Genetische scherpschutter

Genetische scherpschutter
NRC, 21 februari 2004
Een klein molecuul, pas zes jaar geleden ontdekt, verandert de hele biologie. Want RNAi legt heel specifiek genen het
zwijgen op.
Biologen van het Nederlands Kankerinstituut (NEI) in Amsterdam hebben gekweekte menselijke tumorcellen terug veranderd
in gezonde cellen. Ze deden dat door een kankerverwekkend gen in de tumorcel uit te schakelen, met behulp van een
genetisch mechanisme dat pas vijf jaar geleden werd ontdekt: RNAi. RNAi is een van de vormen van RNA. RNA lijkt op DNA en
speelt een belangrijke rol bij de aanmaak van eiwitten op basis van de erfelijke code in het DNA. De i in RNAi staat voor
interference. "Ik durf gerust te stellen dat RNAi in de biologie de belangrijkste ontdekking van het laatste decennium is", zegt
geneticus prof.dr. Ronald Plasterk in zijn werkkamer in het Utrechtse Hubrechtlaboratorium, waarvan hij directeur is. "Dat
zeg ik niet omdat ik daar toevallig zelf aan werk, maar vooral omdat we in de wetenschap zo langzamerhand waren gaan
denken dat we de basale mechanismen van het leven wel zo'n beetje kenden. En dan duikt er op eens zo'n geheel nieuw
regelproces op. Een mechanisme bovendien dat bijna universeel is; het komt voor bij schimmels, planten en dieren. Alleen in
bacteriën komt het niet op grote schaal voor."
Pas sinds kort doorgronden wetenschappers de functie en werking van RNAi (zie kader). Maar het vooruitzicht dat met deze
techniek gericht genen uitgeschakeld kunnen worden heeft tientallen farmaceutische ondernemingen en academische
wetenschappers geïnspireerd om te investeren in het onderzoek naar RNAi. Maar het is op dit moment nog de vraag of RNAi
zich zal ontwikkelen tot de magic bullet die allerlei ziektegenen selectief kan uitschakelen. "Kanker is een genetische
ziekte", zegt de Israëlische onderzoeker Reuven Agami van de afdeling tumorbiologie van het NKI, die samen met zijn
collega's Thijn Brummelkamp en René Bernards via RNAi tumorcellen wist uit te schakelen. "Een tumorcel is genetisch
ontregeld door mutaties die in het DNA zijn opgetreden. In een tumor die al een tijd bestaat vind je altijd veel mutaties.
Maar er zijn slechts een een paar mutaties die de kanker hebben veroorzaakt. Vijf tot tien mutaties zijn genoeg om een
gezonde cel te veranderen in een ongebreideld delende tumorcel. Als je er daarvan een of twee kunt stilleggen, verliest de
tumorcel zijn tumoreigenschappen en kan niet verder leven."
SIMPEL Agami stopte woekerende tumorcellen in een weefselkweek, nadat hij het zogeheten RAS-oncogen met RNAi had
stilgelegd (Cancer Cell, september 2002). "Omdat het in celkweek zo simpel ging, was het het verleidelijk om hetzelfde in
een muis te proberen", vertelt hij. "Nu snel het oncogen ook in een levend dier met RNAi uitschakelen, dachten wij
optimistisch. We hebben het één keer geprobeerd, maar we slaagden er niet in alle cellen te bereiken. De tumor kregen we
dus niet weg." Volgens Agami is een RNAi-therapie tegen kanker op dit moment nog ver van de werkelijkheid. "In celkweek
hebben we bewezen dat RNAi een tumorcel kan stoppen, maar in patiënten heb je te maken met compacte tumoren,
waarbinnen het moeilijk is om alle cellen te bereiken. En dat is nodig om de kanker uit te roeien. Want stel dat je vijf
procent van de tumorcellen mist, dan groeit er binnen een maand weer een nieuwe tumor. We moeten methoden zien te
vinden die de hele tumor kunnen aanpakken, en daar is nog geen zicht op." RNAi-therapie is op de wat kortere termijn
waarschijnlijk wel toepasbaar bij de behandeling van infecties zoals HIV en het herstellen van stamceldeficiënties, denkt
Agami. Daarbij zullen de stamcellen uit de patiënt worden gehaald om ze vervolgens buiten het lichaam te behandelen met
RNAi. "Door met RNAi bijvoorbeeld de receptor op de buitenkant van de cel waarlangs het aidsvirus binnenkomt weg te
halen, blijkt het virus de cellen in kweek niet meer te kunnen infecteren. In het geval van een aidsvirus zou het overigens
wenselijk zijn om meer dan één doel te kiezen en bijvoorbeeld ook de genen van het virus zelf aan te vallen met RNAi. Door
diverse genen in de keten plat te leggen, kun je de infectie met het virus uiteindelijk volledig elimineren." Collega Plasterk is
aanmerkelijk sceptischer. "Op papier en in weefselkweek is RNAi het gedroomde medicijn", zegt hij. Maar voor daadwerkelijk
gebruik in patiënten is er volgens Plasterk nog een zeer lange weg te gaan. "Na 15 jaar ervaring met antisense-therapie
waarbij ook genen zouden worden stilgelegd zijn we wel wat bescheidener geworden. Het is vooralsnog een rottige
therapie." Plasterk: "De verwachtingen zijn heel groot, maar het is nog veel te vroeg om halleluja te roepen. Als we RNAi
roetbehulp van een virus zouden inbrengen, komen we weer terug bij de klassieke problemen die er zijn met gentherapie. En
hoewel ik mijzelf niet tot de boosdoeners reken, heeft mijn vakgebied zich eerder vergaloppeerd aan het wekken van hoge
verwachtingen ten aanzien van gentherapie. De balans tussen de hoeveelheid patiënten die erdoor is genezen en het aantal
dat eraan is overleden, is nog altijd negatief. We moeten nieuwe technologie niet verkopen, voordat bewezen is dat het
goed werkt. Anders doen we onwetenschappelijke uitspraken."
RAZENDSNEL Maar afgezien van toekomstige therapeutische toepassingen hebben wetenschappers met RNAi een zeer krachtig
experimenteel hulpmiddel in handen. Plasterk: "De invloed van RNAi op de vorderingen in het genetisch onderzoek is
gigantisch. In het wormpje Caenorhabditis elegans, waaraan ik werk, hebben we bijvoorbeeld razendsnel de functie van alle
genen kunnen onderzoeken. Het grappige voordeel van C. elegans is datje deze diertjes gewoon dubbelstrengs RNA kunt
voeren en dat dan de specifieke genen in het hele lichaam, behalve de hersenen, worden uitgeschakeld. Anders dan in
celkweek kun je het effect van RNAi in het hele lichaam bestuderen, bijvoorbeeld of het uitschakelen van een bepaald gen
leidt tot leermoeilijkheden in het dier. Het leent zich bovendien voor grootschalige analyse. Je kunt duizenden wormpjes op
microtiterplaten zetten en zo binnen een week of drie alle 20.000 genen van het dier een voor een uitschakelen."
Ook het onderzoek naar menselijke genen is erdoor in een stroomversnelling gekomen. Agami en zijn collega's speelden
daarbij een belangrijke rol. In 2001 bewees de Duitse wetenschapper Tom Tuschl dat RNAi ook in menselijke cellen een rol
speelt. Korte stukjes dubbelstrengs RNA van 20 tot 25 nucleotiden lengte bleken de normale functie van genen te
inactiveren. Het probleem was echter dat het blokkerende effect van het RNA maar kort aanhield; de cel breekt het
dubbelstrengs RNA snel weer af. Reuven Agami verzon een oplossing voordat probleem: "Ik bedacht datje de voorraad
dubbelstrengs RNA in de cel op peil kunt houden door een stukje kunstmatig DNA in de cel te brengen om dat als een normaal
gen te laten aflezen. Het stukje DNA was zo ontworpen dat het een stuk van 19 nucleotiden bevatte met een code die bij
een bepaald gen paste, een stuk van 9 nucleotiden tussenruimte, tenslotte gevolgd door een stuk van 19 nucleotiden dat
complementair is aan de eerste code. Als dat gen in de cel wordt afgelezen, ontstaat een RNA-molecuul dat op zichzelf kan
terugvouwen als een haarspeld. Het teruggevouwen stuk van 19 nucleotiden vormt zo dubbelstrengs RNA dat de RNAimachinerie in de cel vervolgens omzet in een stukje enkelstrengs RNA. Dat kan op zijn beurt de functie van een specifiek gen
onderdrukken."
Aanvankelijk bracht Agami het construct in de cel als een plasmide, een cirkelvormig stukje DNA. Maar al snel stapte hij over
op een verbeterd systeem waarbij een omgebouwd retrovirus werd gebruikt om het DNA in de cel af te leveren. Op die
manier kon de overdracht van het DNA nog efficiënter gebeuren. De publicatie over de vinding, die op 19 april 2002
verscheen in Science, veroorzaakte een ware stormloop van collega-onderzoekers op het NKI, vertelt Agami: "Binnen enkele
maanden na het verschijnen van het artikel kregen we meer dan duizend verzoeken van wetenschappers uit de hele wereld
die ons materiaal wilden gebruiken voor hun eigen onderzoek." Trots toont Agami een plank met tientallen ordners vol
contracten voor materiaalgebruik: "Er waren zoveel verzoeken dat ik zelf niet meer aan onderzoek toe kwam. Ik had er haast
spijt van dat we onze methode hadden gepubliceerd."
OCTROOI Om hun handen weer wat vrij te hebben, vroegen de onderzoekers van het NKI octrooi aan op de techniek en gaven
deze in licentie aan het Amerikaanse bedrijf OligoEngine, dat nu alle verzoeken van wetenschappers afhandelt. "Zij leveren
onze spullen en nog wat meer wat zij er zelf bij gemaakt hebben", zegt Agami. Dat de haarspeldtechniek in korte tijd zo
populair is geworden, kan Agami wel begrijpen: "De methode is goedkoop, nuttig en zo eenvoudig dat iedereen het kan
uitvoeren in zijn eigen laboratorium. In mensen en andere zoogdieren was het altijd moeilijk om bepaalde genen uit te
schakelen. Het maken van knockouts was de enige werkbare manier en dat was bijzonder tijd- en geldverslindend. Een
knockout-muis maken kostte bijvoorbeeld vierjaar.
"RNAi is veel sneller en goedkoper. Daarom is het in een klap mateloos populair geworden. In de twee jaar tijd die nu
verstreken zijn sinds onze publicatie is ons artikel al meer dan 500 keer geciteerd door anderen. Dat is echt ongelooflijk.
RNAi is nu verplichte kost geworden voor genonderzoekers. Een artikel dat zonder RNAi-analyse bij een tijdschrift wordt
ingeleverd loopt grote kans niet door de reviewers geaccepteerd te worden. De ontdekking van RNAi heeft de hele biologie
veranderd."
WONDER Nu noemt Agami het "een kleinwonder" dat zijn haarspeldmethode onmiddellijk zo goed werkte in de menselijke
cellen. "Achteraf is dat ook wel verklaarbaar, want het blijkt dat de natuur dezelfde machinerie gebruikt. Het zogeheten
microRNA maakt ook gebruik van RNA-haarspelden. De RNAstructuurtjes die wij inbrachten werden door de cel dus
onmiddellijk herkend als authentiek. MicroRNA is belangrijk tijdens de embryonale ontwikkeling." De haarspeldtechniek leent
zich door zijn eenvoud ook voor grootschalige gerobotiseerde proeven waarbij vele genen tegelijk getest worden. Kort
beschrijft Agami hoe dat onderzoek in zijn werk gaat: "We maken een bibliotheek van duizenden verschillende plasmiden
verpakt in retrovirussen. Elk plasmide is gericht tegen een bepaald gen. Uit ervaring weten we dat het in ongeveer eenderde
van de gevallen lukt om een gen met RNAi stil te krijgen. Daarom hebben we in de proef drie plasmiden per gen gebruikt,
waarbij de code van de haarspeld telkens gericht is tegen een ander deel van het gen. René Bernards, zijn collega's en ik
hebben 8000 menselijke genen gekloond, ruwweg eenderde van het gehele menselijke genoom. Op basis daarvan maakten
wij 24.000 constructen gericht tegen die genen." In de omvangrijke test richtte Agami's groep zich in eerste instantie op het
identificeren van tumor-onderdrukkende genen. Op deze manier hebben zij twee nieuwe tumor-onderdrukkende genen
ontdekt, en hoe zij werken. Binnenkort zullen zij de eerste resultaten van dat onderzoek publiceren.
DOOD AAN DE BOODSCHAPPER
Zesjaar geleden deden de Amerikaanse celbiologen Andrew Fire en Craig Mello bij toeval een spectaculaire ontdekking (Nature, 19 februari
1998). Fire en Mello bestudeerden de invloed van antisense-RNA op de genen van het wormpje Caenorhabditis elegans. Antisense-RNA
bevat een genetische code die precies complementair is aan de code van een gen. Het idee van Fire en Mello was dat als zij het antisenseRNA in de cellen van het wormpje zouden injecteren, dit precies op een bepaald gen zou plakken. Zo zouden zij dat gen specifiek kunnen
onderdrukken. Het lukte aanvankelijk maar matig. Totdat de biologen door een foutje toevallig dubbelstrengs-RNA inspoten. Het bedoelde
gen, unc-22, lag in één keer stil. De wormpjes die met dubbelstrengs RNA waren behandeld zagen er hetzelfde uit als wormpjes die door een
genetische verandering het gen unc-22 misten. Het waren strong twitchers, heftige kronkelaars, als gevolg van het verlies van een spiereiwit
waarvoor unc-22 codeert. `Iets' op basis van dubbelstrengs RNA had het gen volledig uitgeschakeld.
Binnen enkele jaren plozen onderzoekers over de hele wereld de moleculaire details van dit mechanisme uit. Hoe dubbelstrengs RNA een
gen het zwijgen kan opleggen is nu in
grote lijnen bekend, maar nog altijd zijn er details onduidelijk. Het dubbelstrengs RNA wordt in de cel in korte stukjes geknipt door een
enzym dat dicer heet. Er ontstaan zogeheten small interfering RNA's, siRNA's. Deze stukjes worden opgepikt door een groot enzymcomplex,
genaamd RISC. RISC maakt de siRNA's enkelstrengs en plakt ze op een passend boodschapper-RNA (mRNA) dat het intermediair is tussen
gen en eiwit. Dan vindt de eigenlijke silencing plaats: het gebrandmerkte mRNA wordt door enzymen afgebroken. Dat verhindert dat het
mRNA in een eiwit wordt omgezet, zoals normaal. Zoals de RNAi-onderzoeker Phil Sharp het in een review samenvatte: `Killing the
messenger' (Nature reviews. Molecular cell biology juni 2003). Onderzoekers spreken van een knockdown in plaats van een knockout, omdat
RNAi een gen meestal niet voor 100 procent uitschakelt. Reuven Agami van het Nederlands Kanker Instituut: "We moeten telkens testen in
welke mate een gen is uitgeschakeld. Het expressieniveau varieert gemiddeld van vijftig tot vijf procent. Als een essentieel gen nog voor vijf
procent functioneert, zijn de cellen wel kreupel en nog maar nauwelijks in leven, maar dan kunnen we de functie van het gen nog wel
identificeren."
Ronald Plasterk van het Hubrechtlaboratorium vult aan: "Enerzijds is het een nadeel datje nog een restfunctie overhoudt, maar aan de andere
kant is het ook een voordeel want mutaties die in een echte knockout dodelijk zijn, blijven als knockdown soms nog wel leven. En dan kun je
de functie van het gen nog bestuderen. Dood is een saai fenotype."
De grote kracht van RNAi is dat het zeer specifiek is. Alleen het mRNA dat precies overeenkomt met de code van het siRNA wordt
uitgeschakeld. In de experimenten van Agami bleek dat RNAi onderscheidt tussen penvarianten die slechts één basenpaar van elkaar
verschilden. Zo was het mogelijk een ontspoord RAS-oncogen uit te schakelen en de andere gezonde kopie in de cel intact te laten. Daarnaast
is het RNAi-systeem extreem gevoelig. Eén RNAi-construct per cel is in principe voldoende om een gen nagenoeg plat te leggen. RNAi is
daardoor handig als onderzoeksinstrument en mogelijk bruikbaar als nieuwe genezingsmethode. Maar wat is de natuurlijke functie? Plasterk
omschreef RNAi tweejaar geleden in een overzichtsartikel (Science, 17 mei 2002) als `het immuunsysteem van het genoom'. Plasterk: "In
planten rekent het RNAi-systeem af met binnendringende dubbelstrengs-RNA-virussen. En in wormen geeft het bescherming tegen
springende genen of transposons, die zo'n twaalf procent van het wormengenoom uitmaken. Als transposons niet onderdrukt worden nestelen
deze stukjes DNA zich op willekeurige plaatsen in het genoom en verstoren op die manier mogelijk allerlei belangrijke genfuncties. René
Ketting in mijn lab ontdekte dat mutanten van C. elegans waarin transposons actief waren, een fout bleken te hebben in de RNAi-machinerie.
Het dubbelstrengs RNA dat uit de transposons voortkomt, wordt in deze mutanten niet herkend, waardoor de springende genen vrij spel
hebben. "In andere dieren zal nog moeten blijken hoe algemeen dit defensiemechanisme is. Waarschijnlijk is RNA-interference essentieel
voor de overleving. Vorig jaar toonden onderzoekers aan dat een zebravis met een mutatie in het dicer-gen (cruciaal voor RNAi) voortijdig
doodgaat." Agami vindt Plasterks metafoor van RNAi als het immuunsysteem van het genoom wat sterk: "Bij mensen werkt het niet zoals bij
wormen. Mensen hebben in vergelijking met wormen de beschikking over een veel beter immuunsysteem dat uitstekend beschermt tegen
virussen en bacteriën. Daarom is het RNAi- beschermingssyteem bij ons niet zo belangrijk als in CG elegans. "Tegelijkertijd valt het echter
op dat RNAi in de evolutie vrijwel compleet is geconserveerd. Dat duidt erop dat het toch onmisbaar is voor het organisme."