Verslag onderzoeksstage “Epidemiologie van Eimeria acervulina b
advertisement
Verslag onderzoeksstage “Epidemiologie van Eimeria acervulina bij vleeskuikens”. Door: Christiaan ter Veen Studentnr: 0249157 Begeleider: F.C. Velkers Datum: 15-09-2008 Inhoud Inhoud: Inleiding …………………………………………………………………………………... 3 Verslag 1: “Transmissie van Eimeria acervullina na inoculatie met 5 oöcysten”……….. 5 Statistiek t.b.v. verslag 1………………………………………………………………….. 17 Verslag 2: “Pre-PCR processing, an overview of methods for developing a real-time PCR to enumerate and speciate Eimeria oocysts in feces.” …………………..…………. 28 5. PCR Eimeria spp, how to go on? ………………………………………………………… 38 1. 2. 3. 4. Inleiding. Mijn onderzoeksstage, verplicht in de functiegerichte fase van de opleiding Diergeneeskunde in Utrecht, heb ik gelopen bij de afdeling Epidemiologie van Infectieziekten van het departement Landbouwhuisdieren van de faculteit Diergeneeskunde te Utrecht. De stage betrof het meewerken aan een pilot van mijn begeleider F.C. Velkers, zij onderzoekt in het kader van haar promotieonderzoek de epidemiologie van Eimeria spp bij pluimvee en heeft in het verleden een aantal soortgelijke experimenten uitgevoerd. Gezien mijn, tijdens de studie opgewekte, interesse in epidemiologie leek dit mij een uitgelezen kans om mij wat meer in dit onderwerp te verdiepen. Dit onderzoek betrof een paartjesexperiment met als doel de beschrijving van de transmissiesnelheid van Eimeria acervulina na inoculatie met een zeer laag aantal oöcysten. Omdat een dergelijk lage inoculatiedosis niet eerder is gebruikt is het onderzoek tevens gebruikt voor het valideren van een methode voor het inoculeren met 5 oöcysten. Aangezien het praktisch experimentele werk ongeveer 1 maand tijd in beslag nam en de twee maanden aan stage die resteerden meer dan voldoende zouden zijn om de data te analyseren en het verslag te schrijven moest er naast het hoofdonderwerp een tweede onderwerp gezocht worden. Dit tweede onderwerp werd gevonden in het veld van de diagnostiek, een ander onderwerp waarvoor ik me interesseer maar dit keer meer vanuit de praktische kant. Vanwege de limieten van de huidige diagnostische methoden (zie het verslag) zou een kwantitatieve PCR een welkome aanvulling zijn voor het (epidemiologisch) onderzoek naar Eimeria spp. Het probleem met deze PCR is inhibitie door bestanddelen in de mest. Daarom heb ik literatuuronderzoek gedaan naar methoden om de inhibitie te omzeilen of op te heffen. Ten slotte heb ik het hoofdstuk “PCR Eimeria, hoe nu verder?” geschreven, dit is bedoeld als aanvullende handleiding op het literatuuronderzoek en beschrijft hoe ik de PCR zou ontwikkelen. De verslaglegging van de onderzoeksstage moet in de vorm van een wetenschappelijk artikel. Hoewel beide onderwerpen in theorie in één artikel beschreven kunnen worden zou dit met betrekking tot de verschillende doelgroepen niet wenselijk zijn. De onderwerpen verschillen namelijk dusdanig van elkaar dat mensen die in het ene geïnteresseerd zijn niet automatisch ook in het andere geïnteresseerd zijn. Wat betreft de PCR maakt het mijn begeleider niet uit wie de techniek ontwikkelt, als andere (buitenlandse) onderzoekers baat hebben bij het literatuuronderzoek zijn wij bereid om het document te delen; vandaar dat dit document in het Engels is opgesteld. Voor het gemak en het gebrek aan een doelgroep voor mijn epidemiologieverslag is dit document in het Nederlands gemaakt. Daarnaast kan ik in de twee hoofdverslagen niet uitgebreid ingaan op enkele activiteiten tijdens de onderzoeksstage, vandaar dit samengestelde verslag. Wat betreft het epidemiologisch onderzoek heb ik uiteraard de diagnostische vaardigheden opgedaan die in het verslag beschreven worden: OPG bepaling en bloedafname en het oogsten van serum. Daarnaast heb ik de typische sectiebeelden van verschillende soorten Eimeria gezien en darmafschraapsels met verschillende stadia uit de levenscyclus van de parasiet. Door de dagelijkse omgang met de dieren heb ik ervaring op kunnen doen met het werken in een isolator, het hanteren en verzorgen van vleeskuikens, het nemen van cloaca swabs en individuele mestmonsters en ben ik betrokken geweest bij het euthanaseren van de kippen. Voor het verslag van het epidemiologische deel van het onderzoek heb ik de statistiek uitgewerkt, vanuit de basiskennis overgebleven van het -2- Inleiding vak MES heb ik voor een groot deel uit moeten zoeken welke methodes je wanneer kunt gebruiken. Sommige onderzochte onderwerpen bleken geen significante of interessante waarden op te leveren en zijn daarom buiten het verslag gebleven. Om die reden is een beschrijving van de statistiek toegevoegd aan dit verslag. Van PCR wist ik voor het begin van de onderzoeksstage weinig meer af dan de basisprincipes waarop een kwalitatieve PCR is gebaseerd. Om mijn kennis op dit gebied uit te breiden heb ik de cursus “Molecular Diagnostics” bij het Erasmus Medisch Centrum in Rotterdam gevolgd. Deze cursus gaf naast de voor mij benodigde informatie over hoe verschillende moleculair diagnostische technieken werken een overzicht van toepassingen van deze technieken in de humane geneeskunde en andere (onderzoeks) gebieden. Een aantal van de in de cursus behandelde onderwerpen en de kennis gekregen door het inlezen in de PCR technieken zijn in het verslag beschreven. Aan praktisch onderzoek met betrekking tot dit onderwerp heb ik wel wat gedaan maar niet voldoende om dat in het verslag te verwerken, deze ervaringen zijn ingevoegd in het hoofdstuk “PCR Eimeria spp, how to go on?”. De onderzoeksstage heb ik als zeer nuttig ervaren en was erg leuk om te doen. Tijdens de stage heb ik de meeste fasen van het onderzoek kunnen zien of kunnen uitvoeren, het gaat hierbij om: 1) opzet van het onderzoek, 2) de DEC-aanvraag, 3) voorbereiden van het onderzoek met betrekking tot verzamelen van de materialen, inrichten van de experimentenruimte etc. 4) het uitvoeren van het onderzoek, met name het nemen en analyseren van de monsters 5) analyses van de verzamelde data en hoe deze te interpreteren en 6) verslaglegging in de vorm van een wetenschappelijk artikel en presentatie. Vooral bij de laatste drie punten heb ik meer ervaring op kunnen doen en hopelijk zijn mijn vaardigheden daarin verbeterd. Tijdens het praktische deel heb ik gezien dat dit meer inhoudt dan “eentonig labwerk”, je komt namelijk regelmatig verrassende resultaten of onvoorziene gebeurtenissen tegen waarop je moet zien in te springen. Dit vraagt de nodige flexibiliteit van de onderzoeker en vormt één van de uitdagingen. Daarnaast heb je de vrijheid om deze gebeurtenissen verder uit te diepen. Hieronder zijn de verschillende verslagen te lezen. Als eerste het verslag van het epidemiologisch onderzoek gevolgd door de uitwerking van de statistiek van dit onderzoek. Daarna volgen het literatuuronderzoek voor de PCR en een aantal tips voor degene die dit onderzoek wil voortzetten. Transmissie van Eimeria acervullina na inoculatie met 5 oöcysten. Door: Christiaan ter Veen Samenvatting Verondersteld wordt dat een infectie met Eimeria spp in een koppel pluimvee begint met het opnemen van een klein aantal oöcysten door één of meerdere dieren waarna andere dieren worden geïnfecteerd en de infectie zich door de stal verspreidt. Om een model te maken van deze infectie is een paartjesexperiment uitgevoerd aan de hand waarvan de transmissiesnelheid (β) kan worden berekend. Achttien mannelijke SPF vleeskuikens zijn in groepen van twee gehuisvest, één van de dieren is geïnoculeerd met 5 oöcysten en de oöcystuitscheiding van de kuikens is gedurende de volgende 21 dagen gevolgd. Aan de hand van de gevonden data kon de transmissiesnelheid berekend worden, één geïnfecteerd kuiken kan per dag 0,81 gevoelige dieren infecteren. Verder bleek uit onze proef dat de contactdieren meer oöcysten uitscheiden dan de geïnoculeerde dieren. Inoculatie met 5 oöcysten bleek zeer effectief met behulp van een gelatinecapsule. Inleiding Eimeria acervulina is een parasitaire protozo acervulina heeft een indirecte cyclus waarbij plaatsvindt, deze cyclus heeft twee asexuele en acervulina 96 uur vanaf het moment dat een die bij kippen coccidiose kan veroorzaken. E. een deel van de ontwikkeling buiten het dier één sexuele vermeerderingsfase en duurt voor E. gesporuleerde oöcyste wordt opgenomen totdat -3- Verslag transmissie oöcysten via de mest worden uitgescheiden. In de omgeving sporuleren de oöcysten waarbij zich in de oöcyst 8 sporozoïeten vormen. Pas na de sporulatie is de oöcyste infectieus. (Saif et al, 2005) De cyclus wordt uitgebreider omschreven in bijlage 1. In de pluimveehouderij veroorzaken Eimeria infecties enorme economische schade, als gevolg van productieverliezen en kosten voor preventieve (medicamenteuze) therapie (Saif et al, 2005). Met name in de vleeskuikenhouderij is coccidiose een aanzienlijke kostenpost. Coccidiose kan door verschillende Eimeria spp. worden veroorzaakt, hiervan is E. acervulina één van de minst pathogene. Het hoogtepunt van de koppelinfectie vindt meestal plaats op 4-5 weken leeftijd, maar infectie op latere leeftijd (in individuele dieren) is mogelijk wanneer de verspreiding van de infectie traag op gang is gekomen, bijvoorbeeld wanneer een lage initiële infectiedosis aanwezig was in de stal. (Saif et al, 2005) De ernst van de klinische verschijnselen is afhankelijk van de infectiedosis en de immuunstatus van de kip. De infectie wordt vooral gekenmerkt door groeivertraging en een hogere voederconversie (Saif et al, 2005). Bevestiging van de infectie gebeurt door middel van sectie (Saif et al, 2005) en/of door het tellen van oöcysten met behulp van de McMaster telkamer methode of een sedimentatie-flotatie techniek (Long et al, 1976). Bij veldinfecties wordt vrijwel altijd E. acervulina gevonden, vaak in combinatie met andere Eimeria spp. (Haug et al, 2008; Peek & Landman 2003) De behandeling van coccidiose is meestal preventief en bestaat uit het toedienen van coccidiostatica in het voer. Curatief kan behandeld worden met sulfonamiden, amprolium en toltrazuril. Naast medicatie kan er ook gebruik worden gemaakt van vaccinatie om de klinische verschijnselen te verminderen (Peek & Landman 2003). Daarnaast is het reinigen van de stal en de omgeving van de stal van groot belang om de aantallen oöcysten, waaraan jonge kuikens bij aanvang van de productieronde worden blootgesteld, zoveel mogelijk te beperken. Vaccinatie en een preventieve behandeling met coccidiostatica hebben als bijkomend voordeel dat de kuikens geïnfecteerd worden met een lage hoeveelheid oöcysten, waardoor ze een subklinische infectie doormaken en immuniteit kunnen opbouwen (Saif et al, 2005). Sinds 2005 is het gebruik van antimicrobiële additieven aan veevoer als middel voor ziektepreventie in de Europese Unie verboden. Hierbij is een uitzondering gemaakt voor coccidiostatica bij pluimvee, die tot 2012 preventief gebruikt mogen worden (EU Commision, 2003) aangezien deze ziekte een grote invloed heeft op de hedendaagse pluimveehouderij en goede, economisch haalbare alternatieven nog niet beschikbaar zijn. Vanwege dit aankomende verbod, een toegenomen resistentie tegen coccidiostatica en een toegenomen weerstand van de consument tegen voederadditieven moet worden gezocht naar een betere effectiviteit van de huidige preventieve middelen of nieuwe bestrijdingsmethoden om de klinische gevolgen van een Eimeria infectie bij vleeskuikens te verminderen. De infectie van een vleeskuikenkoppel begint als één of meerdere dieren een (klein) aantal gesporuleerde oöcysten opneemt. Deze oöcysten zijn achtergebleven in de stal na de voorgaande ronde of via mechanische transmissie (bijvoorbeeld via schoeisel) de stal binnengebracht. In de geïnfecteerde kippen vermeerdert de parasiet zich zoals hierboven beschreven waarna uitscheiding van grote aantallen oöcysten volgt. De oöcysten sporuleren onder invloed van vocht en zuurstof en infecteren weer andere kippen. Dit heeft een verspreiding van de infectie door de koppel als gevolg, waarbij het strooisel steeds meer oöcysten gaat bevatten, dat op 4 tot 5 weken een piek bereikt (Williams, 1998). Eenmaal geïnfecteerd begint de kip met het opbouwen van immuniteit. Er zijn meerdere infectiecycli nodig om de beschermende immuniteit op te bouwen, waarna de infectie in principe zelflimiterend is en het dier levenslange immuniteit heeft opgebouwd tegen de betreffende Eimeria spp. Het gevolg van de spreiding van de infectie door de koppel en de ontwikkelende immuniteit is dat de kippen van het koppel gedurende de koppelinfectie in verschillende stadia van -4- Verslag transmissie gevoeligheid verkeren; sommige kippen zijn immuun, anderen gedeeltelijk immuun, terwijl andere kippen de infectie nog niet hebben gehad en volledig gevoelig zijn (Severins et al, 2007). De effecten van een infectie zijn afhankelijk van twee factoren: de interactie tussen het pathogeen en het dier, en de verspreiding van pathogenen door de koppel (Velthuis et al, 2007). Het tijdstip in een vleeskuikenronde waarop de meeste dieren een acute infectie doormaken, wat afhankelijk is van de mate van spreiding, bepaalt grotendeels de mate van schade. Wanneer namelijk een groot deel van het koppel de infectie doormaakt aan het eind van de mestronde is de schade groter. Bij een infectie laat in de ronde resteert er immers onvoldoende tijd voor compensatoire groei (Graat et al, 1996). Het bestuderen en beïnvloeden van de mate van spreiding is dus van groot belang bij het beperken van de schade in de vleeskuikenhouderij. De verspreiding van een pathogeen door de koppel kan beschreven worden met behulp van transmissieparameters. Deze parameters kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt in wiskundige modellen waardoor meer inzicht wordt verkregen in het verloop van de infectie in de koppel. Daarnaast kan met behulp van een model het effect van bepaalde factoren, bijvoorbeeld ontstane immuniteit of infectiedosis, zichtbaar gemaakt worden (Graat et al, 1996; Severins et al 2007). Met behulp van transmissieparameters en wiskundige modellen kunnen nieuwe bestrijdingsmethoden worden ontwikkeld en kan de effectiviteit van bestaande bestrijdingsstrategieën worden geëvalueerd en gekwantificeerd. Transmissie-experimenten voor E. acervulina zijn in het verleden reeds uitgevoerd, waarbij inoculatiedoses van 50 en 500 oöcysten zijn gebruikt (Velkers et al, 2008a). In het experiment dat in dit verslag wordt beschreven is de infectie geïnitieerd met een inoculatie met 5 oöcysten. Er wordt namelijk vanuit gegaan dat veldinfecties starten met een lage infectiedosis, aangezien de stallen tussen rondes vaak grondig worden gereinigd. Voor een toekomstig groepsexperiment, waarbij we een vergelijkbare inoculatiedosis willen gebruiken, willen we tevens weten hoeveel dieren na inoculatie met 5 oöcysten E. acervulina gaan uitscheiden om aan de hand daarvan het aantal te inoculeren dieren te bepalen. Materiaal en Methode Opzet van het experiment. Het experiment is uitgevoerd in 10 isolatoren. De eerste 3 dagen dienden twee isolatoren als groepsverblijf, daarna is elke isolator door middel van een scheidingswand verdeeld in een dierverblijf voor 2 dieren en een materiaalruimte, zie afbeelding 1. Het dierverblijf had een afmeting van 56x57 centimeter en bevatte een voerbak en een drinknippel. Om het drinken voor de jonge kuikens makkelijker te maken hadden deze tot dag 6 ook de beschikking over een drinktoren. De bodem van het dierverblijf is dichtgemaakt met waterafstotend karton (stucloper) en voorzien van 1 kg / m2 zaagsel. Het zaagsel is gedurende de proef niet vervangen en er is geen strooisel bijgestrooid aangezien dit in de pluimveehouderij ook niet gebeurt en dit de blootstelling aan infectieuze öocysten en dus de transmissie zou kunnen beïnvloeden. De materiaalruimte bevatte onder andere twee kunststof transportmanden voor katten, die werden gebruikt om de kuikens apart te zetten voor het verzamelen van individuele mestmonsters (single droppings). Twee tonnen waren aanwezig voor opslag of in- en uitsluizen van materialen. De materialen die nodig zijn voor het verzamelen van de single droppings werden dagelijks via de halamidsluis ingesluisd. Op de dag van uitkomen zijn 32 specific pathogen free (SPF) kuikens gezamenlijk gehuisvest in één isolator. De kuikens, een kruising tussen Cobb, Hydro en Ross, waren afkomstig van de GD in Deventer. Op dag 2 zijn uit deze groep 20 kuikens geselecteerd op onder andere vitaliteit; hiervan zijn 10 random gekozen kuikens geïnoculeerd met een gelatineampul met daarin vijf gesporuleerde E. acervulina oöcysten. De oöcysten zijn uit een door de GD geleverd inoculum verzameld door -5- Verslag transmissie middel van micromanipulatie met behulp van een getrokken pasteurse pipet en een mondzuigslang onder een binoculair bij 50 x vergroting. Het aantal oöcysten en de sporulatie is gecontroleerd door middel van microscopie (10 x 40 onder een stereomicroscoop), zie bijlage 2. De geïnoculeerde kuikens zijn als groep in een aparte isolator gehuisvest. Eén dag later zijn de 20 geselecteerde kuikens in paartjes (één geïnoculeerd dier (het I dier) en één contact dier (het S dier)) over de 10 isolatoren verdeeld. Het lichtschema was 231/2 uur licht en ongeveer 1/2 uur donker. Vanaf dag 5 tot 31 zijn de kuikens 's morgens voordat het licht aan ging elk in één van de transportmanden geplaatst. De kuikens bleven hier ongeveer één uur inzitten. Als ze in dat uur gemest hadden werd een cloacaswab genomen, werd het kuiken teruggeplaatst en werd de mest (single dropping) verzameld. Als de kuikens niet gemest hadden bleven ze nog maximaal één uur zitten om te mesten voordat ze werden Afbeelding 1: Isolator met links het dierverblijf en rechts de materiaalruimte met vervoersmanden (rood en blauw) voor het verzamelen van single droppings en de tonnen voor opslag en in- of uitsluizen van materialen. teruggeplaatst. Indien de kuikens wederom niet gemest hadden werd het kuiken ’s middags nog eenmaal één uur apart gezet om een single dropping te krijgen. Van de single droppings werd meestal dezelfde dag de OPG bepaald maar uiterlijk één dag later, waarbij de mestmonsters gekoeld werden bewaard. Op dag 0, 8, 15, 22 en 29 zijn de kuikens gewogen en op dag 3, 8, 13, 22 en 26 is het voer van de kuikens vervangen waarbij zowel de hoeveelheid van het restvoer als de hoeveelheid van het nieuwe toegevoegde voer is afgewogen. Bij sterfte van een kuiken is het gewicht bepaald. Bij kuikens die werden geëuthanaseerd (tussentijds of aan het einde van de proef) werd tevens vooraf bloed afgenomen. Het bloed werd gecentrifugeerd, waarna het serum werd ingevroren voor eventueel later onderzoek naar bijvoorbeeld antlichaamtiters tegen Eimeria. In verband met sterfte van één geïnoculeerd kuiken voordat deze tot uitscheiding kon overgaan is op dag 14 één nieuw paartje aan het experiment toegevoegd. Dit paartje is vanaf het begin in dezelfde isolator gehuisvest en alleen gedurende enkele uren na inoculatie van elkaar gescheiden. Verder is dezelfde werkwijze gevolgd als hierboven beschreven. Het gebruikte inoculum voor het I dier van dit paartje was niet gekoeld bewaard zodat, in tegenstelling tot bij de eerste inoculatie, de oöcysten bij de controle van het aantal en de sporulatie er niet vitaal uitzagen. -6- Verslag transmissie OPG bepaling in single droppings De OPG van de single droppings werden op de dag dat ze genomen werden, of één dag later bepaald met behulp van een gemodificeerde McMaster telmethode. Een afgewogen hoeveelheid mest werd opgelost in 20 ml zoutoplossing met een soortelijk gewicht van 1,1 gram/ml. Na homogeniseren met behulp van een vortexmixer bleef de mest minstens 10 minuten inweken, daarna werd na mixen op de vortexmixer 2 x 1ml vloeistof uit het midden van de 50 ml buis gepipetteerd en toegevoegd aan 8ml verzadigde zoutoplossing (soortelijk gewicht: 1,2 gram/ml). Met deze vloeistof werden na goed mixen twee 0,15 ml McMaster telkamers gevuld. In een verzadigde zoutoplossing drijven de oöcysten tegen het telraam waardoor het aantal oöcysten onder het raster dat in de telkamer is aangebracht geteld kunnen worden. Indien er meer dan ongeveer 400 oöcysten onder het telraam aanwezig waren, werd een doorverdunning gemaakt door 1 ml uit de laatste oplossing toe te voegen aan 9ml verzadigde zoutoplossing. Met behulp van de volgende formule is de OPG berekend: OPG (( 333 , 3 * n ) * dil / 10 ) / m Hierin is n het aantal getelde oöcysten in twee telkamers, dil de verdunning (waarbij de eerste oplossing als een verdunning van 10 geldt, en m het gewicht van het monster. Als het monster volgens de McMaster methode negatief was of als het monster verwacht werd negatief te zijn is er een semikwantitatieve OPG bepaling uitgevoerd met behulp van een aangepaste sedimentatieflotatie techniek (Long et al 1976). Hierbij werd 1 gram mest afgewogen in een 50 ml buis. Hieraan werd 20 ml kraanwater toegevoegd. Na goed schudden werd de oplossing door een zeef in een bekerglas gegoten. De 50 ml buis en zeef zijn nagespoeld met 100 ml kraanwater. Na mengen van de oplossing in het bekerglas is met deze vloeistof een 12ml centrifugebuis gevuld (midstream). De vloeistof is gecentrifugeerd gedurende 5 minuten op 3000 toeren zodat alle oöcysten in het sediment terechtkomen. Vervolgens werd het supernatant afgegoten en de centrifugebuis gevuld met een verzadigde zoutoplossing, waarbij een meniscus van zoutoplossing op de buis wordt gevormd. Op de meniscus werd een dekglaasje geplaatst en de buis werd gecentrifugeerd gedurende 5 minuten op 2500 toeren; door de verzadigde zoutoplossing floteren de oöcysten en komen onder het dekglaasje te zitten. Hierna is het dekglaasje verwijderd en op een objectglas geplaatst. Het aantal oöcysten onder het dekglaasje is gescoord onder een lichtmicroscoop bij 10 x 10 vergroting, de score liep uiteen van 0 (negatief) tot 3 (zeer veel oöcysten). Het epidemiologisch model Eén van de variabelen die binnen de epidemiologie wordt gebruikt is de transmissiesnelheid, β. Deze geeft weer hoeveel dieren één infectieus dier per tijdseenheid kan infecteren. De β kan worden berekend aan de hand van het SIR model, hierin wordt rekening gehouden met drie verschillende stadia waarin dieren zich kunnen bevinden: gevoelig (Susceptible), infectieus (Infectious) en hersteld (Recovered). Aangezien de oöcysten van Eimeria langer infectieus zijn dan de proef duurt (Williams, 1995) worden geen R dieren in het model gebruikt en wordt er dus gebruikt gemaakt van het SI model. In een paartjesexperiment waarbij één infectieus dier en één gevoelig dier aanwezig is en dagelijks monsters worden genomen kan met behulp van dit model de β berekend worden met de volgende formule:5 2ln( 1p) (1) Hierin is p de kans dat een gevoelig dier geïnfecteerd raakt in één tijdseenheid, hier dus één dag. Een schatting van p kan worden gemaakt aan de hand van het aantal succesvolle transmissies (k), de som van de lagtime voor alle paartjes (y), het aantal paartjes (nk) en het aantal dagen waarin de infectie is gevolgd (nx). De lagtime wordt gedefinieerd als het aantal dagen tussen het verwachtte -7- Verslag transmissie moment van uitscheiding en het daadwerkelijke moment van uitscheiding. Voor de schatting van de kans op infectie voor contactdieren geldt de volgende formule:5 k ˆ p y k ( n k ) n k x (2) Statistische analyses. Om de oöcystuitscheiding gedurende het gehele experiment van de kuikens in kaart te kunnen brengen hebben we de area under the curve (AUC) berekend voor de OPG data. Dit hebben we gedaan door de som van de OPG van één dag en de OPG van de dag erna te delen door twee. Indien er geen data beschikbaar was van twee opeenvolgende dagen werd de OPG van de twee bekende waarden opgeteld, gedeeld door twee en vermenigvuldigd met het aantal dagen waarover de AUC is berekend (dit is voor de data binnen dit verslag overigens niet voorgekomen). Dit illustreert wel het voordeel van het gebruik van de AUC: ontbrekende data kan worden opgevuld door extrapolatie, al dient hierbij opgemerkt te worden dat deze data niet altijd even nauwkeurig hoeft te zijn. Bij het maken van een cumulatieve AUC moet er rekening mee worden gehouden dat deze methode één dag vooruit rekent; zo werd de cumulatieve AUC van dag 11 tot en met 27 berekend door de AUC’s van dag 10 tot en met 26 bij elkaar op te tellen. Statistische analyses zijn uitgevoerd met het programma SPSS 15 (SPSS, 2006). Gezien de beperkte steekproefgrootte van onze proef (N < 30) en de standaard deviatie in de normale populatie bij onze analyses niet bekend is, is het niet mogelijk om gebruik te maken van methodes die gebruik maken van de normale verdeling maar moeten we gebruik maken van methoden gebaseerd op de tdistributie. Met deze methoden kunnen groepen met elkaar vergeleken worden mits de standaard deviaties van deze groepen overeenkomen (Kirkwood & Sterne 2003). De cumulatieve AUC’s van de I en S dieren van dag 6 tot en met 27 zijn met elkaar vergeleken door middel van een gepaarde T-test. De test is gepaard omdat het I en S dier van elkaar afhankelijk is omdat ze per paar in één isolator zijn gehuisvest en dus per paar aan dezelfde besmetting zijn blootgesteld. Op dezelfde manier zijn de AUC’s van dag 11 tot en met 27 met elkaar vergeleken. De AUC’s zijn getransformeerd door middel van een log10 transformatie aangezien de standaard deviaties van de vergeleken groepen te afwijkend van elkaar waren. De groei van de kuikens op dag 8, 15, 22 en 29 is per groep vergeleken met de standaard groei voor dit type kuiken, gebaseerd op voorgaande proeven. Omdat deze standaard een gemiddelde is waarvan de verdeling niet bekend is, is een one way T-test gebruikt om de groep met de standaard te vergelijken. De groeivertraging ten opzichte van deze standaard is berekend en met dezelfde methode met de standaard vergeleken. Resultaten Verloop van de infectie De uitslag van de McMaster en sedimentatie-flotatie testen tot dag 27 zijn kwalitatief weergegeven in tabel 1, de OPG is tot dag 31 bepaald, maar fluctueert vanaf dag 27 rond het nulpunt. Alle dieren die ’s middags op dag 2 zijn geïnoculeerd waren op dag 6, ten tijde van de monstername in de ochtend, nog negatief en werden positief bevonden in de ochtend van dag 7. Aangezien de monsters eerder op de dag werden genomen dan de dieren waren geïnoculeerd komt dit overeen met de prepatentperiode van vier dagen. Al de geïnoculeerde dieren waren na 1-3 dagen weer negatief en begonnen weer uit te scheiden tussen dag 11 en 13. 1 I dier begon weer met uitscheiden op dag 11, 2 dieren op dag 12 de overige 6 dieren op dag 13. Van de contactdieren begonnen 4 dieren op dag 12 met uitscheiden, 2 dieren op dag 13, 2 dieren op dag 14 en 1 dier op dag 15. Opgemerkt dient te worden dat het S dier dat op dag 15 is begonnen met uitscheiden in dezelfde isolator is gehuisvest als het I dier dat op dag 11 aan de tweede piek is begonnen. Op enkele dagen -8- Verslag transmissie kon bij sommige dieren de OPG niet bepaald worden omdat geen mest verzameld kon worden. De dieren in isolator 10 zijn op dag 27 en 29 geëuthanaseerd. Het kuiken dat op dag 16 van de proef is geïnoculeerd is niet gaan uitscheiden; de uitscheiding van de kuikens in deze isolator is wel dagelijks bepaald als controle op kruisinfectie tussen isolatoren. Ook tijdens de rest van de periode waren beide dieren negatief. Dier Dag 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 I 1 *- +* ++ -- *- ++ *- ++ +* +* +* +* +* +* +* +* -* -- ++ +* -* -* S 1 *- *- -- *- *- *- *- -- *- ++ ++ *- -+ ++ +* +* +* +* +* +* +* -* I 2 *- +* +* +* -+ *- *- ++ +* +* +* +* +* -* +* +* -* -- -+ -* +* -* S 2 *- *- *- *- -- *- ++ -- ++ +* +* +* +* +* +* +* +* +* -+ +* -+ -- I 3 *- +* +* -- *- *- *- ++ +* +* +* +* +* +* +* +* +* +* ++ +* -* +* S 3 *- *- *- *- *- *- *- -- ++ *- -- *- -+ ++ +* +* +* +* +* +* +* +* I 4 *- +* -- -- ++ *- -- ++ +* +* +* +* +* +* +* +* +* -* -+ +* -* ** S 4 *- *- *- *- -- *- ++ +* ++ +* +* +* +* +* +* +* +* +* +* -* +* +* I 5 *- ++ +* -+ ++ *- *+ ++ +* +* -- *- -+ ++ +* +* +* -- ++ +* +* -* S 5 *- *- -- *- *- *- +* +* +* +* +* +* +* +* +* +* -* -- +* -* -* -* I 6 *- +* -- *+ +- *- *- ++ +* +* +* +* +* +* +* +* +* +* -+ +* -* -* S 6 *- *- *- *- -- *- -- +- +* +* ++ +* +* +* +* +* +* +* -+ -* -* -* I 8 *- +* +* -* -- *- *- ++ +* +* +* +* +* ++ *- -+ ++ +* -+ -+ *+ -+ S 8 *- *- *- *- *- *- -- -- +* +* +* +* +* +* +* +* +* +* +* +* +* -* I 9 *- ++ +* +* -* *- ++ ++ +* +* +* +* +* +* +* +* +* -- +* +* +* -* S 9 *- *- *- *- *- *- +* +* ++ +* +* +* +* +* +* +* -* -- +* -* -* -* I 10 *- +* +* ++ *- *- *- +* +* +* +* +* +* +* +* +* +* -+ +* -+ -* -* Tabel 1: resultaten McMaster telmethode en sedimentatie-flotatie test per dier. In de tabel is het eerste teken is de uitslag van de McMaster telmethode, het tweede teken is de uitslag van de sedimentatie-flotatie test. + = positief, - = negatief, * = niet bepaald. 6 Log10 OPG 5 4 3 2 1 0 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 Dag Grafiek 1: Gemiddelde OPG in Log10 waarde per dag. De gestreepte lijn geeft de OPG van de I dieren weer, de doorgetrokken lijn die van de S dieren. Gemiddeld Isolator 1 2 3 4 5 6 8 9 10 I totaal 5,93 6,08 5,17 5,74 5,3 5,16 5,62 6,31 5,69 S totaal 6,23 6,31 6,18 6,74 6,14 5,57 6,03 6,19 6,18 I D11-27 5,91 6,05 4,68 5,72 5,28 5,15 5,56 6,29 5,67 S D11-27 6,23 6,31 6,18 6,74 6,14 5,57 6,03 6,19 6,18 -9- 5,67 6,17 5,59 Tabel 2: Log10 cumulatieve AUC voor de hele periode en voor dag 11 t/m 16 per type per isolator. 6,1 Verslag transmissie Grafiek 2, groei van de dieren per type per week. 1600 Gewicht (gr) 1200 800 400 0 0 Norm 7 14 I dieren 21 28 S dieren De OPG van de I en S dieren worden weergegeven in grafiek 1, de gemiddelden komen overeen met de individuele uitscheiding, alleen de waarde van dag 11 bij de I dieren en de piek op dag 26 bij de S dieren lijken voornamelijk door één dier veroorzaakt te worden. In de tabel zijn twee pieken te onderscheiden, de eerste piek is alleen te vinden bij de I dieren en loopt van dag 7 tot 10; de piek in deze periode is veroorzaakt door de inoculatie. Vanaf dag 11 ontstaat er een nieuwe piek; deze uitscheidingsperiode komt zowel bij de I als de S dieren voor en wordt veroorzaakt door een continue infectie met oöcysten die in de eerste, en later ook in de tweede periode zijn uitgescheiden. Verder blijkt uit de grafiek dat de eerste uitscheidingspiek van de S dieren hoger is dan de tweede uitscheidingspiek van de I dieren. De log10 waarden van de AUC’s per I of S dier per isolator worden weergegeven in tabel 2. Over de hele periode is de uitscheiding van de S dieren hoger dan de uitscheiding van de I dieren: weergegeven in LOG10 respectievelijk 6,17 (S.D.: 0,30) en 5,59 (S.D.: 0,49). In de periode vanaf dag 11 is de LOG10 AUC 5,67 (S.D. 0,40) voor de I dieren en 6,17 (S.D.: 0,30) voor de S dieren. Het epidemiologisch model Aangezien de I dieren op dag 7 voor het eerst positief waren zou, gezien de prepatentperiode van 4 dagen en een sporulatietijd van gemiddeld 17 uur (Saif et al, 2005), de eerst dag waarop uitscheiding voor S dieren mogelijk was dag 11 moeten zijn. Aan de hand van het moment waarop het S dier tot uitscheiding kwam kan de lagtime, het aantal dagen tussen het verwachtte moment van infectie en het werkelijke moment van infectie, per dier berekend worden. Opgeteld komt de lagtime voor alle S dieren uit op 18 dagen. Van alle paartjes is het S dier besmet geraakt, dus zowel het aantal paartjes (nk) als het aantal succesvolle transmissies (k) is negen. Het aantal dagen dat de infectie is gevolgd (nx) is 21. Met behulp van deze parameters is de β bepaald aan de hand van formule 1 en 2. De transmissiesnelheid bij een inoculatiedosis van 5 oöcysten bedroeg volgens deze berekeningen 0,81, wat betekent dat 1 geïnfecteerd dier gemiddeld 0.81 gevoelige contactdieren per dag kan infecteren. Het gewicht van de dieren. Het gewicht van de I en S dieren, gemeten op dag 0, 8, 15, 22, 29 en 31 en de norm op basis van eerdere experimenten met SPF dieren, zijn weergegeven in grafiek 2. Het gewicht van de I dieren was gedurende de hele proef significant lager dan de norm; bij de S dieren was het gewicht op de dag 0, 8 en 22 significant lager dan de norm. Vanuit de dierwegingen is de groeisnelheid berekend en vergeleken met de norm. Hieruit bleek dat de groei van de I dieren, ten opzichte van de norm, de eerste 8 dagen en tussen dag 15 en 22 significant te laag is. Bij de S dieren de groei alleen tijdens de eerste 8 dagen significant te laag. 10 Verslag transmissie Discussie In dit onderzoek is aangetoond dat inoculatie met 5 oöcysten, met behulp van een capsule, een geschikte manier is om kuikens te infecteren en uit te laten scheiden. De mislukte inoculatie van het dier dat op dag 14 van de proef is opgezet is mogelijk te verklaren door een slechte kwaliteit van het inoculum; het inoculum was niet onder de juiste condities bewaard en de oöcysten zagen er onder de microscoop minder vitaal uit. Williams (Williams, 1995) heeft echter aangetoond dat uit het uiterlijk van oöcysten niet kan worden opgemaakt of de oöcysten al of niet infectieus zijn. In dat onderzoek worden op de laatste dagen naast minder vitaal ogende oöcysten ook intacte gesporuleerde oöcysten in het strooisel gevonden, het is dus mogelijk dat deze de infectie veroorzaakten. Het totale aantal opgenomen oöcysten in de proef van Williams is, vanwege het aantal kippen en de besmettingsgraad van het strooisel, waarschijnlijk groter dan de vijf oöcysten uit ons inoculum. Hierdoor is de kans dat een kip een oöcyste met infectieuze sporozoïten heeft opgenomen, en dus de kans op infectie, groter. Een betere onderbouwing van de infectiviteit van oud uitziende oöcysten zou worden verkregen door een gevoelige kip met een groot aantal beschadigde oöcysten te infecteren om te testen of de kip tot uitscheiding komt, en deze oöcysten nog infectieus waren. Alle geïnoculeerde dieren zijn 4 dagen na inoculatie begonnen met uitscheiden, dit in tegenstelling tot de proeven die zijn uitgevoerd met een inoculatie van 50 en 500 oöcysten waarbij de start van uitscheiding varieert (Velkers et al, 2008a). Het verschil kan zijn veroorzaakt door de kwaliteit van het inoculum, de methode van toedienen en een verschil in tijdsduur tussen toedienen en monstername. Het tijdsinterval tussen het toedienen van het inoculum en monstername kan de variatie voor een deel verklaren; deze was in deze proef 116 uur terwijl dit interval in de voorgaande studie 96 uur was, waardoor sommige dieren net voor de monstername op 4 dagen na inoculatie tot uitscheiding kwamen, en andere dieren net daarna. De kuikens in dit experiment zijn waarschijnlijk op verschillende momenten op dag 6, na de monstername in de ochtend, tot uitscheiding gekomen, waardoor alle kuikens positief waren bij de monstername in de ochtend van dag 7. Daarnaast zijn in dit experiment het aantal oöcysten precies vastgesteld, terwijl bij de vorige proef gewerkt is met verdunningen, waarbij de moedersuspensie wel is gecontroleerd, maar de daaropvolgende verdunning niet meer gescoord konden worden. Tevens zijn in de huidige proef de oöcysten door middel van een capsule direct in de krop ingebracht, terwijl destijds geïnoculeerd werd met een waterige oplossing die met een 1 cc spuit ingebracht werd in de krop, waardoor het aantal oöcysten dat succesvol de maag bereikt sterk kan variëren. Uit ons onderzoek blijkt dat de transmissiesnelheid 0,8 bedraagt, wat betekent dat 1 infectieus kuiken per dag 0,8 andere dieren kan infecteren, mits deze niet immuun zijn voor infectie. Deze transmissiesnelheid kan gebruikt worden om het effect van verschillende (preventieve) behandelingen of managementmaatregelen op een beginnende verspreiding van E. acervulina te kwantificeren en te vergelijken. Opvallend is dat deze waarde weinig verschilt van de gevonden β na inoculatie met 50 of 500 of 50,000 oöcysten (Velkers et al, 2008a, Velkers, Swinkels et al, 2008). Wellicht is de blootstelling aan een klein aantal oöcysten in de omgeving voldoende om een infectie te bewerkstelligen en leidt een hoger aantal oöcysten in de omgeving niet tot een grotere kans voor een contactdier om geïnfecteerd te raken. In één van de isolatoren is het S dier besmet geraakt op een moment dat dit mogelijk veroorzaakt werd door de tweede uitscheidingsperiode van het I dier en niet als direct gevolg van de inoculatie. Deze veronderstelling lijkt te worden ondersteund doordat deze isolator de enige is waarbij er meer dan één dag verschil is tussen het I en het S dier wat betreft het begin van de uitscheiding in deze periode. Dit is echter niet in strijdt met het model waarmee de transmissiesnelheid is berekend, aangezien deze uitscheiding een direct gevolg is van de inoculatie van het dier, zei het met een vertraagde werking. 11 Verslag transmissie De uitscheiding van oöcysten vanaf dag 11 is veroorzaakt door een herhaaldelijke infectie met oöcysten die tijdens de proef zijn uitgescheiden en niet door oöcysten uit het inoculum; de besmetting van het I en S dier in deze periode is dus vergelijkbaar. Door de AUC’s van de I dieren met de AUC’s van de S dieren te vergelijken blijkt dat de oöcyst uitscheiding tijdens deze periode door de I dieren significant lager is dan de uitscheiding van de S dieren. Dit verschil wordt waarschijnlijk veroorzaakt worden door de reeds ontstane immuniteit als gevolg van de infectie met het inoculum. Het is aangetoond dat cellulaire immuniteit reeds vier dagen na het begin van een infectie ontstaat. (Swinkels et al, 2006). Het verschil in uitscheiding gedurende deze periode is dusdanig groot dat als de uitscheiding over het gehele experiment wordt vergeleken, dus inclusief uitscheiding als gevolg van de inoculatie, deze voor de I dieren nog steeds significant lager is in vergelijking met de S dieren. Gezien de normale huisvesting van pluimvee in groepen van tienduizenden vleeskuikens lijkt een paartjesexperiment een vreemde opzet. Het voordeel van deze methode is echter dat het zeker is dat de infectie van het geïnfecteerde dier uitgaat (Velkers et al, 2008a). Daarnaast heeft een paartjesexperiment wat betreft de wiskundige analyse ook voordelen; de betrouwbaarheid van meerdere kleine experimenten is namelijk vergelijkbaar met dat van één groot experiment en het voordeel van een groot aantal kleine experimenten is dat de schatting van de transmissiesnelheid robuuster is (Velthuis et al, 2007). Voor het bepalen van de infectiviteit van het dier, wat essentieel is voor het bepalen van de transmissiesnelheid, is de OPG bepaald in de mest. Het nemen van een betrouwbaar mestmonster per dier voor het bepalen van de OPG is momenteel alleen mogelijk door de dieren tijdelijk van elkaar te isoleren in een omgeving zonder andere mest of strooisel, omdat anders niet duidelijk is welke mest van welk dier is, en of het verse mest betreft. Uit een voorgaand onderzoek blijkt dat de OPG van deze single droppings overeenkomt met de OPG van een mestmonster genomen uit de totale dagelijkse geproduceerde mest (Velkers et al, 2008b). Gezien de hoeveelheid mest in het strooisel heeft deze methode van het verzamelen van mest nauwelijks invloed op de totale contaminatie van het strooisel. Met het oog op de verwachtte groeivertraging tijdens de infectie zijn de dieren wekelijks gewogen. Het gewicht van de I en S dieren is tijdens het grootste deel van de proef lager dan het normgewicht. Vooral aan het eind van de proef is het gewicht significant lager. Dit is opmerkelijk omdat op dat moment nog maar een laag aantal oöcysten wordt uitgescheiden, terwijl je de groeivertraging zou verwachten rond de periode van de grootste uitscheidingspiek. In die periode is echter geen groeivertraging waargenomen. Aan het eind van de proef is kreupelheid bij de dieren waargenomen, hierdoor hebben de kuikens misschien minder gegeten en zijn ze dus minder hard gegroeid. Aangezien de kuikens vanaf uitkomst al een te laag gewicht hadden ten opzichte van de norm is er ook naar de groeisnelheid gekeken, de lage groeisnelheid in de eerste week heeft mogelijk te maken met het lagere startgewicht. Met ons onderzoek hebben we een herhaalbaar model gemaakt voor de transmissie van E. acervulina na inoculatie met een zeer lage dosis. Aangezien de infectie in dit model gestart is met een dosis die waarschijnlijk ongeveer overeenkomt met de startdosis van een veldinfectie kan het model worden gebruikt om bestrijdingsmethoden te vergelijken voor de veldsituatie. Met dit experiment is tevens naar voren gekomen dat de spreiding van de infectie ook met een lage initiële infectiedosis goed op gang kan komen, en tot vergelijkbare spreiding kan leiden als hogere initiële infectiedoses. Uit de lagere uitscheiding van oöcysten door I dieren in vergelijking met S dieren vanaf D11 van het experiment is gebleken dat de immuniteit, als gevolg van een eerdere infectie / inoculatie, een reductie in uitscheiding bij een herinfectie tot gevolg heeft, zoals eerder aangetoond door Velkers, Swinkels et al (2008). 12 Verslag transmissie Inoculatie met 5 gesporuleerde oöcysten met behulp van een gelatineampul bleek zeer effectief en kan gebruikt worden voor vervolgexperimenten. Literatuurlijst. DE JONG, M.C.M. (1995) Mathematical modelling in veterinary epidemiology: why model building is important Preventive Veterinary Medicine 25 pp183-193. EU COMMISION (2003) Regulation (EC) No 183112003 of the European Parliament and the council of 22 september 2003 on additives for use in animal nutrition. http://eur-lex.europa.eu/ GRAAT, E.A., PLOEGER, H.W., HENKEN, A.M., DE VRIES REILINGH, G., NOORDHUIZEN, J.P. & VAN PEEK, P.N. (1996) Effects of initial litter contamination level with Eimeria acervulina on population dynamics and production characteristics in broilers. Veternary Parasitology. 65 (3-4) pp 223232 HAUG, A., ANNE-GERD, G., THEBO, P., MATTSSON, J.G. & KALDHUSDAL, M., 2008, Coccidial infections in commercial broilers: epidemiological aspects and comparison of Eimeria species identification by morphometric and polymerase chain reaction techniques. Avian Pathology 37 (2) pp 161-170 KIRKWOOD, B.R. & STERNE, J.A.C., (2003) Essential medical statistics 2nd edition. Blackwell Science Ltd. Malden, Massachusettes USA. LONG, P.L., MILJARD, B.J., JOYNER, L.P., NORTON, C.C. (1976) A guide to laboratory techniques used in the study and diagnosis of avian coccidiosis. Folia Veterinaria Latina 6 (201) pp 201-217 PEEK, H.W. & LANDMAN, W.J.M. (2003) Resistance to anticoccidial drugs of Dutch avian EimeriaI spp. Field isolates originating from 1996, 1999 and 2001. Avian pathology 32 (4) pp 291-401 SAIF, Y.M., BARNES, H.J., GLISSON, J.R., FADLY, A.M., MCDOUGALD, L.R. & SWAYE, D.E. (2005) Diseases of poultry 11th Ed. Iowa State Press, Ames Iowa USA. SEVERINS, M., KLINKENBERG, D. & HEESTERBEEK, H. (2007) Effects of heterogeneity in infection-exposed history and immunity on the dynamics of a protozoan parasite. Journal of the Royal Society interface. 4 (16) pp 841-849 SPSS, 2006. SPSS 15.0 for windows, SPSS inc, Chicago, NY USA. SWINKELS, W.J.C.. POST, J., CORNELISSEN, J.B., ENGEL, B., BOERSMA, W.J.A. & REBEL, J.M.J. (2006) Immune responses in Eimeria acervulina infected one-day-old broilers compared to amount of Eimeria in the duodenum, measured by real-time PCR. Veterinary Parasitology 138 (3-4) pp 223-233 VELKERS, F.C, SWINKELS, W.C.J., REBEL, J.M.J., BOUMA, A., DAEMEN, A.J.J.M., KLINKENBERG, D., BOERSMA, W.J.A., STEGEMAN, J.A., DE JONG, M.C.M. & HEESTERBEEK, J.A.P. (2008) Immunity against Eimeria acervulina: the influence of exposure history on transmission in broiler chickens. From: Host response to Eimeria infection, thesis of W.C.J. Swinkels. University of Utrecht, Utrecht, The Netherlands. VELKERS, F.C., BOUMA, A., GRAAT, E.A.M., KLINKENBERG, D., STEGEMAN, J.A. & DE JONG, M.C.M. (2008) Quantification of transmission in Eimeria acervulina between broilers. Manuscript submitted toPreventive Veterinary Medicine VELKERS, F.C, GRAAT, E.A.M., BOUMA, A., DE JONG, M.C.M., STEGEMAN, J.A. (2008) Comparision between use of single droppings and 24 hour bulk fecer for determination of Eimeria acervulina oocyst counts inbroilers. Manuscript submitted toAvian Diseases VELTHUIS, A.G.J., BOUMA, A., KATSMA, W.E.A., NODELIJK, G. & DE JONG, M.C.M. (2007) Epidemiology and Infection. 135 (2) pp 202-217 WILLIAMS, R.B. (1995) Epidemiological studies of coccidiosis in the domesticated fowl (Gallus gallus): II Physical condition and survival of Eimeria acervulina oocysts in poultry-house litter. Applied Parasitology 36 pp 90-96 WILLIAMS, R.B. (1998) Epidemiological aspects of the use of live anticoccidial vaccines for chickens. International Journal for Parasitology. 28 pp 10891098 13 Verslag transmissie Bijlage 1: levenscyclus Eimeria. Afbeelding 1: levenscyclus Eimeria spp. (Bron: UU of GD, aangepast) De cyclus van Eimeria spp. wordt weergegeven in afbeelding 1. Van boven met de klok mee: vrije sporozoiet in de darmtractus, infectie van het darmepitheel gevolgd door de eerste asexuele vermeerderingsfase, vrij merozoiet in het darmlumen deze kan nog een asexuele vermeerderingsfase ingaan (pijl terug) of zich ontwikkelen tot macrogameet (binnenste route) or zich ontwikkelen tot microgameet (buitenste route). Micro- en macrogameten en macrogameten komen samen in 1 cel waarna zich een oöcyst vormt. Deze wordt uitgescheiden. In de oöcyst vormen zich eerst 4 sporocysten en ontwikkeld elke sporocyste zich tot twee sporozoiten. De oöcyst is dan infectieus en kan een nieuwe infectie starten.Bijlage 2: isoleren oöcysten door middel van micromanipulatie. Benodigd materiaal: PBS – BSA ( pH 7.2, 0.5%) 3 eenogen Terasaki platen (3) Getrokken pasteuren Mondpipet Houder (piepschuim) voor ampullen Ampullen Stereo microscoop Olympus CK2 Omkeermicroscoop Wild Basisoplossing waarin de Coccidiose eieren Handschoenen 14 Verslag transmissie Werkwijze: Drie eenogen vullen met 500 µl PBS-BSA. Aan een van de eenogen 10 µl basisoplossing toevoegen mengen en hieruit weer 10 µl verdunde basisoplossing toevoegen aan een 2e eenoog. 1e en 2e verdunning PBS-BSA In Terasaki plaat 6 welletjes vullen met 4 µl PBS-BSA. Nu, met behulp van de getrokken pasteur, 6 eieren in een Terasaki welletje stoppen. Als er 6 welletjes gevuld zijn, deze ter beoordeling op de CK2 aanbieden (10 x 20 of 10 x 40 vergroting) voor controle op sporulatie (er moeten 5 gesporuleerde eieren inzitten er mag dus een 6e niet gesporuleerd ei aanwezig zijn eventueel 6e gesporuleerd ei verwijderen uit welletje) Indien okay dan per capsule 6 eieren (=inhoud welletje), inbrengen in lange deel op rechte gedeelte, zo dicht mogelijk bij de basis van de capsule. Daarna controle of er inderdaad 6 eieren inzitten dmv spoelvloeistof uit pasteur onder binoculair bij 50x vergroting te bekijken. Zo ja dan aanvullen met 25 µl PBS-BSA (minder mag ook, als de oöcysten maar omhuld worden met vloeistof), sluit de capsule en plaats hem rechtstandig in de houder (piepschuim houder). De eerste 5 kippen krijgen nu een capsule (krop). Een capsule als reserve indien er een wordt uitgespuugd. Ondertussen starten met de 2e serie van 6 Terasaki-welletjes. Indien nodig worden 3 series gedaan waarbij telkens na 1 serie dieren worden geïnoculeerd. Statistiek experiment epidemiologie Beschrijving gemiddelde output met grafiek Dagelijks zijn per dier single droppings verzameld door het dier één uur in een transportmand voor katten te plaatsen, in dit uur poept het kuiken. Daarna wordt het kuiken teruggezet en de mest verzameld. Van deze mest is de OPG (aantal oöcysten per gram mest) bepaald met behulp van de McMaster telkamer-methode of in gevallen waarbij de McMaster uitslag negatief was of verwacht werd dat de McMaster uitslag negatief zou zijn werd de kwalitatieve sedimentatie-flotatie techniek (SF)uitgevoerd. De resultaten staan in Grafiek 1.1 en Grafiek 1.2 300000 250000 I Normaal I Gecorrigeerd S normaal S gecorrigeerd I gecorrigeerd oud S gecorrigeerd oud OPG 200000 150000 100000 50000 0 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 Dag Grafiek 1.1 Gemiddelde uitscheiding voor S en I dieren, berekend vanuit verschillende waarden. 15 Statistiek transmissie In grafiek 1.1 wordt de gemiddelde output van de I en S dieren per dag weergegeven. “Normaal” betekent dat de waarde rechtstreeks overgezet is uit de dataset, “gecorrigeerd” houdt in dat indien de McMaster niet is uitgevoerd en de SF 0 was de McMaster waarde op 0 is gezet. Hierdoor krijg je een gemiddelde van alle gemeten dieren, en niet alleen van de positieve dieren. De pieken I20, S14/15 en S 17 lijken nogal wat verschil te maken tussen normaal en gecorrigeerd. Ook opgenomen is een lijn waarbij de oude oöcysten (gecorrigeerd) zijn meegeteld, hoewel het aantal oude oöcysten per gram mest percentueel vrij groot is aan het einde van de proef is dit in de grafiek niet goed te zien omdat het aantal oöcysten per gram mest op dat moment laag is ten opzichte van het aantal oöcysten per gram mest tijdens de hoge uitscheiding. Dit verschil komt beter uit als ik logaritmen van het gemiddelde gebruik. De logaritmen van de OPG zijn te zien in grafiek 1.2, de verschillen tussen de verschillende berekeningen in de lage waarden is nu goed te zien. Hier is het verschil tussen oude en vitale oöcysten een stuk beter te zien, echter de verschillen tussen de originele en gecorrigeerde tabel zijn m.u.v. het verschil van de I dieren op dag 11 en 13 minder goed te zien. Gemiddelde OPG 6 Log10 OPG 5 I normaal I gecorrigeerd S normaal S gecorrigeerd I gecorrigeerd oud S gecorrigeerd oud 4 3 2 1 0 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 Dag Grafiek 1.2 Gemiddelde uitscheiding van de I en S dieren per dag, gelijk aan grafiek 1.1 maar Log10 getransformeerd. Uiteindelijk gaat het erom welke data je weer wilt geven, de gecorrigeerde tabel komt overeen met de manier waarop de monsterverwerking is opgezet, deze heeft daardoor de voorkeur boven de normale lijn. De oude oöcysten representeren waarschijnlijk een besmetting uit de omgeving, dwz de transportmand (in mest uit de darm geen oude oöcysten gevonden, n=1) of mogelijk door het kuiken gepasseerd zonder een infectie te veroorzaken. Daarnaast zijn in de andere experimenten (inoculatie met 50 of 500 oöcysten) de oude oöcysten ook niet meegenomen. Om deze redenen gaat mijn voorkeur ernaar uit om de oude oöcysten niet weer te geven. Logwaarden geven de verschillen bij een lage OPG beter weer dan gewone waarden, echter bij een hogere OPG zijn verschillen juist minder goed te zien waardoor vooral I-piek op dag 7-11 en de Spiek op dag 26 erg hoog lijken. Wat mij betreft geeft grafiek 1.1. gecorrigeerd de gevonden OPG dus het beste weer. Output per paartje met grafiek (Zie voor een beschrijving ”Hoogte en tijdstip eerste en 2e piek I en hoogte en tijdstip 1e piek S”) 16 Statistiek transmissie Isolator 1 Isolator 3 7, 00 Log10 OPG Log10 OPG 6, 00 5, 00 4, 00 I dier 3, 00 S-dier 2, 00 1, 00 0, 00 5 7 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 I dier S dier 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 Dag Dag Isolator 4 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Log10 OPG Log10 OPG Isolator 2 I dier S dier 5 7 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 I dier S dier 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 Dag Dag Isolator 5 Isolator 9 5,00 4,00 Log10 OPG Log10 OPG 6,00 I dier 3,00 2,00 S dier 1,00 0,00 5 7 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 I dier S dier 5 7 Dag Dag Isolator 6 Isolator 10 5,00 Log10 OPG Log10 OPG 6,00 4,00 I dier 3,00 S dier 2,00 1,00 0,00 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 I dier S dier 5 7 Dag 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 Dag Log10 OPG Isolator 8 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 OPG per dag voor zowel de I- als S-dieren per isolator. De gecorrigeerde waarden zijn weergegeven. I dier S dier 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 Dag AUC per I en S dier per isolator Hierin heb ik de AUC berekend van zowel het I dier als het S dier, de AUC wordt berekend door de OPG van een dag bij de OPG van de dag erna op te tellen en te delen door 2. Over een periode van afwijkende lengte, bijvoorbeeld door missing values kan de AUC berekend worden door de OPG van het begin en eind van de periode bij elkaar op te tellen, deze te delen door twee en te 17 Statistiek transmissie vermenigvuldigen met het aantal dagen. In de AUC van het I dier zijn twee besmettingen (inoculatie en eerste uitscheiding I) opgenomen terwijl de AUC van het S dier alleen door de eerste uitscheiding van het I dier wordt bepaald. Deze AUC’s zijn te vergelijken waardoor je kunt aantonen of een lage infectiedosis zorgt voor een lagere totale uitscheiding dan een hoge infectiedosis. Naast deze “levensuitscheiding” is het mogelijk om de AUC van de tweede uitscheidingsperiode van het I dier te vergelijken met de AUC van de eerste uitscheidingsperiode van het S dier, beide uitscheidingsperiodes zijn immers veroorzaakt door dezelfde infectiedruk namelijk de eerste uitscheidingsperiode van het I dier. Deze pieken worden beide gedefinieerd vanaf dag 11 tot en met dag 27, dag 11 omdat dat de eerste dag is dat dieren beginnen met uitscheiden als gevolg van infectie op dag 7 (en niet meer door het inoculum). Dag 27 omdat dat de laatste dag is dat we alle 9 dieren mee kunnen tellen i.v.m. euthanasie van één van de kuikens. Met deze vergelijking kun je aantonen wat het effect is van een eerdere infectie (en dus van immuniteit) op de hoeveelheid uitgescheiden oöcysten. Absolute waarden Isolator 1 2 3 4 5 6 8 9 10 I totaal 859069 1188877 146793 543449 197396 144353 413104 2044639 490562 AUC Logwaarden S totaal 1712825 2028650 1507184 5483053 1375965 368683 1079302 1532963 1510486 I D11-27 805578 1124735 48329 521527 188495 140578 360524 1955394 471619 S D11-27 1712825 2028650 1507184 5483053 1375965 368683 1079302 1532963 1510486 I totaal 5,93 6,08 5,17 5,74 5,30 5,16 5,62 6,31 5,69 S totaal 6,23 6,31 6,18 6,74 6,14 5,57 6,03 6,19 6,18 I D1127 5,91 6,05 4,68 5,72 5,28 5,15 5,56 6,29 5,67 S D1127 6,23 6,31 6,18 6,74 6,14 5,57 6,03 6,19 6,18 Tabel 4.1 AUC en LOG AUC per isolator voor het I dier en het S dier weergegeven over de hele periode en in de periode van 11-27 dagen. Aangezien we een kleine sample size hebben (N=9) en de standaarddeviatie in de populatie niet bekend is kunnen we geen gebruik maken van een normale distributie maar moeten we gebruik maken van een t-distributie en dus van een t-test om aan te tonen of het verschil significant is. De tdistributie vereist dat de standaard deviatie van beide groepen vergelijkbaar is (dus niet meer dan twee keer zo groot). Uit tabel 4.2 blijkt dat voor de normale AUC’s de standaard deviatie van de S dieren meer dan twee keer zo groot zijn als die van de I dieren, na een log10 transformatie liggen de standaarddeviaties dichter bij elkaar, het is dus beter om de Log10 te gebruiken. Aangezien de dieren per paar in een isolator gehuisvest zijn en dus met dezelfde dosis besmet, zijn de dieren van elkaar afhankelijk en wordt een gepaarde T-test gebruikt. I totaal N S totaal I D11-27 S D11-27 LOG I totaal LOG S totaal LOG I D11-27 LOG S D11-27 9 9 9 9 9 9 9 9 Mean 669805 1844346 624087 1844346 5,67 6,17 5,59 6,17 Std. Deviation 620708 1440304 603554 1440304 ,40 ,30 ,49 ,30 Tabel 4.2 Gemiddelde en Standaard Deviatie AUC’s Met behulp van SPSS kunnen we nu berekenen of het verschil in de output significant is: (Analyse > Compare Means > Paired-Samples T-test) 18 Statistiek transmissie Hierbij worden LOG I Totaal en LOG S totaal als paired variable gebruikt en LOG I D11-27 en LOG S D11-27 ook, zie tabel 4.3. t df Sig. (2tailed) 95% Confidence Interval of the Difference Mean Std. Deviation Std. Error Mean Upper Lower Upper Lower Upper Paired Differences Pair 1 Pair 2 I total S total I D11-27 S D11-27 Mean Std. Deviation Std. Error Mean Lower Upper Lower -,50778 ,37729 ,12576 -,79779 -,21777 -4,038 8 ,004 -,58444 ,47345 ,15782 -,94837 -,22052 -3,703 8 ,006 Tabel 4.3 resultaten paired-samples t-test. Voor de periode tot dag 27 en de periode van dag 11-27 is de P respectievelijk 0,004 en 0,006 dus is het verschil tussen de AUC’s significant. De volgende staafgrafieken geven de AUC weer over de hele periode, hoewel er in het verslag alleen gebruik wordt gemaakt van de AUC tot dag 27 maakt dit visueel niet een dusdanig verschil met de AUC tot dag 31 dat de onderstaande grafieken afwijken. De staafgrafieken zijn met name bruikbaar voor het opsporen van individuele verschillen met het gemiddelde, bijvoorbeeld isolator 9. Isolator 3 1800000 2000000 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 1600000 1400000 1200000 AUC AUC Isolator 1 I dier S dier 1000000 I dier 800000 S dier 600000 400000 200000 0 1 1 Isolator 4 Isolator 2 6000000 2500000 5000000 4000000 1500000 AUC AUC 2000000 AUC I AUC S 1000000 I dier 3000000 S dier 2000000 1000000 500000 0 0 1 1 19 Statistiek transmissie Isolator 10 Isolator 5 1600000 1600000 1400000 1400000 1200000 1200000 1000000 AUC AUC 1000000 I dier 800000 S dier 600000 600000 400000 400000 S dier 200000 200000 0 0 1 1 Totaal Isolator 6 18000000 400000 16000000 14000000 300000 12000000 AUC 350000 250000 AUC I dier 800000 I dier 200000 S dier 10000000 I dieren 8000000 S dieren 6000000 150000 4000000 100000 2000000 50000 0 0 1 1 Isolator 8 Gemiddelde AUC 1200000 1000000 I dier 600000 AUC AUC 800000 S dier 400000 200000 0 1 2000000 1800000 1600000 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 I dieren S dieren 1 Isolator 9 2500000 Staafgrafieken van de AUC per isolator van het I- en S-dier en weergave van de de totale en gemiddelde AUC over alle isolatoren. AUC 2000000 1500000 I dier S dier 1000000 500000 0 1 20 Statistiek transmissie Hoogte en tijdstip eerste en 2e piek I en hoogte en tijdstip 1e piek S Opmerking: het vergelijken van pieken is eigenlijk alleen interessant voor wat betreft het tijdstip dat de piek begint. Bovendien is de data op z’n minst moeilijk te definiëren. Omdat je de hoogte van de piek op één punt meet is de afwijking in geval van een meetfout groter dan als je over een langere periode gaat vergelijken. Als je kijkt naar de grafieken van de OPG per isolator zijn er vaak meerdere pieken te ontdekken. De eerste uitscheidingsperiode van de I dieren heeft vaak maar 1 piek van een paar dagen, maar een enkele keer zit hier een dag tussen. De tweede uitscheidingsperiode van de I dieren lijkt enigszins overeen te komen met de eerste uitscheidingsperiode van de S dieren, de grafiek heeft hier vaak de vorm van twee kamelenbulten. Daarnaast begint de uitscheidingsperiode van de S dieren op verschillende dagen wat een eenduidige definitie moeilijker lijkt te maken. Om de tweede piek van de I dieren te vergelijken met de eerste piek van de S dieren zullen we deze moeten stellen op een gelijkmatige kans op infectie. Door de periode van de eerste piek te zetten op dag 7-10 is het zeker dat het hoogste punt van deze piek wordt bereikt door de inoculatie, bovendien ben je hiervan zeker dat de tweede piek niet door de inoculatie veroorzaakt wordt maar door de eerste piek. De tweede piek van de I dieren en dus de eerste piek van de S dieren wordt gedefinieerd van dag 12-15. Hierdoor ben je er zeker van dat de uitscheiding wordt veroorzaakt door besmetting door oöcysten van de eerste piek en niet door oöcysten uit het begin van de tweede uitscheidingsperiode. Wat betreft het verschil in de start van uitscheiding is het geen probleem om de piek van dag 12-15 te definiëren, alle S dieren hebben immers een piek in deze periode. Opmerking: in isolator 1 begint de tweede piek op dag 11, in theorie zou het dus mogelijk zijn dat zowel de tweede top van het I diertje als het begin en de top van het S dier met deze uitscheidingspiek te maken heeft. Isolator 1 2 3 4 5 6 8 9 10 Diernr 5 1 26 19 23 4 6 9 20 16 3 8 21 30 24 19 27 2 Type I S I S I S I S I S I S I S I S I S Begin 7 15 7 12 7 14 7 12 7 12 7 13 7 14 7 12 7 13 Top 7 15 7 15 7 14 7 15 8 14 7 14 7 15 7 14 7 15 1e piek OPG top 39390 489 33787 114619 66888 136 20368 1470901 5263 321396 2428 3213 38458 6950 45688 373805 9332 229037 Log OPG 4,60 2,69 4,53 5,06 4,83 2,14 4,31 6,17 3,72 5,51 3,39 3,51 4,58 3,84 4,66 5,57 3,97 5,36 Begin 11 13 13 13 13 10 13 12 13 - Top 15 15 14 15 14 15 15 15 15 - 2e piek OPG Top 16476 502874 7891 233545 92583 21024 178944 389705 59216 - Tabel XX, Begin en top eerste en tweede piek I dieren en eerste piek S dieren 21 Log OPG 4,22 5,70 3,90 5,37 4,97 4,32 5,25 5,59 4,77 - Statistiek transmissie Verband tussen uitscheiding per week /AUC en gewicht of VC Wekelijks zijn de dieren gewogen, ook de hoeveelheid opgenomen voer per isolator is bepaald om de voederconversie te berekenen. Uiteindelijk zegt de voederconversie niet zoveel over het individu omdat van de twee kuikens niet bekend is wat ze individueel hebben opgenomen, hieraan zijn dus geen verdere berekeningen uitgevoerd. Het gemiddelde gewicht van de I en S dieren en de norm zijn weergegeven in grafiek 6.1. De I en S dieren lijken beide goed met de norm mee te gaan maar gedurende het begin van de periode, alleen aan het eind raken ze achter. Gewicht kuikens 1600,00 Gewicht (gr) 1400,00 1200,00 1000,00 Norm I dieren S dieren 800,00 600,00 400,00 200,00 0,00 0 8 15 22 29 31 Dag Grafiek 6.1 Gemiddelde gewicht per dier per dag voor I dieren, S dieren en de norm. Een one sample t-test is gebruikt om de I- en S-dieren met de norm te vergelijken, de resultaten hiervan staan in tabel 6.2. De gebruikte normgewichten zijn: D00: 47, D08: 176, D15: 427, D22: 799, D29 1214 en D31 1337. Het gewicht blijkt significant lager voor I dieren tijdens de hele periode en voor de S dieren op dag 0, 8 en 22. df Upper Mean Difference Upper -12,20000 95% Confidence Interval of the Difference Lower Upper -14,0409 -10,3591 W_I00 t Lower -14,992 9 Sig. (2-tailed) Lower ,000 W_S00 -12,993 9 ,000 -11,50000 -13,5021 -9,4979 W_I08 -6,973 8 ,000 -37,22222 -49,5316 -24,9129 W_S08 -4,223 8 ,003 -33,88889 -52,3947 -15,3831 W_I15 -3,394 8 ,009 -47,66667 -80,0489 -15,2844 W_S15 -,563 8 ,589 -10,22222 -52,0772 31,6328 W_I22 -4,280 8 ,003 -80,55556 -123,9600 -37,1511 W_S22 -2,370 8 ,045 -69,33333 -136,8045 -1,8622 W_I29 -4,008 8 ,004 -131,22222 -206,7268 -55,7177 W_S29 -2,142 7 ,069 -106,75000 -224,6088 11,1088 W_I31 -3,300 7 ,013 -153,50000 -263,4986 -43,5014 W_S31 -1,938 7 ,094 -113,50000 -251,9719 24,9719 Tabel 6.1 One sample t-test van gewichten ten opzichte van de norm Isolator 1 I08 117 S08 115 I15 248 S15 258 I22 353 S22 I29 119 414 22 S29 373 Statistiek transmissie 2 98 84 227 215 321 321 372 217 3 104 91 222 286 364 379 448 410 4 85 94 282 260 350 376 183 377 5 133 116 287 289 332 354 417 431 6 94 114 168 261 300 388 379 407 8 91 95 257 379 331 276 273 315 9 91 89 233 245 328 348 419 491 10 120 161 241 279 373 255 374 Mean 104 107 241 275 339 313 364 378 SD 16,2 23,8 35,4 45,2 22,8 86,1 84,3 82,3 Norm 129 129 251 251 372 372 415 415 Tabel 6.1 Groei per isolator per type per week. I = Infected, S = Susceptibel Nummer is dag. I08 t Lower -4,691 8 Sig. (2-tailed) Lower ,002 Mean Difference Upper -25,333 df Upper 95% Confidence Interval of the Difference Lower Upper -37,79 -12,88 S08 -2,830 8 ,022 -22,444 -40,74 -4,15 I15 -,884 8 ,402 -10,444 -37,69 16,80 S15 1,570 8 ,155 23,667 -11,09 58,42 I22 -4,318 8 ,003 -32,889 -50,45 -15,33 S22 -2,060 8 ,073 -59,111 -125,28 7,06 I29 -1,804 8 ,109 -50,667 -115,45 14,11 S29 -1,285 7 ,240 -37,375 -106,14 31,39 Tabel 6.2 Resultaten one sample t-test groei per groep per week ten opzichte van de norm. Uit deze test blijkt dat de groei vergeleken over de koppel alleen significant afwijkend lager is op dag 5 en 22 voor de I dieren en lager op dag 5 voor de S dieren. Het is echter nog steeds mogelijk dat de er wel groeivertraging optreedt bij dieren die veel uitscheiden en geen bij dieren die weinig uitscheiden. Relatie hoogte of moment van piek I met lagtime S Hier heb ik de data van op een rijtje gezet en gekeken of er een verband is tussen hoogte of moment van de piek van het I dier met de lagtime van het S dier. Hiertoe is getracht een lineaire regressielijn door de data te trekken; met voldoende fantasie is er een lijn te zien maar echt duidelijk is het niet. Wellicht dat dit met meer waarnemingen beter te zien is. Bovendien is de data niet normaal verdeeld waardoor de methoden om een regressielijn te bereken eigenlijk niet gebruikt kunnen worden. Data nodig voor de analyses: Isolator 1 2 3 4 5 6 AUC 4 dagen 55703,32 45009,94 98464,08 20368,33 5936,77 2428,01 Begin Lagtime 15 12 14 12 12 13 4 1 3 1 1 2 23 Statistiek transmissie 52580,57 58552,53 16679,79 8 9 10 14 12 13 3 1 2 LagTime LagTime 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 LagTime 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 AUC Groot verschil als je naar oude oöcysten kijkt? Opmerking: Het verschil is er wel, het hangt van je eigen redenering af wat je er mee doet. Eventueel is het mogelijk je experiment/data af te kappen als je de oude oöcysten niet meetelt. Hiervoor kan het nuttig zijn om per dag te berekenen of het aantal vitale en oude oöcysten significant hoger is dan het aantal vitale oöcysten. Dag 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Normaal 28849 13147 3783 1078 4424 294 28144 102387 160000 34906 15623 11823 101379 150103 32762 4019 90 50 198 97 30 67 9 Gecorrigeerd 28849 13147 3363 719 492 65 28144 102387 160000 34906 13887 11823 101379 133425 32762 4019 90 50 198 87 30 67 9 Verschil 0 0 420 359 3933 228 0 0 0 0 1736 0 0 16678 0 0 0 0 0 11 0 0 0 Percentage 0 0 11 33 89 78 0 0 0 0 11 0 0 11 0 0 0 0 0 11 0 0 0 24 Oud, Cor 28849 13147 3460 968 492 95 28144 102387 160000 34906 13887 11842 101598 133941 34658 11278 857 677 1959 2545 1517 2487 1161 Verschil 0 0 -98 -249 0 -29 0 0 0 0 0 -19 -219 -516 -1896 -7259 -767 -627 -1761 -2459 -1487 -2420 -1152 Procent 0 0 -3 -35 0 -45 0 0 0 0 0 0 0 0 -6 -181 -848 -1265 -890 -2837 -4925 -3614 -13191 Statistiek transmissie 30 31 36 46 36 52 0 -6 Normaal Gecorrigeerd 0 0 0 0 29473 53289 219701 281992 84744 143218 29463 149531 246857 265065 161974 97307 34874 10394 126913 7341 441 73 54 23 22924 53289 195290 250659 84744 111392 29463 149531 246857 265065 161974 97307 34874 10394 126913 7341 441 73 61 25 Verschil 0 0 0 0 0 6550 0 24411 31332 0 31826 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -7 -3 0 -13 713 512 -676 -461 Oud, Corr Verschil 0 0 0 0 0 -10 0 0 -1125 22 0 0 0 0 -187 -7643 -1032 -860 -985 -3426 -4113 -2030 -2485 -1006 -2538 -1863 -891 Tabel 8.1 OPG I dieren Dag 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Procent 0 0 22 0 11 11 0 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -13 -13 22934 53289 195290 251784 84722 111392 29463 149531 246857 265252 169617 98339 35733 11379 130339 11454 2471 2558 1067 2563 Procent 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -5 -1 -2 -9 -3 -56 -460 -3393 -1652 -9968 Tabel 8.2 OPG S dieren Bij het vaststellen van de OPG zijn m.b.t. het valideren van een PCR de oude oöcysten apart gekwantificeerd, de reden hiervoor is dat wordt aangenomen dat de oude oöcysten in de singledropping niet door de kip zijn uitgescheiden maar vanuit de omgeving in de mest komen. Het verschil tussen een vitale en een oude oöcyst wordt visueel vastgesteld, een PCR zou dit verschil niet kunnen maken. Aangezien de oude oöcysten met name later in de uitscheidingscyclus, dus na de top van de uitscheiding, te vinden zijn lijkt het erop dat het meetellen van de oude oöcysten geen significant verschil uitmaakt op de totale uitscheiding. Om te berekenen of het verschil tussen alleen vitale of vitale en oude oöcysten siginificant is kunnen we wederom de Independent Samples T-test gebruiken (zie hoofdstuk 4). De test variabele is de OPG gegroepeerd bij V (vitaal) en O (oud) de standaard deviaties van beide groepen komen vrijwel overeen en ook de Levene’s test > 0,05. Bij een T van -0,068 en 48 graden van vrijheid komt de P op 0,946 (> 0,05). Zie tabel 8.3. Hieruit kan dus geconcludeerd worden dat het meetellen van de oude oöcysten geen significant verschil maakt op de totale OPG van de I dieren als je de oude oöcysten meetelt. De S-dieren laten een vergelijkbaar beeld zien (Tabel 8.4) Levene's Test for Equality of Variances t-test for Equality of Means Std. Error Sig. (2Mean Differenc tailed) Difference e F Sig. t df Lower Upper Lower Upper 25 Lower Upper Lower 95% Confidence Interval of the Difference Upper Lower Statistiek transmissie OPG Equal variances assumed Equal variances not assumed ,002 ,968 -,068 48 ,946 -883,76000 12945 -26913 25145 -,068 47,99 7 ,946 -883,76000 12945 -26913 25145 Tabel 8.3 Resultaten Independent Samples test vergelijking Vitale en Vitale + Oude OPG dieren Levene's Test for Equality of Variances OPG_ S Equal variances assumed Equal variances not assumed t-test for Equality of Means Std. Error Sig. (2Mean Differenc tailed) Difference e 95% Confidence Interval of the Difference F Sig. t df Lower Upper Lower Upper ,000 ,992 -,045 42 ,964 -1246 27611 -56968 54475 -,045 42,00 0 ,964 -1246 27611 -56968 54475 Lower Upper Lower Upper Lower Tabel 8.4 Resultaten Independent Samples test vergelijking Vitale en Vitale + Oude OPG S dieren. Een éénduidige conclussie valt niet te trekken, of je oude oöcysten al dan niet meerekent is afhankelijk van je doelstelling. Het berekenen of het al dan niet meetellen van oude oöcysten een significant verschil maakt kan deze beslissing ondersteunen. Pre-PCR processing, an overview of methods for developing a realtime PCR to enumerate and speciate Eimeria oocysts in feces. Summary. In Eimeria research a PCR has been developed for speciating oocysts in feces, also a quantitative PCR has been developed to speciate and enumerate oocysts in a solution or sporozoites in intestinal tissues. However a quantitative PCR for fecal samples could not be established yet because of inhibition by fecal substances. A protocol has to be developed to isolate oocysts or DNA from the sample or to prevent inhibition in order to perform a quantitative PCR. This document describes various techniques that can be used within this protocol, and can be used to develop a quantitative PCR to enumerate and speciate Eimeria oocysts in feces. 1. Introduction. Several strains of Eimeria spp. infect chickens and cause a disease called coccidiosis. The disease is widespread worldwide and responsible for major economical losses due to (preventive) treatment and a lower production (Saif et al., 2005). There are seven species of Eimeria that cause disease in chicken, the degree of clinical effects and site of reproduction differs per species. Often disease is caused by a mixed infection of two or more different species (Haug et al, 2008 ; Saif et al., 2005; Peek & Landman, 2003). Coccidiosis can be controlled with anticoccidial drugs or vaccination. However resistance to anticoccidial drugs becomes and increasing problem and in the European Union the preventive administration of coccidiostatic drugs will be prohibited in 2012 (EU Commision, 2003). For these reasons new methods for the control of the disease have to be found or existent methods have to be improved. Therefore a lot of research is done on coccidiosis. Classical methods to monitor coccidiosis include various flotation techniques for detecting oocysts in feces or post mortem examination, either by scoring gross lesions or by scraping the intestines for examination of various stadia of Eimeria by light microscopy. The flotation techniques have as disadvantage that they are time and labour intensive and distinguishing each of the species is not 26 Verslag PCR Eimeria possible. Furthermore, feces have to be processed within a limited timespace to prevent inaccurate counts because of disintegrating or unrecognisable oocysts. Post mortem examination makes it possible to distinguish between the different species based on gross lesions but require sacrificing birds, which is undesirable during an animal experiment. Therefore a new method that can quantify species specific oocysts in stored feces would be a major advantage in coccidiosis research. A PCR has been developed as a tool to detect Eimeria and to distinguish between the species and because it's possible to quantify the reaction, PCR is a promising candidate. Various researches have reported a PCR on either intestinal tissue (Schnitzler et al. 1998; Blake et al. 2005; Swinkels et al. 2006) or oocysts isolated from litter or stored in potassiumdichromate. When the PCR was carried out on litter, the oocysts were separated from the litter by using various types of centrifugal techniques to prevent inhibition from fecal substances. Different techniques have been described: simple flotation (Schnitzler et al. 1998; Su et al. 2003), washing out by repetitive sedimentation after initial flotation (Haug et al, 2008) or purification over a sucrose gradient (Jenkins et al. 2006; Morris et al. 2007a; Morris et al. 2007b). DNA can be extracted from the firm oocyst by cracking the wall by means of bead beating (Haug et al. 2007). Specific primers have been designed to detect Eimeria (Morris et al. 2007a; Morris et al. 2007b; Blake et al. 2005) a number of it's species (Haug et al. 2007; Jenkins et al. 2006; Haug et al. 2008; Schnitzler et al. 1998; Morris & Gasser, 2006; Su et al. 2003; Blake et al. 2005) or for detection of specific genetic markers (Morris & Gasser, 2006). Work has been done to create an effective and reproducible standard protocol for the PCR by reviewing different methods for the various steps of performing the PCR (Haug et al. 2007). With the development of real-time PCR in which the amount of DNA is detected during the PCR reaction (see paragraph 4.1) a reliable method of quantifying the number of copies of the target DNA in the sample has been established (Heid et al, 1996). Recently a number of reports appeared which describe a real-time PCR on Eimeria, however those have been done on intestinal tissue where stadia other then oocysts were targeted (Blake et al. 2005; Swinkels et al. 2006) or a dilution series of oocysts (Blake et al. 2008). The oocyst solution used in this experiment was derived from feces so the accuracy of the quantification of oocysts by the real-time PCR would be highly influenced by the yield of oocysts gained from the feces. When the number of oocyst in a standardised amount of feces should be determined, a method to separate oocysts from feces, in order to prevent inhibition of the PCR by fecal components, should be developed that is reliable and predictable regarding the yield of oocysts. Inhibition of the PCR reaction has not only been reported in feces but also in different types of biological materials and soil. Preventing inhibition is one of the major goals of pre-pcr processing which targets the steps before detection of the PCR's products. Those steps are: 1) taking of samples, 2) processing the sample and 3) amplification of DNA (Rådström et al. 2004). In this paper I will describe various methods used in pre-PCR processing and results taken from research on other parasites in feces I hope this paper might help to find a good protocol for real-time detection of Eimeria oocysts in feces by means of PCR. 2. Taking samples. There are various different methods of taking fecal samples for enumeration of oocysts. If the goal of the enumeration is to monitor a group of chickens, samples can be taken from the litter, however if a single bird has to be followed over time you have to (temporary) isolate the chicken to obtain feces or take a cloacal swab. A swab would contain only a small amount of oocysts and feces so it needs less processing and has the additional advantage that in a group experiment you don't have to separate the chickens to obtain animal specific feces. However the small amount of feces might make the enumeration less accurate and it can't be processed by the classical methods. Collecting 27 Verslag PCR Eimeria individual droppings doesn't have these disadvantages but is more labour intensive and would probably require more processing. In studies where a high number of samples have to be processed or direct processing is not possible, the samples have to be stored in order to perform an oocyst count later. Eimeria oocysts can be stored in a 2-4% potassiumdichormate solution at 4 degrees Celcius (Saif et al., 2005), this will keep the oocysts alive and free from bacterial contamination and given appropriate circumstances it will allow the oocysts to sporulate (Ryley et al. 1976). During sporulation 8 sporozoites develop inside the oocyst, therefore real-time PCR results may indicate eight times the number of oocysts present in the sample. So if oocysts were stored in potassiumdichromate sporulation has to be prevented or the sporulation percentage has to be calculated to correct for the number of oocysts found. Another disadvantage of storing the oocysts in potassiumdichromate would be a possible loss of oocysts during pre-storage processing. An alternative might be storing the sample by freezing, this might kill the oocysts and prevent sporulation. However it might be harder to separate the dead oocysts from the sample using conventional techniques that are based on flotation. 3. Processing the sample. Different strategies in processing the sample to prevent inhibition have been used, basically there are three strategies to accomplish this: separate the target cells, in our case oocysts, from inhibiting substances, extract the DNA from the inhibiting substances and by inactivating the inhibiting substances so the PCR can be performed on the whole sample. Separation of oocysts from the fecal sample has as side effect that it makes cracking the oocyst wall easier, however the effect of the feces on bead beating can be passed by increasing the time (Haug et al. 2007). 3.1 Separating the oocysts from the sample. Different techniques have been established to separate cells from a sample, a straight forward method is using flotation techniques or filters, however separation by magnetic beats coated with antigen is also described (Rådström et al. 2004). Accuracy of the real-time PCR would be highly influenced by the efficiency of extracting oocysts from the sample, however shouldn’t be a problem as long as the oocyst yield is a comparable representation of the sample in repeated extractions. 3.1.1. Flotation techniques. As described above, separation of oocysts and fecal contents by centrifugation has been done to improve the performance of a normal PCR, however loss of oocysts within this process is well known and inhibition of PCR in these samples has not been tested by adding a control. An advantage of separating the oocysts by centrifugation is that the oocysts are concentrated in the process (Rådström et al. 2004). Different flotation techniques have been used in pre-processing a sample for PCR: 1) simple flotation or washing, 2) Discontinuous gradients or 3) Buoyant density flotation. 3.1.1.1. Simple flotation techniques and washing. This is the easiest technique to perform where oocysts are either collected at the top of a satured salt or sucrose solution or they are washed by repeated sedimentation in tap water. These methods are well known in the classical methods for detection or separation of oocysts (Shirley, 1995; Long et al, 1976) and have been used by different researches in preparing samples for PCR (Haug et al. 2008; Schnitzler et al. 1998; Su et al. 2003). In this process loss of oocysts is well known during sieving the initial feces solution (Ryley et al. 1976) so this step might have to be adjusted, for example by better homogenization or dilution, or left out. With sedimentation all substances with a density lighter then the medium will collect at the bottom so inhibiting substances might not be cleared from the sample. After flotation much of the fecal debris is in the sediment, however the sediment still contains oocysts (Ryley et al. 1976) and the yield of oocysts collected from the supernatant might vary (Shirley, 1995; Ryley et al. 1976). To overcome the latter problem isolating 28 Verslag PCR Eimeria the whole supernatant and sedimentating the oocysts afterwards might be an interesting strategy. Fecal debris still is a main component of the sample acquired after flotation (Ryley et al. 1976), however partial inhibition in this sample has not been measured. Sodium hypochlorite (bleach) may be added to the centrifugation medium to gain a cleaner oocyst yield (Ryley et al. 1976). 3.1.1.2. Discontinuous gradients. In a discontinuous gradient, also known as a two-phase aqueous system, two or more layers of fluid with different densities are stacked on top of each other in a centrifugation tube. Rather then collecting contents on top or on the bottom of the fluid another collection point at the “border” of two layers is present. Therefore it's possible to separate the oocysts from substances with either a lower or higher density. A discontinuous sucrose gradient can be made by underlaying tap water with a sucrose-solution (Gasser, 1987) or by overlaying a sucrose solution with tap water (Jenkins et al. 2006). The first method has been used in a PCR on Eimeria and is said to separate the oocysts from the inihibiting substances (Morris et al. 2007a; Morris et al. 2007b), however the density of the sucrose solution and the oocyst yield have not been mentioned. A method which uses a sucrose solution for both layers has been described for isolation Cryptosoridium oocysts from bovine feces (Arrowood & Sterling, 1987). In this method a number of chemical substances has been added to the sucrose solution which was diluted for each of the layers, in two sequential centrifugal rounds 71% and 72% of oocysts were recovered. The polymers, dextran 500, dextran 40 and PEG have been used to create two layers with a different density for processing food samples (Lantz et al. 1996), the polymers did not influence the PCR. Also the use of percoll ® to generate the layers different densities has been described (Lindqvist et al. 1997). 3.1.1.3. Buoyant density flotation. This technique can be compared with discontinuous gradients for substances that will not travel to either the top or the bottom of the layer but stay at a particular level. With buoyant density flotation the gradient will be continuous hence a more accurate separation of substances of different density is possible. The separation is even enhanced because the gradient is not linear but S shaped (Dulski & Turner, 1987). However differences in specific gravity between different life stages of Eimeria might cause oocysts to be separated from the main fraction. The gradient is made by using a percoll ® solution which forms itself during 10-30 minutes of centrifugation (Lindqvist et al. 1997). By adding color coded beads of different densities the gradient can be visualized and hence the specific gravitiy of different substances and Eimeria stages can be measured. This also makes it possible to use this method to optimize densities in discontinuous gradients (Lantz et al. 1996). Buoyant density flotation has been described for isolation of Eimeria tenella sporocysts and sporozoites (Dulski & Turner, 1987). Using a two step purification scheme, 98% of the sporozoites were recovered, containing minor parasite contaminants. However the recovery of whole oocysts by this method was not measured. 3.1.2. Immunological extraction This method is based on magnetic beads covered with cell specific antibodies. The antibodies bind to the cells and the whole complex is removed from the sample with the magnetic beats. This method has been described for a conventional PCR on Giardia oocysts (Van der Giessen et al. 2006). It is said that specificity of the PCR is influenced by the antibodies used (Rådström et al. 2004), this would mean that non-wanted cells are also extracted and detected by PCR. However these cells shouldn’t be detected by PCR if your primers are specific. It’s more likely that the sensitivity is lowered in case the antibodies have a low sensitivity for the oocysts. 29 Verslag PCR Eimeria 3.2 Extracting the DNA from the sample. This method requires the oocysts to be broken so the DNA, rather then complete oocysts can be salvaged from the samples. The efficiency of destroying the oocyst wall by bead beating has been proven to depend on the amount of fecal debris so beating times should be longer than the 1.5 minutes reported (Haug et al. 2007). Various methods have been used to separate the DNA, these include silicon beats, FTA filters and spin columns. Extracting the DNA is a function of many commercially available DNA kits. 3.2.1. Silicon beads Magnetic beads are used that are covered with silicon or a substance with the same properties. The DNA sticks to the bead and is extracted from the sample when the beads are removed. Much like the immunological extraction described above. Although not all samples had a positive response on the internal control, this method has been proven useful in the detection of diarrhea-causing protozoa in human feces by real-time PCR (Ten Hove et al. 2007). 3.2.2. FTA filters. FTA Filters® are manufactured by Whatman, (Maidstone, UK) and are specially designed to extract DNA from difficult samples. The sample is dropped on the filter where chemicals lyses the cells and DNA is captured in the filter’s matrix where it is protected against nucleases and UV light (Inque et al. 2007). The remains of the sample can be washed off and the filter can be stored at room temperature. A piece of the filter is cut out and added to a solution on which the PCR is performed. (Whatmann, 2008) These filters have been used in the detection of spores of Enterocytozoon bienuesi (Subrunggruang et al. 2004) however chemicals are said to be less effective in distracting Eimeria oocyst walls, so initial grinding of the sample might be needed. The use of probes with these filters has been investigated (Higgins et al. 2000) no real-time PCR has been carried out (Inque et al. 2007), however the latter paper uses the probe in a qualitative way rather then quantitative. Quantitative detection of DNA using FTA Filters® or likewise products might only be possible if all the DNA is extracted from the filter or an equal concentration of DNA throughout the filter can be obtained. 3.2.3 Spin columns. These work like filters, the filter contains silica which binds the DNA, whereas other substances and PCR inhibiting proteins are washed away after centrifugation. The centrifugal force is used to push the sample through the sample. Additional processing by washing, heating and sodium dodecyl sulphate-proteinkinase K treatment before using the spin columns is used to make the extraction of DNA more efficient (Quigen, 2008). This method has been used to detect and quantify infection by a number of helminthes (Ten Hove et al. 2008; Verweij et al. 2007a; Verweij et al. 2007b)), internal controls have been used to monitor PCR inhibition. No inhibition using the protocol mentioned in these articles has been mentioned. Cells are lysed enzymatic (Quigen, 2008) so preprocessing of oocysts by grinding might be needed. 3.2.4 PCR Kits Many PCR Kits have been developed by commercial companies for PCR processing, many of these kits work by extracting the DNA and storing it in buffers appropriate for the PCR reaction. The PCR Kit that contains the highest yield and purification of DNA should be chosen (Rådström et al. 2004). Different kits have been used for a conventional PCR on Eimeria and Haug et al compared three different kits with the classic phenol-chlorophorm method (Haug et al. 2007). From these kits the GeneReleaser® Protocol (Bioventures, 2008) and classic phenol-chlorophorm extraction (Keller & Manak, 1989) seem to have fairly equal performance regarding repeatability and detection limits. 30 Verslag PCR Eimeria The GeneReleaser® is easier to perform and loss of material during processing is limited because the whole process takes place in one tube. 3.3 Inactivation of inhibitory substances. Although not all inhibitory substances in feces are known, it is suggested that part of it is caused by proteinases that degrade the DNA polymerase, bile salts and complex polysaccharides (Rådström et al. 2004). Reaction facilitators like the proteins BSA and gp32 might be added to function as substrate for the proteinases and therefore protect the DNA polymerases by competition (Rådström et al. 2004). If phytic induces inhibition of the PCR, phytase treatment of the sample will significantly reduce inhibition (Thornton & Passen, 2004). Other methods may be proteinekinase K or guanidine isothiocyanate digestion (Schwab & McDevitt, 2003). 4. Amplification of DNA. Amplification of the DNA is the final step of pre-PCR processing and this step focuses on the composition of the reaction mixture, the choice of DNA polymerase and the use of facilitators for DNA Amplification (Rådström et al. 2004). Although primers and the choice of detection reagent probably are not effected by the inhibition they have a major influence in the results of a real-time PCR (Zhang & Fang, 2006) so they are discussed here as well. 4.1. Detection reagents. As opposed to traditional PCR where the reaction products are analyzed by post-PCR processing, in real-time PCR the concentration of amplicon is measured throughout the reaction using specially developed fluorescent dyes, known as detection reagents. Three different groups of fluorescent dyes are used in real-time PCR: double stranded DNA binding dyes, DNA sequence specific probes and DNA sequence specific primer-probes (Zhang & Fang, 2006). Each of these groups has specific properties and within groups different dyes with specific properties have been developed. 4.1.1 Double stranded DNA-binding dyes. Double-stranded DNA binding dyes are naturally fluorescent. When they bind to double stranded DNA (dsDNA) the intensity of the fluorescence substantially increases. By measuring the amount of fluorescence the amount of dsDNA which is produced during the extension phase can be monitored. One of the most common used dsDNA-binding dyes is SYBR Green I; other examples are BEBO and Thiazole Orange (Zhang & Fang, 2006). dsDNA-binding dyes are regarded simple to use, relatively cheap compared with sequence specific probes and can be used with any PCR primer set (Zhang & Fang, 2006). The last feature also is a disadvantage because the amount of fluorescence is also increased by amplification of non-target DNA due to a low specificity of the primer set. This also means that multiplexing, i.e. multiple simultaneous PCRs in one mixture, is not possible. Because of this, internal controls cannot be used but non-species specific quantification of Eimeria spp is much easier using dsDNA-binding dyes then when using species-specific probes. Amplification of non-target DNA can be prevented by designing species specific primers (Zhang & Fang, 2006) and can be detected by melting curve analysis (Coleman & Tsongalis, 2006). Use of dsDNA-binding dyes in a PCR on Eimeria has not been published although the GD in Deventer used it in their experiments. 4.1.2. Sequence specific probes. These probes consist of an oligonucleotide, a reporter fluorophore and a quencher. The oligonucleotide binds to sequence specific single-stranded DNA like primers do, therefore these probes can be used for species identification, but also for the detection of point mutations.The reporter is fluorescent but the fluorescence is quenced if close to the quencher (Coleman & Tsongalis, 2006). Two types of probes have been described: the cleavage based probe and a molecular beacon. 31 Verslag PCR Eimeria The cleavages based probes, e.g. the taqman probe, are short linear oligonucleotides with a reporter fluorophore on one end and a quencher on the other end, in this configuration the fluorescence is quenced due to their close proximity. The probe binds to single-stranded DNA and is cleaved by the DNA polymerase during the extension phase, this cleavage separates the reporter and the quencher resulting to an increase in fluorescence (Zhang & Fang, 2006; Coleman & Tsongalis, 2006). The basic composition of a molecular beacon is like cleavage based probe with an oligonucleotide, a reporter and a quencher. However the oligonucleotide has three sections: two self-complementary strands at the ends and the sequence specific strand in the middle. When not bound to DNA the selfcomplement DNA strands hybridize causing the probe to take up a hairpin loop structure with the reporter and quencher in close proximity and therefore fluorescence is low. The self-complement DNA strands are separated by thermal degradation and annealing allowing the probe to bind to single stranded DNA during the annealing phase. The hairpin loop structure is now open and the reporter and the quencher are further apart so fluorescence increases. This means that the intensity of fluorescence is a reference to the amount of single stranded DNA in the mixture (Zhang & Fang, 2006; Coleman & Tsongalis, 2006). In the extension phase the temperature rises and the molecular beacon detaches from the DNA and takes back its hairpin loop structure, thus the fluorescence is quenched again and the beacon isn't destroyed during extension (Zhang & Fang, 2006). Four different reporter fluorophores have been developed which can be detected simultaneously, therefore multiplexing is possible with up to four different primer/probe combinations (Zhang & Fang, 2006) limiting the amount of PCRs needed to perform a real time PCR with different Eimeria species and allowing the use of an internal control. The development of additional dyes and more advanced detection systems might allow for more simultaneous reactions in the future. The sequence specific probes do not detect side-reactions other then the desired one like the dsDNAbinding dyes, however due to their sensitivity an accurate design of the probe-sequence is essential and the preparation of the sample and DNA quality are of major influence of the quality and accuracy of the acquired data (Coleman & Tsongalis, 2006). Sequence specific probes have been used in real-time PCR on Eimeria spp; for the sequence of primers and probes see the specific articles (Blake et al. 2008; Blake et al. 2005; Swinkels et al. 2006). 4.1.3. Sequence specific primer-probes. The sequence specific primers-probes have the same mode of action as the molecular probes, however rather then having a target sequence specific oligonucleotide in the middle it is placed at the end with the quencher and this oligonucleotide is used as a primer. The primers come in two versions: with or without a hairpin loop structure. In the latter the reporter and quencher are completely separated like the cleavage based probes, this prevents some degree of quenching which is seen in hairpin loop structured probes and primers. These primer-probes are faster and more efficient the separated primer and probe systems (Coleman & Tsongalis, 2006). 4.2. Primers and probe sequence. Design of the sequence of primers and probes are important for both sensitivity and specificity of the real-time PCR. When the primers are not specific for the target Eimeria strain non-target DNA sequences might be amplified or primers can form dimmers which are detected by the dsDNAbinding dyes (Zhang & Fang, 2006). If the sensitivity of the primers or probes is low not all the DNA is amplified and quantification can be too low for all types of detection reagents. A low specificity of the primers will not be a problem with the DNA sequence specific dyes, as long as the specificity of the probe itself is high (Coleman & Tsongalis, 2006). 32 Verslag PCR Eimeria The primer and probe combination used by Swinkels (Swinkels et al. 2006) have been designed with computer software, however sensitivity and specificity in a mixture with other organisms has not been reported. Blake tested his primers for species-specificity against other Eimeria spp. and chicken DNA (Blake et al. 2008). Primers targeting the E. maxima MICI region and the Eimeria 5S rRNA have been tested against several species and with a dilution series, the primers showed to be sensitive and highly specific in the used ranges (Blake et al. 2005). 4.3. DNA Polymerase. Over time different types of DNA polymerase have been discovered or developed, the polymerase of Thermus aquaticus (also known as Taq polymerase) is the most widely used but other thermostabile polymerases have been reported (Rådström et al. 2004). The activity of polymerase depends on the composition of the reaction mixture: pH, ion concentration (Mg2+) and temperature influence the activity of Taq polymerase and optimum values are to be determined empirically (Coleman & Tsongalis, 2006). Furthermore polymerase is inactivated by longer exposure to high temperatures (Coleman & Tsongalis, 2006) and can be degraded by proteases (Rådström et al. 2004). Activity can be further reduced by a number of other PCR inhibiting compounds (Rådström et al. 2004). The effect of different substances changed by the type of polymerase used; therefore the type of polymerase should be adapted to the material the PCR is performed on. In feces samples it has been reported that the polymerase of Tth DNA polymerase isolated from Thermus thermophilus is more sensitive then Taq polymerase. Furthermore Tth or Pwo (Isolated from Pyrococcus woesei) polymerase can be used in the presence of 0,4% feces without inhibition (Rådström et al. 2004). Besides inhibition of polymerase another problem can be unwanted side reactions. Although the optimum temperature for Taq polymerase activity lies at 72°C there is also activity at 37°C which may result in unwanted replication of DNA before the PCR reaction is started. This might be important if dsDNA-binding dyes are used to detect PCR products, however it is not clear what the impact of this effect is. To overcome this problem special Taq polymerase preparations (Platinum Taq polymerase from Invitrogen Life Technologies and TaqBead Hot Start Polymerase by Promega) have been developed which use antibodies or wax to prevent replication until the high temperature is reached which destroys the antibodies and wax (Coleman & Tsongalis, 2006). 4.4. Amplification Facilitators. A number of substances have been added to the basic reaction mixture to examine their effects on the efficacy of amplification. These substances may prevent inhibition (see above), improve the stability of the DNA polymerase or have a positive effect on the quality of DNA. These substances are known as amplification facilitators (Rådström et al. 2004). Due to the different composition of samples of different origin the amplification facilitators used between these samples may vary. Amplification facilitators that enhance the PCR reaction in general see that chapter in the article by Rådström et al. (Rådström et al. 2004). Amplification facilitators specific for fecal samples are polyethylene glycol (PEG) and BSA which have enzyme stabilizing properties and are believed to enhance the persistence of enzymatic activity. Also Tween-20 has been mentioned to enhance the activity of Taq DNA polymerase and prevent false terminations (Rådström et al. 2004). 5. Control of inhibition. In many substances on which a PCR is performed, whether it is feces, blood, tissue or dirt, inhibition of PCR has been an issue. Inhibition can be detected by adding an internal control or including a PCR on a target that is guaranteed to be in the sample. In PCR based Eimeria research the ubiquitous E. acervulina has been used as an internal control to detect inhibition (Haug et al. 2008). However, because the concentration or oocysts is unknown this could only detect a total 33 Verslag PCR Eimeria inhibition of the PCR while in quantitative PCR inhibition could result in an inaccurate detection level as well (Schwab & McDevitt, 2003). To detect partial inhibition in real-time PCR an universal internal control has been developed using a DNA virus: Phocine HerpesVirus Type 1 (Niesters, 2004). This virus can easily be grown in cell culture and be detected with PCR using a TaqMan assay. In the field of virology a fixed amount of virus is added to the sample before extraction resulting in a control for both extraction and DNA amplification (Niesters, 2004). In a real-time PCR on Eimeria it would not be likely that this virus is co-extracted, especially when flotation techniques are used, therefore the internal control can only be used to monitor inhibition of the PCR itself. Possibly a new internal control with the same properties of Eimeria or even by using a different Eimeria strain then the one that is tested for can be developed. An internal control isn’t only useful in validating a method, since the contents of feces may vary inhibition is always possible. Therefore an internal control should always be used for validation of the PCR’s efficiency so in the case of inhibition results van be compensated (Schwab & McDevitt, 2003). 6. Conclusion. Inhibition of PCR by fecal components has always been a problem and many methods have been developed to overcome inhibition. In this article I described a number of these methods and how they could apply to a PCR on Eimeria. The aim of pre-PCR process would be to get 1) a DNA yield representative for the sample and 2) a prevention of inhibition of the PCR reaction. The methods described have different properties of DNA retrieval and prevention of inhibition but a protocol can be made using multiple methods that complement each other. While a real-time PCR on an oocyst suspension has already been developed (Blake et al. 2008), research needs to be done on the efficiency of DNA isolation from field samples, either directly on the sample or by storing the oocysts in a suspension first. DNA extraction is not the only factor in the accuracy of real-time PCR though, therefore the design of primers, probes and the contents of the reaction mixture have to be optimized and tested for sensitivity and specificity for as far as this isn’t done yet. After all it’s the whole process that defines the accuracy of the acquired data. For reproducibility and user friendly methods commercial methods might be preferred, however these might not be available for oocysts or might contain steps with no effect on or totally incompatible with Eimeria oocysts. I will have to leave it to other people to test the methods and develop a real time PCR for Eimeria, I hope this document can help you in your efforts. Literature ARROWOOD, R.J. & STERLING, C.R. (1987) Isolation of Cryptosporidium oocysts and sporozoites using discontinuous sucrose and isopycnic percoll gradiënts. Journal of parasitology 73 (2) pp 314-319 BIOVENTURES (2008) http://www.bioventures.com/products/genereleaser/i ndex.php BLAKE, D.P., HESKET, P., ARCHER, A., SHIRLEY, M.W. & SMITH, A.L. (2005) Eimeria maxima: The influence of host genotype on parasite reproduction as revealed by quantitative real-time PCR. BLAKE, D.P., QIN, Z., CAI, J. & SMITH, A.L. (2008) Development and validation of real-time polymerase chain reaction assays specific to four species of Eimeria. Avian Pathology 37 (1) pp 89-94 COLEMAN, W.B., & TSONGALIS (2006) Molecular Diagnostics, For the clinical laboratorian 2nd Ed. Humana Press Inc., Totowa New Jersey USA. DULSKI, P. & TURNER, M. (1987) The purification of sporocysts and sporozoites from Eimeria tenella oocysts using percoll density gradients. Avian Diseases 32 pp 235-239 EU COMMISION (2003) Regulation (EC) No 183112003 of the European Parliament and the council of 22 september 2003 on additives for use in animal nutrition. http://eur-lex.europa.eu/ GASSER, R.B., ECKERT, J. & ROHRER, L. (1987) Infectivity of Swiss Giardia isolates to jirds and mice, and in vitro cultivation of trophozoites originating from sheep. Parasitology Research, 74 pp 103-110 HAUG, A. THEBO, P. & MATTSSON, J.G., 2007. A simplified protocol for molecular identification of Eimeria species in field samples. Veterinary parasitology 146 g 35-45 HAUG, A., ANNE-GERD, G., THEBO, P., MATTSSON, J.G. & KALDHUSDAL, M., 2008, Coccidial infections in commercial broilers: epidemiological aspects and comparison of Eimeria species identification by morphometric and 34 Verslag PCR Eimeria polymerase chain reaction techniques. Avian Pathology 37 (2) pp 161-170 HEID, C.A., STEVENS, J., LIVAK, K.J. & WILLIAMS, P.M. (1996) Real time quantitative PCR. Genome Research 6 pp 986-994 HIGGINS, J.A., HUBALEK, Z., HALOUZKA, J., ELKINS, K.L., SJOSTEDT, A., SHIPLEY, M. & SOFI IBRAHIM, M. (2000) Detection of Francisella tularensis in infected mammals and vectors using a probe-based polymerase chain reaction. American Journal of Tropical Medical Hygiene 62 (2) pp 310-318. INOUE, R., TSUKAHARA, T., SUNABA, C., ITOH, M. & USHIDA, K. (2007) Simple and rapid detection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus from pig whole blood using filter paper. Journal of Virological Methods 141 pp 102106 JENKINS, M.C., MISKA, K. & Klopp, S., 2006 Application of Polymerase Chain Reaction Based on ITS1 rDNA to Speciate Eimeria. Avian Diseases 50 pp 110-114 KELLER, G.H. & MANAK, M.M., 1989. DNA probes, Macmillan, London pp. 29-35 LANTZ, P.-G., THERNELD, F, HAHN-HÄGERDAL, B., RÅDSTRÖM, P., 1996, Use of aqueous twophase systems in sample preparation for polymerase chain reaction-based detection of microorganisms. Journal of Chromatography B 680 pp 165-170 LINDQVIST, R., NORLING, B., THISTED LAMBERTZ, S., 1997 A rapid sample preparation method for PCR detection of food pathogens based on buoyant density centrifugation Letters in Applied Microbiology 24 pp 306-310 LONG, P.L., MILJARD, B.J., JOYNER, L.P., NORTON, C.C. (1976) A guide to laboratory techniques used in the study and diagnosis of avian coccidiosis. Folia Veterinaria Latina 6 (201) pp 201-217 MORRIS, G.M., WOODS, W.G., RICHARDS, D, G. & GASSER, R.B. (2007) The application of a polymerase chain reaction (PCR)-based capillary electrophoretic technique provides detailed insights into Eimeria populations in intensive poultry establishments. Molecular and Cellullar Probes 21 pp 288-294 MORRIS, G.M, WOODSM W.G., RICHARDS, D.G. & GASSER, R.B., (2007) Investigating a persistent coccidiosis problem on a commercial broilerbreeder farm utilising PCR-coupled capillary electrophoresis. Parasitology Research. 101 pp 583589 MORRIS, G.M. & GASSER, R.B. (2006). Biotechnological advances in the diagnosis of avian coccidiosis and the analyses of genetic variation of Eimeria. Biotechnology Advances. 24 pp 590-603. EimeriaI spp. Field isolates originating from 1996, 1999 and 2001. Avian pathology 32 (4) pp 291-401 QIAGEN (2008) http://www1.qiagen.com/Products/GenomicDnaStab ilizationPurification/QIAampSystem/QIAampDNA MiniKit.aspx?ShowInfo=1 RÅDSTRÖM, P., KNUTSSON, R., WOLFFS, P., LÖVENKLEV, M., LÖFSTRÖM, C., 2004, PrePCR Processing Molecular Biotechnology 26 pp 133-146 RYLEY, J.F., MEADE, R., HAZELHURST, J. ROBINSON, T.E. 1976 Methods in coccidiosis research: separation of oocysts from faeces. Parasitology 73(3) pp 311-26 SAIF, Y.M., BARNES, H.J., GLISSON, J.R., FADLY, A.M., MCDOUGALD, L.R. & SWAYE, D.E. (2005) Diseases of poultry 11th Ed. Iowa State Press, Ames Iowa USA. SCHNITZLER, B.E., THEBO, P.L., MATTSON, J.G., TOMLEY, F.M., SHIRLEY, M.W. (1998) Development of a diagnostic PCR assay for the detection and discrimination of four pathogenic Eimeria species of the chicken. Avian Pathology 27 pp 490-479 SCHWAB, K.J. & MCDEVITT, J.J. (2003) Development of a PCR-Enzyme immunoassay oligoprobe detection method for Toxoplasma gondii oocysts incorporating PCR controls. Applied and environmental microbiology 69 (10) pp 5819-5825 SHIRLEY, M.W. 1995 Eimeria species and strains of chicken, ECKERT, J., BRAUN, R., SHIRLEY, M.W. & CAUDERT, P. COST 89/820 Biotechnology: Guidelines in coccidiosis research Luxembourg: European Commission pp 1-25 SU, Y., FEI, A.C., & TSAI, F. (2003) Differential diagnosis of five avian Eimeria species by polymerase chain reaction using primers derived from the internal transcribed spacer 1 (ITS-1) sequence. Veterinary Pathology. 117 pp 221-227 SUBRUNGGRUANG, I., MUNGTHIN, M., CHAVALISCHEWINKOON-PETMITR, P., RANGSIN, R., NAAGLOR, T. & LEELAYOOVA, S., (2004) Evaluation of DNA Extraction and PCR Methods for Detection of Enterocytozoon bienuesi in Stool Specimens Journal of Clinical Microbiology 42 (8) pp 3490-3494 SWINKELS, W.J.C., POST, J., CORNELISSEN, J.B., ENGEL,B., BOERSMA, W.J.A., REBEL, J.M.J. (2006) Immune responses in Eimeria acervulina infected one-day-old broilers compared to amount of Eimeria in the duodenum, measured by real-time PCR. Veterinary Parasitology 138 (3-4) pp 223-233 TEN HOVE, R., SHUURMAN, T., KOOISTA, M., MÖLLER, L., VAN LIESHOUT, L. & VERWEIJ, J.J. (2007) Detection of diarrhoea-causing protozoa in general practice patients in The Netherlands by multiplex real-time PCR. Clinical Microbiology and Infection. 13 pp 1001-1007 TEN HOVE, R., VERWEIJ, J.J., VEREECKEN, K., POLMAN, K., DIEYE, L. & VAN LIESHOUT, L. 2008, Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of Schitosoma mansoni ans S. haematobium infection in stool samples collected in NIESTERS, H.G.M. (2004) Molecular and diagnostic clinical virology in real time. Clical Microbiology and Infection 10 pp 5-11 PEEK, H.W. & LANDMAN, W.J.M. (2003) Resistance to anticoccidial drugs of Dutch avian 35 Verslag PCR Eimeria northern Senegal Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 102 pp179-185 THORNTON, C.G. & PASSEN, S. (2004) Inhibition of PCR amplification by phytic acid, and treatment of bovine fecal specimens with phytase to reduce inhibition. Journal of Microbiological methods. 59 pp 43-52 VAN DER GIESSSEN, J.W.B., DE VRIES, A., MOOS, M.M WIELINGA, P., KORTBEEK, L.M. & MANK, T.G. (2006) Genotyping of Giardia in Dutch patients and animals: A phylogenetic analyses of human and animal isolates. International Journal for Parasitology 36 pp 849-858 VERWEIJ, J.J., BRIENEN, E.A.T., ZIEM, J., YELIFARI, L., POLDERMAN, A.M. & LIESHOUT, L, VAN (2007) Simultaneous Detection and Quantification o Ancylostoma duodenale, Necator americanus, and Oesophagostomum bifurcum in Fecal Samples Using Multiples Real-Time PCR. American Journal of Tropical Medical Hygiene 77(4) pp 685-90 VERWEIJ, J.J.M MULDER,B., POELL, B., VAN MIDDELKOOP, D., BRIENEN, A.E.T. & VAN LIESHOUT, L. 2007, Real-time PCR for the detection of Dientamoeba fragilis in fecal samples. Molecular and Cellular Probes 21 pp 400-404 WHATMAN (2008) http://www.whatman.com/FTANucleicAcidCollecti onStorageandPurification.aspx ZHANG, T. & FANG, H.H.P. (2006) Applications of real-time polymerase chain reaction for quantification of microorganisms in environmental samples. Applied microbiology & biotechnology 70 pp 281-298 36 PCR Eimeria spp, how to go on? PCR Eimeria spp, how to go on? This is a short manual about how I think the “review” about pre-PCR processing for the development of a real-time PCR on Eimeria species should be used. I’m not an expert on either PCR or Eimeria so I lack experience of what might work and this document might be highly subjective. I’ve written the document to hand on possible methods that might be successfully incorporated in a protocol for this PCR, but then, they might prove worthless too… If you are new to the subject I can suggest the article of Zhang & Fang and the book of Coleman & Tsongalis as an introduction to (real-time) PCR and the article of Rådström et al. as an introduction to pre-PCR processing. The latter also formed the basis of my review which focuses more on fecal samples and techniques while the article of Rådström et al. is written for a more general use. I hope I mentioned a reasonable number of techniques but there may always be more, there’s no need to tackle the same problem twice so look for them in other fields of (parasitical) research. My supervisor (F.C. Velkers) asked a number of researchers to share their ideas about establishing a quantitative PCR for the detection of Eimeria spp, many responded that inhibition of the reaction was the main problem that should be solved and many suggested the use of flotation techniques to separate the oocysts from the inhibitory substances. However loss of oocysts is well known with these techniques. In my own experience with simple flotation many oocysts are lost with sedimentation of fecal substances or when the top layers are isolated with a syringe or pipette. Single use pipette caps may be preferred over vacuum based systems to remove the top layers for you don’t have to clean them between samples, however they are difficult to handle if you need an exact amount of fluid from the top. The GD in Deventer tried isolating the whole supernatant from an eppendorf cup but this didn’t give the expected results. Despite that I think the only way simple flotation might work is to isolate a major part of the supernatant and to concentrate the oocysts by sedimentation afterwards if needed. More advanced flotation techniques or methods that aren’t based on flotation might result in a smaller loss of oocysts. If you want to separate the oocysts before performing the PCR I suggest to test your method thoroughly whether you get a representative oocyst yield for a wide range of oocyst concentrations. I have more confidence in the methods that isolate the DNA from the mixture. There are two limiting steps here: the first is the firm oocyst wall but Haug cracked this nut by beat beating, however fecal samples with a lot of debris may need longer beating time for good results so be sure to check the efficiency of this step. The second limiting step is the actual amount of DNA that is extracted, I think the only way to measure this would be to perform the PCR but there might be other ways to detect the amount of DNA. Be sure to add an internal control to test for inhibition. Inactivating the inhibitory substances seems to be very specific to the sample mixture to me so I have my doubts about using them as a primary tool to prevent inhibition. They may prove their real value in preventing possible remaining inhibition after cleaning up the sample with one of the other methods. The amplification itself may be optimized but Blakes latest articles look promising to me. However because of lack of experience I can’t quantify the effects of improving primers or probes on the accuracy of the acquired data. This part of the text is probably quite lengthy because of personal interest. 37 PCR Eimeria spp, how to go on? Basically the research has two components: validate the amount of DNA you can isolate (with or without oocyst) from the sample and validate the inhibition of the PCR itself with an internal control. Francisca Velkers still has a number of (small) fecal samples containing known amounts of Eimeria acervulina either frozen and on potassiumdichromate. These can be used to validate the protocol for each of the storage methods. Developing the protocol might be easier using fresh feces for these are easier to count using the McMaster counting chamber method. Good luck! 38
