkbaar met PCR, maar er worden gekende stopnucleotiden toegevoegd (ddA-ddC-ddG-ddT) (zonder OH-groep aan 3’) • Waar het kopiëren van de enkelstreng stopt zit een gekende stopnucleotide de nucleotide op de oorspronkelijke streng is dan ook gekend (bv. stop met ddA T in oorspronkelijke streng) • Toepassing: basensequentie van het onderzochte gen vergelijken met een normaal, ’gezond’ gen opsporen van genmutaties 5.3.2 Automatische basensequentiebepaling Stopnucleotiden worden gemerkt met een fluorescente merker Merker wordt tijdens de elektroforese (in capillairen) gededecteerd door een sensor elektroferogram 5.4 DNA fingerprinting 5.4.1 Short tandem repeats (STRs) Korte stukjes repetitief DNA Aantal herhalingen (repeats) is verschillend per individu: DNA-polymorfismen Vb: AATG 7 herhalingen 8 herhalingen Het aantal herhalingen is variabel voor verschillende personen. 5.4.2 Restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP) DNA-stalen knippen met specifieke restrictie-enzymen Fragmenten vermeerderen met PCR Fragmenten scheiden o.b.v. lengte met elektroforese Bandenpatroon is voor ieder individu uniek Toepassingen: • dader-identificatie speeksel haar bloed sperma AmpFlSTR® Identifiler™ 6FAM (blue) D8S1179 D3S1358 D7S820 D21S11 TH01 D13S317 D16S539 VIC (green) TPOX NED (yellow) D19S433 AMEL PET (red) D18S51 VWA D5S818 FGA Geslachtsmerker: MAN In DNA profiel AMEL: X , Y GS500 LIZ size standard LIZ (orange) CSF1PO D2S1338 • vaderschapsbepaling fingerprint kind, moeder, mogelijke vaders overeenkomstige banden van moeder en kind identificeren resterende banden moeten van de biologische vader zijn 5.5 Therapeutisch klonen Lichaamscellen produceren, uitgaande van stamcellen Persoonsspecifieke weefsels maken die na transplantie geen afstotingsverschijnselen zullen vertonen 5.5.1 Stamcellen Totipotente stamcellen Pluripotente stamcellen Embryonale stamcellen Multipotente stamcellen Adulte stamcellen • Zygote en blastomeren na eerste klievingsdelingen • Cellen uit de embryoblast (na ivf uit ‘restembryo’) • Aanwezig in veel weefsels voor weefselherstel (bv. in beenmerg) • Kunnen uitgroeien tot volledig organisme • Kunnen differentiëren tot alle celtypes • Genereren alleen celtypes van het eigen weefsel 5.5.2 Multipotente Adulte Progenitorcellen (MAP) Voorlopercellen in spieren, hersenen, beenmerg, botweefsel en pancreas Kunnen geherprogrammeerd worden zodat ze embryonale stamcellen vervangen Minder morele bezwaren (geen embryo’s nodig) Ontdekt door prof. Catherine Verfaillie 5.5.3 Verloop van therapeutisch klonen Mogelijke (toekomstige) toepassingen • • • • • huidtransplanten bij brandwonden ß-cellen in pancreas neuronen aanmaken om Alzheimer te behandelen hartspiercellen aanmaken na hartinfarct beenmergcellen aanmaken tegen leukemie 5.5.4 Synthese van stamcellen uit lichaamscellen Eigen lichaamscellen worden geherprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Er moeten dan geen stamcellen meer worden ‘geoogst’ Nog in onderzoeksfase (klinische studies) Zouden toch niet zo ongedifferentieerd zijn als embryonale stamcellen Men zou op termijn ei- en zaadcellen op deze manier kunnen produceren (onvruchtbaarheidsproblemen) lukt al bij muizen
