BIOCHEMIE

Samenvatting
hoofdstukken 1 t/m
30, 30 april 2015
BIOCHEMIE
Gemaakt door Mart Kicken
College 1:
Algemene informatie over het vak:
Biochemie bestaat uit stromen, hierbij maak je onderscheidt tussen stofstromen, energie stromen en
informatie stromen. Stofstroming bestaat bijvoorbeeld uit katabolen (afbrekende stoffen), anabolen
(opbouwende stoffen) en transport. Energiestroming bestaat bijvoorbeeld uit energie opwekking,
chemische opslag en thermodynamica. De Informatiestroming bestaat uit DNA-> replicatie ->
transcriptie -> (m)RNA -> translatie en uiteindelijk het eiwit. Biochemie verbindt het molecuul met de cel
en gebruikt de chemie om de biologische processen weer te geven.
Ons lichaam bestaat voor 70% uit water, 1% uit zouten, 15-18% uit eiwitten, 1-5% uit
lipiden, 3% uit suikers (polysachariden) en 2-7% uit nucleïnezuren. Je treft ongeveer
20 gram eiwit per 100 ml lichaamsvolume aan. Polysachariden worden opgebouwd
uit suikers en vetten, lipiden en membranen uit vetzuren. Eiwitten worden
opgebouwd uit aminozuren en nucleïnezuren uit nucleotiden.
Prokaryoten zijn eencellige organismen zoals bacteriën. Hierbij zit het DNA en RNA
vrij in de cel en alle andere eiwitten zijn los in de cel aanwezig. Eukaryoten zijn
meercellige organismen. Eukaryoten hebben meerdere organellen met hun eigen
membranen en het DNA zit vast in de nucleus.
Evolutie proces:
Alle verschillende rijken organismes (zoals bacteriën, eukaryoten en
archaea/extremofielen komen vooruit uit één voorvader (progenoot).
Extremofielen/archaea zijn oer bacteriën die onder extreme omstandigheden leven, de
meeste extremofielen worden gevonden in bijvoorbeeld de kern van vulkanen etc. Na
verloop van tijd zijn de rijken, uit de progenoot voortkomend, steeds meer uit elkaar
gegroeid.
Chemische bindingen:
We hebben covalente en niet covalente
bindingen.
Covalente bindingen zijn de sterkste bindingen, hierbij wordt er een verbinding gemaakt tussen atomen
die gemeenschappelijke elektronenparen hebben. Denk aan sulfide bindingen S-S (oxiderende
omstandigheden buiten de cel-> disulfide bruggen gevormd, in de cel reducerende omstandigheden->
disulfide bindingen worden verbroken). De amide (N-N) binding is labieler dan de C-C binding, hierdoor
kunnen er gemakkelijker verbindingen gevormd en verbroken worden aan de amide binding. De amide
binding is dan ook de basis waaruit eiwitten worden gemaakt. Eiwitten worden gemaakt complexen in
de cel zoals het ribosoom. Eiwitten worden afgebroken door enzymen; proteasen. Dit zijn speciale
enzymen die eiwitten afbouwen. C-C binding is veel stabieler en kan niet meteen afgebroken worden,
moet hiervoor eerst geoxideerd worden. Je zult weinig peptiden (meerdere aminozuren en dus veel
stikstofbindingen) vinden die als medicijn gebruikt worden door hun zwakke bindingen.
Teprotide is een bloeddrukverlager, de peptide komt oorspronkelijk uit een slang (door dit principe kan
je doodgaan aan een slangenbeet). Teprotide is een angiotensin converting enzyme inhibitor (ACE
inhibitor), welke het omzetten van angiotensine I naar angiotensine II tegenhoudt.
Niet covalente bindingen zijn interacties tussen atomen en/of groepen van atomen doormiddel van
elektrostatische interacties, waterstofbruggen of van der Waals bindingen, waardoor ze aan elkaar
kunnen binden. Elektrostatische interactie is een interactie waarbij twee geladen groepen een
interactie met elkaar aangaan en elkaar aantrekken-> E =kq1q2/Dr2. Dr is de dielektrische constante,
deze constant bepaalt of een ionische interactie sterk zal zijn of niet. Bijvoorbeeld is de Dr in water veel
hoger dan in vacuüm, daardoor is de kracht verschillend in de tabel. Bij een eiwit zal je twee
verschillende dielektrische constante hebben, aan de buitenkant (dicht bij de Dr van water) en aan de
binnenkant van het eiwit (lagere Dr). Het is dus belangrijk waar de reactie plaats vindt.
De waterstofbrug interactie is ook een
elektrostatische interactie, maar dan net iets anders;
hierbij wordt een waterstofatoom gedeeld tussen
twee atomen. De donor is waar het waterstofatoom
direct aan verbonden is. De acceptor is waar het
elektronen veld van het waterstofatoom aan
gebonden is. Een waterstofatoom kan met de atomen
F, O, N-H een waterstofbrug vormen.
Waterstofbruggen zijn normaliter lineair onder een
hoek van 180 graden. Zij zijn ook de reden van het
speciale karakter van water.
Van der Waals interactie is een interactie middels ongeladen atomen-> door
zogenaamde dipolen. Het zijn interacties waarbij twee atomen elkaar
aantrekken als ze op een bepaalde afstand (Van der Waals afstand) van
elkaar af zitten. Van der Waals binding zijn relatief zwakke interacties maar
door hun hoeveelheid (grote hoeveelheden atomen in een bepaald gebied)
zijn ze toch nog redelijk sterk.
Interacties tussen aromaten noem je π-π staking. Er is nog een belangrijk fenomeen voor het vouwen
van eiwitten, namelijk water. Water heeft een hydrofobisch effect en is het oplosmiddel waar bijna alle
reacties plaats vinden. Water is een polair molecuul. Door deze niet lineaire vorm is water zeer geschikt
voor het vormen van waterstofbruggen, zowel met zichzelf als met andere moleculen in het water.
Water is daardoor sterk cohesief. Water kan heel goed verdunnen met een Dr van 80, 80%, het is dus
een goed oplosmiddel door de polaire/geladen moleculen. Omdat water zo polair is, heeft het als nadeel
dat het heel slecht hydrofobische verbindingen oplost. Niet-polaire moleculen kunnen geen ionische of
waterstofbruggen interactie aangaan met water en zijn dus slecht oplosbaar. Deze moleculen gaan
liever een interactie aan met zichzelf. De drijvende kracht hierachter is het vrijkomen van water dat dan
waterstofbruggen kan vormen. Een enkel hydrofoob molecuul
wordt helemaal omgeven door water moleculen, maar zit zo
geordend dat ze geen waterstofbruggen kan vormen. Als het
hydrofobe molecuul dan vrij komt, wordt het ongeordend en
kunnen ze wel waterstofbruggen gaan vormen-> de toename van
de entropie van water.
Het hydrofobe effect is de drijvende kracht achter het vouwen van
eiwitten. Eiwitten zijn lineaire ketens van aminozuren, normaal
gesproken zouden ze ongevouwen in water aanwezig zijn. Echter
vouwen hydrofobe elementen met elkaar samen. Het water wat
eraan gebonden is en daarbij vrijkomt, is de drijvende kracht achter deze reactie. De covalente en niet
covalente bindingen zorgen dat het molecuul de ultimate hoeken heeft etc.
Aminozuren:
De mens kent twintig verschillende aminozuren met allemaal verschillende
eigenschappen. Het combineren van deze verschillende aminozuren zorgen voor
polypeptiden combinaties en daaruit -> eiwitten. Wij mensen hebben dus twintig
aminozuren waaruit alle menselijke eiwitten zijn opgebouwd. De mens zelf kan er
elf zelf synthetiseren de andere negen moet hij binnen krijgen door voeding. Dat
zijn de negen essentiële aminozuren, deze zitten vooral in vlees. Planten/eieren
hebben natuurlijk ook veel aminozuren en ook de essentiële aminozuren. Maar
kinderen kunnen bepaalde aminozuren nog niet
zelf aanmaken, deze moeten ze uit vlees.
Aminozuren zijn chiraal en hebben een stereocentrum met het alfa koolstof Cα, meestal heeft dit
koolstofatoom een L en S conformatie. Deze heet een alfa koolstofatoom omdat er maar een koolstof
tussen de amine en zuurgroep zit, zitten er twee koolstofatomen is het een bèta koolstofatoom, drie
voor gamma koolstofatoom etc. Alle eiwitten in aminozuren hebben de L-configuratie en meestal de S
configuratie, behalve bij Cysteine.
Wanneer is er sprake van L of D?. L en D zijn de afkortingen voor Laevo (links) en Dextro (rechts). Een
aminozuur heeft de L configuratie als de amino (-NH2) groep aan de linkerkant van het asymmetrisch Catoom zit en er is sprake van een D configuratie als de aminogroep aan de rechterkant van het
asymmetrisch C-atoom zit.
Moleculen die dezelfde atomaire opbouw hebben, maar een verschil vertonen in ruimtelijke structuur,
dat niet is op te heffen door draaiing rond enkelvoudige bindingen, worden configuratie isomeren
genoemd. Configuratie-isomeren zijn een vorm van stereo-isomeren en kunnen opgedeeld worden in
cis-trans-isomeren (met een dubbele binding of ringen), enantiomeren (spiegelbeeld) en
diastereomeren (niet spiegelbeeld). R (rectus, rechts) en S (sinister, links) bepalen de absolute
configuratie op basis van de prioriteit van de molecuuldelen die aan het asymmetrisch (C-)atoom zitten.
College 2:
Eiwitten functioneren als katalysatoren, transporteerders en voor opslag van andere moleculen zoals
zuurstof, ze bieden mechanische hulp en immuniteit bescherming, generen beweging, sturen
zenuwpulsen door en controleren de groei en differentiatie van cellen. Enkele eigenschappen van
eiwitten:
1. Eiwitten zijn lineaire polymeren of monomeren opgebouwd
uit aminozuren, die aan elkaar zijn gelinkt. De volgorde van
het aan elkaar gelinkte aminozuren is de primaire
structuur. De drie dimensionele structuur, die wordt
gevormd door waterstofbruggen tussen aminozuren,
noem je de secundaire structuur. De tertiaire structuur
wordt gevormd door langeafstand interacties tussen
aminozuren. De eiwitfunctie is direct afhankelijk van de
drie-dimensionele structuur. De quaternaire structuur is de
structuur die gevormd wordt door de meerdere
polypeptiden ketens die een interactie aangaan met
elkaar.
2. Eiwitten hebben een groot gebied van functionele groepen. Deze functionele groepen zijn
alcoholen, thiolen, thioethers, carboxylische zuren, carboxamides en een hoeveelheid basische
groepen. De meeste van deze groepen zijn chemisch reactief. Door ze te combineren met elkaar
krijg je verschillende eigenschappen van eiwitten.
3. Eiwitten kunnen een interactie met elkaar aangaan en met biologische macromoleculen om
complexe samenstellingen te vormen. Denk aan DNA.
4. Sommige eiwitten zijn best star, en weer andere zeer flexibel. Starre eenheden kunnen
structurele elementen zijn in het cytoskelet of in het connectieve weefsel.
Eiwitten worden opgebouwd uit 20 aminozuren:
Een α-aminozuur bestaat uit een centraal koolstofatoom, het α-koolstofatoom, gelinkt aan een
amide groep, een carboxylic acid groep, een waterstofatoom en een R groep. De R groep
wordt ook wel de side chain genoemd. Doordat er vier verschillende groepen aan het
koolstof atoom zitten, zijn α-aminozuren chiraal; ze kunnen in een of twee spiegelbeelden
voorkomen, genoemd de L-isomeer en de D-isomeer.
Alleen de L aminozuren zijn bestandsdelen van eiwitten. Voor bijna alle aminozuren, heeft de L isomeer
S absolute configuratie. L en D heeft niks met S en R te maken, L en D gaat over hoe eiwitten polair licht
breken. Dit kunnen ze met de klok meedoen (R) en tegen de klok in (S). Ze weten niet precies waarom
de L aminozuren zo domineren maar denken dat het komt omdat L aminozuren iets beter kunnen
oplossen. Aminozuren in oplossing bij een neutrale pH waarde komen voor als dipolaire ionen
(zwitterionen). In de dipolaire vorm is de aminogroep
geprotoneerd (-NH3+) en de carboxyl groep
gedeprotoneerd (-COO-). De ionisatie toestand van een
aminozuur varieert met de pH. In een zure omgeving
(bijvoorbeeld pH van 1) is de aminogroep geprotoneerd
(-NH3+) en is de carboxyl groep niet afgezonderd(-COOH).
Als de pH hoger wordt, is de carboxyl zuur de eerste
groep die een proton afgeeft, aangezien zijn pKa rond de
twee zit. De dipolaire vorm blijft bestaat tot de pH van
negen wordt genaderd, wanneer de geprotoneerde
aminogroep een proton verliest.
De twintig aminozuren worden in vier grote groepen ingedeeld, gebaseerd op de karakteristieken van
de R-groep:
1. Hydrofobische aminozuren met niet-polaire R groepen
2. Polaire aminozuren met neutrale R groepen maar de lading is niet gelijk verdeeld.
3. Positief geladen aminozuren met R groepen die een positieve lading hebben bij een
fysiologische pH (bij de mens ligt deze tussen de 7.35 en 7.45).
4. Negatief geladen aminozuren met R groepen die een negatieve lading hebben bij fysiologische
pH.
Hydrofobische aminozuren:
Het simpelste aminozuur is glycine, welke een enkel waterstof atoom als zijketen heeft. Met twee
waterstofatomen gebonden aan het α-koolstofatoom is glycerine uniek omdat ze niet chiraal is.
Alanine is het volgende simpelste aminozuur, dat een methyl groep (-CH3) heeft als zijketen. Grotere
waterstof-koolstof zijketens worden gevonden in valine, leucine en isoleucine. Methionine bevat een
grote alifatische (niet aromatische) zijketen dat een thioether (-S-) groep heeft. De zijketen van
isoleucine bevat een extra chiraal centrum; alleen het isomeer in afbeelding komt in voor in eiwitten. De
grotere alifatische zijketens zijn speciaal hydrofobisch. Dit betekent dat ze graag bij elkaar willen zitten
dan in contact te komen met water. De drie-dimensioneel structuur van de in water oplosbare eiwitten
worden gestabiliseerd door de neiging van de hydrofobische groepen om samen te zitten, wat je het al
eerder behandelde hydrofobisch effect noemt. De verschillende groottes van vorm van deze waterstofkoolstof zijketens zorgen ervoor dat ze compacte structuren kunnen vormen in kleine ruimtes. Proline
heeft ook een alifatische zijketen, maar verschilt van de andere aminozuren doordat zijn zijketen
verbonden is tot zowel een stikstofgroep als het α-koolstofatoom. Proline is door zijn ring structuur
meer conformationeel gebonden dan de andere aminozuren. Phenylalanine, als de naam al aangeeft,
bevat een fenol ring aan de plaats van een van de waterstofatomen in alanine. Tryptofaan heeft een
indole groep aan een methyl (-CH2-) groep; de indole groep brengt de twee gefuseerde ringen met een
NH groep bij elkaar. Phenylalanine is helemaal hydrofobisch, bij tryptofaan is dit minder door zijn NHgroepen.
Polaire aminozuren:
Deze zes aminozuren zijn polair maar ongeladen. Drie aminozuren (serine, threonine en tyrosine)
bevatten hydroxyl groepen (-OH) gehecht aan een hydrofobische zijketen. Serine kan gezien worden als
een variatie van alanine met een hydroxyl groep aangehecht, threonine kan gezien worden als valine
met een hydroxyl groep i.p.v. een van valine’s methyl groepen en tyrosine kan gezien worden als een
versie van phenylalanine met een hydroxyl groep die een waterstof vervangt op de aromatische ring. De
hydroxyl groep maken deze aminozuren veel meer hydrofilisch en reactief dan hun hydrofobische
tegenhangers. Threonine bevat, net als isoleucine, een extra asymmetrisch centrum; en weer is er maar
één isomeer aanwezig in eiwitten.
Daarbij zijn asparagine en glutamine, ongeladen afgeleiden van de aminozuren aspartaat en glutamaat.
Elke van deze twee aminozuren bevatten een carboxamide in plaats van een carboxylic acid. De zij keten
van glutamine is een methyl groep langer dan dat van asparagine. Cysteine is structureel gelijk aan
serine maar heeft een sylfhydryl of thiol (-SH) groep i.p.v. een hydroxyl (-OH) groep. De thiol groep is
heel reactief. Paren van sulfydryl groepen kunnen samen komen om di-sulfidebindingen te maken,
welke heel belangrijk zijn bij bepaalde eiwitten in het stabiliseren.
Postief geladen aminozuren:
Dit zijn de aminozuren lysine, arginine en histidine. Lysine en arginine hebben lange
zijketens die opgaan samen met groepen die positief geladen zijn bij een neutrale pH.
Hierbij wordt er bij lysine een primaire aminogroep gevormd en bij arginine een
guanidinium groep. Histidine bevat een imidazole groep, een aromatische ring dat ook
positief geladen kan zijn. Met een pKa van bij de zes, kan de imidazole groep niet geladen
of positief geladen zijn bij een neutrale pH, afhankelijk van de omgeving. Histidine wordt
vaak gevonden bij actieve plaatsen van enzymen, waar de imidazole ring kan binden en
protonen vrij kan laten voor enzymatische reacties.
Negatief geladen aminozuren:
Deze groep van aminozuren bevat twee aminozuren met zure zijketens: aspartaatzuur en
glutamaatzuur (aspartic acid en glutamic acid). Deze aminozuren worden vaak aspartaat en glutamaat
genoemd, omdat bij fysiologische pH hun zijketens meestal een proton missen dat aanwezig is in de
zuur vorm en daarom negatief geladen is. Maar in sommige eiwitten accepteren deze zijketens wel
protonen.
Zeven (tyrosine, cysteine, arginine, lysine, histidine, aspartic acid en glytamic acid) van de twintig
aminozuren hebben ioniseerbare zijketenen. Deze zeven aminozuren kunnen zowel protonen doneren
als accepteren en faciliteren reacties of ionische bindingen. Zie tabel 2.1 op bladzijde 32 (leer deze wel!)
voor de typische pKa waardes van deze aminozuren. Ook de terminal α-amino groep en de terminaal αcarboxyl groep kunnen geïoniseerd worden, zie hiervoor ook het tabel.
Vaak worden aminozuren afgekort door drieletters of door één hoofdletter.
Dit zijn bijna altijd de eerste drie letters van hun naam.
Primaire structuur:
Eiwitten zijn lineaire polymeren die gevormd worden door het linken van de α-carboxyl groep van een
aminozuur met de α-amino groep van een ander aminozuur. Deze typebinding noem je een
peptidebinding of een amidebinding. De vorming van een dipeptide vanuit twee aminozuren gaat
gepaard met het verlies van een watermolecuul (H2O). Het evenwicht van deze reactie ligt meestal meer
naar de hydrolyse kant dan de vorming kant. Hierdoor heeft de reactie vaak een input nodig van energie
anders zal het een zeer geringe reactie aangaan; een katalysator verlaagt deze energie input maar dat
wordt later beter uitgelegd. Een serie aminozuren met peptide bindingen vormen een polypeptideketen,
en elk aminozuur in een polypeptide heet een residu. Een polypeptide keten heeft polariteit vanwege
haar verschillende eindes; een α-amino groep aan het ene uiteinde en een α-carboxyl groep aan het
andere uiteinde. Bij afspraak zit het amino-uiteinde altijd aan het begin van de peptideketen, zodat het
opschrijven van de amino-keten begint met amino-terminal residu. Dus bij de pentapeptide Tyr-Gly-GlyPhe-Leu is tyrosine de amino-terminal (N-terminal) residue en leucine de carboxyl-terminal (C-terminal)
residu. Leu-Phe-Gly-Gly_tyr is dus een totaal ander pentapeptide met andere chemische eigenschappen.
Een polypeptide bestaat uit een herhalend deel, de hoofdketen (main chain), en een variërend deel,
bestaand uit de onderscheidende zijketenen. De hoofdketen van de polypeptide is rijk in de
mogelijkheid van het vormen van waterstofbindingen/bruggen. De meeste polypeptiden ketenen
bevatten tussen de 50 en 2000 aminozuur residu’s en worden eiwitten genoemd. Peptides die zijn
opgebouwd uit kleine aminozuren noem je oligopeptides of peptides. De massa van een eiwit wordt
uitgedrukt in daltons; één dalton is gelijk aan één atomische massa eenheid; een eiwit van 50,000 g/mol
heeft dus een massa van 50,000 daltons. In sommige eiwitten is
de lineaire polypeptide keten gecross-linked. De bekendste
cross-links zijn disulfide bindingen, gevormd door de oxidatie
van een twee cysteine residu’s. Extracellulaire eiwitten hebben
vaak verschillende disulfide bindingen, echter hebben
intracellulaire eiwitten juist vaak weinig disulfide bindingen.
De aminozuur volgorde van een eiwit wordt de primaire structuur genoemd. De volgorde van
nucleotiden in DNA bepaalt de complementaire volgorde van nucleotiden in RNA, welke weer vertalen
naar een bepaalde aminozuur volgorde van een eiwit. De aminozuur volgorde kennen is belangrijk voor
vele redenen. Eerst, door het weten van de volgorde van een eiwit kan je vaak de mechanismes van het
eiwit beter snappen. Als tweede bepaalt de aminozuur volgorde de 3-dimensionele structuur van het
eiwit. Als derde, de volgorde van het aminozuur kan ziektes verklaren en bepalen. En als vierde, vertelt
de aminozuur volgorde veel over de evolutionaire geschiedenis van het eiwit/organisme.
Polypeptide ketens zijn flexibel maar toch ook conformationeel star:
Bij het bestuderen van de geometrie van de polypeptiden vallen
bepaalde dingen op; als eerste is de peptide bond vooral planair.
Dus voor een paar aminozuren gelinkt door een peptide binding,
liggen zes atomen in hetzelfde vlak; het α-koolstofatoom en de CO
groep van het eerste aminozuur en de NH groep en het αkoolstofatoom van het tweede aminozuur. De binding resoneert
tussen een enkel binding en een dubbele binding.
Door dit dubbele-bindingskarakter wordt rotatie rond deze binding tegengehouden en is een
conformatie van de hoofdketen ‘onnatuurlijk’. Het dubbele-bindingskarakter wordt ook uitgedrukt in de
lengte van de binding tussen de CO en de NH groepen. De C-N afstand in een peptidebinding is ongeveer
1.32 A (met cirkeltje erboven), dit zit tussen de afstand van een enkelbinding (C-N, 1.49 A) en een
dubbele binding (C=N, 1.27 A). Als laatste is de peptidebinding niet geladen,
waardoor polymeren van aminozuren gelinkt door peptidebindingen
dichtgepakte bolvormige structuren kunnen vormen. Twee configuraties
zijn mogelijk voor een planaire peptidebinding; de trans configuratie,
waarbij de twee α-koolstofatomen aan tegenovergestelde kanten van de
peptide binding zitten, en de cis configuratie waarbij de twee αkoolstofatomen aan dezelfde kant van de peptide binding zitten. Bijna alle
peptide bindingen in eiwitten zijn trans. Dit komt omdat de atomen bij een
cis peptidebinding met elkaar zouden interfereren. Hiervan is geen sprake
bij trans configuratie. De meeste bekende cis peptide binding zijn de X-Pro
links. Zulke bindingen hebben minder preferentie aan trans binding omdat
de stikstof van proline gebonden is aan twee tetrahedrale koolstofatomen,
zie bladzijde 37 voor plaatje, waardoor er bijna geen voorkeur is naar cis of
trans configuratie.
In contrast met de peptidebinding, zijn de bindingen tussen de amino
groep en de α-koolstof groep en tussen de α-koolstof groep en de
carbonyl groep enkele bindingen. De twee starre peptide eenheden
kunnen roteren rondom deze bindingen en hierdoor verschillende
oriëntaties aannemen. Deze vrijheid van rotatie over twee bindingen
van ieder aminozuur, staat het eiwit toe om in verschillende
manieren te vouwen. De rotaties over deze bindingen kunnen
gespecificeerd worden door torsion angles. De hoek van rotatie over
de binding tussen de stikstof en het α-koolstofatoom noem je phi (φ).
De hoek van rotatie tussen het α-koolstofatoom en de carbonyl koolstofatomen noem je de psi (ψ). Met
de klok mee draaien geeft een positieve hoek en tegen de klok indraaien een negatieve hoek.
Niet alle combinatie tussen φ en ψ hoeken zijn mogelijk, sommige zijn niet mogelijk door sterische
botsingen tussen atomen. De toegestane waardes staan in het Ramachandran diagram. ¾ van de
mogelijke combinaties worden al uitgesloten door simpele lokale sterische botsingen; het begrip dat
twee atomen niet op dezelfde plek kunnen zijn tegelijkertijd. De starheid van een peptide eenheid en de
beperkte set van toegestane φ en ψ hoeken, limiteren het aantal structuren toegankelijk voor de
ongevouwen vorm. Toch blijkt dit meer dan voldoende genoeg te zijn om eiwittenvouwing te laten
plaatsvinden.
Secundaire structuur; alfa helix, bèta sheets en turns and loops:
Alfa helices:
Alfa helices en turns worden gevormd door een herhalend
patroon van waterstofbindingen tussen de peptiden N-H en C=O
groepen van aminozuren die dichtbij elkaar zitten in de lineaire
volgorde. Deze gevouwen segmenten noem je secundaire
structuur. De α-helix is een stafachtige structuur. Een strakke
opgerolde ruggengraad vormt het binnen deel van de ‘staf’ en
de zijketens strekken zich naar buiten uit.
De α-helix wordt gestabiliseerd door waterstofbindingen tussen de NH en CO groepen van de
hoofdketen. De CO groep, in het bijzonder, van elk aminozuur vormt een waterstofbinding met een NH
groep van het aminozuur dat vier residu’s verder ligt in de volgorde. Dus, met uitzondering van de
aminozuren aan het einde van de α-helix, zijn alle hoofdketens CO en NH groepen door
waterstofbindingen gebonden. Elke residu is gerelateerd aan de volgende door een stijging, dit noem je
translation van 1.5 A langs de helix assen en een rotatie van 100 graden, dit geeft 3.6 aminozuren
residu’s per draaiing van de helix.
De residu’s zitten dan ook allemaal dichtbij elkaar. De hoogte (pitch) van de α-helix is gelijk aan de
lengte van een complete draaiing langs de helix as en is gelijk aan het product van de stijging (1.5 A) en
het nummer van residu’s per draaiing (3.6) oftewel 5.4 A. De draaiing van de helix kan zowel met klok
mee draaien of tegen de klok in. Zie het Ramachandran diagram hiervoor. Echter zijn helices die met de
klok mee draaien energetisch gezien voordeliger omdat ze minder sterische botsing hebben tussen hun
zij-ketens en de ‘ruggengraad’. Bijna alle α-helices gevonden in eiwitten draaien met de klok mee.
Echter kunnen niet alle aminozuren gemakkelijk in een α-helix worden ‘ondergebracht’. Aftakkingen bij
het β-koolstofatoom (het tweede koolstofatoom na het α-koolstofatoom), zoals bij valine, threonine en
isoleucine, destabiliseren de α-helices door sterische botsingen. Serine, aspartate en asparagine
ontwrichten de α-helices ook doordat hun zijketens zowel donoren als acceptoren van
waterstofbindingen bevatten dichtbij de hoofdketen, waar de hoofdketens van NH en CO groepen
zitten. Proline is ook een helix breker door het gebrek aan NH-groepen en omdat zijn ringstructuur hem
niet de goede φ waarde geeft om in een α-helix te komen. α-helices kunnen zowel 100% van het eiwit
uitmaken als 0%.
Bèta sheets:
Een tweede secundaire structuur is de bèta sheet ofwel β-sheet. Deze wijkt
zeer af van de α-helix in vorm. Het bestaat uit twee of meer polypeptide
ketens β-strengen (β-strands) genoemd. Een β streng is bijna helemaal
verlengd i.p.v. dichtbij op elkaar gevouwen zoals bij de α-helix. De afstand
tussen aangrenzende aminozuren langs een β streng is ongeveer 3.5 A, in
contrast met de 1.5 A bij α-helices. De zijketens van aangrenzende aminozuren
wijzen in tegengestelde richtingen. Een β sheet wordt gevormd door het
linken van twee of meer β strengen, die naast elkaar liggen, door
waterstofbindingen. Aangrenzende ketenen in een β sheet kunnen zowel parallel
liggen als anti-parallel. Bij de anti-parallelle vorm is de NH groep en de CO groep
van elk aminozuur respectievelijk gebonden aan de CO groep en de NH groep
van de partner van de aangrenzende/tegenovergestelde keten. Bij de parallelle
vorm is voor elk aminozuur de NH groep door een waterstofbinding verbonden
met de CO groep van een van de aminozuren van de tegenovergestelde keten,
en de CO groep is door een waterstofbinding verbonden met de NH groep op het
aminozuur twee residu’s verder langs de keten, zie het figuur hiernaast.
Verschillende ketens van normaal 4 tot 5, maar ook van 10 of meer, kunnen
samen komen in β sheets, deze kunnen zowel parallel als antiparallel zijn of
gemixt. Β sheets worden vaak als grote pijlen schematisch weergegeven.
Turns en Loops:
Veel eiwitten hebben compacte, bolvormige vormen met omkeringen in de richting
van hun polypeptide ketenen. Veel van deze omkeringen worden gevormd door
een structureel element genoemd de reverse turn (β turn of haripin turn). Bij vele
reverse turns is de CO groep van het residu i van een polypeptide d.m.v. een
waterstofbinding gebonden aan een NH groep of residu i + 3.
De interactie tussen deze twee groepen stabiliseert abrupte veranderingen in de
richting van de polypeptide keten. In andere gevallen worden er meer
ingewikkeldere structuren gebruikt voor ketenomkeringen. Deze structuren noem
je loops of soms Ω loops, wegens hun karakteristieke vorm. Niet net zoals α-helices
en β sheets hebben loops geen regelmatige structuren.
