Het effect van verschillende mRNA-vaccinatie strategieën op de
advertisement
Het effect van verschillende mRNA-vaccinatie strategieën op de sterkte van het T-cel immuunantwoord Jolien BAERT Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master of Science in de Biochemie en de Biotechnologie Major Biomedische Biotechnologie Academiejaar 2014-2015 Promotoren: prof. dr. Johan Grooten en dr. Stefaan De Koker Wetenschappelijk begeleider: Ans De Beuckelaer Vakgroep Biomedische Moleculaire Biologie Onderzoeksgroep: Laboratorium voor Moleculaire Immunologie Dankwoord Na vier jaar verschillende boeiende vakken te volgen in de richting Biochemie Biotechnologie kreeg ik het genoegen in het tweede masterjaar mijn thesis uit te oefenen in het Labo voor Moleculaire Immunologie. Ik bedank dan ook graag mijn promotor, prof. dr. Johan Grooten en mijn co-promotor, dr. Stefaan De Koker voor deze opportuniteit. Ik ben steeds enorm gefascineerd geweest door immunologie en tijdens het uitoefenen van mijn thesis is deze fascinatie alleen maar gegroeid. In het bijzonder dank ik mijn begeleidster Ans voor de leerrijke en aangename begeleiding. Ans, enorm bedankt voor je enthousiasme en inspanning om mij op verschillende vlakken veel bij te leren! Daarnaast bedank ik ook graag Lien en Muriel voor de ontspannende werksfeer en de leuke babbels tussen het werk door. Also Vimal, thank you for being a great labpartner. Bedankt alle LMI’ers dat ik mijn laatste masterjaar met jullie in een toffe sfeer heb kunnen beëindigen! Ik bedank eveneens graag mijn vrienden voor de plezierige studententijd en mijn vriend Laurens voor zijn steun. Laurens, bedankt voor de vele lachbuien waarmee jij me steeds opvrolijkte. Tot slot gaat mijn speciale dank uit naar mijn ouders en lieve zus Hanna voor hun onvoorwaardelijke steun de voorbije jaren, voornamelijk tijdens de examenperiodes. Mama en papa, bedankt dat jullie steeds in mij geloofden. Dankzij jullie kreeg ik de kans om verder te studeren in een richting die me boeide en evolueerde ik tot een zelfstandige jonge wetenschapster! Jolien i Inhoudstafel Dankwoord .................................................................................................................................. i Inhoudstafel ............................................................................................................................... ii Lijst met afkortingen ................................................................................................................. iv Samenvatting.............................................................................................................................vii Summary ..................................................................................................................................viii Deel 1 Inleiding .......................................................................................................................... 1 1.1 Het immuunsysteem ........................................................................................................ 1 1.1.1 Aangeboren en adaptieve immuniteit ...................................................................... 1 1.1.2 De humorale en cellulaire adaptieve immuniteit ..................................................... 2 1.1.3 T-cel gemedieerde cytotoxiciteit............................................................................... 4 1.1.4 Geheugencellen ......................................................................................................... 5 1.2 Conventionele vaccinatie ................................................................................................. 5 1.2.1 Vaccinatie en de verschillende vaccin types ............................................................. 5 1.2.2 De nood aan adjuvantia ............................................................................................ 7 1.3 mRNA-vaccinatie als kanker immunotherapie................................................................. 9 1.3.1 Kanker immunotherapie ........................................................................................... 9 1.3.2 Antigeen-specifieke immunotherapie..................................................................... 11 1.3.3 Het gebruik van mRNA als therapeutisch mRNA-vaccin ......................................... 11 1.3.4 Type I interferonen, een dubbelzijdig zwaard ........................................................ 13 1.3.5 mRNA-modificatie ................................................................................................... 14 1.4 mRNA-vaccinatie strategieën ......................................................................................... 15 1.4.1 Lipidegebaseerde strategie met DOTAP/DOPE ....................................................... 15 1.4.2 Peptidegebaseerde strategie met RALA ................................................................. 16 1.4.3 In vivo electroporatie .............................................................................................. 16 Deel 2 Doelstelling ................................................................................................................... 17 Deel 3 Resultaten..................................................................................................................... 19 3.1 Analyse van in vivo electroporatie als mRNA-vaccinatie strategie voor het induceren van CD8+ T-cel proliferatie ................................................................................................... 19 3.1.1 OT-I proliferatie assay ............................................................................................. 19 3.1.2 In vivo electroporatie .............................................................................................. 22 3.1.3 DOTAP/DOPE-mRNA vaccinatie .............................................................................. 24 3.1.4 RALA-mRNA vaccinatie ............................................................................................ 25 ii 3.1.5 Vergelijking tussen in vivo electroporatie, DOTAP/DOPE en RALA ........................ 27 3.2 Analyse van in vivo electroporatie op vlak van antigeen mRNA-expressie ................... 28 3.2.1 In vivo bioluminescentie imaging ........................................................................... 28 3.2.2 Invloed van in vivo electroporatie op antigeenexpressie ....................................... 28 3.2.3 Invloed van mRNA-modificatie op antigeenexpressie ............................................ 30 3.2.4 Antigeenexpressie na in vivo electroporatie ........................................................... 32 3.2.5 Antigeenexpressie na DOTAP/DOPE- en RALA-mRNA vaccinatie ........................... 32 3.3 Onderzoek naar de invloed van type I interferonen op antigeenexpressie na in vivo electroporatie ....................................................................................................................... 35 3.3.1 Rol van type I IFN na in vivo electroporatie: IFNAR KO model................................ 35 3.4 Karakterisatie van de adjuvantscapaciteit van flagelline na in vitro electroporatie ..... 