Samenvatting

Samenvatting
Samenvatting
De productie van bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) voor het rijzen van deeg is een van
de oudste fermentatie processen in de geschiedenis. Het wordt gekarakteriseerd door de
productie van ethanol en kooldioxide door de fermentatie van suikers.
Tegenwoordig wordt S. cerevisiae ook gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten
die van groot belang zijn voor industriële toepassingen zoals de farmaceutische markt en
industriële enzymen. Deze zogenaamde heterologe eiwitten worden normaliter geproduceerd
in fed-batch fermentaties met hoge celconcentraties, waarin glucose als enige koolstofbron
wordt gebruikt. Echter, een overmaat van deze suikers induceert de productie van ethanol.
Deze ethanol fermentatie is recentelijk geanalyseerd met behulp van DNA microarrays,
waaruit bleek dat de regulatie van een opmerkelijk groot aantal genen zowel sterk was
verhoogd als verlaagd. De meeste van deze veranderingen worden beschouwd als
ongewenst en betiteld als stress respons en in de analyses bleken dan ook veel stress
eiwitten te zijn geïnduceerd en de opbrengst van biomassa op de koolstofbron te zijn
verlaagd.
Om het productieproces van heterologe eiwitten te verbeteren is het gehele productiesysteem
aan een grondige analyse onderworpen. Het bleek dat juist de cultivatie op ethanol in een
simpel batch fermentatieproces een gunstig effect had op de opbrengst van heterologe
eiwitten door S. cerevisiae. Dit geldt in het bijzonder voor de eindfase van het proces en is
aangetoond voor verschillende recombinante eiwitten. Vervolgens is dit proces verder
ontwikkeld om de eigenschappen van ethanol cultivatie ten volste te benutten. Daarvoor zijn
eerst deze karakteristieken bepaald in batch en fed-batch fermentatie experimenten door de
invloed op de productiviteit te onderzoeken van de groeisnelheid, de zuurstof concentratie en
de ophoping van ethanol in de cultuur. Dit resulteerde in een verbeterd productie protocol.
Vervolgens hebben we onderzocht hoe S. cerevisiae in staat is om de heterologe eiwit
opbrengst te verhogen terwijl het groeit onder stress omstandigheden en onder een
suboptimaal gebruik van de energie. Dit is gedaan door allereerst te focussen op de metabole
en fysiologische staat van de gistcel en vervolgens door het bestuderen van de eiwitproductie
en secretieprocessen in de cel. Hiertoe zijn verschillende methoden gebruikt: DNA
microarrays om een totaal beeld van de veranderingen te krijgen, de constructie van een
mutant van het heterologe eiwit (variabel domein van Cameloide antilichamen, VHH’s) en
elektronen microscopie (EM).
De DNA microarrays bevestigden dat vele processen in de cel dramatisch veranderen. Het
stikstof- en vetzuurmetabolisme bleken een belangrijke rol te spelen door intermediairen naar
het centrale metabolisme te dirigeren om het tekort aan koolstof en energie uit ethanol te
167
Chapter 6
compenseren. Ook is een verhoogde expressie gevonden van genen die gerelateerd zijn aan
eiwitkatabolisme. Daarentegen was de ERAD respons niet geïnduceerd, hoewel dat
normaliter wel gebeurt in heteroloog eiwit producerende S. cerevisiae.
Ook is gevonden dat ondanks het feit dat de glucoseconcentratie in het fed-batch proces
nagenoeg nul is, de GAL7 promotor voor het gen dat voor het heterologe eiwit codeert zorgt
voor een veel hogere transcriptie. Verder is een sterk effect aangetoond van de redox-staat
en de oxidatieve stress. Mutanten van VHH’s toonden aan dat juist VHH’s met
vouwingsproblemen door de mogelijke vorming van ongewenste zwavelbruggen, aanzienlijk
beter worden geproduceerd met ethanol als enige koolstofbron in plaats van glucose. Echter,
de productieverhoging is niet beperkt tot dit fenomeen. Ten slotte heeft EM een aantal
opmerkelijke aspecten laten zien, de belangrijkste: de hoge aanwezigheid van heteroloog
eiwit en het endoplasmatisch reticulum eiwit BiP in een vergrote celwand.
Enerzijds hebben deze observaties geresulteerd in een compleet nieuw proces voor de
productie van heterologe eiwitten, dat toegepast is op grote schaal (>10.000 L). Anderzijds is
het mogelijk gebleken om op basis van DNA microarrays, mutantenonderzoek en EM
observaties een kwalitatief model op te stellen om de verhoogde eiwit opbrengst op ethanol te
verklaren.
168