Speciale types van helices zijn de twee eiwitten α-keratine en collageen. Deze eiwitten vormen lange
vezels en dienen een structurele rol. α-keratine, het hoofdcomponent van wol, haar
en huid, bestaat uit twee rechtshandige (met de klok meedraaiende) α-helices in
elkaar gewikkeld tot een linkshandige (tegen de klok indraaiende) superhelix; een αhelical coiled coil genoemd. α-keratine is een eiwit wat deel uitmaakt van de
superhelix-familie van eiwitten de coiled-coil eiwitten. Deze eiwitten kunnen twee
of meerdere α-helices in elkaar draaien tot een zeer stabiele structuur die een lengte
van wel 1000 A of meer kan hebben. Er zijn ongeveer 60 verschillende ‘leden’ van
deze familie in de mens, waaronder intermediaire filamenten en
de spiereiwitten myosine en tropo-myosine. Deze ‘leden’
worden gekarakteriseerd door een centraal gebeid van 300
aminozuren die een imperfecte herhaling hebben van een
volgorde van zeven aminozuren, genoemd een heptad repeat.
De twee helices in α-keratine zijn cross-linked door zwakke
interacties zoals van der Walls krachten en ionische interacties.
Doordat ze in elkaar zijn geketend krijg je om de 3.5 residu’s een
turn i.p.v. om de 3.6. Twee helices met zulke herhaling kunnen
interactie met elkaar aangaan als de herhalingen complementair
zijn. Bijvoorbeeld complementaire cysteines die een sulfide binding
aangaan.
Een ander type van helix is te vinden in collageen, de belangrijkste
vezel in je huid ,botten ,tendons , kraakbeen en tanden. Dit
extracellulaire eiwit heeft een ‘staf’ vorm, is ongeveer 3000 A lang
en heeft een 15 A diameter. Het bestaat uit drie helixvormige
polypeptide ketens, allemaal ongeveer 1000 residu’s lang. Glycine
komt voor elke derde residu in de aminozuur volgorde en de
volgorde glycine-proline-hydroxyproline komt herhaaldelijk terug.
Deze helix heeft geen waterstofbindingen binnenin. Maar de helix
wordt gestabiliseerd door sterische afstoting van de pyrrolidine
ringen van de proline en hydroxyproline. De pyrroline ringen
houden afstand van elkaar als de polypeptide keten zijn helixvorm
heeft aangenomen, welk om de drie turns eentje heeft. Drie
strengen om elkaar gewonden vormen een superhelical cable dat
wordt gestabiliseerd door waterstofbindingen tussen de strengen.
De waterstofbindingen worden gevormd tussen de peptide NH groepen van glycine residu’s en de CO
groepen van residu’s van de ander ketens. De hydroxyl groepen van hydroxyproline residu’s helpen ook
mee met waterstofbindingen. Deze structuur vereist echter dat glycine op elke derde positie op elke
streng moet zitten. Het enige residu die past in een interior positie is glycine. Het aminozuur residu op
elke zijde van glycine is gelokaliseerd aan de buitenkant van de ´cable’, waar er geen ruimte is voor
omvangrijke ringen van proline of hydroxyproline residu’s
Tertiaire structuur:
Met X-ray kristallografie en nucleaire magnetische resonantie (NMR) kunnen we de 3-dimensionele
structuur van duizenden eiwitten laten zien. De algemene loop van een polypeptide keten van een eiwit
wordt de tertiaire structuur genoemd. De interior van een eiwit bestaat bijna alleen uit niet polaire
residu’s zoals leucine, valine, methionine en phenylalanine. Geladen residu’s zoals aspartaat, glutamaat,
lysine en arginine zijn vaak afwezig van de binnenkant van een eiwit.
We nemen als voorbeeld het eiwit myosine; zijn interior bestaat uit vrijwel alleen maar niet polaire
residu’s (met als uitzondering twee histidine residu’s) en zijn buitenkant uit zowel polaire als niet polaire
residu’s. Binnen in is er maar heel weinig vrije ruimte. Deze ‘afwijkende’ verdeling wordt gemaakt bij het
vouwen van het eiwit. In een waterig milieu wordt het eiwit vouwen aangedreven door een sterke
neiging om hydrofobische residu’s uit te sluiten van het water. Een polypeptide vouwt zo dat de
hydrofobische zijketens zijn ‘begraven’ in het eiwit en zijn polaire, geladen keten op het oppervlakte
liggen. Vele α-helices en β ketens zijn amfipatisch; ze hebben zowel een hydrofobische kant, meer naar
het interior van het eiwit gelegen, en een hydrofiele kant, meer naar het oppervlak van het eiwit
gelegen. Het lot van de hoofdketen die de hydrofobische zijketens vergezellen is ook belangrijk. Een
ongepaarde peptide NH of CO groep verkiest water boven een niet polair milieu. Om een segment van
de hoofdketen in een hydrofobisch milieu te ‘begraven’, moet je alle NH en CO groepen door
waterstofbindingen met elkaar verbinden. Dit paren van groepen wordt netjes bereikt in een α-helix en
β sheet. Van der Walls bindingen tussen de dicht op elkaar gepakte hydrocarbon-zijketens helpen ook
mee met de stabiliteit van de eiwitten.
Sommige eiwitten die de biologische membranen spannen ‘zijn de
uitzonderingen die de regel bewijzen’, omdat zij een omgedraaide distributie
hebben van hydrofobische en hydrofilische aminozuren. Bijvoorbeeld porins,
dit zijn eiwitten die gevonden worden in de buitenmembranen van vele
bacteriën. Membranen zijn opgebouwd uit hydrofobische alkaan ketens. Dus
zullen de porins vooral op de buitenkant aanwezig zijn met hydrofobische
residu’s die een interactie aangaan met naburige alkaan ketens. In contrast
bestaat het centrum van het eiwit uit vele geladen en polaire aminozuren dat
een water-gevuld kanaal omgeeft wat door het midden van het eiwit loopt.
Omdat porins functioneren in hydrofobische omgevingen, zijn ze ‘inside out’
relatief aan eiwitten die functioneren in een waterige oplossing.
Bepaalde combinaties van secundaire structuren zijn aanwezig in vele
eiwitten en oefenen vaak dezelfde functie uit. Deze combinaties worden motifs of supersecondaire
structuren genoemd. Bijvoorbeeld wordt een α-helix gescheiden van een andere α-helix door een turn,
een helix-turn-helix eenheid genoemd, en deze wordt vaak gevonden in de vele eiwitten die het DNA
binden. Sommige polypeptide ketens vouwen in twee of meer compacte regionen die zijn verbonden
door een flexibel segment van een polypeptide keten, net als parels op een snoer. Deze compacte
bolvormige eenheden heten domeinen (domains), en verschillen in grootte tussen de 30 en 400
aminozuren residu’s.
Quaternaire structuren:
Even samenvatting van de vorige drie structuren; de primaire structuur is de aminozuur volgorde, de
secundaire structuur refereert naar de ruimtelijke ordening van aminozuur residu’s die dicht bij elkaar
zitten in de sequentie/volgorde, denk aan de α-helix , β sheets en de turns en loops. De tertiaire
structuur refereert naar de ruimtelijke ordening van aminozuur residu’s die ver van elkaar zitten in de
sequentie/volgorde en naar de patronen van de disulfide bindingen. We gaan nu kijken naar eiwitten die
meer dan een polypeptide keten hebben, deze eiwitten hebben een 4de niveau van structuur. Elke
polypeptide keten in zo’n eiwit noem je een subunit. De quaternaire structuur refereert naar de
ruimtelijke ordening van de subunits en de natuur van hun interacties. De simpelste soort van
quaternaire structuur is een dimeer, bestaand uit twee identieke subunits. Maar er zijn ook combinaties
met meerdere verschillende subunits. Virussen maken gebruik van subunits om een soort jas te vormen
om zich te beschermen. De ‘jas’ van een rhinovirus bijvoorbeeld, het virus wat verkoudheid veroorzaakt,
bevat 60 kopieën elk van vier subunits.
De aminozuur volgorde van een eiwit bepaalt zijn drie-dimensionele structuur:
In de 20ste eeuw zijn er experimenten gedaan naar overeenkomst tussen de aminozuurvolgorde en zijn
3-D structuur. Daaruit kwam dat ook al verbrak je de disulfide bindingen in een enzymeiwit
(ribonuclease), het eiwit gegeven tijd weer terug ging naar zijn oude vorm en de disulfide binding weer
repareerde en zijn enzymatische activiteit weer terug kreeg. Dit liet zien dat de informatie die nodig is
om de katalytisch actieve structuur van ribonuclease te specificeren in de aminozuur volgorde
opgesloten zat. Dit principe noem je de sequence specifies conformation.
Bepaalde residu’s met di-sulfidebindingen passen maar op andere vaste
residu’s, deze kunnen niet onderling met elkaar wisselen. Er zijn 105
verschillende manieren om acht cysteine moleculen met elkaar te paren met
vier verschillende di-sulfides. De 104 verkeerde paringen heten ‘scrambled’
ribonuclease en de enige goede heet de native ribonuclease. Als de
ribonuclease weer terug gaat naar zijn oude vorm gaat hij door de
verschillende scramble structuren totdat hij de stabiele native structuur heeft
bereikt.
College 3:
Proteoom = de verzameling van alle eiwitten van een organisme of van een cel. Het staat in verband
met onder meer het genoom (verzameling van alle genen).
3.1 de zuivering van eiwitten is een belangrijke eerste stap om hun functie te begrijpen
Hoe herkennen we het eiwit waar we naar op zoek zijn?
Zuivering moet ervoor zorgen dat je alleen een sample krijgt wat het eiwit naar interesse bevat. Deze
sample kan soms maar een fractie van 1% van het startmateriaal zijn. Een eiwit kan worden gezuiverd
door een aantal keer te scheiden op basis van fysische eigenschappen zoals grootte en lading.
Assay = nodig als test om te kijken naar het succes van de zuivering. Positief resultaat op de assay
betekent dat het eiwit aanwezig is.
Eiwitten moeten uit de cel vrij worden gelaten om gezuiverd te kunnen worden.
 Stap 1) Als de assay en de bron van het eiwit is gekozen, wordt de cel in componenten
gebrokkeld en wordt er onderzocht welk component er is verrijkt in het eiwit. Je maakt eerst de
cellen open met bijvoorbeeld verwarmen/ultrageluid.

Stap 2) Vervolgens dient het eiwitgedeelte van het nieteiwitgedeelte gescheiden te worden. Dit niet-eiwitgedeelte bevat
doorgaans zaken als DNA, RNA, celmembraan, celwand,
celorganellen etc. Deze gedeeltes zijn doorgaans zwaarder en hebben
een hogere dichtheid dan de eiwitten zelf. Hierdoor kan het
eiwitgedeelte van het niet-eiwitgedeelte gescheiden worden
middels centrifuge. Het niet-eiwitgedeelte zakt naar de bodem
(pellet) en het eiwitgedeelte blijft in oplossing (de supernatant).

Stap 3) Het supernatant wordt nog een keer gecentrifugeerd met een hogere kracht om nog
een ander pellet en supernatant te vergrijken. De procedure (differentiële centrifugering)
verkrijgt verschillende fracties van het verkleinen van de dichtheid, elk bevat nog steeds
honderden van verschillende eiwitten.
Eiwitten kunnen worden gezuiverd door oplosbaarheid, grootte, lading en aantrekkingskracht
Uitzouten
De meeste eiwitten zijn minder oplosbaar tijdens hoge zoutconcentraties. Dit effect heet
‘uitzouten’. Bij welke zout concentratie het eiwit zal neerslaan verschilt per eiwit. Dit kan
gebruikt worden om de eiwitten op te splitsen.
Dialyse
Eiwitten kunnen worden gescheiden van kleine moleculen zoals zout door dialyse met
een semi permeabel membraan zoals een cellulose membraan met poriën. De eiwitmix wordt in de
dialyse tas gestopt, waarna deze wordt ondergedompeld in een buffer oplossing die geen kleine
moleculen bevat. De moleculen die groter zijn dan de porie diameter blijven in de
dialyse zak. De kleinere moleculen en ionen
die door de poriën heen kunnen diffunderen
met de concentratie gradiënten mee en
gaan naar de oplossing buiten de zak.
Gelfiltratie chromatografie
Hierbij bestaat de kolom uit een gel bestaande uit - met poriën bedektekorreltjes. De moleculen van de mobiele fase vallen als het waren in de
poriën. De poriën en korrels hebben een voorgeschreven diameter.
Grotere eiwitten zullen niet in de poriën passen, en dus de kortste weg
nemen langs de korreltjes. De grootste eiwitten zullen dus in de
zogenaamde void volume terechtkomen, en dus als eerste elueren
(worden gescheiden). Hoe kleiner de eiwitten, hoe vaker ze in de poriën
zullen vallen, en hoe langer ze er over zullen doen om de onderkant van
de kolom te bereiken.
Ion wisselingschromatografie
Bij ion –wisselingschromatografie (IEC) wordt de lading van eiwitten
gebruikt om een scheiding te verkrijgen. De kolom van een IEC is sterk
polair. Er bestaan twee typen IEC; een kationenwisselaar en een
anionenwisselaar. Een kationwisselaar bestaat zelf uit negatief geladen
sulfonzuurresten (-C2-H4-SO3-). Een anionwisselaar bestaat zelf uit
quaternaire ammioniumgroepen. (-C2-H4-N+-(CH3CH2)3) Als men nu
langzaam de zoutconcentratie verhoogt, kan het gebonden eiwit aan de
geladen groepen in de kolom gescheiden worden. Dus bij de
kationwisselaar zullen de negatief geladen deeltjes eerder passeren.
Affiniteitschromatografie
Deze techniek maakt gebruikt van de hoge aantrekkingskracht van
eiwitten met bepaalde chemische groepen. Het kan effectief
worden gebruikt om een eiwit te isoleren dat een groep X herkend
door:
(1) Covalente bindingen of een derivaat aan een kolom.
(2) Het toevoegen van een mix van eiwitten aan deze kolom,
welke daarna wordt gespoeld met een buffer om de
ongebonden eiwitten te verwijderen.
(3) Het scheiden van het gewilde eiwit door een hoge
concentratie van de oplosbare vorm van X toe te voegen of
de condities te veranderen om de bindingskracht te
verkleinen.
Bijvoorbeeld een epitoop eiwit met een tag voor nikkel, deze kan je
dan inbouwen in het DNA van het gewilde eiwit, vervolgens zorg je dat het column materiaal uit nikkel
bestaat en zal alleen de eiwitten met de tag aan de nikkel binden.
Hoge druk vloeistof chromatografie (HPLC)
HPLC is een complexere versie van de kolom technieken die al zijn benoemd. Het is een vorm van
vloeistofchromatografie waarbij de mobiele fase onder hoge druk door een kolom gepompt wordt.
Gel elektroforese (SDS-PAGE)
Je maakt een gel en stopt boven in je gel de eiwitoplossing. Vervolgens zet je
het onder spanning met bijvoorbeeld de minpool boven en de pluspool
onder. De kleine moleculen zullen snel door de gel gaan en grote moleculen
langzaam. Is jouw eiwit zuiver, dan moeten ze allemaal dezelfde grootte en
dus snelheid hebben. Die gel is gebaseerd op PA (polyacrylamide, zeer
kankerverwekkend). Je neemt eerst acrylamide en voegt daar
methylenebisacrylamide aan toe, deze maakt dan crosslinks tussen twee polymide
ketens en daarmee maak je een soort gelachtig materiaal. Je doet dit vervolgens in
een waterige oplossing. Hierbij voeg je SDS (sodiumdedi, dit is een zeep molecuul
die negatief geladen is en een grote hydrofobische staart heeft, met deze
hydrofobe staart bindt hij aan eiwitten). Deze denatureert het eiwit en geeft er een
negatieve lading aan. Hoe groter eiwit hoe meer SDS er aan bindt en hoe negatieve
hij geladen is. Je voegt eventueel nog β-mercaptoethanol om de disulfide bindingen
te verbreken.
De wiskunde bij SDS-PAGE:
Eén molecuul met een netto lading zal gaan bewegen in een elektrisch veld.
[3.1] v 
Ez
f
Hierbij is v de migratie snelheid van een eiwit(of molecuul) is, E is de sterkte van het
elektrisch veld, z is de netto lading van het eiwit en f is de wrijvingscoëfficiënt.
De elektrische kracht (E*z) brengt het geladen deeltje richting de tegenovergesteld
geladen elektrode. f hangt af van de massa en vorm van het migrerende molecuul en
van de viscositeit van het medium.
[3.2] f  6   r
Moleculen die klein zijn ten opzichte van de poriën in de gel gaan gemakkelijk door
de gel heen. Hoe groter de moleculen, hoe trager ze door de gel zullen bewegen. Het
elektrische veld wordt zo gezet dat de eiwitten migreren van de negatieve naar de positieve
elektroden. Het vindt plaats in polyacrylamide gel.
Iso-elektrisch focusseren
Eiwitten kunnen ook worden gescheiden op basis van hun relatieve inhoud van zure en basische
residuen. Het iso-elektisch punt (pI) van een eiwit, is de pH waar de netto lading nul is. Bij deze pH is de
elektroforetische mobiliteit nul omdat z in de vergelijking [3.1] nul is. Een pH-gradiënt bepaalt het
gedrag van de eiwitten; de zure residuen worden negatief geladen in een basisch milieu (en
omgekeerd). De eiwitten, die een verzameling zijn van basische en zure residuen, zullen migreren tot ze
bij de pH-zone (overeenkomstig met hun pI) terechtkomen waar hun netto-lading nul wordt.
Je brengt dus eigenlijk het eiwit op een gel aan waarop je een pH milieu aanbrengt. Het gaat van hoge
pH naar lage pH. Je zet hier een spanning op, het eiwit zal dan ‘stil’ staan waar hij neutraal geladen is.
Basische eiwitten zullen bij hoge pH stil staan en zure eiwitten bij lage pH.
2D elektroforese (SDS-PAGE + iso-elektrische focussering)
In de gel worden eiwitten gescheiden in de horizontale richting, gebaseerd op hun iso elektrisch punt en
in de verticale richting op basis van massa (SDS-PAGE + iso-elektrische focussering).
Het succes van eiwit zuiveringsschema is afhankelijk van enkele parameters:
1. Totaal aantal eiwit. Hoeveelheid eiwit aanwezig in de fractie
2. Totale activiteit. De enzymactiviteit voor de fractie is verkregen door de enzymactiviteit te
meten in het volume van de fractie die gebruikt is in de assay vermenigvuldigd door het otaal
volume van de fractie.
3. Specifieke activiteit. Deze parameter is verkregen door de totale activiteit te delen door het
totaal aantal eiwit.
4. Opbrengst. Deze parameter is een meting van de activiteit die is behouden na elke
zuiveringsstap als percentage van de activiteit in het ruwe extract. De hoeveelheid activiteit in
eerste extract is 100%.
5. Zuiveringslevel. Deze parameter is een maat voor de toename in zuiverheid en is verkregen
door de specifieke activiteit te delen, berekend na elke zuiveringsstap, door de specifieke
activiteit van het eerste extract.
Ultracentrifugering is handig voor het scheiden van biomoleculen en het bepalen van hun massa
[3.3] s 
m(1  v )
f
De sedimentatie s is afhankelijk van de massa m, het partieel specifiek volume , de dichtheid van het
medium ρ en de weerstand coëfficiënt f.
3.2 aminozuur sequentie van eiwitten kunnen experimenteel worden vastgesteld
1. De sequentie van een eiwit kan worden vergeleken met alle andere bekende sequenties om na
te gaan of er significante overeenkomsten zijn.
2. Vergelijking van sequenties van het zelfde eiwit in verschillende soorten verkrijgt ook veel
informatie over evolutionaire ‘weg’.
3. In aminozuursequenties kan er worden gezocht naar het voorkomen van interne herhalingen.
4. Vele eiwitten bevatten aminozuur sequenties die als signalen dienen, die hun eigen
eindbestemming aanwijzen of hun eigen verwerking controleren.
5. Sequentie data zorgt voor een basis voor het maken van antilichamen specifiek voor een eiwit.
6. Aminozuur sequenties zijn waardevol voor het maken van DNA probes die specifiek zijn voor
genen die de corresponderende eiwitten coderen.
Peptide sequenties kunnen worden vastgesteld door geautomatiseerde Edman degradatie
VB. Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly
 Stap 1 is om de aminozuur compositie te bepalen van de peptide. Door de aminozuren in een
oplossing te scheiden door ion exchange chromatografie. Dan weet je welke aminozuren er in
de peptide zitten, maar niet in welke volgorde.
 Stap 2 is om de N-terminale aminozuur te identificeren. Dit
kan worden gedaan door de Edman degradatie. Hierbij
begin je bij de laatste twee aminozuren van het eiwit. Je
wilt het laatste aminozuur weten, dus laat je aan de Nterminus PITC binden. Deze vormt een ring structuur met
je aminozuur (R1) tijdens afsplitsing. Afsplitsing gebeurt
door het toevoegen van zure protonen Hierdoor krijg je bij
dit voorbeeld een PTH-Arg groep en de rest van het eiwit,
waarmee je de procedure weer kan herhalen voor elk
aminozuur individueel in het eiwit. Dus eerst wordt het
aminozuur gelabeld en dan wordt het complex losgelaten
van de peptide.
Trypsine
Trypsine heeft een zeer specifieke functie - het splitst alleen peptidebindingen waarvan de
carboxylgroep afkomstig is van een van de basische aminozuren lysine en arginine - en wordt daarom in
het laboratorium veel toegepast bij structureel onderzoek van eiwitten. Hierbij krijg je namelijk een
peptide met een vrije N-term en C-term.
Waarom is het enzym trypsine selectief ?
De S1 pocket van trypsine bevat een negatief geladen carboxylaat
functie van een aminozuur zijstaart
(aspartaat). Hierdoor selecteert trypsine peptide sequenties met dan
wel een lysine, dan wel een arginine, door ionische interactie met de
positief geladen zijstaarten en knipt/hydrolyseert direct na dit
aminozuur.
Chymotrypsine
Het splitst peptidebindingen waarvan de carboxylgroep afkomstig is van tyrosine,
tryptofaan, phenylalanine, leucine, methionine (de aromatische aminozuren)
Door bijvoorbeeld trypsine en chymotrypsine te combineren kan de volgorde
van de aminozuren worden onthuld door te kijken naar overlap van
aminozuren.
Thrombine
Thrombine knipt alleen na het aminozuur arginine.
Het is ook mogelijk chemisch te knippen met bijvoorbeeld CNBr die reageert
met methionine tot homoserine lactone.
Postranslationele modificaties zijn modificaties na translatie.
3.3 immunologie zorgt voor belangrijke technieken om eiwitten te onderzoeken
Antilichamen die binden aan specifieke eiwitten kunnen worden gebruikt
Antilichamen (immunoglobulines IG) zijn eiwitten die worden geproduceerd als reactie op de
antigenen en hebben allemaal dezelfde vorm. Ze bestaan uit twee grote ketens (heavychains)
en twee kleine ketenss die aan elkaar vast zitten door middel van disulfide bindingen. De
kleine ketens herkennen de antigenen. Als het antilichaam aan een bepaalde bindingssite
(epitoop) gaat zitten van het antigen, kan het antigen geen reacties meer ondergaan.
Er zijn 2 soorten antilichamen:
(1) Polyclonale (kan aan meerdere antigenen binden)
(2) Monoclonale (bind aan slechts 1 antigen)
Antigen worden ingebracht in een muis. Deze begint antilichamen te produceren
in zijn milt. De milt van de muis wordt vervolgens verwijderd. Cellen uit de milt
worden samengevoegd in polyethyleenglycol met myeloma/tumor cellen.
Vervolgens worden de cellen geselecteerd die het juiste antilichaam aanmaken. Je
kunt vervolgens of deze cellen laten groeien of induceren in de muis voor
aanmaak van meer antilichamen.
Techniek met assay
 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
Dus het antilichaam bindt aan het enzym. Dan zal het antilichaam met het enzym
aan het antigen binden. Een enzym reactie levert dan een gekleurd product. Zo
kun je kijken of een persoon antilichamen in zijn lichaam heeft.
Western blotting
 Sample wordt in een SDS-polyacrylamide gel geplaatst met
elektroforese.  Polymeer sheet wordt tegen de gel gedrukt
de opgeloste eiwitten van de gel naar een sheet verplaatst 
antilichaam wordt toegevoegd op sheet en reageert met
antigen. Het antilichaam-antigen complex kan zichtbaar worden gemaakt door de sheet te spoelen met
ander antilichaam dat het eerste antilichaam herkent. En een fluorescentie label aan tweede
antilichaam te doen.
Fluorescente markers kunnen eiwitten in cel laten zien
Door bijvoorbeeld fluorescerende eiwitten (GFP) te binden aan een bepaald eiwit
dat je graag wilt volgen.
3.4 Massa spectrometrie is een krachtige techniek voor de identificatie van
peptide en eiwitten
Hierbij kijk je naar massa van een eiwit door bijvoorbeeld MALDI-TOF:
6. Eerst wordt het eiwit sample geïoniseerd. Vervolgens wordt het eiwit
sample door een lange buis getransporteerd door een spanning op deze
buis te zetten. Kleine moleculen (minder zwaar) komen als eerste aan bij de
detector dan grotere moleculen. Dus hierbij is tijd de maat voor de massa.
Maar meestal wordt vaak het eiwit eerst in kleinere peptiden verdeeld door bijvoorbeeld enzymen. (zie
trypsine en chemotrypsine) Dan krijg je een heel grafiekje vol met alle componenten in een
massa/lading op de x-as en intensiteit op de y-as.
3.5 Peptiden kunnen worden gesynthetiseerd door automatische vaste fase methodes
Deze peptide zijn handig voor een paar dingen:
1. Synthetische peptiden kunnen als antigen dienen om de vorming van specifieke antilichamen te
stimuleren.
2. Synthetische peptiden kunnen worden gebruikt om receptoren voor veel hormonen en andere
signaal moleculen te isoleren.
3. Synthetische peptiden kunnen dienen als medicijnen
4. Synthetische peptiden bestuderen kan helpen om de regels met betrekking tot de 3D structuur
van eiwitten op te stellen.
De eiwitsynthese in vaste fase gaat als volgt:
1. Polystyreen bindt aan het eiwit dat beschermd is met T-BOC
2. Met CF3COOH wordt de T-BOC losgemaakt van aminozuur
3. De koppelt vervolgens aan het volgende aminozuur etc.
3.6 3D eiwit structuur kan door X-ray kristallografie en NMR spectroscopie worden vastgesteld
Röntgenstraling(X-ray) kristallografie onthult 3D structuren tot in atoom detail.
De drie componenten in een X-ray kristallografische analyse zijn:
1. Gekristalliseerd eiwit
2. Bron van röntgenstraling
3. Een detector
De X-ray fotonen gaan door het gekristalliseerde eiwit heen en botsen daar
met elektronen. Bij zo’n botsing blijft de energie, en dus golflengte, van het
foton onveranderd, maar de richting waarin het foton zich voortbeweegt
(de impuls) kan veranderen. Deze botsing kunnen we ook zien als het
meetrillen van het elektron met de golf. Door dat meetrillen, gaat het
elektron zelf als bron van röntgenstraling fungeren. Alle elektronen zullen gaan meetrillen met de
invallende straling, in fase met de invallende straling. Als we nu onder een willekeurige hoek naar het
object kijken, stralen al deze elektronen een klein gedeelte van hun straling naar ons toe. Wanneer het
voorwerp amorf is, bijvoorbeeld een gas of een vloeistof, leidt dit tot gedeeltelijke strooiing in alle
richtingen, hoewel niet in iedere richting even sterk. In een kristal is er echter iets bijzonders aan de
hand: de driedimensionale translatiesymmetrie. Vanwege deze translatiesymmetrie is het mogelijk om
een richting op te zoeken waarvoor geldt dat als een bepaald elektron een vastgestelde fase heeft, het
elektron dat daaraan geregaleerd is dezelfde fase heeft. Bij een kristal geeft dit dus veel elektronen die
in fase stralen en de totale intensiteit veel hoger maakt. In precies die richting ontstaat er een
röntgenstraal. Vlak daarnaast, waar er kleine faseverschillen tussen de naburige elektronen optreedt,
wordt er door destructieve interferentie bijna geen straling gezien.
De wet van Bragg legt aan de hand van de translatiesymmetrie vast waar men deze gebroken
röntgenstralen kan verwachten. De hoek tussen de invallende bundel en de verstrooide straal wordt
meestal weergegeven met de strooiingshoek 2θ. In het kirstal is een translatiesymmetrie van een
periode d. De wet van Bragg geeft het verband aan tussen deze afstand (d), de golflengte (λ) van de
straling en de hoek (θ).
[3.4] 2d  sin( )  
Aangezien de sinus van de hoek θ een waarde tussen de 0 en 1 kan aannemen (θ ligt immers tussen de 0
en 90 graden), volgt hieruit dat alleen experimenten met λ kleiner dan d kunnen worden uitgevoerd. In
de praktijk wordt vaak straling met een golflengte van 0,5-2,0 A genomen, dit is ongeveer even groot als
de afstanden tussen naburige atomen.
NMR
Onthult de structuur en dynamica van de eiwitten in de oplossing. De chemische shifts van de kernen
hangen af van het milieu. Ook vertonen de naburige kernen interacties met elkaar, wat ook structurele
informatie onthult.
Eiwitten:
Collageen bestaat uit secundaire structuren die bij elkaar komen en een
triple helix vormen. Eiwitdomeinen zijn kleine stukjes eiwitten die
kunnen worden opvouwen tot een stabiele structuur/modules. Een
eiwit, zoals het EGFR eiwit met 4 domeinen, bestaat vaak uit meerdere eiwitdomeinen.