39 3.4.1 Gebruikte validatietechniek .................................................................................... 39 3.4.2 Pro-inflammatoire cytokineprofiel.......................................................................... 40 3.4.3 Expressieniveau flagelline mRNA ............................................................................ 42 Deel 4 Discussie ....................................................................................................................... 44 Deel 5 Materialen en methoden ............................................................................................. 51 5.1 Muizen ............................................................................................................................ 51 5.2 Genotypering .................................................................................................................. 51 5.3 mRNA aanmaak .............................................................................................................. 51 5.4 Cultivatie van beenmerg-afgeleide dendritische cellen ................................................ 52 5.5 In vitro electroporatie BMDCs ........................................................................................ 52 5.6 In vivo bioluminescentie imaging .................................................................................. 52 5.7 DOTAP/DOPE complexatie ............................................................................................. 53 5.8 RALA complexatie........................................................................................................... 53 5.9 In vivo electroporatie ..................................................................................................... 53 5.10 In vivo proliferatie assay .............................................................................................. 54 5.11 Flow cytometrie............................................................................................................ 55 5.12 Bradford assay.............................................................................................................. 55 5.13 Western blot................................................................................................................. 55 5.14 qPCR ............................................................................................................................. 55 5.15 Statistische analyse ...................................................................................................... 56 Referenties ............................................................................................................................... 57 Addendum ................................................................................................................................ 63 Supplementaire data ............................................................................................................ 63 Gedetailleerde protocols...................................................................................................... 69 iii Lijst met afkortingen A APC ARCA BCR BMDCs BSA CFSE CK cRPMI CTL CTLA-4 DAMP DC DNA DOPE DOTAP ds e.a. EGFR EP EPO EpoR FasL Fc FCS FSC Fv GDP GM-CSF GMP GTP HER2 HGF HIF HIV HRP i.m. i.n. i.p. i.v. alanine antigeen presenterende cel anti-reverse cap analog B-cel receptor beenmerg-afgeleide dendritische cellen bovine serum albumin carboxyfluorescein succinimidyl ester cytokine compleet RPMI cytotoxische T-lymfocyt cytotoxische T-lymfocyt antigeen 4 damage-associated molecular pattern dendritische cel desoxyribonucleïnezuur 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 1,2-dioleoyl-3trimethylammonium-propane dubbelstrengig ear pinna epidermal growth factor receptor electroporatie erythropoëtine erythropoëtine receptor Fas ligand constante regio van een antilichaam foetaal kalfsserum forward scatter variabele regio van een antilichaam guaninedifosfaat granulocyte-macrophage colony-stimulating factor good manufactering practices guaninetrifosfaat human epidermal growth factor receptor 2 hepatocyte growth factor hypoxia inducible transcription factors human immunodeficiency virus horseradish peroxidase intramusculair intranodaal intraperitoneaal intraveneus iv IFN IFNAR IFNGR Ig IL JAK KO L L/D LPS MAMP MAPK MHC miRNA mRNA mRPL13a MyD88 NF-κB NK ORF OVA PARP PBS PD-1 pDNA PRR qPCR R RAG RIG-I RNasen ROI s.c. SDS SPF ss SSC STAT TAA Tc TCM TCR TEM Th TLR TNF tRNAmet interferon IFN-α/β receptor IFN-γ receptor immunoglobuline interleukine janus kinase knock out leucine live/dead lipopolysaccharide microbe-associated molecular pattern mitogen-activated protein kinase major histocompatibility complex micro RNA messenger ribonucleïnezuur mitochondrial ribosomal protein 13a myeloid differentiation primary response gene 88 nucleaire factor kappa B natuurlijke killer cel open reading frame ovalbumine poly-ADP ribose polymerase fosfaat gebufferde zoutoplossing programmed death 1 plasmide DNA pattern recognition receptor quantitatieve PCR arginine recombination-activating genes retinoic acid inducible gene I ribonucleasen region of interest subcutaan sodium dodecyl sulfate specific pathogen free enkelstrengig side scatter signal transducer and activator of transcription tumor-geassocieerd antigeen cytotoxische T-cel T central-memory cellen T-cel receptor T effector-memory cellen T-helper cel toll like receptor tumor necrosis factor transfer RNAmethionine v UTR VEGF VIB WB WT Ψ-uridine untranslated region vascular endothelial growth factor Vlaams Instituut voor Biotechnologie Western blot wild type pseudo-uridine vi Samenvatting De laatste jaren is er veel onderzoek gevoerd en vooruitgang geboekt in het veld van nucleïnezuurgebaseerde vaccinatie met oog op inductie van cellulaire immuunresponsen. Zo is voor de bestrijding van intracellulaire infectieziekten zoals HIV, net zoals de bestrijding van kanker een cellulair immuunantwoord vereist voor een efficiënte afweerreactie. In tegenstelling tot eiwitgebaseerde vaccins zijn nucleïnezuurgebaseerde vaccins wel in staat om cytotoxische T-lymfocyt (CTL) immuunresponsen op te wekken doordat de gecodeerde eiwitten in het cytosol worden verknipt door proteasomen en vervolgens gepresenteerd worden aan CD8+ T-cellen. Binnen de nucleïnezuurgebaseerde vaccins ontwikkelde mRNAvaccinatie zich tot een veelbelovend en veilig alternatief in vergelijking tot DNA door onder andere de afwezigheid van het risico op genoomintegratie. Dankzij de moleculaire identificatie van tumor-geassocieerde antigenen (TAAs) werd antigeen-specifieke kankervaccinatie mogelijk waarbij een immuunreactie opgebouwd wordt tegen het toegediende TAA. Door het toedienen van antigeen coderend mRNA kunnen cytotoxische CD8+ T-cellen opgewekt worden die in staat zijn specifiek de tumorcellen die de TAAs expresseren aan te vallen en te elimineren. Het uiteindelijke doel van therapeutische mRNA-kankervaccinatie is het opwekken van een anti-tumorale CD8+ Tcelrespons die leidt tot tumorregressie. Er zijn verschillende vaccinatie strategieën toepasbaar om nucleïnezuurgebaseerde vaccins efficiënt naar hun doelwitcellen te transfereren. Een geschikte vaccinatie strategie moet een hoge antigeenexpressie induceren in aanwezigheid van een goede activatie van het immuunantwoord. Een recente studie binnen de onderzoekseenheid toonde aan dat immunisatie met DOTAP/DOPE gecomplexeerd mRNA sterke antigeenspecifieke T-cel responsen induceert maar dat type I interferonen (IFNn) de expressie van het antigeencoderend mRNA inhiberen. Vandaar werd in dit project in vivo electroporatie bestudeerd als potentiële vaccinatie strategie voor het toedienen van mRNA als therapeutisch kankervaccin. De resultaten toonden aan dat in vivo electroporatie van antigeen coderend mRNA zowel in de ear pinna als intramusculair geen CD8+ T-cel proliferatie activeert ondanks het feit dat ze een hoge maar transiënte antigeenexpressie induceert. Daarnaast konden we aantonen dat type I IFNn de antigeenexpressie inhiberen na in vivo electroporatie. Deze bevindingen suggereren dat in vivo electroporatie niet geschikt is voor vaccinatiedoeleinden. Vandaar moet men in de toekomst op zoek gaan naar een geschikt adjuvant dat een sterk immuunantwoord kan opwekken na in vivo electroporatie. Voorts bevestigden we dat het gebruik van lipoplexen (mRNA-complexatie met DOTAP/DOPE) voor het toedienen van antigeen coderend mRNA wel een sterke antigeenspecifieke cellulaire immuniteit induceert, waardoor deze techniek verkozen wordt boven in vivo electroporatie als mRNA-vaccinatie strategie. Deze studie suggereert dat door de transiënte antigeenexpressie en de afwezigheid van een immuunantwoord in vivo electroporatie ideaal is als gentherapie methode, waarbij een transiënte transgenexpressie vereist wordt in de afwezigheid van interfererende immuunresponsen. vii Summary The last few years a lot of research was conducted and progress has been made in the field of nucleic acid based vaccination with the objective to induce cellular immune responses. To be able to fight off cancer and also control intracellular infections such as HIV, a cellular immune response is required to induce an efficient defense response. In contrast to proteinbased vaccines, nucleic acid-based vaccines are capable of generating cytotoxic Tlymphocyte (CTL) immune responses since the encoded proteins undergo proteasomal degradation in the cytosol and are then presented to CD8+ T-cells. Within the nucleic acid vaccines, mRNA-vaccination developed into a promising and safe alternative as compared to DNA because of the absence of the risk of genome integration. Due to the molecular identification of tumor-associated antigens (TAAs), antigen-specific cancer vaccination became possible in which an immune response is built up against the administered TAA, encoded by mRNA. By administering antigen-encoding mRNA, cytotoxic CD8+ T-cells can be activated which are capable to attack specifically tumor cells that express the TAAs and eliminate them. The ultimate goal of therapeutic mRNA cancer vaccination is to elicit an anti-tumor CD8+ T-cell response that leads to tumor regression. There are several different vaccination strategies applicable to transfer nucleic acid-based vaccines efficient to their target cells. A suitable vaccination strategy must achieve a high antigen expression in the presence of a good activation of the immune responses. A recent study from our research unit showed that immunization with DOTAP/DOPE complexed mRNA elicits strong antigen-specific T-cell responses, but type I interferons (IFNs) inhibit the expression of the antigen-encoding mRNA. Hence, this project investigated in vivo electroporation as a potential vaccination strategy for the administration of mRNA as a therapeutic cancer vaccine. The results showed that in vivo electroporation with antigen encoding mRNA elicits no CD8+ T-cell proliferation both in the ear pinna as well as intramuscular, despite the fact that the technique induces a high but transient antigen expression. In addition, we demonstrated that type I IFNs inhibit antigen expression after in vivo electroporation of mRNA. These findings suggest that in vivo electroporation is not suitable for vaccination purposes. Therefore, one should look for a suitable adjuvant that induces a strong immune response after in vivo electroporation. Furthermore, we confirmed that the use of lipoplexes (mRNAcomplexation with DOTAP/DOPE) for the administration of antigen-encoding mRNA does elicit a strong antigen specific cellular immunity, making this technique more preferable over in vivo electroporation as mRNA-vaccination strategy. This study shows that due to the transient antigen expression and the absence of an immune response, in vivo electroporation is ideal as a gene therapy method wherein a transient expression of the transgene is required in the absence of any interfering immune responses. viii Inleiding Deel 1 Inleiding 1.1 Het immuunsysteem 1.1.1 Aangeboren en adaptieve immuniteit Ons lichaam heeft verschillende verdedigingsmechanismen. In de eerste plaats hebben we een aantal fysieke barrières zoals de huid en trilhaartjes in de neus. Ook de lage pH in maagsappen, traanvocht in de ogen en slijm in de neus en mond verhinderen de binnenkomst van micro-organismen (Delves & Roitt, 2000; Parkin & Cohen, 2001). Daarnaast breken bacteriolytische enzymes, lysozymes, aanwezig in traanvocht en slijm de celwand van de indringende bacteriën af (Delves & Roitt, 2000; Parkin & Cohen, 2001; Turvey & Broide, 2010). Ondanks deze fysieke hindernissen slagen sommige micro-organismen er soms toch in ons lichaam binnen te dringen. Deze pathogenen worden blootgesteld aan het aangeboren en het adaptieve immuunsysteem. Het aangeboren immuunsysteem is onmiddellijk werkzaam en bestrijdt een breed spectrum aan pathogenen waardoor ze als aspecifiek kan beschouwd worden. Deze respons leidt niet tot blijvende immuniteit. Het maakt gebruik van een gelimiteerde set aan receptoren, namelijk de pattern recognition receptors (PRRs) waaronder de Toll like receptors (TLRs). PRRs herkennen sterk geconserveerde structuren van pathogenen, de microbe-associated molecular patterns (MAMPs). Hiernaast hanteert het aangeboren immuunsysteem ook fagocyten zoals neutrofielen, dendritische cellen (DCn), monocyten en macrofagen. Fagocyten induceren fagocytose, waarbij een pathogeen opgenomen en verteerd wordt door de fagocytcel. Samen met de natuurlijke killer (NK) cellen gaan deze cellen de pathogenen elimineren. Hiernaast worden verschillende inflammatoire mediatoren zoals cytokines (CKs), interleukines (ILs), chemokines en interferonen vrijgelaten (Delves & Roitt, 2000; Parkin & Cohen, 2001; Turvey & Broide, 2010). Het adaptieve immuunsysteem is daarentegen sterk specifiek. Het verzorgt onder andere de productie van antilichamen tegen een bepaald pathogeen of zijn producten, door somatische recombinatie van de variable (V), joining (J), en in sommige gevallen diversity (D) gensegmenten. Deze somatische recombinatie, ook gekend als V(D)J recombinatie, resulteert in een breed spectrum van receptoren, in contrast met de aangeboren immuniteit. Het wordt verzorgd door de recombination-activating genes (RAGs). Door ontwikkeling van geheugencellen resulteert het adaptieve immuunrespons bovendien in een immunologisch geheugen dat het lichaam langdurig beschermt tegen herhaalde infecties van hetzelfde pathogeen. De adaptieve immuniteit kan onderverdeeld worden in een humorale (antilichamen) en cellulaire (T-cellen en B-cellen) component (Delves & Roitt, 2000; Parkin & Cohen, 2001; Turvey & Broide, 2010). 