SAMENVATTING

SAMENVATTING
Samenvatting
Coeliakie is binnen de Westerse samenleving een veelvoorkomende
voedingsintolerantie en heeft een prevalentie van ongeveer 1%. In de vroege
kindertijd, wanneer een overgang wordt gemaakt naar glutenbevattend voedsel
(m.n. tarwegerelateerde producten), manifesteert de ziekte zich middels vette
diarree, buikkrampen, en een opgezette buik. In haast alle gevallen verdwijnen
deze klachten als de patiënten overgaan op een glutenvrij dieet. Echter, in
moderne samenlevingen die gekenmerkt worden door een hoge standaard van
pediatrische zorg, is er een toenemende groei waarneembaar van patiënten
die coeliakie vertonen als adolescent en volwassene. In deze leeftijdsgroepen
vertonen coeliakiepatiënten minder specifieke klinische verschijnselen zoals
oververmoeidheid, bloedarmoede, botontkalking, groeiachterstand, dermatitis
herpetiformis (coeliakie van de huid) en mogelijk ook voortplantingsproblemen.
Ongeacht de klinische presentatie van coeliakie, zij is het gevolg van een door
gluten veroorzaakte ontsteking van de dunne darm. Deze ontsteking leidt
tot de kenmerkende veranderingen in het slijmvlies (mucosa) van de dunne
darm: infiltratie met lymfocyten in het epitheel en de dieper gelegen lamina
propria; vergroting van de tussen de darmvlokken (villi) gelegen crypten (crypt
hyperplasie); en het verlies van de darmvlokken (villeuze atrofie). Zo krijgt de
darm het uiterlijk van een ‘gladde darm”. Deze ontsteking veroorzaakt ook een
verhoogde doorlaatbaarheid van de darmwand voor zouten en suikermoleculen (de
zgn. ‘lekke darm’). Het verlies aan darmvlokken heeft een dramatische afname van
het opnameoppervlakte tot gevolg en leidt tot voedingdeficiëntie in onbehandelde
patiënten, resulterend in een gevarieerd beeld van chronische gezondheidsklachten.
Coeliakie is een multifactoriële ziekte, wat betekent dat het wordt veroorzaakt
door een interactie van omgevingsfactoren (bijv. gluten; borstvoeding; infecties) and
erfelijke factoren (risicogenen). De genetisch bedrage aan coeliakie komt duidelijk
aan het licht door het verhoogde herhalingsrisico bij nakomelingen waarvan er
één is aangedaan, en door het vergelijken van het risico bij eeneiige en twee-eiige
tweelingen. Ook patiënten met een auto-immuunziekte hebben een verhoogde kans
om coeliakie te ontwikkelen, wat duidt op gedeelde risicogenen en veroorzakende
mechanismen. De belangrijkste risicofactoren om coeliakie te ontwikkelen zijn
de genen gelegen binnen het MHC-complex op chromosoom 6p21.3 die coderen
voor de heterodimeren HLA-DQ2 en HLA-DQ8. De aanwezigheid van de MHCgenen die coderen voor deze HLA moleculen dragen ‘slechts’ voor 40% bij aan het
totale genetische risico. De aanwezigheid van deze genvarianten is noodzakelijk,
maar niet afdoende om coeliakie te ontwikkelen. Coeliakie is een complexe
genetische aandoening, wat betekent dat meerdere genen, elke met een bescheiden
risicobijdrage, betrokken zijn bij het ontstaan van de ziekte. De identiteit van
deze genen, hun totale aantal, en de combinatie waarin zij voorkomen is voor het
grootste deel nog een raadsel. In dit proefschrift hebben we gebruik gemaakt van
197
Samenvatting
een combinatie van genetische en genexpressie methoden om genen en moleculaire
paden te identificeren die bijdragen aan de oorzaak en de pathologie van coeliakie.
De hoofdstukken 1 en 2 verschaffen meer achtergrondinformatie over coeliakie
in het algmeeen en verder een overzicht van de diverse methoden voor
genetisch onderzoek die eerder zijn toegepast. Verder wordt het vaststellen van
genexpressieprofielen besproken als methode om inzicht te verkrijgen in de
pathologie. Middels de identificatie van door de ziekte beïnvloede moleculaire
paden kan dit een bijdrage leveren aan genetische studies. Nadruk wordt gelegd op
de integratie van genetica en ‘genomics’ voor de identificatie van kandidaatgenen en
gennetwerken die betrokken zijn bij de pathogenese.
In sectie II worden ‘high-throughput’ technologieën toegepast voor het
bestuderen van genexpressie in de mucosa van de duodenum (twaalfvingerige
darm) in coeliakiepatiënten. In hoofdstuk 3 hebben we het effect onderzocht dat
weefselheterogeniteit mogelijk zou hebben op het vaststellen van genexpressie.
Waargenomen werd dat de mate van ontsteking en de differentiatiegraad van
de mucosa (weergegeven door de expressie van IFNG, respectievelijk TM4SF4)
omgekeerd evenredig waren en afhankelijk van de mate van weefselveranderingen
in de mucosa. Opmerkelijk genoeg was de variatie in genexpressie tussen
afzonderlijke monsters van dezelfde persoon min of meer onafhankelijk van de
variatie in weefselstructuur van dezelfde monsters. Deze variatie in genexpressie
was ook aanwezig, en in de zelfde mate, in controle monsters. Dus, variaties in
genexpressie zijn aanwezig ongeacht het pathologisch stadium van de darm.
Dit heeft geleid tot het poneren van een model waarin een mozaïek patroon
van genexpressie in de duodenum kan resulteren in weefselheterogeniteit o.i.v.
veranderingen in de ontstekingsgraad.
Hoofstukken 4 en 5 beschrijven het gebruik van microarrays* voor
de bestudering van genoomwijde genexpressie in de duodenum van
coeliakiepatiënten. De twee studies verschilden in het type microarray (cDNA of
oligonucleotiden) en het soort patiëntenmonsters (patiënt-controle of herstelreeks)
dat werd gebruikt. De twee groepen van differentieel tot expressie komende
genen was nauwelijks overlappend, hoewel de biologische processen die ze
vertegenwoordigden wel vergelijkbaar waren. De veranderingen geïnduceerd
door coeliakie wijzen op een verhoogde celdeling in de mucosa die gepaard
gaat met een onvolledige ontwikkeling van de darmcellen (enterocyten). Dit
ontwikkelingsdefect verstoort m.n. de opname en verwerking van vetten, sterolen,
suikers, eiwit(fragmenten), en ijzer. De resulterende deficiënties dragen mogelijk
bij aan het gevarieerde klinische beeld van coeliakie. Ook werd aantasting van
het ontgiftingssysteem waargenomen dat reeds eerder was beschreven voor dikke
198
Samenvatting
darmontstekingen (IBD). Mogelijk wordt IBD net als coeliakie gekenmerkt door een
defect in de ontwikkeling van darmcellen.
In sectie III bespreken we de analyse van moleculaire paden bij de uitvoering
van genetische (hoofdstuk 6) en genexpressie (hoofdstuk 7) studies. Hierbij
richtten we ons op het ‘tight junction’ gennetwerk, dit mede gebaseerd op de
verhoogde darmpermeabiliteit in coeliakiepatiënten en het eerder geïdentificeerde
risicogen MYO9B. Het expressiepatroon van genen uit de claudin-familie bleek
geconserveerd te zijn gebleven gedurende minstens 75 miljoen jaren van evolutie.
Drie paren van claudin-genen vertoonden een synchrone regulatie. Patiënten
lieten dynamische patronen van claudin genexpressie zien met vaak opmerkelijk
afwijkende waarden. Met name genen betrokken bij signaaloverdracht en
regulering van het celskelet vertoonden de tendens tot verandering in genexpressie.
Patiënten gaven ook een opmerkelijke verhoging in expressie van het groeifactorgen
EGF te zien. Hetzelfde gennetwerk werd ook onderzocht voor genetische associatie
waarbij gebruik gemaakt werd van varianten van enkelvoudige nucleotiden (SNPs)
en informatie over de ‘linkage disequilibrium’ structuur van het genoom afkomstig
van het International HapMap Consortium. Twee ‘tight junction’ genen werden
geïdentificeerd die geassocieerd bleken met coeliakie, en in mindere mate ook met
dikke darmontsteking (IBD). Mogelijk delen beide darmaandoeningen, coeliakie en
IBD, een genetisch defect in de darmbarrière.
De adaptieve respons van het immuunsysteem in coeliakiepatiënten,
opgeroepen door gluten, wordt gekarakteriseerd door een T helpercel type 1
activatie waarbij interferon-gamma een cruciale rol speelt. In sectie IV waar we
kandidaatgenen onderzoeken met betrekking tot immuniteit, beschrijven we de
genetica en genexpressie van IFNG. In hoofdstuk 8 laten we zien dat de mate
van weefselverandering in de mucosa gecorreleerd is met het niveau van IFNG
genexpressie. Een studie uitgevoerd met de ‘CA-repeat’ uit het eerste intron van
het IFNG gen (een veelgebruikte merker), vertoonde geen genetische associatie
binnen onze Nederlandse patiëntengroep. In hoofdstuk 9 werd het IFNG gen
weer getest, maar nu met SNP merkers, en werd een zwakke genetische associatie
aangetoond met coeliakie binnen de Nederlandse bevolking. Tot slot hebben we
ook een genetische en genexpressiestudie uitgevoerd naar vier leden uit de familie
van SPINK (serine protease remmers van het Kazal type) genen. SPINK-genen
zijn betrokken bij bescherming van weefsels en inperking van bacteriële groei, en
kunnen worden beschouwd als onderdeel van de aangeboren immuniteit. Drie
van deze vier SPINK genen liggen binnen twee kandidaatgebieden voor coeliakie
(chromosomen 5q32 en 9p21-13), wat hun tot aantrekkelijke positionele en
functionele kandidaatgenen maakte. Echter, geen van deze SPINK-genen bleek
genetisch geassocieerd met coeliakie binnen de Nederlandse bevolking.
199
Samenvatting
Ter afsluiting wordt in de Discussie een evaluatie gegeven van onze
onderzoeksbenadering met interpretaties van de behaalde resultaten in de context
van andere onderzoeken. Deze worden dan verwerkt in modellen m.b.t. de
mogelijke oorzaak en het verloop van de ziekte coeliakie.
*) microscopisch kleine druppeltjes met het DNA van meer dan 20.000 afzonderlijke
genen, aangebracht op vlakke glaasjes en geordend in een rasterpatroon)
200