Eén module (domein) alleen kan niet actief zijn als eiwit. Ze heeft hier andere modules nodig om te
functioneren. Bijvoorbeeld heeft het EGF-domein een transmembraan domein nodig en andere
eiwitmembranen om te kunnen functioneren. Door combinatie van eiwitmodules kan je verschillende
functies maken. De tertiaire structuur is, hoe het eiwit gevouwen is met de secundaire structuur
elementen. De α-helices worden met loops verbonden. Hydrofiel blauw, hydrofoob geel, wit ligt er een
beetje tussen in: hydrofiele atomen zitten aan de buitenkant zodat het een reactie met water aan kan
gaan.
Eiwitten vouwen vooral door het hydrofobe effect.
Bij
bijna alle eiwitten zit de hydrofiele kant aan de buitenkant en de hydrofobe kant aan de binnenkant van
het eiwit. Histidine echter heeft zijn polaire groep binnenin heeft. En bij porine is de binnenkant van het
eiwit polair, want daar moet water doorheen kunnen. De functie van het eiwit bepaalt dus hoe hij
gevouwen wordt; en weer dicteer het hydrofobe effect de vouwing. Apolaire zijstaarten willen graag bij
elkaar zitten. De waterstofbruggen zorgen voor de verbinding onderling. Eiwitvouwing gaat coöperatief.
Als een stukje van het eiwit gaat vouwen vouwt het hele eiwit direct.
Levinthal’s paradox: 100 aminozuren die 3 verschillende conformaties kunnen aannemen, bijvoorbeeld
α helix, β sheets of loops. Dit geeft 3100 aminozuren mogelijkheden met 10-13 seconde per conformatie
zal het nog jaren duren voordat de juiste conformatie is gevonden. Bij progressieve stabilisatie worden
goed gevouwen stukken van het eiwit vastgehouden en niet meer veranderd.
Je ziet dat conformaties worden vastgehouden en niet meer veranderd. Denk aan een trechter, eiwit wil
naar de laagste energie toe, naar het onderste punt van de trechter. Je begint helemaal boven met de
meeste energie, volgens Levinthal zal je bij de top van de trechter steeds zoeken naar de goede
conformatie. Maar door progressieve stabilisatie ga je rustig aan naar beneden. Soms ziet de trechter er
niet helemaal goed uit en kan het eiwit in een lokaal minimum komen, hierdoor is het eiwit dus fout
gevouwen. Specifieke domeinen van het eiwit gaan al vouwen als ze uit het ribosoom zijn.
Je kunt eiwitten ook weer ontvouwen door bijvoorbeeld de waterstoffen te breken, met urea breek je
de waterstoffen. Als je het eiwit dan weer met rust laat zal het weer terug vouwen naar zijn
oorspronkelijke vorm. De informatie van de vouwing is vast gelegd in de primaire structuur. Dit geldt
niet voor elk eiwit.
Chaperonnes zijn eiwitten die helpen met het vouwen van andere eiwitten. Eiwit wordt afgebroken
door protease.
Er zijn twee bekende chaperonnes zijn: HSP (heat shock proteins), bij te hoge temperaturen
beschermen ze het eiwit maar ze helpen ook met vouwen van eiwitten. HSPs zorgen dat het eiwit op de
goede manier vouwt, gebeurd tijdens de eiwitsynthese als het uit het ribosoom is. Een ander
chaperonne eiwit is een soort container. Hierin kan het eiwit ‘veilig’ vouwen. Met ATP worden dan
aanpassingen gemaakt zodat hij goed gevouwen worden en dan wordt de ‘container’ weer geopend.
Eiwitten die niet goed zijn gevouwen heten prioneiwitten. De
gekkekoeienziekte of alzheimer werkt op deze manier. Prioneiwitten
(proteinaseous infectiones particle) zijn infectieuze eiwit moleculen. Je kunt
dus door het eten van deze eiwitten, prionen in je lichaam krijgen. Steeds meer
fout gevouwen eiwitten zorgen ervoor dat stukken van je hersenen afsterven
door een overmaat aan prionen in je hersenen.
Zwavelbruggen zorgen voor betere stabiliteit van eiwitten. Dit is een covalente
brug tussen twee zwavelatomen, bevinden zich vooral buiten de cel.
Je kunt deze disulfide bruggen verbreken met β-mercaptoethanol, als je ze dan met rust laat zullen ze
op precies dezelfde manier terug vouwen. Bij snel terug vouwen had hij 1% van de activiteit maar als hij
ze langzaam liet terug vouwen was dit 100%.
De primaire sequentie bepaalt de structuur van de disulfide bruggen. Insuline slaat glucose op in je
lichaam. Insuline bestaat uit twee disulfide bindingen. Het wordt gemaakt uit pro-insuline. Het grijze
gedeelte heeft geen directe functie maar bepaalt wel de volgorde van de sulfidebruggen en is daardoor
essentieel voor de vouwing.
Dierlijk insuline leidt tot afweer reacties van het lichaam. Menselijk insuline is hiervoor ontworpen.
Aduiretine (ADH) zorgt er onder andere ervoor dat water geconcentreerd wordt in je urine. Als je veel
ethanol drinkt blokkeer je het aanmaken van dit peptide en moet je dus vaak naar de wc.
College 4:
8.1 Enzymen zijn krachtige en erg specifieke katalysatoren
Voorbeeld zijn proteolytische enzymen
7. Ze katalyseren de hydrolyse van peptide bindingen
8. Of van ester binding
De specificiteit van een enzym komt door de precieze interactie van het
substraat met het enzym. Deze precisie is een resultaat van de ingewikkelde
3D structuur van het enzym eiwit.
Bij sommige leukemie soorten heeft het kanker asparagine nodig. Om de
kanker onschadelijk te maken kan je dit aminozuur omzetten naar
asparaginasezuur. Dit kan je doen met het enzym asparginase. Dit gebeurt door de
hydrolyse (met behulp van H2O) van een peptide binding. Dit is een
evenwichtsreactie met een reactietijd van ongeveer zeven jaar. Dit duurt natuurlijk
veel te lang. Hiervoor worden enzymen (proteasen peptidasen) gebruikt, deze
verkleinen dit proces van zeven jaar na iets minder dan één milliseconde. Enzymen
versnellen de reactie (het katalytisch effect is heel groot) en zijn vaak heel specifiek.
Bijna alle enzymen zijn eiwitten, je hebt echter een paar enzymen gebaseerd op
RNA. Dit duidt erop dat er eerst RNA was voordat er eiwitten waren. Enzymen
stabiliseren de overgangstoestand (transition state). Ze doen niets met het product
en substraat.
Enzymen zijn specifiek. Het enzym trypsine knipt alleen na een basisch
aminozuur zoals lysine en arginine. Trypsine snijdt wel alle lysine’s en
arginine’s in eiwitten dus in die zin is hij niet specifiek. Papaine is een
enzym dat eiwitten willekeurig knipt, dit gebruiken we om taai vlees
minder taai te maken. Maar ook enzymen die (bloed)vlekken uit je
kleren wast etc. Enzymen werken vaak niet alleen maar doen dit met
behulp van een co-factor. Dit is een extra stuk molecuul aan het enzym
gebonden.
Cofactoren = De katalytische activiteit van vele enzymen hangt af van
de aanwezigheid van een klein molecuul , de cofactor. De cofactor kan
vaak een chemische reactie uitvoeren die niet door de standaard set
van 20 aminozuren kan worden uitgevoerd.
Apo-enzym = een enzym zonder cofactor
Apo-enzym + cofactor = holo-enzym dit is het complete katalytische actieve enzym.
Cofactoren kunnen in twee groepen worden opgesplitst:
1) Metalen
2) Kleine organische moleculen (co-enzymen)/sterk gebonden co-enzymen worden prosthetic
groepen genoemd, dit zijn vaak vitamines
Enzymen kunnen energie omzetten van een vorm in een andere vorm. Bijvoorbeeld zet myosine ATP
om in spiercontractie
8.2 Vrije energie is een nuttige thermodynamische functie om enzymen te snappen
Enzymen kunnen de snelheid van chemische reacties verhogen maar de eigenschappen van de reactie of
het plaats kan vinden hangt van de energie verschillen af tussen de reactant en product.
Vrije energie (G) is een thermodynamische eigenschap dat een maat is voor nuttige energie.
Twee dingen nodig om enzymen te snappen:
1) Het vrije energie verschil: ∆G
2) De energie die nodig is om het reactant om te zetten in producten.
De vrije energie verandering geeft informatie over de spontaniteit van de reactie:
1. Een reactie kan spontaan plaats vinden alleen als ∆G negatief is. Zulke reacties zijn exergonisch
(energie wordt gemaakt en komt vrij).
2. Een systeem is in equilibrium en er is geen netto verandering die kan plaatsvinden als ∆G is nul.
3. Een reactie kan niet spontaan plaats vinden als ∆G positief is.
4. De ∆G van een reactie hangt alleen af van de vrije energie van de producten min de vrije energie
van de reactanten. ∆G van een reactie is onafhankelijk van het moleculaire mechanisme van de
transformatie.
5. De ∆G geeft geen informatie over de snelheid van de reactie. Alleen of die reactie spontaan kan
plaatsvinden of niet.
De standaard vrije energie verandering van een reactie is gerelateerd met de equilibrium constante.
Reactie: A + B ↔ C + D
∆G van de reactie = ∆Gₒ + RT*ln
Hierin is ∆Gₒ de standaard vrije energie verandering (onder standaard condities), R is de gasconstante, T
is de absolute temperatuur. ∆Gₒ ‘ = de standaard vrije energie verandering bij een pH van 7
Enzymen wijzigen alleen de reactie snelheid en niet het reactie equilibrium
Enzymen versnellen het bereiken van het equilibrium maar verandert deze niet. Het equilibrium is alleen
een functie van ∆G tussen reactanten en producten.
8.3 enzymen versnellen reacties door de formatie van de transitie toestand te faciliteren
Reactie: substraat S transitie toestand X|  product P
De transitie toestand heeft een hogere vrije energie dan S of P.
De transitie toestand is het minst stabiele in de reactie. Het vrije
energie verschil in de transitie toestand van het substraat  De
Gibbs vrije energie van activatie ∆G|.
∆G| =GX| -GS
Dus de functie van enzymen is de reactie snelheid verhogen
zonder ∆G te veranderen: Dus enzymen dienen er voor om de
activatie energie te verlagen.
De vorming van een enzym-substraat complex is de eerste stap
in de enzymatische katalyse.
In enzym-substraat complexen zijn de substraten aan een specifieke regio van het enzym gebonden ( de
actieve kant). De meeste enzymen zijn erg selectief met de substraten waaraan ze binden.
De actieve bindingskant van enzymen hebben sommige gemeenschappelijke dingen
Actieve kant bevat residuen die direct deelnemen in het maken en breken van bindingen. Deze residuen
worden de katalytische groepen genoemd. De interactie van het enzym en substraat bij de actieve kant
bevorderd de vorming van de transitie toestand.
Hoewel enzymen veel verschillen zijn er een paar overeenkomsten wat betreft actieve kant:
1. De actieve kant is een drie dimensionale spleet gevormd door de groepen die van verschillende
aminozuursequenties afkomen.
2. De actieve kant neemt een klein stuk van het totaal volume van een enzym in.
3. De actieve kanten zijn unieke micromilieus.
4. Substraten zijn gebonden aan enzymen door vele zwakke aantrekkingen.
5. De specificiteit van de binding hangt af van de precies gedefinieerde overeenkomst van de
atomen in een actieve kant.
De bindingsenergie tussen enzymen en substraten is belangrijk voor de katalyse.
Enzymen verlagen de activatie energie, maar waar komt de activatie energie vandaan? De vrije energie
is losgelaten door de vorming van een groot aantal zwakke bindingen tussen een enzym en zijn
substraat. Deze vrije energie is dus de bindingsenergie. Alleen het correcte substraat kan deelnemen bij
de meeste interacties en zorgt dus voor de maximale bindingsenergie. De maximale bindingsenergie is
vrij gelaten wanneer het enzym helpt met de vorming van de overgangstoestand door het verlagen van
de activatie energie.
8.4 De Michaelis-Menten-vergelijking beschrijft de kinetische eigenschappen van veel enzymen
VB. Een simpele reactie A  P
De snelheid van de reactie V is de hoeveelheid van A die in een bepaalde tijd verdwijnt. Het is gelijk aan
de snelheid van het verschijnen van P.
V = - ∆A/∆T = ∆P/∆T
V = k[A]
Veel reacties bevatten twee reactant  BI moleculaire reacties
2A  P
V = k[A]2
A+BB
V=k[A][B]
De steady state aanname maakt een beschrijving van enzym kinetiek.
De makkelijkste manier om de reactie snelheid te onderzoeken is de toename van het reactie product
als functie van de tijd te volgen.
V0, de reactiesnelheid van de katalyse, is het aantal mol product dat per seconde wordt gevormd als de
reactie net is begonnen (t ≈0).
Model van Michaelis–Menten
Enzym E en het substraat S vormen een enzymsubstraat complex ES met een reactiesnelheid constante
k1. Het ES complex heeft twee mogelijkheden: het kan losgaan in E en S met constante k-1 of het kan
doorgaan om het product P te vormen met reactiesnelheid constante k2. Daarnaast kan ES ook worden
gevormd uit E + P met k-2. Echter gaan we er vanuit dat die snelheid van de reactie bijna nul is.
 E+S ES  E + P
V0=k2[ES]
Snelheid vorming ES = k1[E][S]
Snelheid vorming ES = (k-1 +k2)[ES]
K1[E][S]=(k-1+k2)[ES]
[E][S]/[ES] =(k-1+k2)/k1
De Michaelis constante Km = (k-1+k2)/k1
[ES] =
Het substraat is meestal in veel hogere concentratie aanwezig dan het enzym. Dus de concentratie van
ongebonden [S] is bijna gelijk aan de totale substraat concentratie. De concentratie van ongebonden [E]
is gelijk aan de totale enzym concentratie [E]T min de concentratie van ES complexen.
[E] = [E]T – [ES]
Dit levert dat
Vmax = k2
De Michaelis-Menten vergelijking:
De relatie tussen de reciproke reactiesnelheid, 1/V, en de reciproke substraatconcentratie, 1/[S], is een
lineaire functie die wordt gegeven door de reciproke van de Michaelis-Mentenvergelijking:
De plot heet een Lineweaver-Burk of dubbel-reciprocale plot.
De plot verkrijgt een rechte lijn die de y-as snijdt op 1/Vmax en een
helling/afgeleide heeft van km/Vmax. Het snijpunt met de x-as is -1/Km.
Km en Vmax zijn belangrijke enzym eigenschappen
De Km waarde van een enzym hangt af van de soort substraat en van milieu
condities (pH, temperatuur, ion sterkte). De Km is de concentratie van het
substraat wanneer de helft van de actieve sites zijn gevuld.
Dus Km geeft een maat van de substraat concentratie weer die nodig is voordat een bepaalde katalyse
plaatsvindt. Km is gerelateerd aan de reactie constanten van de individuele
stappen in het katalytische schema.
(er wordt minder product gevormd)
Km is gelijk aan de loskoppeling constante van ES complex als k2 veel kleiner is dan
k-1.

Dan betekend ook dat Km dan een zwakke binding aangeeft wanneer k-1 groter is
dan k1.
kcat/Km is een maat voor katalytische efficientie.
Vmax = K2[E]T
Als [S] veel groter is dan Km is de snelheid van de katalyse gelijk aan Vmax, wat een functie is van kcat, het
turnover getal (aantal substraat moleculen in product en enzym omgezet in tijd
waar enzym volledig is verzadigd met substraat).
V0 =
Als [S] << Km is [E] bijna gelijk aan [E]T dus: V0 =
kcat/Km is een maat voor de katalytische efficientie omdat het als eerste de
snelheid van de katalyse met een bepaald substraat (kcat) en de kracht van
ES interactie (Km) bevat. Hiermee kun je dus de voorkeur van enzym voor
een substraat goed vergelijken.
We zitten bij het beginpunt van de reactie als we kijken naar de MichaelisMenten kinetiek. K1 van E+S naar ES, k2 van ES naar E+P en k-1 van ES naar E+S. De
K beschrijft hoe V0 afhangt van de Vmax en de substraat concentratie en de Km (de
bindingsconstant van het enzym aan het substraat). Vmax als al het enzym bezet is
dus k2[E]. De Km is de ratio van (k-1+k2)/k1. Een hoge Km staat voor een zwakke
binding en een lage Km voor een sterke binding.
Km is gecorreleerd aan de concentratie en de Vmax aan de snelheid.
1/V0=Km/Vmax=1/S+1/Vmax
Sequentiële reacties
Alle substraten moeten binden aan een enzym voordat het product wordt
gevormd. Voor een bisubstraat reactie betekend dat het een ternary(drievoudig)
complex moet vormen.
Dat bevat: enzym+substraat+substraat.
Dubbele verplaatsing (ping-pong) reacties
Een of meer producten zijn vrijgegeven al voor dat alle substraten aan de
enzymen zijn gebonden.
Het kenmerk van de reactie is het bestaan van een gesubstitueerd enzym
intermediar, waarin het enzym tijdelijk in is gewijzigd.
Allostere enzymen
Allostere enzymen vertonen ander gedrag dan Michaelis Menten
kinetiek. Allostere enzymen bestaan uit meerdere sub-eenheden en
hebben meerdere ‘active sites’. De binding van een substraat aan
een sub-eenheid beïnvloedt de eigenschappen (katalytische
capaciteit) van de andere sub-eenheid.
8.5 Enzymen kunnen worden geremd door specifieke moleculen
De activiteit van veel enzymen kan worden geremd door het binden van een
specifiek klein molecuul en/of ion. Dit principe speelt een belangrijke rol bij
het controle mechanisme in biologische systemen. Methotrexaat neemt de
plek in van de tetrahydrofolaat. Methotrexaat wordt gebruikt als kanker
medicijn, omdat de methotrexaat het enzym inhibeert die zorgt voor polymerase van de kankercellen.
Enzym remming kan irreversibele of reversibele zijn:
1. Bij irreversibele remming: de remmer is zeer sterk gebonden aan het enzym
2. Bij reversibele remming: snelle dissociatie van het enzym-remmer complex
Bij reversibele remming zijn er drie (2) soorten:
1. Competitieve remming: Een enzym kan binden aan het substraat(ES) of aan de remmer (EI), maar
niet aan beide. Oftewel: Verlaging van de snelheid van katalyse doordat substraat niet kan binden aan
het enzym terwijl remmer gebonden is
3. noncompetitive remming: Verlaging van de snelheid van katalyse doordat remmer en substraat op
twee verschillende plaatsen aan het enzym kunnen binden.
Reversibele inhibitoren zijn kinetisch te onderscheiden!
Ki = [E][I]/[EI] is de dissociatie constante voor de inhibitor. Hoe kleiner de Ki hoe krachtiger de remming.
KMapp = KM(1+ [I] / Ki )
Vmax app = Vmax/(1+[I]/Ki)
De beste competitieve inhibitor is een verbinding die lijkt op de overgangstoestand. De noncompetitieve
inhibitor bindt aan de buitenkant van het enzym. Hij neemt de hoeveelheid actief enzym weg hierdoor
wordt de Vmax lager en de Km blijft hetzelfde.
Kinetiek competitieve inhibitor: Als [I] toeneemt is er een hogere [S] om dezelfde bepaalde reactie
snelheid te krijgen. Het geeft een nieuwe Km waarde genaamd: KMapp. De Vmax is wel nog hetzelfde met
of zonder de inhibitor.
Kinetiek noncompetitieve inhibitor: Verlaging van Vmax in nieuwe waarde Vmax app. Het verhogen van
de [S] overwint niet de noncompetitieve
remmer.
Double reciprocal plots van ,non- en competitieve remmers
Bij competitieve: Het snijpunt met y as is het zelfde met als zonder inhibitor. Omdat de Vmax niet
veranderd door de remmer. De helling van de lijn is met de inhibitor steiler geworden. De steilere helling
geeft de kracht van de binding van een een competitieve binding weer. (met factor: 1+ [I]/Ki)
Bij noncompetitieve: Vmax is veranderd in Vmaxapp(kleiner). Dus het snijpunt met de y as ligt hoger
met de inhibitor. De helling is gelijk aan Km/Vmaxapp dus die is ook wat steiler.
Irreversibele remmers kunnen worden gebruikt om de actieve site toe te wijzen.
De remmers wijzigen de functionele groepen, deze kunnen worden geïdentificeerd.
Irreversibele remmers kunnen in 3 groepen worden verdeeld:
1. groep-specifieke reagens
Reageren met specifieke zij ketens van aminozuren.
2. reactieve substraat analogen (affiniteit Labels)
Het zijn moleculen die structureel overeen komen met het substraat voor het enzym en die kan
binden aan de active site residuen. Deze zijn meer specifiek voor een enzym dan groepspecifieke reagens.
3. suicide remmers
zijn gemodificeerde substraten die de meest specifieke middelen voor het wijzigen van de
actieve site van een enzym verkrijgt. Om een reactieve groep die onomkeerbaar reageert om
een stabiele inhibitor-enzymcomplex te produceren.
Overgangstoestand analogen zijn krachtige remmers van enzymen.
Katalytische antilichamen demonstreren het belang van selectieve binding van de overgangstoestand
voor enzymatische activiteit.
Katalytische antilichamen (abzymes) kunnen geproduceerd worden door gebruik te maken van als
overgangstoestand analogen dienend als antigenen.
Product-inhibitie: als het product kan binden in active site remt hij hiermee zijn eigen vorming
competitief. Irreversibele inhibitie als iets covalent bindt aan het eiwit waardoor het eiwit als het ware
weggenomen wordt uit de oplossing; is de covalente binding in de active site.
Bij velen katalyseerde reacties met enzymen speelt
water een grote rol. De concentratie van het substraat
of product bepaalt het evenwicht van de reactie. Elk
enzym wordt gemarkeerd met nummer 1 t/m 6 ingedeeld in deze
groepen. Eerste kolom het enzym, tweede kolom de halfwaardetijd
zonder katalyse, derde kolom met katalyse.
Verplaats calcium van buiten de cel in de cel, doormiddel van de
hydrolyse van ATP naar ADP. Een fysische reactie die door enzymen
gestuurd wordt.
Cystathionase (http://en.wikipedia.org/wiki/Cystathioninuria) deficiëntie is een genetische ziekte
waarbij het enzym cystathionase niet functioneert. Het enzym is er wel maar de co-factor niet. Het is
een genetische metabolische ziekte. Sommige metabolieten worden niet gevormd of te veel gevormd.
Dit enzym is belangrijk voor de synthese van cysteine uit cystationine. Als dit enzym niet werkt krijg je
dus een ophoping van cystationine. Je hebt hiervoor de co factor vitamine B6 nodig. Bij de ziekte vindt
een puntmutatie plaats in het enzym waardoor de co-factor minder goed wordt herkend. Door het
geven van een overmaat aan vitamine B6, wordt het enzymcomplex toch gevormd. Enzym kinetiek
verandert niets aan het evenwicht, maar alleen het versneld instellen van het evenwicht van de reactie.
Er wordt dus evenveel product gevormd als zonder enzym, ze zorgen alleen dat het evenwicht van de
reactie sneller in gesteld wordt.
Evenwichtsconstant K= [P]/[S] met S->-<P. G is de energie voor de reactie. Of er een reactie optreedt of
niet is afhankelijk van ΔG. De activeringsenergie bepaald de snelheid van de omzetting. Enzymen
verlagen de activeringsenergie. De overgangstoestand is de toestand met de hoogste vrije energie,
waarbij de structuur ergens tussen het substraat en product zit. Als je de overgangstoestand met 5,69
kJ/mol verlaagd gaat het proces 10 keer zo snel.
Het enzym bindt aan het substraat, dan krijg je het ES (EnzymSubstraat) complex. Het ES complex moet
het substraat klaar maken zodat de overgangstoestand makkelijk bereikt kan worden. De snelheid van
reactie is afhankelijk van de concentratie van het substraat. Maar het is ook afhankelijk van hoeveel
enzym er is, als deze allemaal vol zitten met
substraat kan het natuurlijk niet nog sneller
gaan!
De ingekleurde delen zijn de aminozuren van de actieve site. De actieve site is dat gedeelte van het eiwit
dat de aminozuren bevat die de covalente in het substraat breken of maken. De 3D holte bepaalt of het
substraat erin kan. Door de 3D structuur worden deze sites bij elkaar gebracht. Slechts een klein
gedeelte van het eiwit bevat de actieve site, de rest is om de 3D structuur te vormen. Reactiviteit van de
enzymen kun je veranderen door de omgeving te veranderen. In de actieve site zal je vooral polaire
aminozuren tegen komen die waterbruggen kunnen vormen met het substraat.
De specificiteit van het enzym wordt bepaald door de vorm van de active site. De reactie van een enzym
is optimaal als de binding van het substraat zoveel mogelijk lijkt op de overgangstoestand. De snelheid
van de enzymmatige reactie is dus afhankelijk van hoeveel enzym je hebt en hoeveel substraat je
toevoegt. Hoe meer substraat hoe sneller de reactie, tot de maximale snelheid is bereikt. V0 is de
snelheid waarbij er nog geen product is gevormd. De substraat concentratie tegen de V0 is grafiek twee,
je bereikt een asymptoot omdat je een maximum aan substraat/enzym hebt.
Hoe werkt katalyse? Vaak ontstaat er een covalente binding met
het enzym, deze wordt dan weer verbroken door bijvoorbeeld
hydrolyse. Meeste eiwitten zijn van de binnenkant hydrofoob,
maar in de active site hebben ze vaak polaire (hydrofiele)
groepen. Je krijgt een micro-pH waardoor een specifieke zuurbase milieu kan komen verder zijn metaal-ionen nodig die zorgen voor de elektronen en de nabijheid
van de reagentia; entropie en oriëntatie.
College 5:
Een paar simpele katalytische principes die door veel enzymen worden gebruikt:
1. Covalente katalyse
2. Algemene zuur base katalyse
3. Katalyse bij benadering
4. Metaal ion katalyse
9.1 proteasen faciliteren een bela ngrijke moeilijke reactie
Proteasen zijn enzymen die eiwitten en andere ketens van aminozuren afbreken.
De hydrolyse van peptide binding is thermodynamisch favoriet, maar de reactie duurt echter erg lang
(jaren) zonder de aanwezigheid van een katalysator. De CN binding is gesterkt door zijn dubbele binding
karakter (resonantie structuur). Door een enzym toe te voegen, wordt deze binding door geknipt.
Chymotrypsine bevat een erg reactief serine residu (DIPF toevoegen liet dat zien)
Chymotrypsine splitst peptide bindingen selectief bij de carboxyl terminale kant van een groot
hydrofoob aminozuur zoals: tryptofaan, tyrosine, fenylalanine, methionine.
Chymotrypsine is een goed voorbeeld van covalente katalyse. Het enzym stuurt een krachtig nucleofiel
om aan te vallen op het niet reactief (carbonyl)koolstof atoom van het substraat. Het nucleofiel wordt
covalent gebonden aan het substraat.
De werking van Chymotrypsine gaat in 2 gelinkte stappen met een covalent gebonden intermediair.
Katalytische triade = serine + histidine + aspartaat
De actieve site (banaan) van chymotrypsine, gemarkeerd door serine, ligt in een spleet op het oppervlak
van het enzym en wordt gevormd door een katalytische triade. De serine is met een waterstofbrug
verbonden met histidine. De NH groep van de imidazole ring vormt een waterstofbrug met aspartaat.
Deze opstelling wordt dus de katalytische triade genoemd. Histidine dient om de positie van de serine
zijketens te positioneren en hun R-OH groep te polariseren zo dat het klaar is voor deprotonering.
In de aanwezigheid van een substraat accepteert de histidine een proton van de OH groep van serine.
Dus het histidine residu gedraagt zich als een base katalysator. Het wisselen van het proton verkrijgt
een alkoxide ion dat een veel sterker nucleofiel is dan een alcohol. Het aspartaat residu helpt de
histidine te oriënteren en maakt histidine een beter proton acceptor door de waterstofbrug vorming en
elektrostatische effecten. Bij een eventuele
uitvalling van aspartaat hierbij (door mutatie
bijvoorbeeld), werkt de katalytische triade niet.
Het enzym chymotrypsine is een relatief aselectief enzym. Hoe komt dat en hoe
zou dit enzym selectiever gemaakt kunnen worden / waarom zijn andere enzymen
soms wel selectiever?
Chymotrypsine heeft alleen een S1 pocket tot zijn beschikking om te selecteren
na welke aminozuren het knipt (F, W, Y). Deze aminozuren komen veel voor in
eiwitten, dus wordt er vaak geknipt (aselectief). Door gebruik te maken van additionele pockets voor en
na de te knippen peptide binding kan de selectiviteit worden verhoogd.
De overgangstoestand moet gestabiliseerd worden door een soort pocket het oxyanion gat. Dat is een
peptide keten die bestaat uit glycines. De negatieve lading wordt gedeelte gestabiliseerd door de NH’s
van de glycine. Hierdoor wordt de overgangstoestand gestabiliseerd. Deze wordt twee keer gebruikt om
het enzym eerst te laten adderen aan de peptide binding en de tweede keer om de hydrolyse met water
te bewerkstelligen.
Reactieverloop:
 Stap 1: substraat binding
 Stap 2: het zuurstof (O) atoom van de zij-keten van serine doet een nucleofiele aanval op het
carbonyl koolstofatoom van de peptide binding. Daarna wordt het tetraëdische intermediair
gevormd. De negatieve lading op de O wordt gestabiliseerd door interacties met NH groepen
van het eiwit in het oxy-anion gat. Deze interacties helpen ook de overgangstoestand te
stabiliseren die voorafgaat aan het tetraëdisch intermediair.
 Stap 3: het tetraëdisch intermediair wordt gebroken om het acyl enzym te krijgen
(protontransfer)
 Stap 4: de amine component mag vertrekken. Hiermee is het eerste stadium – de acylering van
het enzym – volbracht.
 Stap 5: het nieuwe stadium – de deacylering – begint met een H2O molecuul dat komt helpen.
Die komt op de plaats te zitten, waar de amine vertrok.
 Stap 6: histidine trekt een H weg van water. De OH- valt de carbonyl koolstof aan van de
acylgroep. Dit vormt een tetraëdisch intermediair.
 Stap 7: de structuur wordt gebroken om het carboxylic zuur te vormen.