1 Inleiding 1.1.2 De humorale en cellulaire adaptieve immuniteit De humorale adaptieve immuunrespons wordt gekenmerkt door antilichaamproductie van de plasmacellen. Nadat het antigeen wordt gepresenteerd door antigeen presenterende cellen (APCn) zoals macrofagen en DCn, wordt het antigeen herkend door een antigeen specifieke B-cel wat leidt tot priming, activatie en differentiatie tot plasmacellen. De antigeen-herkenningsmoleculen van de B-cellen zijn antilichamen, ook gekend als immunoglobulines (Ig’s) en kunnen gesecreteerd en membraangebonden voorkomen. De membraangebonden antilichamen bevatten een hydrofobe transmembranaire sequentie waardoor het antilichaam in het B-cel membraan wordt verankerd. Het membraangebonden Ig samen met het signaliserende heterodimeer Ig-α/Ig-β wordt de B-cel receptor (BCR) genoemd. Antilichamen bevatten twee identieke zware ketens en twee identieke lichte ketens die samen gehouden worden door disulfide bruggen. De N-terminus bevat een variabele regio (Fv) dat het antigeen herkent. Zoals reeds vermeld wordt deze variabiliteit verkregen door somatische recombinatie. De C-terminus bevat een constante regio (Fc) dat bepaalt tot welke klasse het antilichaam toebehoort (IgG, IgA, IgM, IgD, of IgE) en welke functie ze zal uitoefenen (Delves & Roitt, 2000; Janeway, 2005; Parkin & Cohen, 2001). De differentiatie van de B-cellen in antilichaam producerende plasmacellen vindt plaats in het beenmerg. B-cellen kunnen zowel een T-cel afhankelijke als onafhankelijke respons vertonen (Fig. 1 a). Tijdens de T-cel afhankelijke respons worden de antigenen die herkend worden door de B-cel verteerd, waarna de peptiden gepresenteerd worden door major histocompatibility complex (MHC)-II moleculen. Deze gaan vervolgens T-helper (Th) cellen activeren die cytokines gaan secreteren en zo de B-cellen helpen matureren en multipliceren in antilichaam producerende plasmacellen. Hiernaast kunnen de B-cellen differentiëren in plasmacellen zonder de hulp van Th cellen. Plasmacellen produceren antilichamen die circuleren doorheen het lichaam en de gastheer kunnen beschermen tegen infecties op drie verschillende manieren. Ten eerste kunnen ze de toxische effecten van de pathogenen inhiberen door neutralisatie, waarbij de biologische effecten van het antigeen geïnhibeerd worden en dus de aanhechting van de pathogenen verhinderd wordt. Ten tweede kunnen de antilichamen ook antigenen merken door opsonisatie waardoor fagocytose geïnduceerd wordt. Opsonines gaan namelijk binden aan de doelwitcel, in dit geval het antilichaam dat een antigeen herkent en bindt, waardoor hun negatieve lading gemaskeerd wordt en zo de fagocytcel het antigeen-bindend antilichaam beter kan herkennen. Tijdens fagocytose wordt het antigeen omsloten door het membraan van de fagocytcel waardoor een fagosoom gevormd wordt. Door secretie van proteasen naar het fagosoom worden de antigenen ten slotte verteerd. Ten derde kunnen de antilichamen het complement systeem activeren wat opsonisatie versterkt. Naast differentiatie in plasmacellen kunnen B-cellen ook verder ontwikkelen tot Bgeheugencellen die de toekomstige immuniteit verzorgen (Delves & Roitt, 2000; Janeway, 2005; Parkin & Cohen, 2001). 2 Inleiding a) b) Figuur 1 | De rol van B- en T-lymfocyten bij adaptieve immuniteit. (a) B-cellen differentiëren in plasmacellen die antilichamen produceren en pathogenen inhiberen. Dit kan op een T-cel afhankelijke en onafhankelijke manier. (b) T-cellen differentiëren in CD8+ cytotoxische T-cellen of CD4+ T-helper cellen met uiteenlopende functies. MHC: Major Histocompatibility Complex. Th: T-helper cel. Figuur afkomstig van: (Parkin & Cohen, 2001). De cellulaire adaptieve immuunrespons wordt gekenmerkt door antigeen specifieke Tcellen. De antigeen-herkenningsmoleculen van de T-cellen zijn enkel membraangebonden en worden T-cel receptoren (TCRen) genoemd. De TCR is samengesteld uit een heterodimeer van twee transmembranaire glycoproteïne ketens verbonden aan de CD3 co-receptor. In 95% van de gevallen zijn deze ketens α en β, de andere 5% bestaan uit een γ- en δ-keten. CD4+ Tcellen bevatten een CD4 co-receptor op hun oppervlakte die antigene peptiden herkennen die gepresenteerd worden door MHC-II moleculen. MHC-II moleculen worden enkel geëxpresseerd door APCn en presenteren exogene antigenen na opname via endocytose. De CD8+ T-cellen echter bevatten een CD8 co-receptor en herkennen antigene peptiden die gepresenteerd worden door MHC-I moleculen. MHC-I moleculen komen tot expressie op het oppervlak van bijna alle genucleëerde cellen en presenteren endogene antigenen. Na de antigeenherkenning, differentiëren T-cellen in de thymus in effector T-cellen met een variëteit aan functies zoals Th cellen en cytotoxische T-cellen (Tc) (Fig. 1 b) (Delves & Roitt, 2000; Janeway, 2005; Parkin & Cohen, 2001). De CD8+ cytotoxische T-cellen worden ook killer cellen genoemd en doden de cellen die de antigenen presenteren. Daarentegen verzorgen de CD4+ T-cellen de productie van Th cellen. De type 1 Th cellen stimuleren onder andere het cellulaire immuunsysteem door macrofagen te activeren en het opreguleren van CD8+ T-cel proliferatie en gaan intracellulaire micro-organismen bestrijden. Daarentegen zullen de type 2 Th cellen het humorale immuunsysteem stimuleren door proliferatie van B-cellen te stimuleren en bestrijden extracellulaire micro-organismen. Een klein percentage van de effector T-cellen (5-10%) blijft aanwezig nadat de infectie bestreden werd en ontwikkelen verder in Tgeheugencellen (Delves & Roitt, 2000; Janeway, 2005; Parkin & Cohen, 2001). 3 Inleiding 1.1.3 T-cel gemedieerde cytotoxiciteit CD8+ T-cellen worden ook cytotoxische T-lymfocyten (CTLn) genoemd. Elke cel dat geïnfecteerd werd door een virus of een andere intracellulaire pathogeen, kan antigenen presenteren door middel van een MHC-I molecule. Op die manier worden deze cellen herkend door een Tc cel en verwijderd door een cytotoxische aanval. Deze CTL respons is dus sterk gericht naar de cel die het endogene antigeen presenteert (Parkin & Cohen, 2001). De CTLn kunnen de doelwitcel elimineren op drie verschillende manieren. Als eerste mogelijkheid kunnen de CTLn granzymes (proteolytische enzymes) binnenbrengen in hun doelwitcel via endocytose (Fig. 2 a). Perforines aanwezig in de endosomen zullen poriën ontwikkelen in het endosoommembraan. Hierdoor kunnen de granzymes zich bewegen door de poriën van het endosoom naar het cytoplasma van de doelwitcel. Deze activeren vervolgens caspases die desoxyribonucleïnezuur (DNA) fragmentatie en cel apoptose induceren. Dit mechanisme is calcium afhankelijk en verklaart de grootste cytotoxische activiteit van de effector CD8+ T-cellen (Janeway, 2005; Parkin & Cohen, 2001). Als tweede mogelijkheid kunnen de Tc cellen via hun Fas ligand (FasL) binden aan de Fas receptoren die zich op het oppervlakte van de doelwitcel bevinden (Fig. 2 b). Dit leidt tot apoptose door activatie van caspases. Dit mechanisme is calcium onafhankelijk (Janeway, 2005; Parkin & Cohen, 2001). Tenslotte kunnen de CTLn geïnfecteerde cellen elimineren door de vrijstelling van cytokines zoals tumor necrosis factor (TNF), lymfotoxine en interferon γ (IFN-γ). IFN-γ activeert macrofagen, gaat virale replicatie direct inhiberen en induceert verhoogde expressie van MHC-I moleculen. TNF en lymfotoxine werken samen met IFN-γ om macrofagen te activeren (Janeway, 2005; Parkin & Cohen, 2001). a) b) Figuur 2 | De werkwijze van cytotoxische Tlymfocyten. (a) Via endocytose worden granzymes de doelwitcel binnengebracht. Perforines aanwezig in de endosomen ontwikkelen porieën waardoor de granzymes naar het cytoplasma van de doelwitcel migreren en apoptose induceren. Dit mechanisme is calciumafhankelijk. (b) Door interactie tussen de Fas receptor op het oppervlakte van de doelwitcel en het Fas ligand aanwezig op het oppervlak van de cytotoxische T-cel wordt apoptose geïnduceerd in de doelwitcel. Figuur afkomstig van: (Trapani & Smyth, 2002; van den Brink & Burakoff, 2002). 4 Inleiding Deze T-cel gemedieerde cytotoxiciteit is van belang onder andere bij kanker immunotherapie. Het doel van therapeutische kankervaccinatie is namelijk het opwekken van een anti-tumorale CD8+ T-celrespons die leidt tot tumorregressie. Hierop wordt verder teruggekomen in volgende hoofdstukken. 1.1.4 Geheugencellen Het immuunsysteem gaat pathogenen efficiënter elimineren nadat het lichaam eerder aan hen blootgesteld werd aangezien geheugencellen deze pathogenen snel kunnen herkennen en elimineren (Esser et al, 2003; Smith-Garvin & Sigal, 2013). Zoals reeds vermeld gaan sommige effector T-cellen verder ontwikkelen in geheugencellen die de toekomstige immuniteit verzorgen. Ten minste twee types geheugencellen werden vastgesteld bij mensen gebaseerd op hun functionele en migrerende eigenschappen. Enerzijds zijn er T central-memory (TCM) cellen die voornamelijk teruggevonden worden in de lymfoïde organen (Esser et al, 2003). Ze secreteren IL-2 en IL-10 en prolifereren in secundair lymfoïde weefsel om de effector-lymfocytpopulatie uit te breiden. Anderzijds zijn er T effectormemory (TEM) cellen die voornamelijk in de perifere weefsels en infectieplaatsen gevonden worden en die een snelle effectorfunctie uitoefenen. Deze cellen kunnen herinfectie bestrijden door cytokines zoals IFN-γ en TNF vrij te laten. Bovendien elimineren ze ook geïnfecteerde cellen met behulp van cytolyse waarbij door een osmotische imbalans overtollig water de cel binnendringt en zo de cel doet barsten, of met behulp van het perforine mechanisme. CD4+ en CD8+ T-geheugencellen verschillen van naïeve en effector Tcellen op drie verschillende manieren (Esser et al, 2003). Enerzijds bevatten ze andere activatiemerkers en intracellulaire eiwitten. Daarnaast hebben ze ook lagere activatiedrempels en andere effectorfuncties. Tenslotte expresseren ze andere chemokineen adhesiereceptoren waardoor ze naar geïnfecteerde weefsels en organen kunnen migreren (Amanna & Slifka, 2011). 1.2 Conventionele vaccinatie 1.2.1 Vaccinatie en de verschillende vaccin types Bij vaccinatie wordt het lichaam doelbewust blootgesteld aan een verzwakte vorm of bepaalde structuur van een pathogeen wat leidt tot activatie van het immuunsysteem en bescherming van de patiënt tegen een specifiek pathogeen (Delany et al, 2014). Oorspronkelijk werden vaccins voornamelijk gebaseerd op hetzij levende, geattenueerde pathogenen hetzij afgedode pathogenen. Levende, geattenueerde vaccins wekken de sterkste en breedste immuniteit op waardoor slechts eenmaal hoeft gevaccineerd te worden en een levenslange bescherming mogelijk is. Een groot nadeel van levende vaccins is hun veiligheid. Zo kunnen ze terug muteren naar een virulente vorm en kunnen ze ziektes veroorzaken in mensen met een verzwakt immuunantwoord. Bovendien worden in sommige gevallen immuunantwoorden vooral gericht tegen antigenen die snel muteren en zo weinig bescherming bieden (Delany et al, 2014). Vandaar werden afgedode vaccins ontwikkeld die veiliger zijn. Deze hebben echter als risico dat ze inflammatoire toxiciteit kunnen induceren (Delany et al, 2014). 5 Inleiding De laatste jaren vond er een shift plaats naar eiwitgebaseerde vaccins waarbij gevaccineerd wordt met recombinante eiwitten (Delany et al, 2014). Deze vaccins zijn veilig en bovendien kan het antigeen gekozen worden waartegen men het immuunantwoord wil richten. Men is wel genoodzaakt meerdere keren te vaccineren en adjuvantia toe te dienen. Het opwekken van een geheugen ligt aan de basis van alle vaccins. Het doel van een succesvolle vaccinatie is namelijk het induceren van een langdurige immuniteit tegen een bepaald pathogeen. Het aangeboren immuunsysteem regelt de kwantiteit en kwaliteit van langdurige T-cel en B-cel geheugen (Pulendran & Ahmed, 2006). Vaccins redden wereldwijd ongeveer 2 tot 3 miljoen levens per jaar wat van vaccinatie de meest effectieve medische interventie maakt om de mortaliteit en morbiditeit veroorzaakt door infectieziektes te reduceren (Delany et al, 2014). Tijdens vaccinatie wordt een individu meerdere keren geïmmuniseerd met het betreffende vaccin, met als uitzondering levende vaccins waarbij een eenmalige immunisatie volstaat. Wanneer het lichaam voor de eerste keer (prime) in contact komt met een antigeen duurt het vijf tot zeven dagen vooraleer er specifieke antilichamen ontwikkeld worden tegen het antigeen. Dit wordt de lag-fase genoemd (Fig. 3). De primaire immuunrespons wordt voornamelijk gekenmerkt door IgM type antilichamen (Ademokun & Dunn-Walters, 2010). Wanneer het lichaam na een bepaalde tijd opnieuw blootgesteld wordt aan hetzelfde antigeen (boost) treedt er een secundaire immuunrespons op die zich veel sneller zal ontwikkelen (na twee tot drie dagen) vergeleken met de primaire respons (Fig. 3). Bovendien is de titer van de antilichamen veel hoger en wordt deze respons gekenmerkt door IgG antilichamen die een hogere affiniteit vertonen voor het antigeen. Herhaalde vaccinatie of boost is noodzakelijk zodat antilichamen met hoge affiniteit geproduceerd worden dankzij somatische hypermutatie van de variabele gensegmenten van de Ig’s (Ademokun & Dunn-Walters, 2010). Figuur 3 | De primaire en secundaire immuunrespons bij vaccinatie. De primaire immuunrespons wordt vooraf gegaan door een lagfase en wordt gekenmerkt door IgM antilichamen. De secundaire immuunrespons wordt gekenmerkt door een hogere titer van IgG antilichamen. Ig: immunoglobuline. Ag: antigeen. Figuur afkomstig van: http://mcb.berkeley.edu/courses/mcb150/lecture7/L ecture7%284%29.pdf). Er zijn verschillende factoren die de immunogeniciteit van een vaccin beïnvloeden. Zo is het belangrijk dat de correcte antigenen geïntroduceerd worden in het lichaam van de patiënt die de gewenste immuunrespons induceren: humoraal of cellulair (Esser et al, 2003). Bovendien zijn verschillende immunisaties met een correcte dosis en route vereist om voldoende antilichamen te induceren (Esser et al, 2003). Tenslotte is ook de vorm van het vaccin belangrijk waarbij partikels verkozen worden boven oplosbare vaccins (Mäkelä, 2000). 6 Inleiding Vaccins kunnen opgedeeld worden in twee grote groepen (Delany et al, 2014). Enerzijds zijn er vaccins die ziektes voorkomen, dit zijn profylactische vaccins. Anderzijds zijn er therapeutische vaccins die ziektes genezen. De profylactische vaccins worden in Tabel 1 gegroepeerd naargelang hun productiemethode (Delany et al, 2014). Tabel 1 | Verschillende profylactische vaccin types met hun voor- en nadelen. ProductieVoordeel Nadeel methode Levende, Gelijkaardig aan natuurlijke infectie dus sterk Minder veilig aangezien het kan geattenueerde immunogeen. Hierdoor is slechts één dosis muteren in een virulente vorm. vaccins noodzakelijk. Induceert zowel humorale als cellulaire Niet toepasbaar voor personen respons. Eenvoudig te produceren. met verzwakt immuunsysteem (vb. chemotherapie patiënten). Geïnactiveerde Stabiel en veilig aangezien de dode pathogenen niet Stimuleert een zwakkere vaccins terug kunnen muteren naar hun ziekte-veroorzakende immuunrespons. Risico op staat. Kan ontwikkeld worden door chemische inflammatoire toxiciteit. behandeling, hitte of radiatie. Subunit vaccins Deze vaccins bezitten enkel de essentiële antigenen die Minder immunogeen. Moeilijk en het immuunsysteem het best stimuleren, zonder de tijdrovend proces om te additionele componenten waaruit het pathogeen onderzoeken welke antigenen bestaat. Hierdoor zijn de kansen op bijwerkingen lager. bescherming bieden. Toxoïde vaccins Toxines geproduceerd door bepaalde bacteriën kunnen Enkel toepasbaar voor bacteriële geïnactiveerd worden door behandeling met formaline. infecties. Wanneer het lichaam in contact komt met gedetoxificeerde toxines (“toxoïden”) leert het om het natuurlijke toxine te bestrijden. Conjugaat Vele bacteriën bevatten een polysaccharidelaag Enkel toepasbaar voor bacteriële vaccins waardoor het antigeen niet goed meer kan herkend infecties. worden door het immature immuunsysteem van o.a. kinderen. Om dit op te lossen wordt een antigeen dat wel herkend kan worden door het immature immuunsysteem gelinkt aan de polysaccharidenlaag. Afhankelijk van het type immuniteit dat vereist is om een bepaalde infectie of ziekte tegen te gaan, wordt een bepaald type vaccin het best toegediend (Gurunathan et al, 2000). Zo induceren levende, geattenueerde vaccins zowel een cellulaire als een humorale immuniteit, terwijl geïnactiveerde en subunit vaccins eerder een humorale immuniteit opwekken dat beschermt tegen lytische virussen zoals Influenza (Liu, 2010). Gedurende tumorontwikkeling zijn cellulaire responsen, waaronder de CTL respons, een belangrijk onderdeel van de beschermende immuunrespons. 1.2.2 De nood aan adjuvantia Vaak zijn adjuvantia vereist voor de amplificatie van de immuunresponsen, geïnduceerd tijdens vaccinatie (Delany et al, 2014). Ze bepalen ook in belangrijke mate het type immuunantwoord dat opgewekt wordt. Adjuvantia zijn componenten die het immuunsysteem stimuleren en de respons op een vaccin verhogen, zonder zelf een specifieke antigene immuunrespons te induceren (Klebanoff et al, 2011; Kutzler & Weiner, 2008). Het toedienen van adjuvantia kan leiden tot een verhoogde doeltreffendheid van het vaccin, verhoogde antilichaamtiters en CD4+ T-cel frequenties, verhoogde duur van de beschermende responsen en de mogelijkheid tot het verlagen van de dosissen (Delany et al, 7 Inleiding 2014; Petrovsky & Aguilar, 2004). De voordelen die adjuvantia kunnen bieden moeten gebalanceerd worden met de zijeffecten die ze kunnen induceren. Zo hebben adjuvantia het risico om zowel lokale bijwerkingen (inflammatie, zweren en abcessen) als systemische bijwerkingen (misselijkheid, koorts en allergie) te ontwikkelen (Petrovsky & Aguilar, 2004). Adjuvantia kunnen opgedeeld worden naargelang hun bron, fysicochemische eigenschappen of werkwijze. Er zijn verschillende adjuvantia die de PRRs van het aangeboren immuunsysteem activeren wat leidt tot de versterking van de T- en B-cel responsen. Enkele voorbeelden zijn TLR4 en TLR9 liganden (Delany et al, 2014). Hiernaast kunnen ook cytokines, chemokines en co-stimulerende moleculen gebruikt worden als adjuvantia, aangezien deze belangrijk zijn voor de priming en de memory fase (Esser et al, 2003; Kutzler & Weiner, 2008). De meest klassieke adjuvantia zijn de aluminiumzouten die een Th 2 humorale immuunrespons induceren maar die niet in staat zijn een Th 1 CD4+ respons of een cytotoxische T-cel respons te induceren (De Geest et al, 2012; Esser et al, 2003; Mäkelä, 2000). De conventionele vaccinatie strategieën maken gebruik van adjuvantia die een Th 2 humorale immuunrespons induceren en dus de productie van antilichamen stimuleren. Hiermee echter kunnen intracellulaire infectieziektes en tumorcellen niet behandeld worden. De nood naar nieuwe adjuvantia die een Th 1 cellulaire respons induceren en die veilig en niet toxisch zijn, is hoog. Flagelline is een activator van verschillende celtypes betrokken bij het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. Het flagellum, een structuur dat vereist is voor de motiliteit van Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën, zorgt eveneens voor hun pathogene eigenschappen doordat componenten van het flagellum binden aan hun gastheer en zo inflammatoire signaalpathways induceren (Cuadros et al, 2004b). De aanleiding voor deze inflammatoire reactie is het eiwit flagelline. Het flagellum van Salmonella typhimurium is samengesteld uit gepolymeriseerd flagelline dat bestaat uit terminale en centrale α-helixen en hypervariabele β-sheets (Fig. 4 a) (Rumbo et al, 2006). Flagelline is een TLR5 ligand dat Th 1 en Th 2 responsen kan opwekken (Mizel & Bates, 2010). Extracellulair flagelline zal met zijn centrale α-helixen herkend worden door de TLR5 waarna het myeloid differentiation primary response gene 88 (MyD88) downstream de mitogen-activated protein kinases (MAPK) en de nucleaire factor kappa B (NF-κB) zal activeren (Fig. 4 b) (Rumbo et al, 2006). Hierdoor bevordert flagelline de cytokineproductie, celoverleving en ook de rekrutering van B- en Tlymfocyten naar secundaire lymfoïde sites. Hiernaast activeert flagelline het Ipaf inflammasoom in het cytosol waardoor het de activatie van inflammatoire responsen stimuleert door maturatie van IL-1β via caspase 1 (Miao et al, 2006). Bovendien biedt flagelline een aantal voordelen als adjuvant: ten eerste induceert flagelline geen IgE responsen, ten tweede geeft voorgaande immuniteit voor flagelline geen invloed op de adjuvantactiviteit, ten derde kunnen antigeensequenties zowel N- als Cterminaal ingebracht worden zonder dat de TLR5 signalisatie van flagelline verstoord wordt en tenslotte kan flagelline eenvoudig aangemaakt worden in grote volumes onder good manufactering practices (GMP) condities (Mizel & Bates, 2010). 8 Inleiding Figuur 4 | Moleculaire mechanisme flagelline. (a) Het flagellum van Salmonella typhimurium bestaat uit drie domeinen: terminale α-helixen (paars), centrale α-helixen (blauw) en hypervariabele β-sheets (geel). (b) De TLR5 bindt het flagelline via zijn centrale α-helixen waarna MyD88 downstream MAPK kinasen en NF-κB activeert. TLR5: Toll like receptor 5. MyD88: myeloid differentiation primary response gene 88. MAPK: mitogen-activated protein kinases. NF-κB: nucleaire factor kappa B. Figuur afkomstig van: (Rumbo et al, 2006). In de literatuur werd reeds beschreven dat een fusie-eiwit met flagelline in vitro en in vivo leidt tot CD8+ T-cel activatie en dus een Th 1 cellulaire immuunrespons induceert (Braga et al, 2010; Cuadros et al, 2004a; Huleatt et al, 2007; Mizel & Bates, 2010). Of flagelline in mRNA vorm ook een geschikt adjuvant is voor vaccins die tumorcellen targetten werd nog niet onderzocht (Mizel & Bates, 2010). Bovendien moet ook onderzocht worden of flagellinegebaseerde vaccins niet leiden tot bijwerkingen zoals een cytokinestorm of lokale inflammatie op de plaats van immunisatie. 1.3 mRNA-vaccinatie als kanker immunotherapie 1.3.1 Kanker immunotherapie Er zijn verschillende mogelijkheden om kanker te bestrijden. De drie meest toegepaste behandelingen zijn chemotherapie, radiatietherapie en chirurgie (Oncosec, 2013). Tijdens chemotherapie worden cytotoxische drugs toegediend aan de patiënt die de kankercellen gaan elimineren. Er zijn verschillende cytotoxische drugs beschikbaar met verscheidene functies. Zo kunnen deze drugs het genetisch materiaal aanvallen (zoals alkylerende agents), de metastase of verspreiding van de kankercellen onderdrukken, de absorptie van nutriënten blokkeren of celdeling belemmeren (zoals mitotische inhibitoren). Vaak worden verschillende drugs met elkaar gecombineerd om betere resultaten te bekomen. Radiatietherapie maakt gebruik van hoge dosissen van voornamelijk x- en γ-stralen om de genetische inhoud van kankercellen te beschadigen. Radiatietherapie kan toegepast worden voor de behandeling van specifieke locaties, terwijl chemotherapie het volledige lichaam beïnvloedt. Tijdens chirurgie worden kwaadaardige tumoren verwijderd uit het lichaam. Het wordt voornamelijk toegepast wanneer de kankercellen zich nog niet verspreid hebben over het hele lichaam (Oncosec, 2013). Helaas is het gebruik van de huidige middelen waarmee kanker bestreden wordt, gelimiteerd. Zo elimineren cytotoxische drugs niet alleen kankercellen maar ook gezonde cellen wat leidt tot klinische cytotoxiciteit (Madan & Gulley, 2015). Tijdens radiatietherapie 9 Inleiding kunnen de nabijgelegen weefsels beschadigd worden. Vandaar werd immunotherapie ontwikkeld waarbij het immuunsysteem van de patiënt geïnduceerd of versterkt wordt (Delany et al, 2014). Immunotherapie is de verzamelnaam voor verschillende behandelingen die elk bijdragen tot het versterken van het immuunantwoord. Zo spreekt men over het toedienen van antilichamen, cytokines, vaccins of adoptieve celtransfer (Yang et al, 2003). Tijdens kanker immunotherapie wil men het natuurlijke immuunsysteem van het lichaam versterken om kanker te bestrijden. Kanker immunotherapie werd in 2013 uitgeroepen tot “Doorbraak van het jaar” door het gerenommeerde tijdschrift Science (Couzin-Frankel, 2013). Een veel besproken klinisch voorbeeld van immunotherapie door middel van het toedienen van antilichamen is de behandeling van borsttumoren waarbij de human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) overgeëxpresseerd wordt. Door het toedienen van trastuzumab, een monoclonaal antilichaam dat de HER2 receptor gaat binden en inhiberen, wordt celproliferatie geïnhibeerd en tumorgroei ingedijkt (Monneur et al, 2014). Een tweede voorbeeld van een op immunotherapie gebaseerd medicijn heet ipilimumab, een antilichaam gericht tegen het cytotoxische T-lymfocyt antigen 4 (CTLA-4), een eiwitreceptor aanwezig op het oppervlakte van T-cellen. CTLA-4 is een immuun checkpoint receptor en verhindert T-cellen om blijvende immuunresponsen te induceren (Fig. 5 a). Door CTLA-4 te blokkeren met ipilimumab krijgt het immuunsysteem vrij spel om kanker te bestrijden (Couzin-Frankel, 2013; Klebanoff et al, 2011; Pardoll, 2012). Een aantal jaren na de ontdekking van CTLA-4 werd het molecule programmed death 1 (PD-1) ontdekt dat geëxpresseerd wordt door uitgeputte T-cellen. Ook dit is een immuun checkpoint receptor en oefent een negatief effect uit op de activiteit van T-cellen (Fig. 5 b) (Klebanoff et al, 2011). Onderzoekers hebben reeds ontdekt dat de combinatie van anti-PD-1 antilichamen en antiCTLA-4 antilichamen leidt tot snelle tumorregressie bij melanoma patiënten (Couzin-Frankel, 2013). Figuur 5 | Immuun checkpoint receptoren. (a) Na antigeenherkenning door een T-cel wordt de CTLA-4 receptor geactiveerd en blootgesteld op het oppervlakte van de T-cel. CTLA-4 zorgt voor neerregulatie van de T-cel activiteit doordat het de T-cel co-stimulerende CD28 receptor tegenwerkt en eveneens inhiberende signalen doorgeeft. (b) Geactiveerde T-cellen gaan eveneens PD-1 receptoren opreguleren die de activiteit van T-cellen inhiberen in de perifere weefsels op het moment van een inflammatierespons en ook auto-immuniteit gaan voorkomen. DC: dendritische cel. MHC: Major Histocompatibility Complex. TCR: T-cel receptor. CTLA-4: cytotoxische T-lymfocyt antigen 4. PD-1: programmed death 1. PDL: programmed death ligand. Figuur afkomstig van: (Pardoll, 2012). 10 Inleiding Onderzoekers zijn naarstig aan het werk om kanker uit de wereld te helpen, maar toch moet er nog veel onderzoek uitgevoerd worden naar doeltreffende methodes en bovendien moeten de potentiële behandelingen klinische studies doorstaan vooraleer kankerpatiënten geholpen kunnen worden. Rosenberg, een specialist in immunotherapie en actief binnen het National Cancer Institute concludeert hoopvol het volgende: “The goal right now is to find things that work, when you find things that work, industry finds ways to make it happen.” (Couzin-Frankel, 2010) 1.3.2 Antigeen-specifieke immunotherapie Dankzij de moleculaire identificatie van tumor-geassocieerde antigenen (TAAs) werd antigeen-specifieke immunotherapie mogelijk (Palucka & Banchereau, 2012). Therapeutische kankervaccins die coderen voor deze TAAs en versterkt worden door specifieke adjuvantia gaan namelijk het immuunsysteem activeren en richten naar de TAAs, om op die manier een brede in vivo anti-neoplastische immuunrespons te induceren (Madan & Gulley, 2015; Palucka & Banchereau, 2012). In tegenstelling tot de standaard drugbehandelingen kan deze immuunactivatie aanhouden tot na de behandelingsperiode doordat geheugencellen geactiveerd worden. Op deze manier kan immunotherapie dus leiden tot verhoogde overlevingskansen (Madan & Gulley, 2015). Het uiteindelijke doel van therapeutische kankervaccinatie is het opwekken van een antitumorale CD8+ T-celrespons die leidt tot tumorregressie. Door te vaccineren met patiëntspecifieke TAAs tracht men Tc cellen op te wekken die in staat zijn specifiek de tumorcellen die de TAAs expresseren aan te vallen en af te doden (Palucka & Banchereau, 2012). Indien kankervaccins die coderen voor deze TAAs hun doeltreffendheid kunnen bewijzen in klinische studies dan kan men in de toekomst deze kankervaccins combineren met additionele immunotherapieën zoals het gebruik van monoclonale antilichamen die de negatieve regulatoren (zoals CTLA-4 en PD-1) van het immuunsysteem gaan tegenwerken (Delany et al, 2014). 1.3.3 Het gebruik van mRNA als therapeutisch mRNA-vaccin Bij therapeutische mRNA-vaccinatie wordt een immuunreactie opgebouwd tegen het toegediende TAA, gecodeerd door mRNA. Zowel DNA als mRNA zijn heel efficiënt in het opwekken van Tc cellen. De belangrijkste eigenschap van mRNA-vaccinatie is dat mRNAgecodeerde antigenen in het cytosol worden verknipt door proteasomen en vervolgens gepresenteerd worden aan CD8+ T-cellen. Eiwitantigenen daarentegen worden na opname door DCn verknipt door endolysomale proteasen en vervolgens gepresenteerd aan CD4+ Tcellen. mRNA-vaccins bezitten dus de unieke eigenschap om CTL immuunresponsen op te wekken (Liu, 2010; Pollard et al, 2013a). De productie van het mRNA wordt verkregen door in vitro transcriptie van een gelineariseerde plasmide DNA (pDNA) template met behulp van bacteriofaag RNA polymerasen zoals T7 en SP6 (Fig. 6) (Kallen & Thess, 2014). Synthetisch mRNA omvat een open reading frame (ORF) dat codeert voor een TAA eiwit geflankeerd aan het 5’ uiteinde door een cap structuur en aan het 3‘ uiteinde door een polyA-staart. De cap en polyA-staart zijn noodzakelijk voor efficiënte translatie van het mRNA maar ook voor stabilisatie van het mRNA aangezien er exonucleasen aanwezig zijn in het cytosol (Holtkamp et al, 2006; Schlake 11 Inleiding et al, 2012). De pDNA template moet dus een bacteriofaag promotor bevatten, een ORF en een polyA sequentie. De cap structuur wordt niet gecodeerd door de pDNA template, hiervoor kan een cap analoog toegevoegd worden tijdens de reactie zoals het Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) van Ambion (Schlake et al, 2012; Yamamoto et al, 2009). Hiernaast is het ook voordelig dat het ORF van het mRNA aan het 5’ en 3’ einde geflankeerd wordt door untranslated regions (UTRs) om de translatie en stabiliteit van het mRNA te verhogen. Deze moeten echter bedachtzaam samengesteld worden aangezien sommige nucleotiden een negatief effect kunnen uitoefenen op de translatie en stabiliteit van het mRNA, zoals micro RNA (miRNA) bindingsplaatsen (Schlake et al, 2012). Figuur 6 | Productie van mRNA. De productie van het mRNA wordt verkregen door in vitro transcriptie van een gelineariseerde plasmide DNA template. Competente bacteriën worden getransformeerd met een plasmide dat codeert voor het betreffende gen en verschillende restrictie-enzymsites bevat. Het plasmide wordt geïsoleerd en gelineariseerd door toevoegen van specifieke restrictie-enzymes. RNA transcriptie vindt plaats met bacteriofaag polymerasen (T7, T3 of S6). Na transcriptie wordt het pDNA en het overblijvende bacteriële DNA verwijderd door toevoegen van DNasen. Figuur afkomstig van: (Kallen & Thess, 2014). mRNA gebaseerde vaccins bieden een aantal opmerkelijke voordelen. Ten eerste wordt mRNA als veilig beschouwd in tegenstelling tot DNA aangezien het risico op genoomintegratie onbestaand is (Kallen & Thess, 2014; Kreiter et al, 2011). Genoomintegratie zou namelijk kunnen leiden tot ontregeling van de genen en nadelige downstream effecten (Cannon & Weissman, 2002). Ten tweede resulteert immunisatie met mRNA in een transiënte expressie van het eiwit waardoor de blootstelling aan het antigeen meer gecontroleerd is en het risico voor tolerantie ook lager is (Pollard et al, 2013b). Ten derde is de productie van het mRNA eenvoudig doordat mRNA verkregen wordt door in vitro transcriptie van pDNA. Ten vierde kunnen er indien gewenst verscheidene modificaties (zie § 12 Inleiding 1.3.5.) eenvoudig worden aangebracht (Kuhn et al, 2011; Pollard et al, 2013a). Tenslotte vindt antigeentranslatie van mRNA plaats in het cytosol waardoor transfectie van trage, niet delende cellen mogelijk is in tegenstelling tot het gebruik van pDNA dat voor transcriptie de nucleaire enveloppe moet doorbreken (Schlake et al, 2012). Al deze factoren maken mRNA een aantrekkelijke optie voor kankervaccinatie. Er werden reeds indrukwekkende preklinische resultaten geboekt met het gebruik van mRNA-vaccins zowel in het kader van oncologie als in het kader van allergieën en infectieziektes. Echter, naast al deze voordelen is de in vivo instabiliteit van mRNA een belangrijk nadeel. Experimenten kunnen vlug falen door de talrijke aanwezigheid van extracellulaire ribonucleasen (RNasen) die het mRNA kunnen afbreken vooraleer het opgenomen wordt door de cellen (Kallen & Thess, 2014). In vivo transfectie van onbeschermd mRNA leidt tot suboptimale CTL immuunresponsen waardoor de sterkte van het kankervaccin sterk afneemt (Kallen & Thess, 2014). Vandaar dat mRNA vaak gecomplexeerd wordt met lipiden of polymeren. Niet alleen de vorm (eiwit, peptide, DNA, pDNA of mRNA) maar ook de toediening en opname van vaccins zijn cruciale aspecten tijdens therapeutische kankervaccinatie (Benteyn et al, 2014; Schlake et al, 2012). 1.3.4 Type I interferonen, een dubbelzijdig zwaard Interferonen (IFNn) zijn eiwitten die behoren tot de cytokines en worden geproduceerd door de gastheercel wanneer deze geïnfecteerd wordt door een pathogeen zoals virussen, bacteriën, parasieten of tumorcellen (Perry et al, 2005; Trinchieri, 2010). Er zijn drie grote klassen IFNn (Trinchieri, 2010). De type I IFNn binden aan de IFN-α/β receptor (IFNAR), waartoe onder andere IFN-α en IFN-β toebehoren. Deze worden geproduceerd door fibroblasten en monocyten en inhiberen virusreplicatie. Ook plasmacytoïde DCn zijn een zeer belangrijke bron van type I IFNn. De type II IFNn, namelijk IFN-γ, worden vrijgesteld door Th 1 cellen en NK cellen en gaan de proliferatie van Th 2 cellen tegen waardoor de Th 2 immuunrespons geïnhibeerd wordt en de Th 1 immuunrespons verder geïnduceerd wordt. Deze type II IFNn interageren met de IFN-γ receptor (IFNGR). Als laatste klasse zijn er nog de type III IFNn, de IFN-λ familie (Perry et al, 2005). Type I en type III IFNn induceren een gelijke set van genen maar de type III IFNn doen dit in een meer beperkte groep van cellen (Zhou et al, 2007). De type I IFNn worden geactiveerd nadat een pathogeen herkend wordt door PRRs (Perry et al, 2005). Herkenning van exogeen mRNA door TLR3, TLR7, TLR8 en TLR9 op het endosomale membraan en herkenning van het mRNA door TLR4 op het celoppervlak, induceert een snelle secretie van type I IFNn (Uematsu & Akira, 2007). Er zijn drie verschillende pathways die kunnen leiden tot de productie van deze type I IFNn die elk geactiveerd worden door specifieke inducers. De best gekende pathway is de retinoic acid inducible gene I (RIG-I) pathway, geïnduceerd door enkelstrengige RNA (ssRNA) en dubbelstrengige RNA (dsRNA) virussen (Kato et al, 2005; Perry et al, 2005). Na hun productie binden de type I IFNn aan de IFNAR wat de Janus kinase - signal transducer and activator of transcription (JAK-STAT) pathway induceert. Dit resulteert in de transcriptie van IFN gestimuleerde genen (Perry et al, 2005; Trinchieri, 2010). De type I IFNn zijn verantwoordelijk voor de activatie van zowel het aangeboren als adaptieve immuunsysteem (Perry et al, 2005). Ze stimuleren T-cel proliferatie, overleving en differentiatie, belangrijk voor de cellulaire immuniteit (Huber & Farrar, 2011; Tough, 2012). