Samenvatting in het Nederlands

Samenvatting in het Nederlands
Kanker van de dikke darm en endeldarm (colorectale kanker) is één van de meest
voorkomende, levensbedreigende vormen van kanker bij zowel vrouwen als mannen. Veelal
komt colorectale kanker niet meer dan één keer in een familie voor. In ongeveer 20% van alle
gevallen echter blijken er in de familie meer dan één persoon met colorectale kanker voor te
komen. Dit maakt het aannemelijk dat erfelijke factoren een belangrijke rol spelen in het
ontwikkelen van deze vorm van kanker. Er vallen enkele duidelijk verschillende erfelijke
colorectale kanker-syndromen te onderscheiden. Het meest voorkomende kanker-syndroom
wordt aangeduid als “Hereditair (oftewel erfelijk) Non-Polyposis Colorectaal Carcinoom”,
afgekort als HNPCC. Deze term geeft aan dat patiënten colorectale tumoren hebben, zonder
dat er sprake is van een groot aantal poliepen, een verschijnsel dat wel bij andere erfelijke
colorectale kanker-syndromen wordt waargenomen. HNPCC wordt klinisch gedefinieerd op
basis van een aantal criteria, welke de “Amsterdam criteria” worden genoemd, o.m.
inhoudend het voorkomen van colorectale kanker in de familie in meerdere generaties
(positieve familie-historie), en dan ook nog op jonge leeftijd (tenminste bij één patiënt
gediagnostiseerd onder het 50ste levensjaar). Bij zulke patiënten worden regelmatig meerdere
primaire tumoren gevonden, veelal in het eerste deel van het colon. Wat verder opvalt, is dat
naast colorectale tumoren ook bepaalde andere typen tumoren in dergelijke families kunnen
voorkomen (zie Hoofdstuk 1).
Sinds 1993 zijn in vijf zogeheten “mismatch repair genen” (MMR genen)
kiembaanmutaties geïdentificeerd in HNPCC patiënten. Deze MMR genen coderen voor
eiwitten die betrokken zijn bij het herstel van DNA fouten die optreden gedurende de DNA
replicatie. Als een mismatch repair eiwit ontbreekt, zal als gevolg hiervan een ophoping van
somatische mutaties optreden. Deze mutaties kunnen zowel optreden in coderende sequenties
(gen-sequenties die coderen voor eiwitten) als in niet-coderende sequenties. Indien dergelijke
mutaties ontstaan in de coderende sequenties van specifieke oncogenen en tumorsuppressorgenen, betrokken bij de regulatie van cel-groei en cel-dood, en niet worden hersteld kunnen
zich tumoren ontwikkelen. Vooral worden frameshift-mutaties gezien als gevolg van kleine
deleties en inserties in opeenvolgingen van adeninen in de coderende sequentie van genen.
Een voorbeeld van een tumorsuppressor-gen met zo’n adenine-reeks waarin veelvuldig zulke
mutaties worden aangetroffen, is TGFßIIR, het gen dat codeert voor de “transforming growth
factor ß II receptor”. In niet-coderende repeterende sequenties (microsatellieten), kunnen
somatische mutaties in de vorm van inserties en deleties worden gevonden door via PCR
tumor DNA te vergelijken met DNA uit normaal weefsel van dezelfde patiënt. Bij een verschil
tussen tumor en normaal weefsel spreken we van microsatelliet instabiliteit (MSI). Het is deze
instabiliteit in tumoren van HNPCC patiënten die veelal als een eerste aanwijzing wordt
gezien voor een betrokkenheid van mismatch repair genen bij HNPCC (Hoofdstuk 1).
Het MMR systeem is voor het eerst beschreven bij bacteriën. Later werden dergelijke
systemen ook gevonden bij gisten en bij de mens. In bacteriën blijken drie eiwitten cruciaal te
zijn voor het herstel van DNA schade, namelijk MutS, MutL en MutH. Deze eiwitten maken
deel uit van een zogeheten “methyl-directed pathway”, een systeem dat reparaties uitvoert aan
base-base mismatches en kleine inserties en deleties die gedurende de DNA replicatie
optreden. In gisten en in de mens zijn verschillende aan de bacteriële MutS en MutL verwante
eiwitten gevonden. In de mens zijn tot nu toe acht bewezen of waarschijnlijke MMR genen
geïdentificeerd (hMSH2, hMSH3, hMSH5, hMSH6, hMLH1, hPMS1, hPMS2, en hEXO1)
(Hoofdstuk 2).