 Stap 8: carboxylic zuur laat los en het zorgt er voor dat het enzym klaar is voor een volgende
ronde.
1.
De Asp, His en Ser zijn de triade van de katalyse, dit
noem je serineprotease omdat serine bij 1 is. De
reactie wordt versneld door het oxyanion gat.
Protease cascades knippen allemaal op dezelfde plek.
Ze knippen allemaal na een positief geladen aminozuur (Arg/Lys). Deze wordt dan herkend en gebonden
en na de C-terminus geknipt. De volgorde ervoor is belangrijk, trypsine knipt naar xxx-xxx-xxx-Arg/Lys,
thrombine na Phe-xxx-Val/Pro-Arg, enzymen zijn dus selectief. Dit komt omdat ze nog meer pockets
hebben voor speciale aminozuren. Het enzym heeft een amino-codering zodat hij alleen bepaalde
amino-sequenties kan herkennen. Je hebt dus ook grote en kleine pockets.
Speciale pocket voor chymotrypsine (trypsine, elastase)
Chymotrypsine heeft een diepe hydrofobe pocket waarin de lange
ongeladen zij-ketens van residuen (zoals fenylalanine, tryptofaan) in
passen. De binding van een passende zij keten in deze pocket
positioneert de aangrenzende peptide binding in de actieve site voor
splitsen. Er zijn drie verschillende pockets: de actieve site waarmee de
peptide binding geknipt wordt, het oxyanion om te stabiliseren en de
S pockets om de peptide selectief te herkennen. We hebben hier
boven serine protease besproken waar Serine een reactie aangaat,
maar je hebt ook cysteineprotease, aspartylprotease en de
metalloproteases. Het mechanisme is hetzelfde. Cysteine is exact hetzelfde
als bij serine protease. Aspartylprotease activeert een watermolecuul en
amide binding tegelijkertijd. Metalloprotease is een metaalion dat bindt
aan water, waardoor het water veel zuurder wordt en valt dan aan op het
carbonyl. Alle proteasen activeren een watermolecuul, polariseren de
carbonyl groep en stabiliseren de tetraedische overgangstoestand.
Aspertyl protease maakt gebruik van een aspartaat. Twee aspartaat
groepen in verschillende ladingstoestanden om zowel het water als de
carbonyl groep tegelijkertijd te polariseren. Vaak puntmutaties in de
pocket die geel gearceerd is. Crixivan HIV is een medicijn die in de active
site gaat zitten.
Andere klassen van peptide knippende enzymen:
Cysteine proteases
Een cysteine residu, geactiveerd door een histidine residu, neemt de rol in als nucleofiel, die aanvalt op
de peptide binding. Omdat het zwavel atoom in cysteine een beter nucleofiel is dan het zuurstof atoom
in serine, bevat cysteine protease alleen het histidine residu in additie met cysteine en niet de volledige
katalytische triade.
Aspartyl proteases
Het centrale kenmerk van de actieve site is een paar van asparagine zuur residuen die samenwerken om
een watermolecuul de peptide binding aan te laten vallen. Een asparaginezuur residu (in
gedeprotoneerd vorm) activeert het aanvallende watermolecuul door het klaar te maken voor
deprotonatie. Het andere asparaginezuur residu(geprotoneerde vorm) polariseert de peptide carbonyl
groep zodat het meer gevoelig is voor de aanval.
Metalloproteases
De actieve site van zo’n eiwit bevat een gebonden metaal ion
(meestal zink) die H2O activeert om als nucleofiel een peptide
carbonylgroep aan te vallen. Zijn peptide keten is zo gevouwen dat 3
histidine in een dergelijke conformatie zitten dat ze bij elkaar zitten
en er een metaalion in past. Metaal ionen worden als cofactor
gebruikt om de chemische activiteit te vergroten. Ze hebben een
positieve lading en zitten in ongeveer 1/3 van alle eiwitten. Metaal
ionen kunnen een kinetisch labiele binding vormen van de
coördinatie bindingen. Sterker dan covalente bindingen. Metaalion heeft verder meerdere oxidatie
toestanden. We hebben zink gecoördineerd aan drie histidines en aan water. Normaal is de pKa van
water ongeveer 15 tot 16, maar gebonden aan zink wordt deze 7 (veel
zuurder en wordt een sterkere nucleofiel). Deze reactie is sterk pH
afhankelijk. De reactie gaat bij hogere pH sneller. Eerst stap is
deprotonarisering, dan bindt CO2 ernaast. De twee reagentia worden dicht
bij elkaar gebracht zodat het vrije zuurstof paar op de koolstof kan
aanvallen, links onder de overgangstoestand. De reactie loopt via 4 als je
CO2 gaat uit ademen. Het enzym versnelt de inzetting van de
evenwichtsreactie.
9.2 carbonzuur anhydrase maakt een snelle reactie sneller
Carbonzuur anhydrase (enzym) bevat een gebonden zink ion dat belangrijk is voor de katalytische
activiteit. Metaal ionen hebben een paar eigenschappen dat de chemische reactiviteit vergroten:
3) Positieve lading, de mogelijkheid om sterke maar kinetische labiele bindingvorming, (soms) de
capaciteit om stabiel te zijn in meer dan een oxidatie stadium.
Er zijn 7 carbonzuur anhydrases, elk met zijn eigen gen. Zink zit in carbonzuur anhydrase vast aan 3
histidines en aan een watermolecuul.
Mechanisme CO2 hydratatie:
1. Het zink ion helpt bij het vrijkomen van een proton (H+) van het water molecuul, waardoor er
een OH- ion wordt verkregen.
2. Het CO2 substraat bindt aan de actieve site van het enzym en is zo gepositioneerd dat het kan
reageren met OH- ion.
3. Het OH- ion valt aan op CO2 en het wordt HCO34. De katalytische site is weer opnieuw verkregen door
HCO3- vrij te laten en een ander H2O molecuul te
binden.
De hoogste reactiesnelheden van CO2 hydratatie hebben
een buffer nodig die deel kan nemen aan de reactie (binden
of loslaten van protonen).
9.3 restrictie enzymen katalyseren hoog specifieke DNA-knip reacties
Het gebruik van beperkingsenzymen: ze kunnen knippen in DNA dubbele helix.
9.4 Myosine benut veranderingen in enzymconformatie om ATP Hydrolyse te koppelen aan
mechanisch werk.
Myosine is een enzym dat de hydrolyse van ATP katalyseert om ADP en Pi te vormen en gebruikt de
energie met deze thermodynamisch voorkeurs reactie om beweging te verkrijgen in cellen. Daarnaast
gebruiken veel andere enzymen ATP hydrolyse om andere reacties etc. te verlopen.
•
•
•
•
•
•
•
•
Myosine structuur onthult een water gevulde pocket.
Myosine kristal geweekt in ATP; geen conformatie verandering.
Divalent metaal ionen (Mg2+ , Mn2+ ) zijn nodig voor activiteit
Myosine is meestal inactief in afwezigheid van de ionen (Mg2+, Mn2+).
Nucleotiden binden deze ionen, en het is de metaal -ion –nucleotide complex dat het echte
substraat is voor de enzymen.
Nucleofiel aanval van water heeft een standaard residu of gebonden metaal nodig om water te
activeren.
ATP hydrolysis bevat een penta-transittie toestand
Het water molecuul valt aan op de g-gefosforyleerde groep, met de hydroxyl groep van Ser236,
welke weer geprotoneerd is door g-fosfaat.
Plaatje rechts (myosine zijn voorbeelden van P loop NTPPase enzymen)
 Kern domein van NMP kinases
 Bestaat uit een centrale β sheet, omgeven aan beide kanten door α helices.
 P loop (groen): between the first β strand and the first α helix.
 Seq. : Gly-X-X-X-X-Gly-Lys
 Interact with NTP
College 6, PDF bestand bevat alle metabolic pathways:
15.1 Metabolisme bestaat uit veel gekoppelde, interconnecting reacties
Waarom energie:
 Mechanisch werk in spiercontractie en cel beweging
 Actief transport van moleculen en ionen
 De synthese van macromoleculen en andere biomoleculen van uitgaansstoffen
Metabolisme is vooral een gelinkte serie van chemische reacties dat begint bij een bepaald molecuul en
dat zet zich om in een ander molecuul of moleculen.
Drie verschillende stromen:
1. Stof stroom ( transport, katabool, anabool)
2. Energie stroom ( opwekking)
3. Informatie stroom ( DNA,RNA, eiwit)
Twee klassen metabolische pathways:
1. Die energie omzetten via brandstoffen in biologisch nuttige vormen
2. Die energie nodig hebben om door te gaan
De reacties die brandstoffen omzetten in cellulaire energie worden katabole reacties genoemd.
Oftewel katabolisme : Brandstof  CO2 + H20 + nuttige energie
De reacties die energie nodig hebben worden anabole reacties genoemd.
Oftewel anabolisme : Energie + bouwstenen  complexe moleculen
Zijn er pathways die katabool zijn en anabool dan heten deze , amfibolische pathways.
Een pathway heeft 2 criteria nodig:
1. De individuele reacties moeten specifiek zijn: de reactie verkrijgt maar een bepaald product of
een set van producten van zijn reactanten.
2. De totale set van reacties waaruit het pathway bestaat moet thermodynamisch favoriet zijn:
de overall vrije energie verandering van een chemisch gekoppelde serie van reacties is gelijk
aan de som van de vrije energie verandering van de individuele stappen.
Een thermodynamisch ongeliefde reactie kan aan worden gedreven door een thermodynamische
geliefde reactie waaraan die gekoppeld is.
15.3 ATP is vrije energie in biologische systemen
Mitochondriën zijn de energiefabrieken van ons lichaam, komen
oorspronkelijk uit bacteriën. Hebben dubbele celwand en hun eigen
DNA. In de mitochondriën vindt de citroenzuurcyclus plaats en de
vorming van ATP. De protonen worden tussen de twee membranen
uitgepompt, zodat er aan de binnenkant een negatieve gradiënt
van elektronen komt en een positieve gradiënt van elektronen aan
de buitenkant. Als we alleen naar het binnenste membraan kijken, zien we dat daar
enzymen zijn die d.m.v. de citroenzuurcyclus protonen buiten het membraan pompen. ATP
synthetase synthetiseert ATP. Aan de ene kant heb je een groep eiwitten die protonen naar buiten
pompen hierdoor krijg je een protongradiënt op je membraan. En hierdoor wordt de ATP synthetase
aangezet. De enzymen pompen de protonen naar buiten met behulp van de co-factoren die in de
citroenzuurcyclus zijn gevormd.
De ATP hydrolyse is exergonisch (=energie komt vrij)
ATP bestaat uit : - adenine, - ribose, - trifosfaat unit
Er komt veel vrije energie vrij als : ATP + H2O ADP = Pi of
ATP + H20 AMP +PPi
Nucleosine monofosfaat kinase: NMP + ATP NDP +
ADP
Een ongeliefde reactieve kan mogelijk worden
gemaakt door het te koppelen aan de hydrolyse van
ATP.
ATP heeft een hoge fosforyl transfer potentiaal, het wil
graag een fosfaat afstaan.
Drie factoren zijn belangrijk:
1. Resonantie stabilisatie: ADP en Pi hebben grotere
resonantie stabilisering dan ATP.
2. Elektrostatische afstoting: bij pH van 7, heeft de trifosfaat van ATP 4
negatieve ladingen. Ze zitten dicht bij elkaar dus stoten elkaar af. Wanneer ATP wordt
gehydrolyseerd herstelt dit weer.
3. Stabilisering door hydratatie: Water kan effectiever binden aan ADP en Pi dan het kan binden
aan de fosfoanhydride deel van ATP.
Creatine fosfaat + ADP
ATP + Creatine (gekatalyseerd door creatine kinase)
15.3 De oxidatieve van koolstofbrandstoffen is belangrijke bron van energie
Stukken met hoge fosforyl transfer potentiaal kunnen
koolstofoxidatie koppelen aan ATP synthese.
De oxidatie vindt niet direct plaats: Als eerste GAP + NAD + +
HPO42-  1,3-bifosfoglyceraat + NADH + H+
1,3 BPG heeft namelijk een hoog fosforyl transfer potentiaal.
Hiermee kan het worden gekoppeld aan de ATP synthese: 1,3 BPG
+ADP  3-fosfoglyceric zuur + ATP
De ion gradiënten over het membraan voorzien een belangrijke
vorm van energie dat kan worden gekoppeld aan de ATP
synthese.
Er wordt gezorgd dat binnen in een min lading ontstaat en tussen de membranen een plus lading zodat
de H+ naar buiten gaan (oxidatie).
Stage 1: grote moleculen in het eten worden
afgebroken tot (monomeren). Dit noem je digestie en
levert geen bruikbare energie op.
Stage 2: De kleine moleculen worden afgebroken in
een paar simpele units die een belangrijke rol spelen
in het metabolisme.
Stage 3: ATP is geproduceerd van de complete
oxidatie van het acetyl stuk van acetyl coA.
15.4 Metabolische patways bevatten veel terugkomende motieven
ATP is een geactiveerde drager van fosforyl groepen omdat de fosforyl transfer van ATP een exergonisch
proces is. Er zijn verschillende soorten geactiveerde dragers:
 Geactiveerde dragers van elektronen voor brandstof oxidatie.
Vb1. NAD+. De nicotinamide ring van NAD+ accepteert een waterstof ion en twee elektronen (H). De gereduceerde drager van NAD+ is NADH.
Vb2. FAD
 Een geactiveerde drager van elektronen voor reductieve biosynthese. Elektron donor: NADPH
reduceert naar NADP+. NADPH draagt elektronen en is uitsluitend gebruikt voor reductieve
biosynthese.
 Geactiveerd drager voor twee koolstof fragmenten. CoA is een drager van een acyl groep. Acyl
groepen zijn belangrijk in het katabolisme etc.
Type reacties:
 Oxidatie-Reductie. Hoe bouwstenen gedeoxideerd worden, dat daar energie bij vrijkomt die
energie kan dan weer worden gebruikt om nieuwe bouwstenen te maken via reductie reacties.
(FAD, NAD).
 Ligatie reacties. Ligaties waarbij je covalente bindingen maakt, waar je de energie van ATP
nodig hebt gekoppeld aan de ligatie reacties. Waar je twee dingen aan elkaar “plakt”. De reactie
gaat altijd zeer langzaam daardoor is deze ook afhankelijk van de ATP hydrolyse naar ADP. (Er
worden bindingen gevormd door ATP te gebruiken)
 Eliminatie +additie reacties leidt tot isomerisatie reacties reacties, waardoor je water kan
elimineren en dan weer kan toevoegen.
 Transfer van functionele groep. Bijvoorbeeld van een fosfaat groep. ATP wil graag zijn fosfaat
groep kwijt en geeft deze bijvoorbeeld aan glucose. Glucose heeft dan een lading door het
membraan dan dezelfde lading te geven kan je glucose concentreren in de cel.
 Hydrolyse reacties. Het verbreken van een amide binding met behulp van water, of het vormen
van een amide binding met het verlies van water.

Functionele groep (additie) reacties: waarbij de ene functionele groep op een andere groep
wordt gezet. Dit zijn lyases.
 Functionele groep eliminatie reacties: waarbij een functionele groep wordt geëlimineerd van
de groepen.
Metabolische processen zijn gereguleerd op 3 manieren:
1. Controleren van de hoeveelheid enzymen
2. Controleren van de katalytische activiteit
3. Controleren van de toegankelijkheid van substraat
Algemene concepten van metabolisme, drie stroming in biochemie:
- Informatiestroom: DNA via RNA naar eiwit.
- Metabolisch, stofstroom: hoe de cel bouwstenen afbreekt en opbouwt.
- Energiestroom: is hoe de energie wordt gemaakt uit het voedsel en weer gebruikt wordt om
nieuwe moleculen te maken. Metabolisme is een serie van aan elkaar gekoppelde reacties. Gaat
vaak via oxidatie reacties. De situatie in de cel beïnvloedt het metabolisme in de cel.
Bijvoorbeeld de verzuring van je spieren heeft invloed op je plaatselijke metabolisme.
Metabolisme is in verschillende groepen ingedeeld. Aan de ene kant hebben we brandstoffen
(suikers/vetten etc.) die we gebruiken en omzetten in CO2 , H2O en bruikbare energie (ATP). Dit noemen
we katabolisme; de afbraak van bouwstenen. Vervolgens gebruiken we die bruikbare energie (ATP) + de
chemische bouwstenen die gemaakt worden in de cel en die worden omgezet in complexe moleculen,
om grotere moleculen (bijvoorbeeld eiwitten, lipiden of nucleïnezuren) te vormen. Dit noemen we
anabolisme; de opbouw vanuit bouwstenen (anabolen; opbouwen). Katabolisme is het energie halen uit
de brandstoffen en het maken van kleine bouwstenen en het anabolisme is het hieruit vormen van
moleculen. In de citroenzuurcyclus wordt ATP en elektronen gegenereerd. Dit is de cyclus voor grote
hoeveelheden energie; hydrolyse van de bouwstenen en die worden vervolgens in die keten compleet
geoxideerd tot CO2, tijdens die oxidatie komt er energie vrij. Eiwitten worden geknipt tot aminozuren,
polysacharides worden geknipt tot suikers, vetten/lipides tot vetzuren en glycerol. Die bouwstenen
worden verder terug gebracht tot voornamelijk Acetyl-CoA enzym, van twee koolstofatomen groot.
Deze worden dan in de citroenzuurcyclus gebracht, hier worden cofactoren/enzymen als NADH
gemaakt, dit zijn reducerende moleculen; die kunnen andere moleculen reduceren en zijn daarmee een
chemische bouwsteen voor de cel.
De essentie van ATP synthase is dat het een enzym is dat ATP synthetiseert. Hij heeft drie gelijken
eiwitdomeinen waar die ATP synthese plaats vindt. Deze drie eiwit domeinen zitten in een hexameer
met in het midden een ratel. Die ratel draait dus rond en maakt op drie verschillende manieren contact
met die drie domeinen, afhankelijk hoe hij contact is, is het domein open (bindt hij zwak aan ADP en
orthofosfaat, PO43-), half open (wordt de binding versterkt) en dicht (wordt ATP gemaakt). Vervolgens
gaat hij weer naar de open toestand en laat het ATP los. Het is een enzym dat door de protonen
gradiënt wordt aangezet. ATP wil graag een fosfaat groep kwijt, want dan gaat de vrije energie naar
beneden; komt energie bij vrij-> een hoger fosforidepotentiaal. Glycerolfosfaat heeft een lagere
fosforidepotentiaal door een neutraal geladen element. Er zijn ook verbindingen die een hogere
fosforidepotentiaal met meer negatieve ladingen als je deze dus mengt met ADP wordt er ATP gevormd.
Als je spieren rust hebben, bouwen ze ATP op voor 1 seconden sporten. Voor de eerste vier seconden
van het sporten wordt energie geleverd door creatinefosfaat dat opgeslagen is in je spieren. De fosfaat
groep op creatinefosfaat wordt dan gebruikt om ATP van ADP te maken. Daarna wordt er nieuw ATP
gemaakt met de citroenzuurcyclus. Als de zuurstof toevoer stopt krijg je anaerobe verbranding->
verzuring van de spieren. ATP wordt gemaakt door de oxidatie van brandstoffen. Hoe gereduceerder
een koolstof atoom is hoe meer vrije energie er vrij komt als er oxidatie optreedt. Die energie wordt dan
gebruikt voor ATP. Met zuurstof oxideren we brandstoffen en de energie die daarbij vrij komt wordt
gebruikt in andere processen om protonen naar buiten te pompen en dan ATP te maken. Meeste
energie zit in vetten, hier zitten sterke gereduceerde koolstofatomen en suikers zijn vaak al gedeeltelijk
geoxideerd. Maar om snel energie te krijgen kun je beter de al gedeeltelijk geoxideerde suikers in te
nemen. Om bijvoorbeeld glyceraldehyde-3-fosfaat te oxideren gebruik je cofactoren NAD+ en NADH. De
eerste stap is de fosfaat erop te zetten met behulp van NAD+, deze neemt dan een hydride proton op
(komen elektronen bij vrij, oxidatie reactie). Deze elektronen worden opgevangen door NAD+ met een
proton-> NADH. Twee elektronen en één proton H+ geeft een H-. Hier komen twee protonen en twee
elektronen bij vrij. Dit alle leidt tot één H+ die naar buiten wordt gepompt (voor de protonen gradiënt)
en twee elektronen die opgeslagen worden op NADH. Vervolgens moet de fosfaat groep nog omgezet
worden tot een zuur en dat gaat door de fosfaat over te dragen op ADP-> is dus ATP gemaakt. Totaal: 2
protonen, 2 elektronen en 1 ATP in één oxidatie stap. Je hebt dus groepen nodig die de vrije energie
opvangen/opslaan. Daarvoor heb je verschillende groepen ADP NADH FADH etc. De chemische energie
van deze groepen kan vervolgens opnieuw gebruik worden in de synthese voor nieuwe bouwstenen.
ATP NADH FADH co-enzym A hebben allemaal een adenine en ribose functionaliteit. En een difosfaat
linker en aan die difosfaat linker zit de functionele groep die opneemt en afstaat. Dit zijn allemaal
bouwstenen van RNA moleculen, dit is ook een eiwit dat we uit RNA synthese voorkomen. NAD+ de
reacties faciliteert die oxideren, NADP+ doet de reductie
reactie. Hiervoor gebruikt hij elektronen. FAD is voor
oxidatie en slaat ook op-> is een elektronen transfer
reagens. Er zijn zes verschillende typen van reacties die in
het metabolisme voorkomen, die hierboven al zijn
besproken.
College 7:
Membranen zijn opgebouwd uit eiwitten en lipiden. Ze realiseren
compartimenten en generen afgesloten gedeeltes waar reacties
kunnen plaatsvinden of complexen beschermd kunnen worden.
Prokaryoten hebben een membraan met een extra verstevigde
wand zodat ze niet uit elkaar spatten. Membraan bestaan vooral
uit eiwitten en lipiden. De lipiden zijn de barrière en de eiwitten
geven de functies aan het membraan. Bacteriën hebben maar een
compartiment en in eukaryoten heb je verschillende membranen,
om de nucleus om de mitochondriën etc.
Celmembranen hebben wat overeenkomsten:
 Membranen hebben een sheet structuur (2 moleculen
dik), dat verschillende compartimenten van elkaar afsluit.
 Membranen bestaan vooral uit lipiden en eiwitten. Daarnaast bevatten sommige ook suikers.
 Membraan lipiden zijn kleine moleculen bestaande uit een hydrofiel en hydrofoob deel.
Daarnaast is het een barrière voor polaire moleculen (water bijvoorbeeld kan er niet zomaar
doorheen).
 Apolaire moleculen kunnen er wel worden opgenomen.
 Specifieke eiwitten kunnen dienen als pomp, kanaal etc. in het membraan.
 Membranen zijn gevormd door secundaire interacties.
 Membranen zijn asymmetrisch.
 Membranen zijn fluïde structuren. Lipide moleculen kunnen snel diffunderen in het membraan
vlak.
 Membraan kan worden bekeken als 2D oplossing van georiënteerde eiwitten en lipiden.
 Meeste membranen zijn elektrisch gepolariseerd (binnenkant is negatief).
12.1 vetzuren zijn de sleutel deel van lipiden
Lipiden zijn vetzuren en hun derivaten en verbindingen die hier bio synthetische functioneel aan
gerelateerd zijn. Lipiden hebben verschillende functies: het opslaan van vetten als
brandstof (het opslaan van energie), ze zijn belangrijk als signaal molecuul en lipiden
vormen membranen. Lipiden bestaan uit vetzuren, dit zijn moleculen met een lange
vette staart en een zure kopgroep. Een vette staart is een apolaire alifatische koolstof
staart, die goed oplost in organische oplosmiddelen. Je hebt verzadigde (geen
dubbele binding, lineaire keten) en onverzadigde (dubbele binding, zorgt voor knip in
de staart) vetzuren. Zo’n knip kan een verlaging van zijn smeltpunt veroorzaken
vetzuren. We tellen af van de carboxyl (COO-) groep. De eerste positie na de
carbonzuur noem je de α vervolgens β etc.
•
•
•
•
•
Vetzuren zijn lange koolstofketens met een carboxylzuurgroep.
Onverzadigde vetzuren: bevat een dubbele binding. (meestal cis)
ω-3 binding (omega 3 binding) is een vetzuur met een dubbele binding op positie 3 geteld vanaf
de andere kant. (niet scheikundig correct)
hoe langer de keten hoe hoger het smeltpunt!
(cis) dubbele bindingen verlagen het smeltpunt!
Voorbeelden van lipiden zijn: CH3(CH2)12COOH (Myristinezuur (ntetradecaan zuur)), CH3(CH2)14COOH (Palmitinezuur), CH3(CH2)16COOH
(Stearinezuur) etc. Je hebt ook verbindingen met dubbele bindingen
zoals oliezuur. Linolzuur is een essentieel vetzuur die wij zelf niet kunnen
maken en door voeding tot ons moeten nemen. De opslag van vetzuren
in de cel gebeurt in vetdruppeltjes. Daar wordt vet opgeslagen in het
lichaam in de vorm van een ester van glycerol. Glycerol heeft als rol puur
de energie opslag in de vorm van vetten.
12.2 Er zijn 3 veel voorkomende membraan lipiden
De drie membraan lipiden zijn:
1.Fosfolipiden
Een fosfolipide bestaat uit: 2 vetzuren, een platform waar de vetzuren aan
vastzitten, een fosfaat en een alcohol aan het fosfaat. Het vetzuur
component zorgt voor de hydrofobe barrière. De rest van het molecuul
heeft een hydrofiel karakter dat interacties kan maken met het waterig
milieu.
2 mogelijke platforms: - glycerol ( drie koolstof alcohol)
- sfingosine (meer complex alcohol)
Bij sfingosine is de aminogroep gekoppeld aan
een vetzuur door een amide binding.
Begint eerst met fosfatidaat en hierop komt dan een tweede esterbinding
met de kopgroep. Mogelijke kopgroep: choline (positief geladen),
ethanolamine(positief geladen), serine (neutraal), glycerol (neutraal) en inositol (neutraal)
Dan heb je nog sfingosine als fosfolipide, wordt vervolgens verester met
een fosfaat groep en een polaire kopgroep. Sfingosines zijn stabieler
dan fosfoglyceriden, omdat ze een aminebinding heeft en de
vetzuurstaart via koolstofbindingen aan de keten zit. De fosfaatgroep is
de groep die het hydrofobe gedeelte van het hydrofiele gedeelte
scheidt. Als er in plaats van de fosfaatgroep een suiker groep zit noem
je dit glycolipiden.
2.Glycolipiden
Glycolipiden zijn ongeveer hetzelfde als de fosfolipiden. Alleen is de
fosfaatgroep vervangen door een suiker. Daarnaast zitten deze altijd aan de
buitenkant van het membraan.
3.Cholesterol
Cholesterol heeft een grote apolaire zijstaart en een kleine polaire
kopgroep. Omdat de polaire kopgroep van cholesterol vele malen
kleiner is, zit ze daardoor verscholen in het membraan en gaat
bijna geen interacties aan met het water. Cholesterol vult de gaten
(door cis-configuratie) op in het membraan, maakt het daardoor
minder gevoelig voor temperatuur veranderingen in het
membraan. We hebben ongeveer 300 gram cholesterol in ons
lichaam. Cholesterol is de voorganger van alle steroïden in ons lichaam. Hdl en ldl, goed en slechte
cholesterol heeft te maken waar het cholesterol in het lichaam zit, of het gesynthetiseerd wordt of
afgebroken wordt. Statides zijn medicijnen tegen overgewicht die de synthese van cholesterol
inhiberen.
12.3 fosfo- en glycolipiden vormen bi-moleculaire sheets in waterige omgeving
Hoe de lipiden een membraan vormen; lipiden bestaan altijd uit twee apolaire
staarten en een hydrofiele/polaire kopgroep. Je kunt dan twee verschillende
vormen hebben:
 Vormen van een micel: De polaire kop vormt de buitenkant van het
oppervlak omgeven met water. De vetzuur ketens zitten binnen in
en reageren met elkaar.

Vormen van een lipide bilaag: De hydrofobe staarten van elk
individuele sheet reageren met elkaar en vormen een hydrofoob
binnen stuk dat als permeabiliteitsbarrière functioneert. De
hydrofiele kopgroepen reageren met de waterige omgevingen aan
elke kant van de bilaag.
Voor fosfolipiden en glycolipiden in een waterig media is een bi moleculair sheet meer geliefd dan een
micel : twee vetzuur ketens van een fosfo- of glycolipide passen niet goed binnen in een micel.
Het hydrofobe effect is de belangrijkste factor die de bouw van de lipiden bepaald. Een vesicle met aan
de buitenkant en aan de binnenkant van de cel hydrofobe kopgroepen die met water een interactie
aangaan, die met het hydrofobe gedeelte zorgt voor de stabiliteit. Dit is eigenlijk gewoon een
celmembraan.
Daarnaast zijn bi-lagen veel stabieler dan micellen. In een bilaag is er veel dynamica van moleculen,
maar ze gaan er moeilijk uit. Van der Waals interacties tussen de staarten vinden dicht bij elkaar pakken
van staarten het fijnste. Daarnaast ook elektrostatische en Waterstofbrug bindingen tussen de polaire
kopgroep en watermoleculen. Dus de lipide bi-laag wordt gestabiliseerd door veel non covalente
interacties.
Lipide vesicle
Lipide vesicles worden ook wel liposomen genoemd. Het zijn waterige
compartimenten die worden gesloten door een lipide bilaag.
Hiermee kun je dingen verplaatsen in de cel.
Het membraan beweegt constant. Overall is ze wel sterk genoeg om geen
water of ionen door te laten (in de cel). Door deze lossigheid kun je de
vorm van het membraan gemakkelijk veranderen, maar kunnen er ook
dingen in het membraan bewegen. Het membraan is sterk en dynamisch
met behulp van het hydrofobisch effect.
Permeabiliteit
De lipide bilaag membranen hebben een lage toegankelijkheid voor ionen en vooral voor polaire
moleculen.
12.4 eiwitten dragen veel membraan processen
Eiwitten zitten vast aan het cytoskelet. Fluid mosaic model: oplossingen
van eiwitten in het membraan in een 2D vloeistof (ze kunnen alleen in de X
en Y richting bewegen), soms zijn de eiwitten mobiel en soms niet mobiel.
De karakteristieken van eiwitten in het membraan zijn: aan de buitenkant
van de cel meer positief geladen en binnen de cel meer negatief geladen.
Eiwitten in de cel hebben vaak een meer positieve lading zodat ze beter
interacties aan kunnen gaan. Alle organellen hebben membranen. Buiten
het membraan zitten vooral fosfatidylcholine en sfingomyeline: positief
geladen en glycolipiden. Aan de binnenkant van het membraan zitten meer
fosfatidylserine en –ethanolamine: neutraal en negatief geladen. Met
behulp van eiwitten worden signalen en/of moleculen doorgegeven.
Soorten eiwitten in het membraan:
1.Perifere membraan eiwitten
Ze zijn gebonden aan het membraan door vooral elektrostatische en waterstof
brug bindingen met de kopgroepen van lipiden. Deze polaire interacties kunnen
worden verstoord door bijvoorbeeld zout toe te voegen of de pH te veranderen.
Deze integraal eiwitten zitten dus helemaal door het membraan heen.
2.Integraal membraan eiwitten
Vooral reageren met hydrofobe deel. Ze kunnen alleen loslaten als er agents de competitie aangaan
voor de niet polaire interacties. Daarnaast spannen de integraal eiwitten vaak over de hele bilaag. Deze
perifere eiwitten zitten dus of helemaal aan de buitenkant of helemaal aan de binnenkant.
Eiwitten kunnen het membraan spannen met alfa helices
 Vaak 7 dicht bijeen gepakte alfa helices loodrecht op het
celmembraan.
Een kanaal eiwit kan worden gevormd door bèta strengen.
 Vormen dan een bèta sheet door waterstofbruggen
Een stukje van eiwit in een membraan kan het eiwit koppelen aan het
membraan oppervlak.
 Het heet dan een integraal eiwit ( ook al spant het niet het membraan). Als eerste is er een deel
van het eiwit dat reageert met het hydrofobe stuk van het membraan, deze bevat niet polaire
aminozuur zijketens. Deze delen reageren met de waterige omgeving.
12.5 Lipiden en veel membraan eiwitten diffuseren snel in vlak van membraan
Je kunt lateraal door het membraan heen maar ook transverse, laterale ( 1
sec) diffusie is vele malen sneller dan transverse (30 min tot 60 min) diffusie.
Dit komt omdat hij door het hydrofobe gedeelte moet bewegen. Ze hebben
iets gebleached (kleurloos) gemaakt en gekeken hoe snel hij weer was
hersteld (de kleur weer terug was). Zo kan je zien hoe mobiel een bepaalde
structuur is in de cel. Lipiden kunnen dus heel snel bewegen maar eiwitten
niet zo snel.
Membraan fluïditeit is gecontroleerd door cholesterol
De overgangstemperatuur hangt af van de lengte van het vetzuur en van de
graad van on-verzadigdheid. De aanwezigheid van verzadigde vetzuren is geliefd
in de stijve toestand, want de rechte ketens kunnen goed met elkaar reageren.
Een cis dubbele binding verkrijgt een kink in de keten, wat zorgt voor een lagere
Tm. Cholesterol zorgt voor : Het voorkomen van kristallisatie en voor het
voorkomen van het smelten. Cholesterol reguleert dus de fluoriteit van het
membraan en vangt de temperatuur schokken op en vormt eiwiteilandjes waar
eiwitten interacties kunnen aangaan. De samenstelling van het membraan heeft
met zijn functie te maken.
12.6 eukaryoten cellen bevatten compartimenten
Een uitgebreid aantal interne membranen in eukaryoten zorgt voor
compartimenten in de cel. Bijvoorbeeld het dubbele membraan om de kern, het
membraan om de mitochondrie. Of het endoplasmatisch reticulum etc.
Transmembraan eiwitten:
Bacteriorhodopsine gebruikt licht om ionen rond te pompen. Porine is een
waterkanaal in het membraan. Hiervoor moet de buitenkant apolair zijn en de
binnenkant polair.
Je hebt ook nog eiwitten die alleen maar buiten of binnen het membraan willen
zitten, dit gebeurt door lipide-ankers die de eiwitten aan het membraan
verbinden.
Thioester is een reactieve ester binding die gemakkelijk hydrolyseert. Een
thioester is een stabiele verbinding. Lipoproteïnes die via een lipide-groep verankerd zitten.
Ras transporteert signalen van de binnenkant van de cel naar de buitenkant van de cel, is dus de hele
tijd in beweging in de cel. Deze beweging wordt gegenereerd door het telkens af halen of opplakken van
lipide ankers.
Na ongeveer 20/30 keer delen voert de cel apoptose uit, dit wordt gedaan door signaal lipiden om te
zorgen zodat de cel gecontroleerd dood gaat. Er zijn verschillen in samenstelling van membranen van
verschillende organellen. Myeline isoleert onze zenuwcellen, moet dus vooral hydrofobe elementen
hebben verschillende fosfolipiden hebben verschillende lading, combinatie van fosfaat groep met base;
lading bepaalt waar hij zich bevindt
13.1 Het transport van moleculen over het membraan (actief/ passief)
Twee belangrijke factoren of een molecuul over het membraan zal gaan:
1. De permeabiliteit van het molecuul in de lipide bilaag
2. De beschikbaarheid van een energie bron
Passief transport : Het kost geen ATP en het gaat altijd met de concentratiegradiënt mee. Dit houdt in
dat het altijd van een hoge concentratie naar een lage concentratie "stroomt".
Actief transport: Kost energie. De moleculen bewegen in een richting tegengesteld aan een elektrische
gradiënt of concentratiegradiënt. Meestal transport van buiten naar binnen, zodat de concentratie aan
stoffen binnen groter wordt dan buiten de cel. Cellen hanteren dit mechanisme ook om afvalstoffen
vanuit de cel naar buiten te transporteren.
De vrije energie verandering bij membraan potentiaal:
Hier is c1 de concentratie aan kant 1. Z is de elektrische lading van het verplaatste stofje.
verandering van potentiaal over het membraan (volt). F is Farad constante.
> 0 dan is het transport proces dat nodig is : actief (heeft energie nodig)
< 0 dan is het transport proces dat nodig is : passief
is de
13.2 Twee families van membraan eiwitten die ATP hydrolyse gebruiken
Pomp
Voor een pomp zijn er twee conformatie toestanden:
1) Ion binding kant open aan de ene kant van het membraan
2) Ion binding kant open aan de andere kant van het membraan
Om ionen in een richting te sturen over het membraan zorgt ATP hydrolyse voor omzetting naar deze
twee conformatie toestanden.
Calcium pomp
De pomp zit bijvoorbeeld in het sarcoplasmatisch reticulum om er voor te zorgen dat de calcium uit het
cytoplasma daar wordt opgeslagen. P-type ATPase bevat 80% van het eiwit in het SR membraan en is
belangrijk bij de spier contractie. Hierin bevat het transmembraan domein twee bindingsplaatsen voor
Ca2+ ionen. Elk Ca2+ ion is gebonden aan zeven zuurstof atomen die afkomen van een combinatie van de
zijketens: glutamaat, aspartaat, threonine, asparagine residuen, backbone carbonyl groepen en water
moleculen.
Het N domein bindt de ATP nucleotide en het domein P ontvangt de fosforyl groep van een aspartaat
residu. Domein A dient als actuator(de in gang zetter), koppelt de veranderingen in N, P en
transmembraan domein van het enzym.
1. de katalytische cirkel begint met het enzym in on-gefosoryleerde toestand met twee gebonden
calcium ionen.
2. Daarna kan het enzym ATP binden. De N, P en A domeinen ondergaan een substantiële
herindeling als ze zich dicht bij de gebonden ATP bevinden, maar er is geen substantiële
conformatie verandering in het transmembraan domein.
3. De fosforyl groep wordt van ATP naar Asp 351 overgebracht.
4. ADP wordt vrijgelaten en het enzym veranderd de totale conformatie (incl. transmembraan
domein).
5. Het fosforylaspartaat residu is gehydrolyseerd om fosfaat los te laten.
6. Als fosfaat wordt losgelaten en alles weer in normale toestand gebracht.
ATP binding cassete
Deze pompen ontwikkelen resistentie tegen medicijnen van bijvoorbeeld
kanker.
Fenomeen: Multi drug resistance eiwit(MDR-eiwit). Dit eiwit gedraagt zich
als een ATP afhankelijke pomp dat een grote range van kleine moleculen
uit de cel pompt (in kankercellen wordt dat verhoogt en wordt het
medicijn nog sneller de cel uitgepompt, voordat het medicijn zijn ding
heeft gedaan ).
MDR bestaat uit vier domeinen: 2 membraan gespannen domeinen en
2 ATP binding domeinen(ATP binding cassetes genoemd)
Transporteurs die deze ATP bindings cassettes bevatten => ABC
transporteur genoemd.
ABC Transporteur mechanisme
1. Geen ATP en geen substraat. Dus de pomp kan vrij open en dicht bewegen.
2. Een substraat komt in het centrale gat van de open vorm van de transporter binnen in de cel.
Hierdoor veranderen de ATP binding cassettes (2 domeinen) van conformatie , wat de affiniteit
voor ATP versterkt.
3. ATP bindt aan de ATP binding cassettes en zorgt er voor dat de twee domeinen nog sterker met
elkaar binden.
4. De sterke interacties tussen de ATP binding cassettes induceert een verandering in de relatie
tussen de twee membraanspanningsdomeinen. Hierdoor wordt het substraat uit de cel vrij
gelaten.
5. De hydrolyse van ATP en loslaten van ADP en Pi zorgt er voor dat de cylus wordt gereset.
13.3 Lactose permease is een secundair transporteur
Kanalen
 Passief transport: Laat dingen door in de cel in de
richting van de concentratie gradiënt.
 2 vormen: open of gesloten
 Vorm van eiwit zorgt voor de selectiviteit van het
kanaal
Lactose permease mechanisme
13.4 specifieke kanalen kunnen snel ionen over het membraan transporteren
In de cel:
- veel K+
In bloed:
- veel Na+
- weinig Na+
- weinig K+
Deze concentraties worden verkregen door Na+ K+-ATPase. Het membraan heeft een elektrisch
potentiaal bepaald door de concentratie van ionen in de cel t.o.v. ionen buiten de cel.
Actiepotentiaal : Depolarisatie(toename Na+ permeabiliteit, dus Na+ cel in)repolarisatie(K+ de cel uit ,
want toename permeabiliteit K+) rust potentiaal
Kalium kanaal
Dit is de structuur van een potassium ion kanaal. Er zit een ion
filter in (dus op basis van grootte en bindingen).
Het eiwit genereerd een stukje waterkanaal, waardoor de
ionen al een klein stuk over het membraan kunnen. ewegen. 
het membraan wordt dunner gemaakt. Kalium verliest dus niet
zijn schild van 8 water moleculen. Uiteindelijk moet elk K+ ion
wel zijn water opgeven en reageert met groepen van het eiwit.
Het kanaal heeft 4 bindingsplekken voor kalium ionen.
Er kunnen maar 2 K+ daadwerkelijk worden gebonden, want
plus en plus stoten elkaar af als ze te dichtbij zitten. Dus als
er een 3de K+ komt duwt hij de andere K+ uit het kanaal.
Selectiviteits groepen voor de voorkeur voor K+ : Thr-Val-GlyTyr-Gly (TVGYG)
Waarom K+ wel er door en Na+ niet?
Desolvatering kost energie/resolvatering geeft energie >
energie verschilt zorgt er voor of kalium aan 8 H20 moleculen
bindt. Na+ is te klein om aan 8 H20 moleculen te binden dus
raakt zijn waterschild niet kwijt.
Controle mechanisme voor openen van kanalen
 Liganden ( achetylcholine is een receptor voor ligand gated ion kanalen, veranderd de
permeabiliteit voor een ion.)
 Mechanisch (
 Lading (dicht als ∆V klein is, open als ∆V groot is (voltage gating)
Nernst vergelijking (membaan potentiaal in evenwichtstoestand):
13.5 Gap junctions staan ionen etc. toe tussen communicerende cellen
Een gap junction bestaat uit twee halve kanalen (connexons), die elk weer uit 6 connexines bestaan.
Wanneer de connexons van twee cellen elkaar ontmoeten vormen ze samen een gap junction. Dus ze
verbinden de interiors van beide cellen. Waardoor de beide cellen kunnen communiceren.
13.6 Specifieke kanalen vergroten permeabiliteit van membranen voor water.
Sommige weefsels bevatten eiwitten dat de permeabiliteit van water over het membraan vergroten.
Deze eiwitten worden aquaporin genoemd. Bestaan uit 6 membraan gespannen alfa helixen en een
centraal kanaal wat watermoleculen toe staat om te passeren.
College 8:
Signaal transductie hangt af van moleculaire circuits.
1. Vrij laten van primaire messenger.
2. Ontvangst van primaire messenger. Meeste signaalmoleculen gaan niet cel in.
Dus eiwitten in de cel gedragen zich als receptoren die de signaal moleculen
kunnen binden. Daarna verzenden ze die informatie in de cel.
3. Afleveren van bericht in de cel door een secundaire messenger. Secundaire
messenger in de cel zijn bijvoorbeeld cAMP, cGMP, calcium ionen.
4. Activering van effectoren die direct het fysiologische respons wijzigen. Activatie
van pompen, kanalen, enzymen etc. die direct controle hebben over
metabolische pathways.
5. Beëindigen van signaal. Als het respons klaar is door de cel, moet het proces
worden beëindigd.
14.1 Hetrotrimeric G eiwitten zetten signalen om en resetten zichzelf
Epinephrine:
Epinephrine kan het afbreken van glycogeen en van vetzuren in gang zetten. Het signaal proces begint
bij het ligand binden aan een eiwit: β-adrenergic receptor.
GPCrs (g-eiwit gekoppelde receptor) is
gebonden aan GDP. Als het aan GTP gaat
binden is het actief. Dan stimuleert het actieve
GTP de activiteit van adenylate cyclase. Deze
zet ATP om in cyclisch AMP (cAMP). cAMP kan
door de cel heen en heeft het signaal bij zich.
Het binden van epinephrine aan de receptor
zorgt er voor dat de snelheid cAMP productie
toeneemt in de cel. Hierna heeft ook cAMP
invloed op ATP productie in spier contractie en
op het afbreken van brandstoffen. Dit komt
doordat het eiwit kinase A wordt geactiveerd.
G-eiwitten kunnen zichzelf resetten door hydrolyse
De gebonden GTP kan weer gehydrolyseerd worden tot GDP. Daarna wordt Gα weer gebonden met Gβy
om het inactieve eiwit te vormen. Hierna moet ook nog het hormoon gebonden geactiveerde receptor
worden gereset.
1. Het hormoon laat los en receptor gaat naar begin toestand
2. Door fosforylering van de receptor bindt β-arrestine.
Calcium ion is een vaak gebruikte secundair messenger.
De mogelijkheid van Ca2+ om gecoördineerd te worden door meerdere liganden (6 tot 8 zuurstof
atomen) maakt het mogelijk om het te crosslinken aan verschillende segmenten in een eiwit. Hierdoor
kan het veranderingen veroorzaken.
Calmodulin(CaM) heeft vier bindingsites voor calcium. Calmodulin bestaat uit 4 EF
handen. 7 zuurstof atomen zijn gecoördineerd ten op zichte van elk Ca2+ ion.
 6 van eiwitten en 1 van water.
14.2 insuline signalering
De insuline receptor is een dimeer dat sluit om een gebonden insuline molecuul. Het α-stuk ligt geheel
buiten de cel. Het β-stuk ligt vooral in de cel. De twee α- units gaan naar elkaar toe om een bindingsite
te vormen voor een insuline molecuul. De Β unit bestaat vooral uit eiwit kinase domein. Het insulin
receptor kinase is een tyrosine kinase. Het katalyseert de verplaatsing van een fosfaat groep van ATP
naar een OH groep van tyrosine.
Dus: insuline binding cross-fosforylering en activering insuline receptorgefosforyleerde kanten van
receptor gedragen zich als bindingsite voor insuline receptor substraat zoals IRS1. Uiteindelijk wordt
Akt1 geactiveerd en kan door de cel bewegen om het signaal te sturen. Het resultaat is vegroting van
glucose opname
14.3 EGF signalering
EGF (Epidermische groei factor) binding induceert een conformatie verandering dat de receptor
dimeriseert en cross-fosforylatie toestaat. De gefosforyleerde receptor bindt adaptor eiwitten dat de
activatie van Ras (klein G-eiwit) bemiddelen. Geactiveerd Ras begint een eiwit kinase waterval dat
uiteindelijk leidt tot fosforylering van transcriptie factoren en veranderingen in gen expressie. EGF
signalering stopt weer door de actie van fosfatase en de hydrolyse van GTP door Ras
14.4 Terugkomende elementen in signaal-transductie pathways
1. Eiwit kinases staan centraal bij veel st pathways.
In epinephrine
=>
PKA (cAMP-afhankelijk eiwit kinase)
In insuline en EGF
=>
zijn de receptoren eiwit kinases en er zijn kinases die in de onderstroom
nog mee helpen.
2. Second messengers nemen deel aan veel st pathways
VB. cAMP, Ca2+, IP3.
Worden geactiveerd door enzymen of door opening van ion kanalen, kunnen de concentraties erg
worden versterkt ten op zichten van hun signaal.
3. Gespecialiseerde domeinen dat specifieke interacties bemiddeld komen in veel eiwitten voor
14.5 Defects in signaal transductie pathways kan leiden tot kanker enz.
Sommige genen kunnen gemuteerd zijn. Monoclonale antilichamen kunnen tegen receptoren gaan
werken die deelnemen aan een bepaald signaal pathway.
Barrières tussen cellulaire compartimenten door lipiden. Selectief transport van moleculen en signalen
door eiwitten, kanalen en pompen.
Ionentransport:
Kleine geladen moleculen komen heel slecht over het membraan, alleen apolaire moleculen
(steroïden medicijnen etc.) omdat deze in het membraan kunnen oplossen. Om toch ervoor te zorgen
dat deze kleine geladen moleculen in de cel komen hebben we transport eiwitten nodig. Je hebt
iontransporters en ionkanalen. Iontransporters functioneren zo dat ze aan de ene kant van het
membraan aan het molecuul binden, het eiwit ondergaat een conformatie verandering (bijvoorbeeld
door ATP-hydrolyse), dan opent hij aan de andere kant van het membraan en kan het ion eruit.
Transporters zijn soort van poriën in het membraan die selectief ionen doorlaten, zijn grootste gedeelte
van de tijd
dicht.
Het algemene concept van deze pompen is: je hebt twee conformaties in de ene conformatie bindt hij
graag een molecuul en bij de andere laat hij graag los. ATP of energie input verandert de conformatie.
De calciumpomp heeft vier eiwit domeinen. Door het transmembraan domein wordt het calcium
getransporteerd. Je hebt het P domein wat gefosforlyseerd is en het N domein, dat is het nucleotide
domein dat aan nucleotiden bindt (dus ATP) en het A domein die de conformatie verandering door geeft
in de receptor.
Bij spiercontractie komt er calcium vrij, je moet hiervoor wel genoeg calcium erin pompen. Voor iedere
twee calcium atomen die getransporteerd worden, is er één ATP energie nodig. Ook hier wordt weer
gebruik gemaakt van energie om de conformatie verandering te krijgen, waardoor er twee verschillende
toestanden komen. De ene toestand waar hij goed bindt met moleculen en de andere waar hij slecht
bindt met moleculen, released.
Bij natrium kalium pomp gaan er drie natrium atomen uit de cel en twee
kalium atomen in de cel. Ook hier vindt weer conformatie plaats door
energie toevoeging van ATP.
Digitalis is een eiwit wat de natrium kalium pomp blokkeert. Je krijgt
hierdoor een overmaat aan natrium concentratie in de cel, beter voor je
hartcontractie maar natuurlijk niet te lang.
Nu het transport van moleculen, soort pomp eiwitten. Multidrug-resistentie kan zieke eiwitten uit de cel
pompen. Kankercellen kunnen gebruik maken van dit soort pompen om effectief medicijnen uit de
kankercellen te pompen-> resistentie. Dit soort pompen zijn niet selectief en pompen meerdere soorten
medicijnen er dus uit, ook al heeft de patiënt die medicijnen nooit gezien/gebruikt. Die pompen komen
ook in normale cellen voor dan noem je ze ABC transporters (ATP Binding Cassette). Die hebben twee
domeinen waar ATP bindt. Qua structuur lijkt hij sterk op de calcium transporters. Hier zorgt het binden
van de drug tot een conformatie verandering en induceert het binden van ATP. Het binden van ATP
zorgt weer voor een conformatie verandering van het eiwit
waardoor het medicijn eruit gaat. Vervolgens wordt ATP
gehydrolyseerd en je weer bij je begin toestand komt. Voor het
transport van een medicijn molecuul zijn dus twee ATP moleculen
nodig. Transporters gebruiken energie om te transporten tegen de
concentratie gradiënt in.
Je hebt ook passief transport door ion
kanalen. Dit kost geen energie en gaat met
de concentratie gradiënt mee. Ze zijn een gecontroleerd gat in
het membraan waar polaire moleculen doorheen kunnen.
Deze tunnel door het membraan heen bestaat uit twee
onderdelen. In de eerste instantie doet hij dit door een tunnel te
maken waar nog water in bevindt-> hij verkleint de barrière door
het graven van een water kanaal in het membraan.
Vervolgens heeft hij een selectiviteit filter die selectief aan kalium bindt. De carbonylen nemen de
functie over van het water in het bovenste gedeelte.
Op de C terminus een delta min en op de N terminus een delta plus. Dit zorgt ervoor dat er kalium uit de
cel getransporteerd wordt en geen water. De afstand is de selectiviteit filter voor de kalium. Waarom
wordt hier geen natrium getransporteerd? Dit komt door de verschillende ionische radius van de
atomen en de hydratie energie van het atoom.
Stel je hebt kalium gehydrateerd door water, moet je het eerst dehydraleren. Dit kost energie, maar het
vervolgens binden van de kalium in het kanaal daar komt weer energie bij vrij. Als daar meer energie bij
vrij komt dan de dehydralisatie kost, dan zal de kalium gedehydrateert worden en in het kanaal
opgenomen worden. Omdat de dehydralisatie energie bij natrium hoger is, kost dit meer energie en zal
hij niet in het kanaal opgenomen worden.
Transport van moleculen kan je ook gebruiken om ziektes te bestrijden. Je hebt peptide structuren die
specifiek het membraan van bacteriën doorlatend maken voor ionen, beide passief. Het zijn cyclische
peptides.
Nu, de doorgifte van signalen door het membraan. Je wilt een signaal de cel binnen krijgen;
signaaltransductie. Is een serie van gebeurtenissen waarbij een extern signaal aankomt bij
het celmembraan, dat moet op een of andere manier omgezet worden in een ander signaal in
de cel die leidt dan weer tot een response. Het signaal (de primairy messenger) zorgt voor
een conformatie verandering van de receptor, die zorgt voor een ander signaal door het cel (de
secundaire messenger). Zo’n signaal kan ook versterkt worden door de receptor. Dit signaal leidt tot
een response.
Epinephrine, insuline en EGF zijn alle drie eiwit signalen, die binden aan verschillende
membraanreceptoren. Cellen hebben duizenden membraan receptoren die specifiek binden aan
primaire signalen. Dan krijg je secundaire signalen door de cel heen wat leidt tot verschillende effecten.
Epinephrine zorgt dat je in alle paraatheid reageert op angst situaties. Insuline zorgt dat glucose
opgeslagen wordt en rustig afgegeven wordt en EGF voor het groeien van cellen en bijvoorbeeld je
botten.
De receptor geeft het signaal dus door. Dit kan een snelle response te weeg brengen of langzame
respons, ligt aan de pathway. Je hebt drie verschillende celmembraan receptoren.
-
Je hebt receptoren die aan ion kanalen gekoppeld zijn, ion kanalen die open of dicht worden
gezet met behulp van een signaal molecuul.
-
Je hebt receptoren die aan zogenaamde G-eiwit zijn gekoppeld,
die G eiwitten worden geactiveerd als een ligand bindt.
-
Je hebt receptoren die aan enzymen zijn gekoppeld.
Ion-kanaal gekoppelde receptoren:
Dit is een ion-kanaal gekoppelde receptor, die wordt open of dicht gezet
door het binden van acetylcholine. Er zijn ook ion kanalen die open of dicht
worden gezet door spanningsverschillen.
G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs):
De G-eiwit gekoppelde receptoren zijn aan de buitenkant vaak hydrofoob (met
het membraan in contact) maar binnen in vind je vaak een kleine polaire pocket
waar de signaalmoleculen kunnen binden. De G-eiwitten worden geactiveerd
door liganden, zie hier rechts. De GPCRs zitten met zeven transmembraan helix
receptoren verankerd in het membraan.
Epinephrine activeert de β-adrenergic receptor, de GPCR en de ligand die
daar aan bindt, deze bindt binnen de cel aan G eiwitten; dit zijn eiwitten
die GTP of GDP binden. GTP is een bron van doorgifte van signalen, daar
waar ATP doorgifte is van energie. Het G eiwit wordt van GDP naar het
geactiveerde GTP omgezet. Hierdoor wordt het signaal doorgegeven,
maakt cyclisch AMP (secundaire messanger). Een adrealine leidt tot het
aanzetten van één enzym.
Bijna alle medicijnen binden aan het GPCR receptor. G eiwitten zijn dus de eiwitten die aan de GPCRs
binden. Als je vetzuren aan eiwitten zet gaan de vetzuren in het membraan zitten. Dit principe wordt
slim gebruikt door de G eiwitten.
We hebben heel veel primair messengers maar een klein aantal secundair messengers. Calcium is een
kation dat graag aan eiwitten bindt, coördineert graag de carboxynaat groepen en de carbonyl groepen
van de backbone van eiwitten. Door het binden aan het eiwit kan de structuur van het eiwit veranderen
en daarmee de functie van het eiwit.
De concentratie van calcium kan worden gemeten met Fura-2. Dit molecuul heeft carboxynaat groepen,
het binden van calcium hieraan leidt tot een verandering van de fluorescentie van het molecuul.
Hiermee kan je concentraties van calcium berekenen.
Er zijn heel veel structuurelementen in eiwitten die aan calcium kunnen binden, maar een hele bekende
daarvan is de EF hand.
Of het calcium bindt of niet leidt tot conformatie. Calmoduline
is het voornaamste eiwit in onze cellen dat aan calcium bindt.
Hij kan twee conformatie hebben; met of zonder calcium. Met calcium krijgt hij een meer helix vormige
conformatie. Dat leidt er toe dat CaM kinase 1 er aan kan binden. Dit enzym zet andere eiwitten aan
door fosfolisering. Calmoduline kan het enzym CaM kinase aanzetten, dat weer andere moleculen kan
veranderen.
EGF wordt gestabiliseerd door zes disulfide bruggen. Enzymen receptoren
leiden uiteindelijk altijd tot een activatie van het G eiwit.
College 9:
4.1 Nucleïne zuur bestaat uit vier basen gekoppeld aan suikerfosfaat hoofdketen
 aan deze OH komt een base te zitten.(1’)
De fosfaat groep komt aan een van de 3’ of 5’ te zitten.
Nucleosine plus een fosfaatgroep heet een nucleotide
 De 2’OH groep is het enige verschil met deoxyribose
Hierdoor is DNA minder vatbaar voor hydrolyse en dus stabieler.
De backbone van DNA = --Suiker-fosfaat-suiker-fosfaat –
De nucleïnezuren schrijven van 5’  3’ kant
De base aan 1’koolstof suiker β-glycosidic binding
Purine zit met N-9 vast en pyrimidine met N-1 aan de C-1
Adenine in RNA  A
deoxyAdenine in DNA dA
Watson-crick base paren
G-C
levert 3 H-bruggen
A-T
levert 2 H-bruggen
4.2 een paar van nucleïne zuur ketens met complementaire sequenties ->dubbele helix
Watson-crick model
1. Twee helicale polynucleotide ketens zitten om elkaar heen gedraaid (rechtshandig ) de ketens
zijn antiparallel (tegenovergestelde polariteit)
2. De suiker fosfaat hoofdketens aan de buitenkant hebben contact met water en bestaan uit
polair/geladen groepen. Hierdoor zitten de fosfaatgroepen het verst uit elkaar en dat is ook
het gunstigste want min en min stoot elkaar af. De purine en pyrimidine basen liggen aan de
binnen kant van de helix. Ze stapelen op elkaar, genaamd π- π stacking. Het levert een
hydrofobe omgeving op en het versterkt de H-bruggen tussen basen.
3. Er zijn 10 basen per draai van de helix
4. De diameter van de helix is 20
Er zijn drie verschillende vormen DNA van links naar rechts; A-DNA, B-DNA en C-DNA
Supercoiled DNA
Supercoiled DNA is een gesloten DNA molecuul waarbij het DNA compact opgevouwen zit. Het kan
worden gedraaid in een super helix. Dit gebeurt wanneer de dubbele helix weer om zich zelf heen
draait. Supercoiling is belangrijk voor:
1. Compact maken van DNA
2. Supercoiling kan de capaciteit van de dubbele helix om te ontvouwen hinderen of helpen en
daarbij heeft het invloed op interacties tussen DNA en andere moleculen.
4.3 DNA is verdubbeld door polymerase
DNA-polymerase katalyseert de stap-voor-stap additie van deoxyribonucleotide units aan een DNA
keten. De reactie : (DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPi
De DNA synthese heef 4 eigenschappen:
1. Reactie heeft nodig dATP, dGTP, dCTP ,TTP en Mg2+
2. Het nieuwe DNA keten wordt verkregen op een DNA template.
3. DNA polymerase heeft een begin element (Primer) nodig om de synthese te beginnen. De
verlenging van de DNA keten in 5’3’ richting
4. Veel DNA polymerase kunnen misstappen in DNA corrigeren door de fout gekoppelde
nucleotiden te verwijderen.
4.4 Gen expressie is de transformatie van DNA informatie in functie
Belangrijkste soorten RNA
 Messenger RNA (mRNA): template voor eiwit synthese (translatie)
 Transfer RNA (tRNA): draagt aminozuren in geactiveerde vorm naar het ribosoom voor peptide
binding vorming.
 Ribosomaal RNA (rRNA): grote component van ribosomen. Is de katalysator voor eiwit synthese
Synthese van RNA door RNA polymerase
De synthese van RNA van het DNA template noem je transcriptie en wordt gekatalyseerd door RNA
polymerase. RNA polymerase heeft nodig:
1. Een templaat. (voorkeur : dubbelstrengs DNA ; kan ook met enkel strengs DNA)
2. Geactiveerde precursors (ATP, GTP, CTP, UTP)
3. Divalent metaal ion (Mg2+ of Mn2+)
RNA polymerase moet worden herkend. DNA templates bevatten regio’s genaamd promotor sites dat
specifiek RNA polymerase binden en bepalen wanneer de transcriptie begint. (eukaryoten hebben
zogenaamde TATA sequentie als promotor site). RNA polymerase beweegt over een DNA template en
schrijft een DNA streng over.
Overeenkomsten DNA synthese/RNA synthese:
1. De richting van de synthese: 5’3’
2. Mechanisme van de verlenging: aanval 3’OH op NTP
3. Gaat door op de hydrolyse van PPi
Verschil:
1. RNA heeft geen primer nodig
2. RNA polymerase heeft minder mogelijkheden om fouten te herstellen als DNA polymerase.
De transcriptie begint in de buurt van promotor sites en eindigt bij de terminator sites.
Bij eukaryoten cellen hebben promotor sites TATAAA (TATA box) bij -25 nucleotiden van de transcriptie
start en -75 zit een CAAT box(is af en toe aanwezig). mRNA is gemodificeerd na de transcriptie. Een cap
structuur is toegevoegd aan 5’einde en een poly(A) staart aan het 3’ einde.
Translatie
tRNA bevat aminozuurbindingskant. Ook bevat het een templaat
herkenningskant, de sequentie van drie basen, genaamd het anticodon.
Het anticodon herkent het codon op mRNA.
4.5 aminozuur gecodeerd door 3 basen vanaf begin punt
1. 3 nucleotiden coderen een aminozuur. (een codon)
2. De code overlapt niet.
3. De code heeft geen interpuncties. (er fungeert geen base als komma)
4. Er is meer dan een codon voor een aminozuur.
Er zijn 64 verschillende mogelijke codons. UAA,UAG, UGA zijn stop codons en AUG is de initiator
(methionine).
4.6 introns en exons
Een intron is een stukje DNA dat zich bevindt in een gen maar dat niet wordt gebruikt om het
eiwit te coderen. De delen van het gen die wel in het uiteindelijke mRNA terechtkomen,
worden exons genoemd.
Splicing
Splicing is de verandering van genetische informatie na transcriptie. Tijdens de RNAprocessing worden de introns uit het pre-mRNA geknipt en de exons van het pre-mRNA aan
elkaar geplakt. Introns komen hoofdzakelijk voor in eucaryotische cellen. Als de introns uit het
pre-mRNA geknipt zijn (cleavage) blijven enkel de exons over. Het verbinden van deze exons
tot een nieuw geheel, het mRNA, heet splicing,
28.1 DNA replicatie gaat verder met depolymerisatie van deoxyribonucleoside trifosfaat op
de templaat
De twee strengen van DNA lopen in tegenovergestelde richtingen. Aangezien DNA streng synthese altijd
van de 5’ naar de 3’ richting loopt, moeten er speciale mechanismen komen om de streng die de andere
kant op loopt te accommoderen. Daarnaast moeten de twee strengen uit elkaar woorden gehaald
omdat de basen aan de binnenkant van de helix zitten.
DNA polymerase
1. katalyseert de vorming van polynucleotide ketens. Elk binnenkomend nucleoside trifosfaat
vormt eerst een base paar met een base van de templaat. Alleen dan koppelt DNA polymerase
de binnenkomende base met de zijn voorganger in de keten. Template-gestuurd enzym. De
polymerase katalyseert de nucleofiele aanval door de 3’-OH groep van de polynucleotide
keten, aan de α fosforylgroep van het nucleosidetrifosfaat dat moet worden toegevoegd aan de
keten.
2. Primer nodig met vrije 3’ OH groep die zich al als basenpaar op template
gekoppeld bevindt.
3. Er zijn 2 metaalionen nodig voor activiteit van DNA polymerase. Een ion bindt
dNTP en de 3’OH groep van de primer. Het andere ion bindt alleen met dNTP.
De 2 metaal ionen worden met elkaar verbonden door de carboxylaat groepen
van twee aspartaat residuen in het domein van de polymerase.
Metaal ion gebonden aan primer activeert de 3’OH groep van de primer en zorgt
er voor dat de fosforyl groep van dNTP wordt aangevallen. De twee metaal ionen
helpen om de min lading van de pentacoordinate toestand te stabiliseren. Een
metaal ion gebonden aan dNTP stabiliseertde min lading van pyrofosfaat product. Door de
veranderde lading verdeling wordt de PP-OH van de fosfaat aan de nieuwe base gesplitst en zit
de 3’OH aan de fosfaat zitten.
Waarom de goede vorm zo belangrijk is:
 DNA polymerase doneert 2 H-bruggen van residuen in de minor groeve aan de base paren.
Waterstofbrug acceptoren zijn aanwezig in de zelfde posities voor alle basen paren in de actieve
kant.
 DNA polymerase sluit rondom het inkomend dNTP af. De binding van een dNTP in de actieve site
van DNA polymerase veroorzaakt een conformatie verandering  thight pocket.
RNA start de synthese van DNA. RNA polymerase (primase) synthetiseert een kort stukje van RNA (5
nucleotiden) complementair t.o.v. streng DNA. RNA polymerase heeft namelijk geen primer nodig. Als
DNA is gesynthetiseerd wordt het stukje RNA weer verwijdert door hydrolyse.
Een streng van DNA wordt doorlopend gemaakt en de andere wordt gesynthetiseerd in fragmenten.
De twee strengen van het oude DNA dienen als templates voor de synthese
van nieuw DNA. De replicatie vork haalt de DNA dubbel helix uit elkaar voor
DNA synthese. DNA polymerase kan alleen DNA synthetiseren in 5’  3’
richting. De lagging streng wordt gevormd uit Okazaki fragmenten en de
leading streng wordt gevormd zonder interrupties (5’3’)
Voor verbinden van de Okazaki fragmenten is een enzym nodig dat het samen
komen van twee DNA einden katalyseert. Dit enzym heet DNA ligase.
Uit elkaar halen van de DNA strengen
Helicase maakt gebruik van de energie van ATP hydrolyse om de strengen uit elkaar te halen (heeft dus
ATP nodig). Helicase bestaat uit zes subunits die een ringstructuur vormen.
Als een DNA streng door helicase gaat, bindt de enkele streng aan loops van twee
subunits, een waar ATP is gebonden en de ander waar ADP +Pi is gebonden.
Door de streng door helicase te brengen ondergaat helicase een conformatie
verandering.
Super coiling (oprollen)
Negatieve super coiling = rechtshandige super helix. (komt door ontvouwen van DNA)
Positieve super coiling = linkshandige super helix (maakt het moeilijker om de strengen van DNA uit
elkaar te halen.
Topoisomerase  afvouwen van DNA
TYPE I
Ontspant de helix (kost geen energie) en knipt 1 van de DNA ketens.
Als eerste bind het DNA molecuul in het gat van topoisomerase.
De OH groep van tyrosine valt de fosforyl groep van een DNA
streng aan om een fosfodieester te vormen tussen enzym en
DNA. Waarna een 5’OH groep loslaat van DNA (knippen van
DNA).
Omdat het ene stuk vast zit aan Tyr kan DNA over het
overgebleven stuk draaien (vouwt supercoil af)
TYPE II
spant de helix (kost ATP) en knipt 2 van de DNA ketens van de dubbele helix.
Het begint met het binden van een dubbele helix (G
segment) aan het enzym. Elke streng is naast een
tyrosine residu gepositioneerd. Dan bindt het
complex nog een dubbele helix(T-segment). En elk
monomeer van het enzym heeft een domein dat
een ATP bindt. Veroorzaakt -> conformatie
verandering waarbij de twee ATP gebonden
domeinen naar elkaar toe worden gebracht. Als
deze domeinen echt dicht bij elkaar zijn valt het T
segment, wat er voor zorgt dat het G segment in
twee splitst.
28.2 DNA replicatie is hoog gecoördineerd
De leading en de lagging strengen worden gesynthetiseerd bij de replicatie vork.
1. DNA polymerase III begint de synthese van de leading steng beginnend vanaf de RNA primer
gevormd door primase.
2. Het duplex DNA voor de polymerase wordt ontvouwen door helicase. Het DNA blijft
ongevouwen doordat er SSB eiwitten aan de strengen gaan zitten, zodat de strengen als
templates kunnen dienen.
3. Leading strengt wordt gewoon continue gesynthetiseerd door DNA polymerase III
4. Topoisomerase II zorgt voor rechtshandige negatieve supercoils om de structuur oké te houden.
5. Lagging streng  okazaki fragmenten  DNA ligase
DNA synthese in eukaryoten
 2 polymerase nodig om de replicatie te doen.
Telomeren
Tijdens de celdeling wordt het DNA via replicatie verdubbeld. Het enzym DNA-polymerase kan echter
het eind van het chromosoom niet verdubbelen, omdat het voortijdig van het DNA afvalt. Hierdoor
worden bij elke celdeling de chromosomen korter. Het enzym telomerase kan een telomeer weer langer
maken. Telomerase bestaat uit een enzymatisch deel en een RNA deel, de complementaire sequentie.
Telomeren zijn unieke structuren aan de uiteinden van lineaire chromosomen. Daarnaast worden
telomeren gerepliceerd door telomerase, een polymerase dat zijn eigen RNA template heeft.
Een telomeer bevat informatie dat nodig is om telomeren te vormen en die sequentie steeds te
herhalen.
28.3 DNA schade kan worden hersteld
Er zijn verschillende systemen om DNA schade te herstellen”
1. Herkennen van de verkeerde base
2. Verwijderen van de verkeerde base
3. Herstellen van het resulterende gat met DNA polymerase en DNA ligase
DNA polymerase heeft een domein genaamd ‘exonuclease’.
De verkeerd toegevoegde base gaat ‘wapperen’ doordat de
waterstofbruggen met de base aan de overkant
‘mismatched’ zijn. Dat ‘wapperen’ wordt herkend door
exonuclease. De base flipt in het hol van de exonuclease en
knipt de base er uit. Daarna flipt de streng weer terug.
Mismatch herstel in E.coli. Een eiwit MutS herkend fout base paar. MutH gaat vast zitten aan de
omgeving van de verkeerde base. Met exonuclease1 wordt stuk DNA geknipt. Dan komt DNA
polymerase III en maakt het gat dicht.
28.4 DNA recombinatie is belangrijk voor replicatie, herstel etc.
Recombinatie is bijvoorbeeld belangrijk wanneer:
1. De replicatie stopt. Door recombinatie kan het proces weer worden gereset, zodat het doorgaat.
2. Sommige dubbelstrengs ‘pauzes’ in DNA kunnen worden hersteld door recombinatie
Holiday junction zijn vier DNA strengen die door middel van kruisvormig bij elkaar komen.
Nucleotiden en nucleïnezuren. Een nucleotide is opgebouwd uit
een fosfaateenheid, een suikereenheid en een base eenheid.
Een suikereenheid is de pentose suiker met 5 koolstofatomen.
Op 1’ komt de base te zitten. Met dubbele OH aan de onderkant
is Ribose en één OH aan de onderkant is 2-Deoxyribose. De
eenheid van de suiker met de base noemen we de nucleoside.
Verder zitten aan de basis nog een fosfaat groep of aan de 3’of
aan de 5’. Bij ATP zit de fosfaatgroep bijvoorbeeld aan de 5’
positie.
De nucleoside met de fosfaat groep noem je de nucleotide. De koolstofatomen in de base zijn zonder
accent en de koolstofatomen in de suiker met accent. Deze noemen we bijvoorbeeld 5’- nucleotide,
waardoor je weet dat er een fosfaat groep aan de 5’ positie zit. We kennen 5 verschillende basen, 4 in
het DNA en 4 in RNA met 3 overlappingen. Deze zijn opgebouwd vanuit twee skelet moleculen de
purine’s en de pyrmidine’s.
Bij purine zit de (deoxy)ribose aan de 9 positie. Uit purine is adenine (A) en guanine (G) opgebouwd. Bij
adenine zit een NH2 op de 6 positie en bij guanine een O op de 6 positie en een NH2 op de 3 positie.
Adenine heeft op de 6 positie dus een waterstofbrugdonor en op de 1 positie een
waterstofbrugacceptor. Guanine heeft op de 1 en 2 positie een waterstofbrugdonor en op de 6 positie
een waterstofbrugacceptor. Bij pyrimidine zit de (deoxy)ribose
aan de 1 positie. Uit pyrimidine wordt cytosine (C), uracil (U) en
thymine (T) gevormd. Cytosine heeft op de 4 positie een NH2 en
op positie 2 een O groep. Uracil heeft op positie 2 en 4 een O
zitten en thymine heeft op positie 2 en 4 een O zitten en op
positie 5 een methyl groep (CH3). Cytosine heeft op positie 2 en 3
een waterstofbrugacceptor en op positie 4 een
waterstofbrugdonor. Uracil heeft op positie (2) en 4 een
waterstofbrugacceptor en op positie 3 een waterstofbrugdonor.
Thymine heeft op positie (2) en 4 een waterstofbrugacceptor en
op 3 een waterstofbrugdonor.
Thymine lijkt dus heel erg op uracil. Je vindt uracil alleen in RNA en thymine alleen in DNA, de andere
basen vindt je bij beiden. Daar waar eiwitten uit 20 verschillende aminozuren zijn opgebouwd is
DNA/RNA uit 5 verschillende nucleïnezuren opgebouwd. In DNA zitten die nucleïnezuren aan elkaar vast
geknoopt in een lineaire keten van telkens de suiker met base en een fosfaat groep ertussen. Een fosfaat
groep zit aan twee suikers vast op de 3’ en 5’ positie als een esther (fosforesther verbindingen).
De bases zitten dan aan de suiker vast gekoppeld op de 1’ positie, zie goed wat het verschil met DNA (H)
en RNA (OH) is. Bij nucleïnezuren schrijven we altijd van de 5’ kant naar de 3’ kant toe. Als we het over
een DNA sequentie hebben, geven we dat gewoon aan met een letter A, G, C, T, U. De binding aan de 1’
van de suiker door de base noem je de β-glycosidic linkage. Dit zijn de nucleosides. dA- DNA A->
deoxyadenosine.
Met fosfaat groepen noem je het nucleotiden. De 5’ ATP betekent drie fosfaatgroepen (TriPhosphate)
aan de 5’ positie met een adenine base. 3’-dGMP betekent één fosfaatgroep (MonoPhosphate) op de 3’
positie met een G base van het DNA.
Op basis van deze bouwstenen kunnen ook medicijnen worden ontwikkeld. AZT is bijvoorbeeld
ontwikkeld uit een suiker groep met base thymide, remt de groei van HIV door het enzym reversetransciptase te blokkeren. Net als acyclovir op basis van guanine, tegen Herpes.
Β-mercapto purine zorgt ervoor dat een bepaalde base niet meer wordt gemaakt. Wordt als chemokuur
gebruikt is dus heel aselectief.
DNA is een dubbel helix, twee lineaire polymeren gaan een interactie met elkaar aan door middel van
waterstofbruggen. G-C met beide 2 donoren en 1 acceptor, kunnen dus nooit aan A of T binden. En A en
T hebben beide 1 donor en 1 acceptor. De afstand tussen de basen is ideaal.
DNA is een rechts draaiende helix, verwar niet met de α helix. Belangrijke kenmerken zijn: twee helicale
polymeren in elkaar gedraaid die in tegengestelde richting lopen (de een van 5’ naar 3’ en de andere van
3’ naar 5’). De suikerfosfaat groepen (de backbone) zitten aan de buitenkant van de helix, dit zijn ook
polaire groepen en zijn dus in contact met water als ze aan de buitenkant zitten. Hierdoor zitten ze ook
zo ver mogelijk van elkaar af zodat de ladingen niet interfereren met elkaar. De basen zitten in het
midden, die stapelen op elkaar π-π-stacking. Hierdoor krijg je een hydrofobe omgeving midden in de
helix, dit leidt tot de vorming van waterstofbruggen.
De structuur van de DNA dubbel helix hebben twee groeven, waar eiwitten/enzymen aan kunnen
vastbinden. Je hebt een grote en klein groeve, deze worden bepaald door de optimale afstand van de
ladingen tussen elkaar. Zie de afbeelding hieronder met de basen paren en de lading.
DNA heeft aromatische basen die licht kunnen absorberen, afhankelijk van of ze gepaard zijn als enkele
of dubbele helix hebben ze verschillende absorptie waarden en krijg je deze grafiek.
Als je de temperatuur verhoogt kunnen de waterstofbruggen verbroken worden en de dubbele helix los
laten van elkaar. Een DNA met veel G-C base paren heeft een hoog smeltpunt en DNA met veel A-T base
paren heeft een lager smeltpunt. Bij de B-vorm van DNA is een helix vorm van het DNA waarbij de base
rechthoekig staat op de backbone. Bij de A-vorm zit er een gat in de DNA helix. Of de Z-DNA waarbij de
helix omgedraaid loopt als een links draaiende helix.
Ieder cel in ons lichaam bevat twee meter DNA. Ons DNA is lineair met een begin en een uiteinde. Het
DNA van bacteriën is circulair en kan dus blijven delen. Ons lineaire DNA wordt steeds een stukje kleiner
na elke deling. DNA moet dus opvouwen om te passen in een cel; supercoiled DNA. Ons DNA heeft
ongeveer één draaiing per 10 basen. Je kan een gedeelte van die dubbel helix ontvouwen, dan krijg je
een bepaalde spanning op het DNA te staan: het DNA vouwt dan zichzelf weer op onder deze spanning
(denk aan de telefoonkabel).
Herhaling: denk aan het telefoonkabel experiment! Negatief coilen is klein beetje ontvouwen en dan
heel snel in elkaar vouwen, het DNA blijft nu nog wel toegankelijk. Positief coilen is het in elkaar vouwen
van het DNA, het DNA is niet toegankelijk meer. Met supercoiling kan je het DNA compacter maken.
Twee enzymen spelen in het vouwen van het DNA een belangrijke rol. Topoisomerase 1 (ontspant de
helix) en topoisomerase 2 (spant de helix). Topoisomerase 1 kost geen energie en topoisomerase 2 kost
energie in de vorm van ATP. Topoisomerase 1 doet ontvouwen door een 1 keten te knippen en
topoisomerase 2 brengt spanning door beide DNA ketens te knippen. Topoisomerase 1 pakt het DNA
beet en knipt een van de ketens open, daardoor kan de andere keten door het gat heen en kan hij door
te veel draaien weg nemen: aan het einde plakt hij ze weer aan elkaar. Topoisomerase 1 heeft een
actieve site met Tyr
Topoisomerase 2 breekt spanning in het systeem, gaat super coilen. Daar is energie voor nodig; ATP. Het
Cyclisch DNA met negatieve backbone vouwt zich om de positieve histone eiwitten. Door het een keer
er om heen te draaien krijg je een negatieve supercoil met een positieve supercoil als tegenhanger. Om
deze positieve super coil weg te halen, topoisomerase knipt het DNA dan in tweeën en brengt het
segment naar de andere kant zodat hij weer relax is. Dit zijn topoisomeren van het DNA.
Het DNA segment bindt aan het enzym, vervolgens binden er twee ATP moleculen hierdoor wordt de
affiniteit met het tweede stuk DNA verhoogt, het enzym ondergaat daardoor een conformatie
verandering waarbij 2 fosforesther bindingen verbroken worden. Het G(ate) segment wordt uit elkaar
getrokken, een stuk wordt erdoorheen geduwd. Vervolgens wordt het DNA weer aan elkaar geplakt.
Deze topoisomerase coilen niet alleen het DNA maar maken het ook beter toegankelijk. Er zijn
medicijnen in de weeg die deze enzymen inhibiteren. Deze inhibitoren werken echter anders, ze
stabiliseren het complex van het DNA met het enzym, hierdoor werkt het enzym niet goed. De antibacteriale topoisomerase inhibitoren binden specifiek aan bacteriën. DNA replicatie is het kopiëren van
één DNA streng (template) en hierbij een nieuwe streng te maken. Aan de ene kant heb je een DNAtemplate en aan de andere kant een DNA streng wat gesynthetiseerd moet worden. Er wordt altijd
gekopieerd van 5’ naar 3’. Het template loopt dan van 3’ en 5’.
Je kan niet van het begin van het DNA gaan kopiëren, je moet ergens midden in het DNA beginnen. De
DNA polymerase begint altijd bij een stukje mRNA; de primer strand. DNA polymerase is het enzym wat
het DNA kopieert. DNA wordt altijd verlengd aan de 3’ van de ribose; van 5’ naar 3’. Het verlies van de
pyrofosfaat eenheid geeft de energie voor de reactie. DNA primase synthetiseert een stukje RNA primer.
RNA heeft geen primers nodig om zich te vermenigvuldigen. Een stukje RNA primer geeft het startpunt
aan, vervolgens wordt er DNA gesynthetiseerd vanaf dat punt. Dan wordt de RNA primer er weer af
gebroken en vervangen door DNA, in de tegengestelde richting gekopieerd met okazaki fragmenten.
Maar DNA is dubbelstrengs en DNA polymerase loopt alleen van de 5’ naar de 3’ richting. De normale
replicatie van de 5’ naar de 3’ richting noem je de leading strand. De replicatie van de 3’ naar de 5’ noem
je de lagging strand. Deze wordt gevormd in (Okazaki) fragmenten waarbij je telkens een RNA primer
nodig hebt en in fragmenten gekopieerd.
DNA ligase plakken korte stukjes DNA aan elkaar vast, gebruikt ATP als energiebron hiervoor.
Waar begint een stuk DNA met repliceren; op de origin of replication. Dit is een bepaalde sequentie van
base paren.
Mensen zijn door hun kleine snelheid van bp/s niet zo vatbaar voor mutaties. DNA helicase gaat over het
DNA, er kan maar één keten door de ring heen en de andere wordt aan de kant geduwd. Heeft ATP
nodig voor conformatie verandering.
Helicase maakt het DNA open, de sliding clamp houdt het DNA op zijn plaats. Een groot complex van
eiwitten kopiëren het DNA. De lagging strand gaat als een trombone waarbij telkens een stukje omhoog
wordt geschoven om een nieuw Okazaki fragment te kunnen maken.
College 10:
29.1 RNA synthese en processing:
RNA synthese wordt gekatalyseerd door RNA polymerase.
Functies van RNA polymerase in de synthese:
1. Zoeken op DNA voor promotor sites
2. De dubbele helix ontvouwen, om enkel strengs DNA templates te verkrijgen, waardoor deze
makkelijker kunnen worden uitgelezen.
3. Selecteert de correcte rNTP en katalyseert de fosfodieester binding. Dit gebeurt heel vaak op
een rij, als RNA polymerase over DNA template heen loopt.
4. Ze herkennen het eind signaal dat bepaald wanneer de transcriptie eindigt.
5. Interactie met transcriptie factoren voor de regulatie van snelheid en frequentie van de RNA
synthese.
Het proces van RNA synthese : initiatie, elongatie, terminatie
29.2 RNA polymerase katalyseert de transcriptie
RNA polymerase heeft nodig:
 Templaat: DNA
 Vier nucleotiden (ATP,GTP,CTP,UTP)
 Magnesium (coördineerd de active site)
De katalytische kant van RNA polymerase bevat twee Magnesium ionen. Een ion zit sterk gebonden aan
het enzym en de ander zit vast aan de NTP. Tijdens de synthese verlaat dit 2de ion samen met PPi. Hierbij
zijn er 3 aspartaat residuen die de Magnesium ionen binden.
Coderende streng heeft dezelfde sequentie als het RNA transcript , die complementair zijn aan de
sequentie van de Template steng.
 RNA synthese kan zonder primer beginnen! Maar begint vaak na een A of G.
Initiatie
RNA polymerase bindt aan de promotor sites op het DNA template om de transcriptie te beginnen.
Het σ sub unit van het holoenzym helpt mee met het zoeken naar deze promotorsites. Het sub unit
bindt dan aan de 2 promotorsites en als het complex stabiel is laat het σ sub unit los van het enzym.
 Herkenning: TATA box  -10 sequentie.
(prokaryoten)
TTGACA  -35 sequentie.
Beide 6 basen lang
 Sterkte van de promotor: Reguleert de transcriptie. Is gen afhankelijk.
Daarna: dubbele DNA helix  ontvouwen DNA strengen. Hierbij helpt RNA Polymerase (geen
supercoiling) en hierna leest RNA polymerase de rest van het DNA af.
Elongatie
De elongatie fase van de RNA synthese begint met de vorming van een fosfodiester binding. Hierna kan
dit lang worden herhaald.
Na de initiatie, verlengt RNA polymerase de nucleïne zuur keten. NTP bind in de actieve site van RNA
polymerase, naast de groeiende RNA keten. Het inkomende NTP vormt een Watson-Crick base paar met
de template streng. De 3’ OH groep van de groeiende RNA keten die gecoördineerd wordt door Mg2+
valt de fosforyl groep aan en vormt een nieuwe binding. Hierna moet de RNA-DNA hybride verplaatsen
zodat het in RNA polymerase op een goede positie staat t.o.v. nieuw binnenkomend NTP. Dit kan ook in
de andere richting dan in de richting van de verlenging : backtracking. Dit is minder favoriet, maar als er
een fout nucleotide aan komt te zitten, kan daarmee de verbinding worden verbroken.
Terminatie
De terminatie is genetisch gecodeerd.
Voor prokaryoten :
1. Als de streng veel G’s en C’s bevat kan het een dubbele helix vormen met zichzelf in de vorm van een
haarspeld. Met een loop dat ook veel G,C. Na de haarspeld volgt een stuk met veel U’s.
2. Rho eiwit helpt om de transcriptie te stoppen. Het loopt over de RNA keten en plakt daar waar RNA
polymerase moet stoppen.
29.3 Transcriptie in eukaryoten
Gen expressie wordt beïnvloed door 3 belangrijke eigenschappen van eukaryoten:
1. Het kern membraan. In eukaryoten vindt de transcriptie en de translatie in andere
compartimenten van de cel plaats. Transcriptie vind plaats in de kern en translatie buiten de
kern in het cytoplasma.
2. Complex transcriptionele Regulatie.
3. RNA processing.
Drie typen RNA polymerase synthetiseren RNA in eukaryoten
 RNA polymerase I
Synthetiseerd rRNA
Promotor: bovenstroom promotor element, ribosomale initiator.
 RNA polymerase II
Synthetiseerd precursors van mRNA
Promotor = TATA box en een initiator element of een benedenstroom promotor element(DPE)
De TATA box wordt gevonden tussen de -30 en – 100.
Initiator element tussen de -3 en +5.
DPE tussen +28 en + 32
 Er is ook nog vaak een CAAT box.
 RNA polymerase III
Synthetiseerd tRNA, rRNA
Promotor = benedenstroom promotor element en initiator element.
Transcriptie factoren
Zorgt voor meer of minder transcriptie van een Gen.
RNA polymerase wordt geholpen bij de promotor site door een aantal transcriptiefactoren. Deze vallen
samen onder de TFII.
 Bij TATA box promotor site, moet deze worden herkend : TFIID complex zorgt er voor dat een
eiwit (TBP) daar bindt. Dus TBP gebonden aan TATA box is hart van het initiatie complex.
29.4 De transcriptie producten in eukaryoten polymerase.
 RNA polymerase I produceert drie rRNAs, namelijk de 18 S , 28 S en de 5.8S rRNA.
Om de precursor rRNA op te splitsen in die 3 rRNA delen is de laatste stap van rRNA processing.
 RNA polymerase III produceert tRNA
Het product van RNA polymerase II , pre-mRNA transcript, heeft een 5’cap en 3’poly(A) staart nodig.
Eukaryoten primaire transcripten worden geplakt door een endonuclease die de plaksequentie genaamd
AAUAAA herkend. De poly(A) staart wordt hierna er aangeplakt voor de stabiliteit. Hoe langer poly(A) ,
hoe vaker mRNA kan worden omgezet.
Sequenties aan de einden van introns specificeren de splicing kanten in mRNA precursors.
Intron
 De intron begint met GU en eindigt met AG
 Consensus sequentie (veel voorkomend) aan de 5’ kant : AGGUAAGU.
 Aan 3’einde van het intron is de consensus sequentie: 10 pyrimidines (U of C), gevolgd door een
willekeurige base en eindigend met AG.  (py)n – N – AG.
 Introns hebben belangrijke interne kant branch site . Gevolg: exon-fosfaatbinding laat los. De
3’OH van exon 1 bindt met fosfaat van exon 2.
Splicing bestaat uit 2 transesterficatie reacties
1. Een Loop in het RNA waardoor je een exon in
upperstream hebt en een exon in downstream.
2. Splicing begint met het plakken van de fosfodieester
binding tussen exon 1 en het 5’ einde van een intron.
3. De branch site van het intron heeft een 2’ OH groep die
aanvalt op fosfoester aan het 5’eind van het intron. 
lariat intermediar.
4. Het 3’OH einde van exon 1 valt dan aan op de
fosfodieester binding tussen het intron en exon 2.
Hierdoor komen exon 1 en exon 2 samen en het intron
wordt losgelaten in lariat vorm.
De kern van de cel bevat veel typen snRNA. U1 t/m U6 zijn belangrijk voor splicing proces.
Zo bindt snRNA aan einde van exon 1 en exon 2 en brengen deze twee bij elkaar.
Splicosoom helpt bij het vormen van de loop.
Pre mRNA  capping enzymen, splicing, poly(A) plakken door endonuclease.
Alternatieve splicing
Het vindt plaats bij eukaryoten, waarbij door splicingvariatie van het pre-mRNA verschillende mRNAmoleculen gevormd worden en daardoor verschillende proteïnen ontstaan.
29.5 Het ontdekken van katalytisch RNA
Onderzoek toonde aan dat sommige RNA moleculen, welke de groep I intron bevatten, zelf-splicing
kunnen ondergaan in afwezigheid van het eiwit. Conclusie : Ribosoom = ribozyme.
DNA replicatie en RNA transciptie. De synthese van de leading strand gaat van de 5’ naar 3’ richting en
gaat ‘normaal’. De lagging strang heeft een probleem wat deze moet van de 3’ naar de 5’, daarvoor
worden de Okazaki fragmenten gebruikt. De groene bolletjes zijn de eiwitten die de single strand DNA
beschermen zodat het niet beschadigd kan worden door enzymen. Hoe werkt deze polymerase nu? Je
hebt een soort hand waar de single strand DNA door heen gaat. De helicase trekt het dus uit elkaar.
Telkens worden er enkele nucleotiden aan toegevoegd, terwijl het erdoor schuift. De reactie gaat behulp
van nucleotrifosfaten. Waarbij er een fosfaat gebruikt wordt voor de binding met het DNA, en het vrij
komen van pyrofosfaat(door oxidatie) is de drijvende kracht van deze reactie. Van positie naar positie.
De palm wordt gevormd door βsheets een vlak oppervlakte waar de nucleotide kan binden. Er vormt het
nucleotidetrifosfaat een waterstofbrug met een vrije DNA base. Past de enkele nucleoside bij de keten
dan vindt er een conformatie plaats en veranderen de vingers.
De hand sluit dan en ‘duwt’ de boel bij elkaar. Proofreading is het kijken of de base past op de
complementaire base. Fouten verwacht op verschil sterkte goede tegenover de foute interactie tussen
basen 1 per 104. Na proofreading 1 op de 1010. Er zijn twee mechanisme om deze fouten te herstellen.
De een door DNA polymerase zelf en de andere door enzymen na replicatie. Het DNA polymerase
herkent de foute base, en die polymerase heeft een additioneel domein; het exo nuclease. Deze
hydrolyseert fosforester bindingen (van een nucleïnezuur). De groeiende keten wordt naar de exo
nuclease site gebracht waar het foute gedeelte wordt afgeknipt. Hierdoor krijg je foutpercentage van 1
op de 108.
Het tweede mechanisme zijn enzymen die herkennen wanneer de helix geen goede structuur heeft.
RNA is een manier om de informatie in het DNA om te zetten naar een makkelijk af te lezen streng wat
eiwitten kan vormen. mRNA is de gekopieerde RNA streng van DNA, het mRNA gaat het ribosoom in en
daar wordt het omgezet in eiwitten. tRNA is het RNA wat het mRNA herkent en het goede stukje eiwit
eraan vast zet.
Transciptie van DNA naar RNA:
Het mRNA maakt een kopie van de coderende keten van de templaat keten (3’naar 5’). mRNA wordt
gekopieerd van de 5’ naar de 3’ richting. Bij RNA synthese heb je geen primer nodig, bij DNA synthese
wel. Een RNA polymerase bindt aan het DNA en trekt die helix uit elkaar, zodat je twee vrije strengen
krijgt. Het enzym zorgt zowel voor het uitelkaar trekken van het DNA als het katalyseren van de reactie,.
RNA polymerase is verantwoordelijk voor de initiatie, elongatie en terminatie van de RNA synthese. Dit
soort polymerase zijn ook belangrijke medicijn doelwitten. Als je er bijvoorbeeld voor zorgt dat het RNA
polymerase niet meer werkt, wordt er geen eiwitten meer aangemaakt en sterft de cel uit. De
paddenstoel groene knolamaniet gebruikt dit als gif. De bacteriële RNA polymerase verschilt zoveel van
het eucaryotische RNA polymerase, dat je speciale medicijnen kan gebruiken (zoals rifampidcine) kan
gebruiken die alleen de bacteriële RNA polymerase aanvalt.
RNA polymerase begint dus zonder primer en begint meteen. Bij DNA polymerase begint hij wel bij een
primer (een A of G). Bij RNA polymerase blijft er wel een trifosfaat groep aan de 5 positie zitten. Schrijf
RNA altijd van de 5’ naar de 3’ richting. De coderende streng wordt 1 op 1 overgezet in het mRNA maar
dat dat gebeurt met behulp van de template streng. mRNA zal dus 1 op 1 overeenkomen met de
coderende streng van DNA alleen waar een T staat is er een U.
De transcriptie bubbel, je hebt een even gesmolten DNA in deze bubbel. In dit gesmolten DNA liggen de
basen vrij voor herkenning en voor kopiering. Dat bovenste metaal ion coördineert aan de OH groep om
hem goed te positioneren. De onderste metaal ion combineert aan de zuurstof van de fosfaatgroepen
om hem reactiever te maken (maakt hem elektrofieler).
Meerdere RNA polymerasen kunnen tegelijkertijd een stuk DNA uitlezen. Al die staartjes die je ziet op de
foto, zijn RNA polymerasen die uit het DNA “groeien”. Je ziet ook duidelijk dat het RNA polymerase
groeit naarmate het al langer is afgelezen/verder is.
Niet al het DNA(junk DNA) moet gekopieerd worden en sommige genen moeten helemaal niet aangezet
worden. Dat gaat doormiddel van codonsequenties die herkent worden door de polymerase. Het RNA
polymerase bindt op het DNA op bepaalde promotor sequenties, dat zijn de herkennings punten van het
DNA: dit stukje moet omgezet worden naar mRNA. Deze sequenties geven ook aan hoelang hij moet
aflezen begint altijd met een A. De specifieke sequentie bepaalt hoe goed het RNA polymerase bindt aan
het DNA, hoe beter hij bindt hoe langer hij afleest en vica versa (hoe betere affiniteit voor RNA
polymerase hoe langer hij afleest). Deze promotor sequenties bevatten vaak veel Adenines en
Thymines. De TATAAT box en de TTGACA zijn twee herkeningssites die herkent worden door het RNA
polymerase, hier op respectievelijk -10 en -35 vanaf base 1 van het DNA. Dit doet hij doormiddel van
een σ factor. Die σ factor helpt bij het herkennen van promotor sequenties. De σ factor herkent de sites
en het complex kan dan binden, verhoogt de affiniteit van het DNA voor de RNA polymerase.
Vervolgens trekt de RNA polymerase de DNA keten uitelkaar. Het begin stukje is altijd belangrijk, want
een klein stukje RNA is nog heel zwak in structuur. De σ factor zorgt dat het begin stukje nog uit elkaar
getrokken wordt. Als het RNA molecuul sterk genoeg, wordt de σ factor uitgestoten.
Eukrayoten hebben twee van die promotors de TATAAT box en TTGACA box. Bacteriën hebben slechts 1
RNA polymerase, eukaryoten hebben drie verschillende RNA polymerasen. RNA polymerase 1
synthetiseert het ribosomale RNA. RNA polymerase 2 synthetiseert het mRNA en RNA polymerase 3
synthetiseert het tRNA. RNA polymerase heeft additionele eiwitten nodig. Die binden allemaal als
complex samen op het DNA en hebben hun eigen functie. Eiwit D zorgt voor de herkenning van de
TATAAA box. Eiwitten a en B zorgen voor binding van het RNA polymerase aan de DNA streng. Eiwit h
zorgt ervoor dat de strengen uit elkaar gaan en het uiteinde gefosforliseerd wordt hierdoor wordt het
enzym aangezet. Eukarytoten moeten differtieren en prokaryoten alleen maar vermigvuldigen. Daar
hebben eukaryoten extra veel eiwitten.
Het stoppen van RNA polymerase kan op verschillende manieren gaan. Het kan gaan via loops of via het
ρ eiwit. Het stoppen van RNA polymerase noem je ook wel terminatie. De RNA polymerase gaat door
totdat er een bepaalde sequentie gesynthetiseerd wordt die rijk is in Guanine en Cytosine en vervolgens
rijkt in Uracil. Vervolgens maken de G’s en C’s een loop met waterstofbruggen tussen elkaar gevolgd
door een sequentie van U’s. De loop pauzeert de helix als het ware doordat het sterische hindering
inbrengt. De uracil sequenties zorgen er voor dat de dubbel helix te zwak wordt, daardoor uit elkaar valt
en dat het DNA weer met zichzelf gaat dimiriseren. Dat betekent dat zowel de start als de terminatie
sequenties gecodeerd zijn in het DNA. Bij ρ eiwit terminatie leest het RNA polymerase het DNA af totdat
ze een sequentie leest dat ervoor zorgt dat het ρ eiwit over het RNA gaat lopen en het RNA uit de
transcriptie bubbel trekt.
RNA modificaties:
Het naakte mRNA moet nog gemodificeerd worden. Bij eukaryoten is dit meer dan bij de prokaryoten,
alweer omdat eucaryotische cellen moeten differentiëren. Bij prokaryoten vindt dit plaats in het
cytoplasma, bij eukaryoten ook maar buiten de celkern. Hierdoor kan er betere aanpassingen worden
gemaakt.
Een stuk mRNA wordt geprocesseerd door modificatie aan het 5’ en 3’ uiteinde. Dit is om te zorgen dat
het mRNA stabieler wordt en beschermd word. Virussen zijn vaak op RNA gebaseerd en je lichaam heeft
daar afweermechanisme tegen om RNA af te breken wat los rond ‘loopt’.
Eerst het 5’ uiteinde. Het zwarte gedeelte rechts is het eerste nucleotide
wat ingebouwd wordt in de RNA synthese. De trifosfaateenheid die daar aan
vast zit wordt gemodificeerd en wordt omgezet tot een difosfaateenheid en
vervolgens gekoppeld met het paarse molecuul (methylguanilaat). Daardoor wordt hij niet meer
herkend door nuclease en krijg je een stabieler uiteinde. Tevens wordt vaak de eerste OH groepen van
het RNA gemethyleerd om de activiteit van de OH groep in te temmen.
Aan het 3’ wordt een poly A sequentie toegevoegd, kunnen wel duizend adenines zijn die aan het RNA
geplakt worden. Die poly A sequentie is niet gecodeerd door het DNA dus door enzymen er aan geplakt
in de nucleus. Stukje wordt door geknipt en door poly A polymerase wordt alle A’s erin gevoegd. Uit een
stuk mRNA kan meerdere eiwitten gesynthetiseerd worden.
Geen enkel gen is lineair gecodeerd op het mRNA. Intronen zijn stukken mRNA die uit het mRNA moeten
gehaald worden waardoor je alleen de ‘blauwe’ delen over hebt die codeert met het gewenste eiwit.
Op die manier kan de cel zich nog differentiëren als hij wilt en meerdere eiwitten uit een mRNA maken.
mRNA splicing is het aan elkaar plakken van de introns.
Een mRNA streng kan voor meerdere eiwitten coderen als je selectief ‘plakt’. Alleen de exonen coderen
voor het eiwit. Het plakken kan ook fout gaan, bij borstkanker gebeurt dit (BRCA1) waarbij er verkeert
gespliced wordt in cellen.
Antilichaam hangt aan de buiten kant van de cel en herkent antigenen. Als hij hem herkent gaat hij
antigenen produceren. Door splicing kan je antilichamen aan de celwand vast laten zitten of ze los
buiten de cel te laten.
College 11:
30.1 Eiwit synthese heeft de translatie van nucleotide sequenties  aminozuur nodig
tRNA
Een aminozuur zit verbonden aan een specifiek tRNA molecuul dat het codon kan herkennen.
tRNA dient als adapter(bewerker) molecuul dat bind aan een specifiek codon en brengt daarbij een
aminozuur die moet worden opgenomen in de polynucleotide keten.
*tRNA moleculen kunnen soms meer dan een codon herkennen.
1. Aminozuur geactiveerd  2. Aminozuur op tRNA  3. tRNA brengt aminozuur naar het ribosoom.
Overeenkomsten van alle tRNAs
1. Elke tRNA is een enkele keten dat tussen de 73 en 93 ribonucleotiden bevat.
2. Ze bevatten ook veel ongewone basen (vaak afgeleiden van A,U,C,G door modificaties)
3. Het molecuul is L vormig.
4. De helft van de nucleotiden in tRNA vormt basen paren om dubbele helices te vormen (A-vorm).
5. Het 5’ einde van tRNA is gefosforyleerd. Meestal is het 5’einde residu pG
6. Geactiveerd aminozuur is verbonden met de 3’ OH. 3’ uiteinde is CCA + Az
7. De anticodon loop. Het anticodon en het aminozuur zitten ver van elkaar af.
2 algemene dingen over codon –anticodon interacties
 Codons waar bij de eerste twee basen verschillen moeten door verschillende tRNA’s worden
herkend. Bijvoorbeeld UUA en CUA ook al coderen ze beide leucine.
 De eerste base van een anticodon bepaald hoeveel codons een tRNA molecuul kan herkennen.
C,A (1 codon)
U,G (2 codons)
I(3 codons)
30.2 Aminoacyl tRNA
Het aminozuren moet worden gelinkt aan de specifieke tRNA moleculen. De binding van een aminozuur
is cruciaal voor twee redenen.
1. De binding van een gegeven aminozuur aan een bepaalde tRNA stelt de genetische code.
2. De vorming van een peptide binding tussen vrije aminozuren is niet thermodynamisch geliefd.
Het aminozuur moet eerst worden geactiveerd voordat de eiwitsynthese verder kan gaan.
Activatie aminozuur
Katalysator activatie reactie = aminoacyl-tRNA synthetase
Stap1: Aminozuur + ATP aminoacyl-AMP +PPi
Stap2: verplaatsen van de aminoacyl groep naar een bepaald tRNA molecuul.
Aminoacyl-AMP +tRNA aminoacyl-tRNA + AMP
Aminoacyl-tRNA synthetase
Dit enzym koppelt het aminozuur met tRNA. Twee verschillende klassen van de synthetase: Class I en II
Verschillen
 De CCA arm van tRNA is in helix conformatie bij class II enzym en voor class I in een haarspeld
conformatie.
 Class I acyleren de 2’OH groep van adenosine van tRNA. Class II acyleert de 3’OH groep.
 De twee klassen binden ATP in verschillende conformaties
 Meeste class I enzymen zijn monomeer, bij class II vaak dimeer.
De synthetase maakt gebruik van de functionele groepen en de vorm van zijn verwante aminozuur om te
voorkomen dat een verkeerd aminozuur aan het tRNA bindt. Sommige synthetase hebben een
gescheiden actieve site waarbij fout gekoppelde aminozuren kunnen worden weg gehydrolyseerd.
 Anticodon loop is ook herkenningsmotief voor synthethase
30.3 het Ribosoom
Ribosoom kan worden gesplitst in : groot subunit (50S) en klein subunit (30S)
Het 30S subunit bevat 21 verschillende eiwitten en een 16S RNA molecuul.
Het 50S subunit bevat 34 verschillende eiwitten en een 23S en een 5S RNA molecuul.
Ribosomen hebben 3 tRNA binding sites die de 30S en 50S overbruggen.
Elk tRNA molecuul is in contact met het 30S en met het 50S subunit. Bij het uiteinde van de 30S zijn 2
van de 3 tRNA moleculen gebonden aan het mRNA door anticodon-codon base paren. De derde tRNA is
gebonden aan de E site.
A site =
aminoacyl site  tRNA met aminozuur er op
P site =
peptidyl site
tRNA met peptide keten er op
E site =
exit site
 leeg tRNA
De andere kant van het tRNA molecuul, zonder anticodon interacteert met 50S subunit. De A en P site
komen een keer tot elkaar en dan wordt er een peptide binding gevormd. Daarnaast is er een tunnel die
die kant verbind met de achterkant van het ribosoom. Hier kan de polypeptide gedurende de synthese
doorheen.
Twee soorten interacties bepalen de start van eiwit synthese:
1. De paarvorming van mRNA basen met 3’ eind van 16S RNA
2. De paarvorming van het initiator codon op mRNA met het anticodon van het initiator tRNA
molecuul
Start codon is bij eukaryoten: Methionine ( AUG)
Start codon is bij prokaryoten: fMet
Peptidyl transferase katalyseert de peptide binding synthese.
Wanneer de A en P sites bezet zijn door aminoacyl-tRNA, zijn ze klaar voor de peptide binding. De
methionine gelinkt aan de initiator tRNA wordt overgebracht op de aminozuur in de A site. De vorming
van de peptide binding is een thermodynamisch spontane reactie gekatalyseerd door 23S rRNA van 50S
subunit : Peptidyl transferase.
Reactie peptide binding vorming: N van Aminozuur in A site valt aan op de C=O van laatste aminozuur in
P site. Hierdoor valt tRNA-OH er van af en zit aminozuur vast aan de peptide keten.
Translocatie van tRNA en mRNA
Nu de peptide binding is gevormd is de peptide keten nu gebonden aan tRNA waarvan het anticodon
zich in de A site van 30S subunit bevindt. Hierna verplaatsen de twee subunits ten opzichte van elkaar.
Dit zorgt ervoor dat het CCA uiteinde van hetzelfde tRNA en zijn peptide in de P site komen van de 50 S
subunit.
De eiwit synthese kan niet doorgaan zonder de translocatie van mRNA en de tRNA’s in het ribosoom.
Het mRNA moet verplaatsten over een afstand van drie nucleotiden zodat het volgende codon precies
goed is gepositioneerd ten opzichte van de A site voor interactie met binnenkomend aminoacyl-tRNA.
Rond dezelfde tijd wordt gedeacyleert uit de P site in de E site op het 30 S subunit en de peptidyl-tRNA
beweegt uit de A site naar de P site van het 30 S subunit. Hierdoor komt de A site weer vrij voor een
nieuw aminoacyl-tRNA.
De translocatie is verbeterd door elongatie factor G /EF-G (EFII in eukaryoten) , ook wel translocase
genoemd. Een mogelijk mechanisme voor de versnelling van de translocatie is:
EF-G in de GTP gebonden vorm bind aan het ribosoom vlakbij de A site en vertoont interactie met 23S
rRNA van 50 S subunit. De binding van EF-G aan het ribosoom stimuleert de GTPase activiteit van EF-G.
Tijdens de hydrolyse van GTP ondergaat EF-G een conformatie verandering. Het verplaatst de peptidyltRNA in de A site naar de P site, wat te gelijke tijd ook mRNA en gedeacyleert tRNA mee draagt. De
loskoppeling van EF-G verlaat het ribosoom, die weer klaar is om het volgende aminoacyl-tRNA te
ontvangen in de A site.
Translocatie
mechanisme
Door de 5’3’ richting is er bijna geen tijd verloren gegaan doordat de translatie meteen begint
wanneer de mRNA is gemaakt, nog voor het 3’einde van mRNA klaar is.
Terminatie van de eiwit synthese = de laatste fase van de translatie
De stop codons worden herkend door eiwitten die release factors (RFs) worden genoemd.
RF1 herkend UAA en UAG. RF2 herkend UAA en UGA. RF3 middelt de interacties tussen RF1 of RF2 en
het ribosoom. In eukaryoten stellen de RF eiwitten tRNA moleculen voor. Als ze binden aan het
ribosoom, ontvouwen ze , om een brug te maken tussen het stop codon op het mRNA en het peptidyl
transferase centrum, met een loop die GGQ sequentie bevat. H2O aanval op de ester binding tussen
tRNA en polypeptide keten  polypeptide keten laat los en verlaat het ribosoom.
mRNA en tRNA blijven gebonden aan ribosoom totdat het hele complex wordt losgelaten door
hydrolyse van GTP door het binden van EF-G en RRF (ribosoom release factor)
Elongatie factor-TU of EF-I(in eukaryoten)
Het voorkomt dat het aminozuur van tRNA wordt af gehydrolyseerd door er zelf aan te binden.
(alleen tRNA+EF) kan aan ribosoom binden. Het beladen tRNA heeft anders te weinig affiniteit.
Loslaten van tRAN bij ‘match’ van anticodon – codon onder hydrolyse van GTP.
30.4 Eukaryoten eiwit synthese verschilt van prokaryoten eiwit synthese
1. Ribosomen. Eucaryotische ribosomen zijn groter (60S en 40S).
2. Initiator tRNA. In eucaryoten is het start aminozuur, methionine. In prokaryoten is er een speciaal
tRNA dat deelneemt: Met-tRNAf
3.Initiatie. In eucaryoten is de initiatie code altijd AUG. Eucaryoten hebben geen specifieke purine rijke
sequentie nodig zoals prokaryoten. De AUG die het dichtstbijzijnd is van de 5’ kant wordt bij eucaryoten
vaak gekozen als start kant. Ribosoom aan de 5’ kant van mRNA bindt aan de cap en gaat zoeken voor
AUG codon door stap voor stap in de 3’ richting te bewegen. Dit scannen wordt gekatalyseerd door
helicase dat over mRNA beweegt door ATP hydrolyse.
 eucaryotisch mRNA heeft vaak 1 start site en representeert 1 eiwit.
 prokaryotisch mRNA heeft vele start sites en kan meerdere eiwitten representeren.
 Eucaryoten maken meer gebruik van meerdere initiatie factoren dan prokaryoten.
 Bij eucaryoten moet pre-mRNA nog een proces doorlopen. Bij prokaryoten is mRNA meteen
beschikbaar
4.De mRNA structuur. De cap en poly(A) staart worden bij elkaar gebracht om cirkel vormig mRNA te
vormen in eukaryoten?
5.Elongatie en terminatie. De terminatie bij eucaryoten heeft 1 RF nodig, prokaryoten 2 RFs.
30.5 ribosomen gebonden aan ER
Eiwitten bevatten signalen die hun bestemming bepalen. De synthese van alle eiwitten begint op de
vrije ribosomen in het cytoplasma. In eukaryoten gaat de eiwit synthese door in het cytoplasma tenzij er
een keten een signaal sequentie bevat dat het ribosoom naar het ER stuurt.
32.1 Eukaryoot DNA is georganiseerd in chromatine
Het is sterk gebonden aan eiwitten genaamd histonen. Deze combinatie wordt een chromatine
genoemd. DNA wikkelt 2 keer om een octameer van histonen om een nucleosoom te vormen. De vier
kern histonen zijn homoloog gevouwen in zelfde structuren. Elke kern histoon heeft een aminoeindstaart met veel lysine en arganine residuen. Nucleosomen zijn de eerste toestand van het compact
maken van eukaryoot DNA.
32.2 Transcriptie factoren binden DNA en reguleren de start van transcriptie
Veel eukaryote gene worden niet geuit, tenzij ze worden geactiveerd door de binding van specifieke
eiwitten , genaamd transcriptie factoren, aan sites van DNA. Deze specifieke DNA binding eiwitten
vertonen interactie (direct en indirect) met RNA polymerase.
32.3 Controle van gen expressie
Structuur van chromatine is daar erg belangrijk in. Chromatine is meer open in de buurt van transcriptie
start sites.
Van RNA naar eiwit; translatie. Telomeren zijn de uiteinden van de chromosomen en telomerase is het
enzym wat het uiteinde kan verlengen. Elke cel verliest een deel van zijn telomeer, wanneer er geen
telomeer over is zal de cel zichzelf niet meer kunnen vermenigvuldigen en sterven; wanneer er niks
meer om de kaars te laten branden gaat hij uit. Als iemand zwanger wordt hij al ouder is, zou het kind
ook een verkleind telomeer hebben. Daarvoor bestaat telomerase die het telomeer van embryo cellen
‘reset’. Kunnen we door de telomeren te verlengen met telomerase onze cellen oneindig laten delen en
onsterfelijk worden? Kanker kan het enzym teleomerase aanzetten zodat hij oneindig kan blijven delen
en telkens het telomeer ‘gereset’ worden. Als je de uiteinden van het DNA hebt en je wilt deze kopieren
leidt dit to problemen op de lagging strand. Als het uiteinde te kort wordt kan de primer niet meer
binden en valt hij uit elkaar. Het telemorase enzym heeft in zichzelf een stukje primer (RNA erin
gebonden) zitten waarlangs hij het uiteinde van het DNA kan kopiëren en verlengen. Door het strand
van 5’ tot 3’ te verlengen kan vervolgens via DNA polymerase de andere strand verlengt worden.
Het RNA bindt niet aan alles van het DNA. Sommige delen slaat hij over dit noem je splicing. De stukken
die niet meer terug komen en eruit worden geknipt noem je de intronen en de delen die worden
gebruikt voor de RNA synthese noem je exonen.
Het hele gen wordt gekopieerd tot RNA, pre mRNA wordt omgezet doro splicing tot het ‘echte’ mRNA.
Hierdoor wordt de mRNA keten korter dan het orginele DNA keten. Hierdoor kan je uit een gen
meerdere eiwitten maken op basis van een gen, dit is afhankelijk van het omgeving van de cel.
De sequentie GUAAGU en NCAG bepalen de grenzen van het intron wat eruit moet worden geknipt.
Dit gebeurt door het verbreken en weer opnieuw vormen van fosforesthers.
Dit kan het RNA niet alleen hier heeft hij andere moleculen nodig de zogenaamde snRNPs. Deze hebben
een RNA sequentie die de splicing site herkent en weet waar hij moet knippen door U1 en U2. Door het
opvouwen van het mRNA komen de posities dicht bij elkaar zitten. Zodat de verbinding verbroken kan
worden door met elkaar te reageren. Door U4,U5 en U6 wordt het mRNA opgevouwen.
Het opgevouwen complex heet het spliciosoom. Dit gaat dus door herkenning door mRNA sequenties
door U1,U2,U4,U5 en U6.
En weer kan één pre-mRNA sequentie voor meerdere eiwitten gebruikt worden, is ook heel gevoelig
voor ziektes/puntmutaties.
Je minimaal 3 basen voor elk aminozuur nodig. 4x4x4=64 aminozuren mogelijkheden, we hebben echter
maar 20 aminozuren. Je hebt dus meerdere codons die coderen voor dezelfde aminozuren.
Nucleinezuren schrijven we altijd van de 5’ kant naar de 3’ kant en het aminozuur gaat altijd van de Nterminus naar de C-terminus van het eiwit.
Hieronder een voorbeeld van een RNA sequentie. Deze codeert met een bepaalde aminozuurfrequentie.
Begrijp goed hoe je dit tabel kan uitlezen.
Dit tabel geeft de code voor elk aminozuur. Je hebt
echter nog drie sequenties die niet voor aminozuren coderen.
Dit zijn de stop codons UAA, UAG en UGA. Deze geven aan
wanneer de eiwitsynthese klaar is.
Methione (AUG) is de startcodon voor de eiwitsynthese. Waarom zoveel codons voor maar 20
aminozuren? Veel voorkomende aminozuren worden gecodeerd door meerdere codons. Dit komt ten
eerste omdat er zo meer verschillende tRNA’s beschikbaar zijn voor dezelfde aminozuren. Verder is het
om te zorgen dat puntmutaties niet meteen leiden tot een defect eiwit.
Het ribosoom is de fabriek die het mRNA omzet in eiwit. Ieder aminozuur wordt door tRNA in het
ribosoom gebracht. Het tRNA bestaat uit RNA moleculen (transfer RNA) met een stukje aminozuur en
een anitcodon. Bestaat uit ongeveer 80-100 ribonucleotiden, het is één lineaire keten die echter zelf
opgevouwen tot een compacte structuur met helix structuren.
Aan de ene kant zit het anticodon waarmee het kan binden aan het RNA. Aan het 3’ uiteinde zit het
aminozuur aan vast. Het heeft de vorm van een klaverblad. Deze vouwing is precies nodig om het tRNA
te herkennen en de eiwitsynthese te doen.
Het is een soort van omgedraaide L vorm die bestaat uit intramoleculaire helices door terugvouwen van
de sequentie. Het uiteinde naar het aminozuur aan het 3’ eind is altijd ACC. In het tRNA zijn sommige
base chemisch veranderd en zijn er meer dan 4 basen zoals de Y of phi base.Vier helices dus die bij
elkaar worden gehouden door loops.
Het tRNA brengt een aminozuur naar het ribosoom, maar moet dan weer opnieuw ‘beladen’ worden
met een aminozuur. Dat gebeurt door het aminozuur-tRNA-synthetase. Het activeert het aminozuur
met ATP naar een aminozuur +AMP+PP1->tRNA+ het enzym aminozuur-tRNA-synthetase= beladen
aminozuur-tRNA+AMP. Voor elk tRNA is er dus een specifieke aminozuur-tRNA synthetase. Aan de ene
kant herkent het juiste tRNA en aan de andere kant de belading van het tRNA faciliteren.
Hier schematisch weergegeven. De activation site is de filter voor grote moleculen en de editing site
voor kleiner moleculen. De editing site is als er een verkeerde aminozuur is ingezet, flipts hij van de
activation site naar de editing site en knipt hij het verkeerde stukje los.
Het blauwe gedeelte is het enzym met de editing en activation site.
Het ribosoom bestaat uit twee delen een groter bovengedeelte (50S)
en een kleiner ondergedeelte (30S). Deze delen bestaan uit eiwitten
en RNA moleculen. 50S + 30S=70S
Hoe wordt het eiwit gesynthetiseerd? Het mRNA wordt uitgelezen van de 5’ richting naar de 3’ richting
en het eiwit van de amide naar de C richting. Telkens schuift de groep op voor een nieuw aminozuur. De
groeiende peptide keten groeit van de amide naar de C keten en zit altijd vast aan een tRNA, al schuift
hij wel telkens op.
Een mRNA sequentie kan door meerdere ribosomen uitgelezen worden. Zo kan een mRNA voor
meerdere eiwitten zorgen. Maar waar begint nou deze synthese? Het start signaal hiervoor is
methionine. Zo gauw ze een AUG sequentie zien is dat het beginpunt voor de eiwitsynthese. AUG is het
start codon voor eiwit synthese: methionine.
Bij prokayroten zie plaatje. Dat mRNA komt dan in die verschillende sites terecht in het ribosoom het
EPA. A; acylsite waar het tRNA met één aminozuur erop zit, de P (peptide) site waar het tRNA met de
peptide keten erop zit en de E (exit) site waar het tRNA uit het ribosoom weggaat.
College 12:
Het ribisoom heeft drie verschillende sites; de E site, P site en A site waar tRNA kan binden. Op de A site
bindt een aminoacyl tRNA (één aminozuur), op de P site bindt een peptide tRNA (tRNA met een peptide
keten) en de E site waar het tRNA het ribosoom verlaat (ongeladen).
Elongatie factor G ‘duwt’ het mRNA en tRNA door naar de volgende positie. De peptide keten blijft altijd
in de tunnel zitten.
Hier hebben ze de tRNA voor cysteine genomen, deze is vervolgens omgezet naar tRNA alanine, je
verandert niks aan de anticodon maar wel aan het aminozuur. Je zou dan dus een alanine i.p.v. een
cysteine in het eiwit inbouwen. Het herkennen van het anitcodon is dus heel belangrijk.
De start positie is AUG, bij prokaryoten zit er voor het startcodon een purine rijk gedeelte. Dit is omdat
er natuurlijk meerdere AUG sequenties zijn, een purine rijke(G’s en A’s) toont de specifieke startcodon.
Eerst wordt er dan een purine rijk (veel G’s en A’s ) gedeelte afgelezen en dan gewacht tot het ribosoom
een AUG start codon tegenkomt. Dat kan het ribosoom niet alleen daar heeft hij meerdere cofactoren
voor nodig. Het 30S herkent in eerste instantie het begin punt van de eiwit synthese, dat complex
belaad het complex met f voor fMet als begin punt. Dan komt het 50S complex erbij, deze sluit het
ribosoom dicht en kan de eiwitsynthese beginnen. Een elongatie factor TU brengt het belanden
aminoacyl-tRNA naar het ribosoom. Het binden van tRNA aan het ribosoom gaat met behulp van
elongatie factoren. De ElongatieFactor Tu bindt aan het tRNA en beschermt voor hydrolyse van het
aminozuur, deze zit als esther binding aan het tRNA vast om dus te voorkomen dat deze binding wordt
gehydrolyseert bindt het EF-Tu. Dit proces helpt het herkennen van het mRNA en zorgt ervoor dat alleen
als het tRNA aan het juist mRNA aan, ondergaat de factor hydrolyse van GTP naar GDP en laat het tRNA
los.
De EF-Tu heeft dus twee belangrijke rollen, in eerste instantie het stabiliseren van de ester binding van
het aminozuur aan het tRNA en als tweede instantie om het tRNA naar het ribosoom met het mRNA te
binden en te voor te zorgen dat alleen het tRNA dat juist aan het mRNA bindt los gelaten wordt, dit
gebeurd dan door hydrolyse van GTP naar GDP. De EF-Tu bindt aan elk tRNA behalve het eerste fMet
tRNA, brengt het tRNA dus naar het ribosoom. Er is ook een twee elongatie factor G, die zorgt dat het
mRNA met de tRNA door het ribosoom getrokken worden. Dat is een eiwit wat aan GTP bindt en door
de hydrolyse naar GDP een conformatie verandering ondergaat en daardoor het eiwit waar hij aan bindt
in een andere positie kan brengen, EF-G noem je ook wel translocase. Hij bindt in eerste instantie in de
lege A site en door de hydrolyse van GTP naar GDP krijgt hij affiniteit naar de P site en zo drukt hij door.
Als de eiwitsynthese klaar is moet het ribosoom vrij gemaakt worden. Dit gebeurt met de release factor,
de peptide komt lost.
De release factor katalyseert de reactie met water zodat de peptide keten eruit kan gaan. De release
factor (RF 1) herkent het stop codon bindt in het ribosoom en katalyseert de binding met de peptide
keten zodat de codon loslaat en de peptide vrij komt. Eiwit synthese van eukaryoten en prokaryoten
verschilt nogal. Het ribosoom is 4.2 MDalton groter bij eukaryoten. Bij prokaryoten is de begin codon
fMethionine en bij eukaryoten gewoon Methionine, methyl-tRNA-specialisatie die de eiwit synthese laat
beginnen. Het initiatie proces is bij beide anders. De structuur van het mRNA is cyclisch met behulp van
eiwit factoren bij eukaryoten. Deze verschillen kan je gebruiken om alleen bacteriën uit te schakelen bij
ziektes.
Bij eukaryoten wordt de eiwitsynthese begonnen door het
binden van de 40S subunit, die glijdt over het mRNA heen
totdat het Methionine wordt gevonden. Bij eukaryoten is
het mRNA opgevouwen in een cyclische structuur wordt
uitgelezen van 5’ naar 3’. Hierdoor kunnen de ribosomen
er rondjes overheen lopen en ribosomen meerdere
malen over het mRNA te laten lopen en meerdere eiwitten te laten synthetiseren.
Je hebt ribosomen los in het celplasma en vast aan het ER. Dit heeft te maken waar het eiwit uiteindelijk
terecht komen, sommige in de cel en sommigen voor buiten de cel. Eiwitten voor buiten de cel worden
op het ER gesynthetiseerd en eiwitten voor in de cel los in het cytoplasma. Dit is af te lezen aan de
sequentie.
De eiwit synthese gebeurt op het membraan van het ER. Vervolgens worden door bepaalde transport
vesicles gebruikt om het naar buiten de cel te transporteren.
DNA is vrij lang (2 meter DNA per cel) en vouwt op door middel van topoisomerasen. Het vouwt om
histonen eiwitten heen, deze zijn positief geladen waar de negatieve backbone van het DNA omheen
vouwt. Een zo ’n parel bestaand uit histonen en nucleïnezuren
noem je een nucleosoom. Selenoiet zijn zes van die parels
samen gevouwd, deze vouwen weer in loops en uiteindelijk
tot een chromosoom. Het in elkaar vouwen van deze draden
zorgt voor een hele sterke structuur. Bestaat voor 50% uit DNA
en 50% uit histon eiwitten.
Waarom vouwt dat DNA om de eiwitten heen? De eiwitten hebben flexibele uiteindes waar allemaal
lysine en arginines opzitten, de amino functionaliteiten worden geprotoneerd (positieve lading) binden
aan de negatieve backbone van het DNA.
Hoe kan je het dan weer ontvouwen van de histonen? Dat doet de cel door de positieve lading op de
histone weg te nemen dit doet hij door het enzym: coenzym A. Coenzym A zorgt dat de acythyl groep
overgedragen wordt op de amino functionaliteit. Er zijn dan wel enzymen nodig om het DNA te
ontvouwen van de histonen dit gebeurt door het enzym histon ac-ethyl transferase. Deze enzymen
moeten wel naar het DNA worden gebracht, anders zouden ze overal DNA gaan ontvouwen. Ze worden
door transcriptie gebracht naar het DNA. Deze binden op de vrij stukjes DNA op de histonen.
Transcriptie factoren zetten alleen de specifieke enzymen aan die ze nodig hebben. De
estrogeen/oestrogeen (testosteron voor mannen) receptor is een transcriptie factor die de genen aan
zet die belangrijk zijn voor het ontwikkelen van de vrouwelijke geslachtskenmerken. Oestrogeen factor
is een eiwit wat gen transciptie aan kan zetten. Het is een eiwit wat bestaat uit verschillende domeinen:
DNA-bindings domein, Ligang-bindings domein. Estradiol bindt in de ligand-binding domein en zorgt
voor een conformatie, waardoor het enzym niet goed meer werkt.
Met de LLXXL kan oestradiol binden aan oestrogeen. Oestradiol zorgt voor de ontwikkeling van
secundaire geslachtskenmerken. Vrouwen hebben door oestradiol minder kans op hartinfarcten en
sterke botten hebben , tot de overgang (stopt de productie van oestradiol). Na de overgang meer kans
op hartinfarcten en sterke botten: behandeling is door het slikken van oestradiol na de overgang.
Oestradiol verhoogt echter wel de kans op baarmoeder kanker. Dit is een probleem, men probeert dus
een molecuul te maken wat de functie van oestradiol overneemt behalve met de verhoogde kans op
baarmoeder kanker.
College 13:
5.1 Het ontdekken van genen is gebaseerd op key tools
Er zijn een aantal technieken erg belangrijk:
1. Restrictie-enzym analyse Restrictie enzymen zijn nodig om DNA segmenten te manipuleren, dit
gebeurt door DNA op bepaalde posities te knippen.
2. Blotting technieken. Worden gebruikt om DNA en RNA te scheiden en te karakteriseren.
3. DNA sequensing. Nodig om de precieze nucleotide sequentie van een molecuul of DNA te bepalen.
4. Vaste fase synthese van Nucleïne zuren Nodig om in het lab nieuwe nz te synthetiseren.
5. Polymerase keten reactie (PCR). De PCR leidt tot amplificatie van een segment van DNA. Een
molecuul van DNA kan worden geamplificeerd naar hoeveelheden die de karakteristatie en manipulatie
toestaan. De techniek kan worden gebruikt om ziektes te zoeken.
Restrictie-enzym analyse
Restrictie enzymen = restrictie endonucleases
- Herkennen specifieke base sequenties in de dubbele DNA helix, en knippen op specifieke
plaatsen beide strengen van de dubbele helix.
- Ze hydrolyserende een fosfodieester binding in elke streng
van de regio waar het gebonden is.
- Tweevoudige rotationele symmetrie. Bij elke streng knipt
het enzym bij de C-G fosfodieester binding aan de 3’ kant
van de symmetrie as.
Restrictie enzymen worden gebruikt om aan DNA moleculen te
knippen in specifieke fragmenten die beter kunnen worden geanalyseerd en gemanipuleerd.
Restrictie fragmenten kunnen worden gescheiden en gevisualiseerd door gel elektroforese
Hoe kleiner het DNA fragment, hoe verder de migratie van het fragment. Polyacrylamide gels worden
gebruikt om te scheiden op grootte. Meer poreuze agarose gels worden gebruikt om de om mengsels
van grotere fragmenten op te lossen. De gel kan worden aan gekleurd waardoor er bepaalde moleculen
zichtbaar worden. Als je wilt weten of een van de sequenties, verkregen door restrictie enzymen het
DNA stukje te laten knippen en in gel elektroforese te laten migreren, een bepaald gen voorstelt 
BLOTTING techniek gebruiken.
Kijken we naar Eiwit  WESTERN BLOTTING
kijken we naar DNA  SOUTHERN BLOTTING
kijken we naar RNA  NORTHERN BLOTTING
Southern blotting
Stap 1. De DNA fragmenten lopen door de agerose gel heen door middel van elektroforese. Kleinste
stukjes komen het verste.
Stap 2. We willen kijken of een van de DNA fragmenten het gen bevat dat we zoeken.
Stap 3. Overzetten naar een Nitrocellulose sheet.
Stap 4. Hieraan wordt een 32P gelabeld DNA probe toegevoegd. Het probe kan dimeriseren met het gen
naar interesse.
Stap 5. Er wordt met een autoradio diagram gekeken waar zich de radioactiviteit bevindt. En waar dus
het DNA probe heeft kunnen dimeriseren en wordt onthuld.
Stap 6. Blijkt het dat we het gen naar interesse hebben kunnen we deze extraheren uit de cel en
amplificeren met PCR.
DNA sequencing
1. De DNA sequentie die moet worden
gesequenceerd. Daaraan komt vaak eerst
een primer en met DNA polymerase I
wordt de rest van de keten
gesynthetiseerd. Als we hieraan gelabeld
dNTP toevoegen en daarbij een kleine
hoeveelheid dideoxy analoog van een
dNTP. Dit stopt de keten, want de 3’OH
groep die verder zou reageren is
geblokkeerd. (terminatie van ketenlengte)
2. 4 reageerbuisjes. Aan de een voeg je een beetje dideoxy ATP aan de ander ddGTP, ddCTP en ddTTP.
Hieruit krijg je dan verschillende producten. Waarbij de ene sequentie steeds getermineerd is met een A
de ander met een G de ander met een C en nog een ander met een T.
3. De producten scheiden met elektroforese. Zo kun je kijken welke het snelste er doorheen loopt. Dat is
de kortste sequentie en je weet dan dat dat bijvoorbeeld A is. Als de daarna snelste eindigt op een T zal
de volgorde van de sequentie: AT zijn. En zo verder.
4. je kan kleurtjes toevoegen aan de dNTPs. Je krijgt dan sequenties die eindige met een verschillend
kleurtje.  Fluorescentie detectie van oligonucleotide fragmenten.
DNA probes en genen kunnen worden gesynthetiseerd door geautomatiseerde vaste fase methodes
Stap 1: Er wordt gebruikt gemaakt van een glas bolletje (resin) waarop de keten gaat groeien. De 5’OH
groep van het geactiveerde monomeer is niet reactief doordat het is geblokkeerd door DMT. De 3’
fosforyl groep is ook niet reactief gemaakt door βCE. Daarnaast zijn ook de amino groepen van de purine
en pyrimidine basen geblokkeerd. Dit gebeurt in vaste fase.
Stap 2 : De fosfiet triester is geoxideerd door I2 .
Stap 3 : DMT van de groeiende keten wordt verwijderd, de DNA keten nu is verlengd met een unit.
Opmerking: De synthese gebeurt andersom als in het lichaam. Hier is namelijk de 3’OH niet vrij, in het
lichaam wel.
Geselecteerde DNA sequenties kunnen worden geamplificeerd door PCR
Nodig voor PCR:
1. DNA template (1 streng of 2 streng)
2. Een paar primers dat hybridiseren met de sequenties van het target.
3. Alle vier dNTPs
4. Een warmte stabiel DNA polymerase.
De PCR cylcus bestaat uit drie stappen
1. Het scheiden van de strengen. De twee strengen van DNA worden
gescheiden door de oplossing te verwarmen in 95 graden Celsius voor 15
seconden.
2. Hybridisatie van de primers. De oplossing wordt dan plots gekoeld tot
54 graden C, waardoor elke primer de DNA streng hybridiseert. Een
primer hybridiseert aan het 3’ uiteinde en de andere hybridiseert aan
het complementaire 3’ uiteinde van de andere streng van de target.
3. DNA synthese. De oplossing wordt dan verwarmd tot 72 graden C. De
polymerase verlengt beide primers in de richting van de target sequentie
omdat DNA synthese in de 5’  3’ richting is.
Deze drie stappen worden samen een cyclus genoemd van de PCR
amplificatie.
steeds meer DNA
heel veel target sequenties
sequenties.
Dus je gaat van 2  4  8
Bij elke volgende cyclus krijg je
sequenties. Uiteindelijk krijg je
en maar een paar langere
 16 32 etc.
5.2 Recombinante DNA technologie
Restrictie enzymen en DNA ligase
Handige tool voor manipulatie van recombinant DNA is een vector ( een DNA molecuul dat zich vanzelf
kan repliceren in een bepaalde gastheer). Zo’n vector kan worden gemaakt voor het accepteren van een
nieuw DNA fragment door het te knippen op specifieke plaatsen door restrictie enzymen.
De geknipte stukken van het DNA (circulair) produceert complementaire enkelstreng eindes. Welke een
specifieke affiniteit hebben voor elkaar. Hierna kan dan elk DNA fragment aan worden toegevoegd als
het ook maar die specifieke complementaire uiteinden bevat. Het nieuwe DNA kan met het circulaire
DNA aan elkaar worden gezet door DNA ligase.
Plasmide en λ-fagen zijn keuze vectoren voor DNA kloneren in bacteriën
Plasmide = circulair twee strengs DNA dat voorkomt in bacteriën. Ze dragen genen voor de inactivatie
van antibiotica, productie van toxines, afbraak van natuurlijke producten. Ze kunnen onafhankelijk
repliceren. Je hebt een aantal plasmide klassen:
- Klonen vectoren: handig voor snel DNA fragmenten inbouwen.
- Expressie vectoren: voor productie van grote hoeveelheiden eiwitten.
λ-fagen = een andere vector die veel wordt gebruikt. Het kan zijn gastheer kapot maken of kan deel
worden van zijn gastheer. Het is een stuk eiwit dat λ-DNA omhult.
Er zijn twee pathways voor λ-fagen:
1. Lytic pathway. Viraal DNA en eiwitten worden snel geproduceerd en gepakt in virus deeltjes,
leidend tot de lysis (de vernietiging) van de gastheer en de plotselinge verschijning van 100 virus
deeltjes.
2. Lysogenic pathway. λ-fagen DNA wordt in de gastheer genoom ingebracht en kan worden
gerepliceerd samen met het DNA van de gastheer voor vele generaties, niet actief. Verschillende
milieuveranderingen kunnen de expressie van het viral DNA triggeren.
λ-faag als kloon vector
Je kan DNA virus pakken van een bacterie en daarbij DNA van het
gen van interesse er in plakken. Daarna pak je het weer opnieuw
in. Het DNA wordt geintegreerd. -> genetisch gemodificeerde
bacterie.
Complementair DNA kan worden klaargemaakt vanuit mRNA en
kan worden getoont in gast cellen
Als je DNA gaat amplificeren levert dat
uiteindelijk ook klonen op die intronen
bevatten. Deze intronen bij eukaryoten kunnen niet tot succes worden getoont
in de gast cellen. Daarom wordt het gedaan door mRNA te amplificeren.
Stap 1. Reverse transcriptase is nodig. Het synthetiseert een DNA streng
complementair aan een RNA template als de transcriptase wordt voorzien van
een DNA primer dat gebasenpaart zit aan RNA en een 3’OH groep bevat.
Stap 2. Gebruik een simpele sequentie van gelinkte thymidine [ oligo(T) ]
residuen als primer. Deze oligo(T) sequentie paart met poly(A) sequentie aan
het 3’einde van mRNA.
Stap 3. Reverse transcriptase synthetiseert hierna de rest van de cDNA streng in
de aanwezigheid van vier dNTPs.
Hieruit volgt een mengels van verschillende mRNAs die voorkomen en mengels
van verschillende cDNAs. Hieruit moet nog de juiste worden geselecteerd.
Je implementeert alle cDNAs in plasmiden en die breng je in bij bacteriën. Elke
bacterie brengt een ander eiwit tot expressie. Dan voeg je een antilichaam toe
die alleen bindt aan het eiwit waarin je interesse in hebt. Maak het antilichaam
radioactief. Maak vervolgens een autoradiogram -- >onthult eiwit naar intresse.
Recombinante DNA technologie
wordt gebruikt om het eiwit te maken of om mutaties te maken in het eiwit.
- Deleties
- Substituties
- Inserties
- Designer genen (eigen eiwit ontwerpen)
Eiwitten met nieuwe functies kunnen worden gemaakt door directe veranderingen in DNA
Deleties: een specifieke deletie kan worden gemaakt door een plasmide aan twee kanten te knippen
met een restrictie enzym en het weer aan elkaar plakken om er een cirkel van te maken.
Substituties: oligonucleotide-directed mutagenesis. Mutant eiwitten met enkele aminozuren
vervangingen kunnen hier mee worden geproduceerd. Je wilt bijvoorbeeld serine vervangen door
cysteine. Dan heb jenodig een plasmide die het gen of cDNA voor dat eiwit bevat. En we moeten de base
sequentie rond de site weten. Als de serine waar we ons interesseren is gecodeerd door TCT levert de
mutatie van de centrale base van C G het TGT codon , dat cysteine codeert. = PUNTMUTATIE.
Dan introduceren van deze puntmutatie in het plasmide. Maak een oligonucleotide primer die
complementair is aan de regio van het gen, behalve dat het nu TGT ipv TCT bevat.
De twee strengen worden gescheiden en de primer wordt verlengt door DNA polymerase. De mismatch
is toloreer baar. Dan wordt de cirkel gemaakt door DNA ligase.
Inserties: cassette mutagenesis. Je haalt met endonuclease een stuk uit de plasmide. Voeg daarna een
nieuw stuk toe in de plasmide.
Designer genen: Nieuwe eiwitten kunnen ook worden gevormd door splicing samen met het gen
segmenten dat domeinen coderen die normaal niet samen voor komen in de natuur.
Recombinate DNA technologie: hoe kunnen we een stuk DNA uit een eukaryotische cel omzetten in een
makkelijk formaat dat we dat eiwit dat correspondeert met dat DNA kunnen produceren in bacteriën.
Bacterien kennen het exonen/intronen systeem niet. Het mRNA wordt uit het weefsel gehaald dan
omgezet naar cDNA. Het omzetten van RNA naar DNA preferse translatie.
Om deze stappen door te lopen zijn 5 belangrijke technieken voor beschikbaar.
-
Restrictie enzymen: enzymen die met ‘scharen en messen’ bepaalde stukjes DNA kunnen
knippen: voor de manipulatie van het DNA.
-
Blotting technieken: om het DNA en RNA te scheiden en te analyseren
-
DNA sequencing: het bepalen van de excate nucleotiden volgorde van het DNA
-
Chemische synthese : van DNA naar RNA
-
Polymerase keten reactie (PCR): om stukjes DNA steeds te vermenigvuldigen
1: Ze hydrolyseren nucleïnes in een keten (endo). Restrictie endonucleases kunnen specifieke sequenties
herkennen en daar knippen. Het zijn enzymen die natuurlijk voor komen in bacterien. Zijn eigen
beschermingsonderdelen om verkeerd DNA af te bouwen/kapot te maken.
Ze zullen altijd in een symmetrisch stukje DNA knippen altijd in een symmetrische manier, zie de
afbeelding hierboven.
Ethidiumbromide maakt de geknipte DNA sequenties fluorescerend, deze gaat tussen de DNA paren
zitten. Hier wordt het DNA door spanning en hun grootte verdeeld. Op die manier kan je geknipte
stukjes scheiden.
2: Waar zit mijn gen? Dit kan je doen met Southern blotting. Je scheidt het DNA op een gel en brengt
deze dan over op een soort van filterings papier/blotting papier. Aan dat papier voeg je een DNA probe
toe die complimentair is met de sequentie die je wilt zien. Die DNA probe is radioactief gelabeld.
Northern blotting is voor RNA, Western blotting voor eiwitten en Southern blotting voor DNA.
3: Je wilt natuurlijk uiteindelijk weten de gehele sequentie is van je DNA. Sanger dideoxy methode: eerst
heeft hij een stuk DNA gekopieerd met DNA polymerase hiervoor heb je een Primer nodig,
4deoxynucleotiden en DNA polymerase. Hij heeft echter additioneel een dideoxy annaloog toegevoegd.
Er zit dan zowel op de 2’ als 3’ een proton. Als dit molecuul is ingebouwd kan de volgende stap niet
meer plaats vinden: synthese is gestopt.
Dit is als het ware een gecontroleerde terminatie met dideoxy analoog. Door ze in verschillende ‘potjes’
te doen van ddATP, ddTTP, ddCTP en ddGTP kan je de sequentie nucleotide voor nucleotide vergelijken.
Nu doen ze dit ook wel met fluorescerende moleculen. Aan de hand van de kleur weet je dan welke
base er is in gebouwd. (apparaat kan 1 miljoenen basen per dag af lezen, niet zo heel veel dus)
Het menselijk genoom heeft ongeveer 3 miljard base paren. De mens heeft 24 chromosomen. We
hebben heel veel eiwitten voor ruik en voelen, deze eiwitten zitten nog wel in ons DNA maar zijn
uitgezet.
4: Het start punt moet je zelf maken. Dit doe je met DNA synthese. De chemische DNA synthese gebeurt
op een soort genaamde vaste drager, glas bolletjes waar de eerste nucleotide is vast geboden. Dit is
voordelig om je dan de overmaat van reagentia kan weg spoelen, en alleen de groeiende keten achter
blijft. Hiermee kan je dus DNA synthetiseren maar ook primers radioactief maken. Je kunt hier hele
genen mee synthetiseren. Er bestaan al bedrijven die jouw sequentie kunnen namaken.
5: PCR is een reactie die een dubbel strengs DNA steeds kopieerd. Dit gaat in 2n , elke 2 min is er een
stap doorgelopen. Stuk DNA wordt verwarmd tot 95 graden dan smelt het DNA en gaat uit elkaar. Dan
koel je het af en laat je de primers binden, dit doe je door een overmaat van primers toe te voegen.
Vervolgens verwarm je het weer tot 72 graden en kan de DNA synthese beginnen.
Waarom zulke hoge temperaturen? Je weet dat het lichaam eigenlijk maar rond de 38 graden altijd is.
Dit komt door de Taq DNA polymerase, dit is een DNA polymerase die voorkomen in bacteriën die in
hete geisers wonen. Hun enzymen zijn dan ook aangepast aan die hoge temperaturen. Deze DNA
polymerase is uit de bacterie gehaald.
Benodigheden voor PCR:
(Dubbel) strengs DNA wat je wilt kopiëren. Twee primers nodig een voor iedere streng, vier
deoxynucleotide en een warmte stabiele DNA polymerase nodig.
1: 95 graden Celsius smelten van de waterstofbruggen tussen de twee DNA ketens: de DNA ketens
worden gescheiden.
2: ~54 graden Celsius om de anneal primers te laten binden aan de DNA strengen, zorg wel voor een
overmaat van primers.
3: ~72 graden Celsius is de optimale temperatuur voor Taq DNA polymerase
4: herhalen van de stappen 1 t/m 3
De stappen worden steeds herhaald om steeds meer kopieën te krijgen. De primers moet je synthetisch
maken, ze zijn vaak van tussen de 20 en 40 primers. Hoe kleinere primers (minder baseparen) hoe lager
de anneal temperatuur hoeft te zijn en vica versa. De DNA synthese gaat altijd voor de 5’ richting naar
de 3’ richting. In de eerste instantie wordt er meer DNA gekopieerd dan wat je nodig hebt.
Als je zo n stukje geamplificeerd DNA hebt stop je in een plasmide. Plasmide wordt open gemaakt door
restrictie nuclease en vervolgens, wanneer het DNA stukje er in zit, weer dicht gemaakt.
Het openknippen gaat door restrictie enzymen, de restrictie enzymen knippen heel selectief. DNA ligase
is de lijm die de twee stukken aan elkaar plakt. DNA ligase heeft twee stukken DNA nodig als dubbel
helix, verder heeft hij een vrij 3’OH uiteinde nodig en een 5’fosforyl uiteinde. Aan de 3’ uiteinde moet
een OH groep zitten dus en aan de 5’ uiteinde een fosfaat groep.’
Dit knippen en plakken gaat wel eens mis. Je kan bijvoorbeeld je stukje DNA op een verkeerde plaats in
de plasmide krijgen, of dat de plasmide het niet meer doet. Standaard plasmiden worden hiervoor
gebruikt, waarvan de restrictie sites bekend zijn. Als je de DNA sequentie in de plasmide pBR322
inbrengt met resistentie tegen Tetracycline en Ampicilline, hierdoor kan je plasmiden selecteren.
De β-galactosidase kleur op, dus weet je of het enzym actief is. Verder heeft deze plasmide een
polylinker met verschillende restrictie sites. Als de DNA sequentie is ingebracht zal de β-galactosidase
inactief worden. Dit kan je gebruiken om te kijken of de plasmide jouw specifieke gen heeft.
De blauwe kolonies zijn de kolonies waar de plasmides voor komen. Maar je wilt juist de plasmiden
hebben die niet gekleurd zijn, waar de kleur sequentie inactief is. Dit ging door middel van bacteriën
maar het kan ook via virussen, zogenaamde fagen. Fagen zijn virussen die bacteriën infiltreren. De virus
spuit DNA in de bacterie, de bacterie vermenigvuldigd het DNA dan. Dan kan de bacterie of ontploffen
door de overmaat aan virus DNA waarbij er nieuwe fagen worden vrijgelaten (lytic pathway). Het virus
DNA kan ook integreren met het DNA van de bacterie (lysogene pathway). Hierbij heb je dus een stuk
DNA ingebracht in het DNA van de bacterie
Fagen bevinden zich in de lucht en is dus zeer besmettelijk. Je kan dus je DNA sequentie door een
plasmide in de bacterie krijgen of via een virus. Ook de DNA sequentie in de fage DNA gaat via knippen
en plakken alleen moet de DNA lengte wel gelijk blijven en niet langer of korter worden.
Er zitten nog veel intronen in het DNA, je zou dus eigenlijk mRNA moeten gebruiken. Hiervoor is een truc
nodig, door mRNA om te zetten in DNA met zogenaamd reverse transciptase. Virussen gebruiken dat om
hun mRNA in de cel om te zetten tot DNA. Dit wordt ook door ons gebruikt om de intronen te
vermijden.
Hier moet je nou eiwitten van maken dit doe je daar de plasmide in een bacteriële cel te brengen. Dit
kan door even te verhitten (tot 42 graden) zodat het membraan even los zit en de plasmide naar binnen
kan. Kationische transfectie reagentia te gebruiken, dit positieve molecuul bindt met de negatieve
backbone van het DNA. Hierdoor krijg je een positief bolletje wat makkelijk door het membraan gaat.
Je zorgt vervolgens dat de bacteriën zich kunnen vermenigvuldigen, de duizenden plasmiden in de
bacterie cellen maken nu jouw eiwit.
Je moet je DNA modificeren om je eiwit te veranderen en nieuwe functies te geven:
-
Door deletions
-
Door substitutions: oligonucleotide-directed mutagenesis
-
Insertions: cassette mutagenesis
-
Designer genes, gemaakt in het labarotorium.
Je hebt nu je plasmide en je ziet een stuk DNA wat je interesseert. Je wilt een nucleotide veranderen
door een puntmutatie, om te kijken hoe dat de actieviteit van het enzym veranderd. Je neemt de
plasmide en gaat hem eerst kpieren. Je neemt echter niet de exact passende primer maar een primer
waar één nucleotide niet past. De primer bindt echter wel aan de streng ,dit brengt een puntmutatie
aan in het stuk DNA, wat codeert met een ander aminozuur.
De toekomst is het zelf ontwikkelen van je gen; designer genes.