samenvatting

Samenvatting
SAMENVATTING
In Eschericha coli zorgt het unieke carbamoylfosfaatsynthase (CPSase, EC
6.3.5.5.) voor de productie van carbamoylfosfaat, precursor voor zowel de
arginine- als de pyrimidine- de novo biosynthese. Deze tweevoudige rol wordt
weerspiegeld in de complexiteit van de regulatie van CPSase synthese en in
de allosterische controle van CPSase activiteit door verschillende
effectormoleculen (ornithine, UMP, IMP).
De synthese van CPSase wordt vooral gereguleerd op het niveau van
transcriptie-initiatie van het coderende carAB operon. Transcriptie gebeurt
vanaf een paar tandempromoters, 67 bp uit elkaar. Transcriptie-initiatie aan
de downstream promoter P2 wordt gereguleerd door arginine en de arginine
repressor (ArgR). In aanwezigheid van arginine bindt de hexamerische
arginine repressor een stel ARG boxen (18 bp imperfect palindroom) die de
promoter van de P2 transcriptie overlappen. Repressie van de P2 promoter
gebeurt door sterische exclusie van de polymerase binding.
De pyrimidinespecifieke regulatie van de upstream promotor P1 is complex
en resulteert uit twee verschillende mechanismen: UTP-sensitieve reïteratieve
transcriptie en een belangrijk multi-proteïne afhankelijk transcriptie-initiatie
mechanisme. Het laatste heeft de participatie van 3 multifunctionele
moleculen nodig: IHF (Integration Host Factor), PepA (Aminopeptidase A) en
vi
Samenvatting
PyrH (UMP-kinase). Het werd aangetoond dat al deze elementen moeten
samenwerken in de opbouw van een specifiek regulatorisch nucleoproteïne
complex waarbij IHF en PepA hoofdzakelijk een structurele rol zouden
vervullen en PyrH de sensor van de wijzigingen in de nucleotidepool zou zijn.
Daarnaast wordt, bij nutritionele stress, de P1 promoter activiteit negatief
gereguleerd door de stringent respons.
Deze studie werd toegespitst op volgende zaken: 1- het aantonen en
ontrafelen van de purinespecifieke repressie van de P1 promoter, 2- het
bepalen van de rol van de linkers, de tussenliggende sequenties die de
verschillende bindingssites verbinden, in de pyrimidine- en purine-afhankelijke
regulatie van P1, en 3- het bestuderen van de proteïnegeïnduceerde
vervorming van het operator-DNA.
In eerste instantie werd aangetoond dat purines de P1 promotoractiviteit
inderdaad represseren. Stroomopwaarts van P1 hebben wij een 16 bp stretch
gevonden die een hoge gelijkenis vertoont met de PUR box consensus. Het
werd aangetoond dat gezuiverd PurR deze potentiële PUR box bindt op een
sequentiespecifieke en ligand-afhankelijke manier. Geactiveerd PurR maakt
gebruik van de pyrimidinespecifieke nucleoproteïne structuur om zijn effect
op carAB transcriptie uit te oefenen en dus zijn de purine- en pyrimidine
regulatie van P1 promotoractiviteit zowel functioneel als structureel
gekoppeld. PepA speelt hierin een sleutelrol. Deze koppeling tussen purineen pyrimidine-gemediëerde repressie is uniek en wordt zelfs niet
teruggevonden in andere pyrimidine-biosynthese genen waarop purines en
PurR ook een controle uitvoeren.
Naast deze onverwachte koppeling tussen de repressie door purines en de
pyrimidinespecifieke repressie vertoont de purinespecifieke repressie van P1 in
E. coli nog een aantal afwijkende karakteristieken in vergelijking met andere
PurR gemediëerde transcriptiecontroles. Allereerst is er de ongewone ligging
van de target site van PurR die zeer ongewoon is; 120 bp upstream van de P1
transcriptie-initiatie site. Meestal overlapt de PUR box de promoter ofwel
fungeert PurR als een versperring voor een elongerende polymerase, als hij
stroomafwaarts bindt. Deze ongewone ligging van de carAB PUR box is
hoogstwaarschijnlijk gerelateerd met de structurele en functionele koppeling
van de P1 purinespecifieke repressie met de pyrimidinespecifieke regulatie.
Een tweede unieke en uiterst opmerkelijke eigenschap van de carAB PUR box
is de guanine op positie 8. In andere PUR boxen vindt men op positie 8
meestal een adenine terug, soms een cytosine of thymine maar nooit een
vii
Samenvatting
guanine. Vorige studies voorspelden dat een guanine op deze positie zeer
ongunstig zou zijn aangezien die een sterische clash zou veroorzaken met de
repressor. In vivo en in vitro onderzoek wijst echter uit dat guanine op positie 8
toch een functionele operator geeft, hoewel de binding niet optimaal is.
Daarnaast hebben wij ook een model geconstrueerd om aan te tonen hoe
de repressor toch met de carAB operator kan binden zonder een sterische
clash te veroorzaken.
Bijkomend onderzoek wees erop dat een overmaat purines antagonistische
effecten uitoefent op de P1 activiteit: een indirect, stimulerend effect,
vermoedelijk afkomstig uit de crosstalk tussen de purine en pyrimidine
biosyntheseweg en een directe, PurR-afhankelijke repressie, resulterend in
een netto tweevoudige repressie.
De bindingssites van de regulatorische proteïnen, betrokken in de purine- en
pyrimidine-specifieke repressie, liggen verspreid over een controlegebied van
ongeveer 450 bp, met grote tussenliggende sequenties. Wij hebben onze
aandacht gericht op deze linker sequenties en onderzochten het belang van
onderlinge afstand en fasering tussen de regulatorische bindingssites door het
introduceren van inserties en deleties van verschillende lengte, en
combinaties daarvan, in de vier linkers.
De analyse van halve en volledige draai inserties en deleties in verschillende
zones van de operator wijst erop dat de pyrimidine-specifieke repressie van
P1 activiteit zeer gevoelig is voor perturbaties in de positionering van de
verschillende regulatorische bindingssites op het oppervlak van de helix. De
systematische analyse van de lengte van linker L2 toont aan dat de afstand
tussen de twee PepA boxen, ten opzichte van elkaar en van de promotor,
strikt bepaald is voor zowel de pyrimidine- als de purine-specifieke repressie.
Gelijkaardig, zijn de afstand en fasering van de IHF en PEPA2 sites strikt
beperkt, maar enkel voor de pyrimidinespecifieke repressie. Voor de
purinespecifieke repressie is een correcte alignering van deze sites niet vereist,
en de IHF bindingssite is zelfs niet onontbeerlijk. Zodus blijkt PepA het
sleutelelement te zijn en de correcte ligging van PepA in het regulatorisch
nucleoproteïne complex is een absolute vereiste voor zowel de pyrimidine- als
de purine-gemediëerde repressie van carAB.
Bij constructen met de combinatie van een insertie en een deletie van gelijke
lengte in een enkele linker, liggen alle reeds geïdentificeerde regulatorische
bindingssites en de promoter op de correcte positie, enkel de lokale linker
sequentie is veranderd. In alle, behalve één, linkers resulteerde deze
viii
Samenvatting
combinatie in een bijna volledig herstel van de pyrimidinespecifieke repressie,
wat er op wijst dat de linker sequentie weinig of geen belang heeft.
L1, naast de promoter gelegen, is de enige linker waarin de combinatie van
een 5 bp deletie en een 5 bp insertie (ins3+del8) de pyrimidine-specifieke
repressie niet volledig hersteld (3-voudige vermindering). De purinespecifieke
repressie was onveranderd. De ins3+del8 operator verschilt van het wilde type
op
twee
posities:
een
G-C
in
de
plaats
van
een
AT op positie –60 en A-T naar T-A verandering op positie –57. Deze mutaties
bevinden zich in een 17 bp stretch die enkel bestaat uit A en T residu’s. Dit
resultaat wijst erop dat dit promoter-proximaal gebied gecontacteerd wordt
door een pyrimidine-specifiek component van het regulatorisch complex
(mogelijk PyrH, de sensor van het systeem).
De analyse van een P1 mutant (P1-ΔO1), losgekoppeld van de downstream
promoter P2 en waarbij het gehele upstream gebied vanaf positie –40
verwijderd werd, toonde aan dat het A+T-rijk gebied upstream van het -35
element niet functioneert als een Upstream Promoter (UP) element.
Tenslotte hebben we de DNA vervormingen, geïnduceerd door het binden
van de regulatorische proteïnen, geanalyseerd. We hebben de proteïnegeïnduceerde buiging door PurR, ArgR, IHF en PepA bepaald en toonden
aan dat PepA het operator DNA wikkelt. PurR en ArgR induceren een buiging
van 97° en 99°, respectievelijk. IHF induceert een bocht van 130°. PepA
brengt het grootste effect teweeg: de proteïne wikkelt het DNA met 240° en
condenseert meer dan 200 bp in het globulair nucleoproteïne complex.
Volume analyse toonde aan dat slechts één PepA hexameer aanwezig is in
het PepA-DNA complex, wat betekent dat één enkel hexameer beide PepA
boxen bindt. Alle proteïnen geïnduceerde hoeken in het controle gebied van
carAB zijn bijna of groter dan 100°. De conformatie van het operator DNA
wordt dus uitermate sterk verstoord en vervormd na de binding van deze
regulatorische proteïnen. Deze vervormingen zijn essentieel voor de werking
van het regulatorisch mechanisme.
Wij hebben een model voorgesteld voor de binding van PepA aan de carAB
operator. Beide PepA boxen komen te liggen in een DNA-bindende groeve
op de zijde van het PepA hexameer (dimeer van trimeren). Het
tussenliggende DNA ligt in een loop over de tussenliggende groeve. Dit DNA
en de groeve kunnen echter geen contact maken, aangezien ze in een
tegengestelde richting lopen. In deze loop ligt de PUR box, vrij om door PurR
gebonden te worden.
ix