138
Er zijn testen ontwikkeld om MSI vast te stellen en om mutaties in MMR genen,
voornamelijk in hMSH2 en hMLH1, te kunnen identificeren. Van de diverse moleculaire
technieken die worden gebruikt om deze mutaties aan te tonen, wordt denaturerende gradiënt
gel electroforese (DGGE) over het algemeen beschouwd als de beste initieel te gebruiken
methode, omdat daarmee in principe iedere mutatie kan worden gedetecteerd. Om op een
snelle, efficiënte en zo volledig mogelijke manier mutaties te kunnen detecteren, hebben wij
een methode ontwikkeld, twee-dimensionale (2D) DNA electroforese, waarbij PCR produkten
op zowel lengte als op uitsmeltgedrag (DGGE) worden geanalyseerd. Door de combinatie van
technieken kunnen meerdere fragmenten tegelijkertijd worden geanalyseerd, zodat multiplexPCR kan worden toegepast. Dit spaart tijd en geld. Onze meest recente protocollen zijn
opgenomen in Appendix 2. Wel moet worden opgemerkt, dat 2D DNA-electroforese, en
hetzelfde geldt voor reguliere DGGE, slechts bedoeld is om kleine mutaties aan te tonen. Voor
het aantonen van grote deleties of duplicaties zijn andere methoden, zoals Southern-analyse
en RT-PCR onontbeerlijk (Hoofdstuk 3).
We hebben de 2-D methodologie toegepast voor het detecteren van mutaties in de MMR
genen hMSH2, hMLH1 en hMSH6 (Appendices 3-6). Een combinatie van RT-PCR voor de
detectie van grote rearrangementen en 2-D DNA electroforese voor de detectie van kleine
mutaties van zowel hMSH2 en hMLH1 resulteerde in een mutatiedetectie opbrengst van 86%
(30/35) in HNPCC families afkomstig uit Finland (Appendix 3). Het illustreert dat deze
aanpak zeer bruikbaar is.
Gedurende de afgelopen jaren hebben vele studies laten zien dat MMR genen betrokken
zijn bij het ontstaan van HNPCC. Tot nu zijn 219 verschillende kiembaan MMR mutaties
gerapporteerd bij de “International Collaborative Group on HNPCC” (ICG-HNPCC). Van
deze mutaties werden er 85 geïdentificeerd in hMSH2 en 129 in hMLH1. Slechts twee
mutaties werden gerapporteerd in hMSH6, twee in hPMS2 en één in hPMS1. Behalve kleine
mutaties zijn ook grote deleties van hMSH2 gevonden in een aanzienlijk percentage van de
HNPCC-families. Mutaties in hMSH2 en hMLH1 zijn verantwoordelijk voor HNPCC in
ongeveer 60% van de families die voldoen aan de Amsterdam criteria.
De grote meerderheid (85-90%) van alle tumoren van HNPCC patiënten laat microsatelliet
instabiliteit zien (zijn MSI-high). Kiembaanmutaties in hMSH2 en hMLH1 worden vrijwel
uitsluitend gevonden in patiënten met tumoren die MSI-high zijn. Daarom wordt de MSI
status in combinatie met een specifieke familie-historie veelal gebruikt als inclusie criterium
voor mutatie analyse van hMSH2 en hMLH1 en wordt de MSI analyse als een aantrekkelijke
eerste onderzoeksmethode beschouwd, voorafgaande aan eventuele mutatie-analyse.
In echte HNPCC-families en in HNPCC-achtige families (waarin niet alle Amsterdam
criteria opgaan) waarbij tumoren geen MSI laten zien (MSI-low zijn), worden zelden MMR
mutaties gevonden. Het blijkt dat 10-15% van de tumoren van HNPCC patiënten en een
meerderheid van de tumoren van HNPCC-achtige patiënten MSI-low is. Aan deze mensen
kan daarom weinig tot niets geboden worden wat betreft DNA diagnostiek. Wij vroegen ons
evenwel af of een MSI-low fenotype in een tumor inderdaad betekent dat MMR genen niet
betrokken kunnen zijn bij het ontwikkelen van deze tumor. Omdat MSI wordt bepaald met
behulp van een lengte-analyse van microsatellieten, worden veranderingen die niet gepaard
gaan met lengteveranderingen, niet opgemerkt. Het zou dus kunnen, dat in een MSI-low
tumor een type MMR gen, betrokken bij de reparatie van andersoortige mutaties, gemuteerd
is. Argumenten ten gunste van deze hypothese werden in de literatuur gevonden in
onderzoeken uitgevoerd bij gisten en muizen. Die wezen uit, dat reparatie van base-base
mismatches, die zich presenteren als MSI-low, wordt uitgevoerd door onder andere MSH6
(ook wel GTBP genoemd). Gezien deze bevindingen zou hMSH6 wel eens gemuteerd kunnen
139
zijn in de HNPCC en HNPCC-achtige families met MSI-low tumoren. Om deze hypothese te
toetsen, hebben we 2-D DNA-electroforese gebruikt om het gen te scannen op kiembaan
mutaties in drie HNPCC families met MSI-low tumoren en in achttien HNPCC-achtige
families met MSI-low tumoren. Als controlegroep werden achttien HNPCC-achtige families
met MSI-high tumoren gebruikt. Vier vermoedelijk pathogene mutaties werden gevonden in
de HNPCC-achtige families met MSI-low tumoren (22%) en in één van de drie HNPCC
families. In de controle groep werd één mutatie gevonden. Deze patiënt had echter naast de
hMSH6 mutatie ook een hMLH1 mutatie. Het zou deze hMLH1 mutatie kunnen zijn, die de
MSI-high status van de tumor verklaart. Onze resultaten geven aan dat hMSH6 een
belangrijke rol speelt in een substantieel deel van de HNPCC en HNPCC-achtige families met
MSI-low tumoren. Er kan verder uit worden geconcludeerd, dat het gebruik van de MSI-high
status van tumoren als inclusie criterium voor mutatie-detectie in het algemeen, niet langer
gebruikt zou moeten worden (Appendix 4).
In een andere studie hebben we 33 sporadische colorectale tumoren met een MSI-high
fenotype gescreend op mutaties in hMSH2 en hMLH1 met behulp van 2D DNA electroforese.
We vonden behalve somatische mutaties (in acht gevallen) ook twee kiembaan-mutaties. De
beide patiënten bij wie een kiembaan-mutatie werd gevonden, behoorden tot de slechts vier
patiënten bij wie een colorectale tumor voor het 50ste levensjaar werd gediagnostiseerd. We
mogen dus concluderen, dat mutaties in hMSH2 en hMLH1 kunnen bijdragen aan het
ontstaan van sporadische colorectale tumoren, maar ook dat jonge patiënten met wat een
“sporadische” MSI-high colorectale tumor lijkt te zijn, een grote kans hebben drager te zijn
van een kiembaan-mutatie in hMSH2 of hMLH1 (Appendix 5).
Omdat voor erfelijkheidsvoorlichting het wel of niet vinden van een kiembaan-mutatie van
wezenlijk belang is, hebben we veel aandacht besteed aan het nog verder verbeteren van de
DGGE techniek (Appendices 6-8). Zo vonden we, dat met het aanbrengen van een aantal
kleine veranderingen in de primers en in de positie van de primers, een substantiële
vermindering van het aantal benodigde PCR sets kon worden bewerkstelligd, en tevens dat
mutaties die eerder werden gemist, nu wel konden worden geïdentificeerd (Appendix 6).
Behalve naar de selectie van primers, is ook gekeken naar de gel-condities en de manier
waarop dergelijke gels worden gerund. Duidelijk werd, dat er grote verschillen bestaan in
resultaten verkregen onder verschillende gel- en run omstandigheden. Als voorbeeld kan
worden genoemd het gebruik van een 9% in plaats van een 6% polyacrylamide gel zoals thans
in de meeste laboratoria gebruikelijk is. De 9% gel gaf een veel hogere resolutie en de
mutatie-detectie wordt hierdoor aanzienlijk verbeterd (Appendix 7). Om de detectie van
mutaties in GC-rijke PCR fragmenten te verbeteren hebben we een nieuw gel-systeem
ontworpen welke twee technieken combineert, namelijk DGGE en een variant van DGGE,
constante denaturende gel electroforese (CDGE). Voor deze combinatie is gekozen om de
voordelen van beide technieken te benutten. Het DGGE-gedeelte van de gel zorgt voor een
goede detectie van wat wordt genoemd de heteroduplex moleculen, terwijl het CDGE-gedeelte
van de gel er voor zorgt dat de fragmenten niet volledig uitsmelten, een probleem dat zich
veelvuldig bij GC-rijke PCR fragmenten voordoet. Met deze combinatie van technieken bleek
de detectie van mutaties in GC-rijke fragmenten inderdaad sterk te worden verbeterd
(Appendix 8).
140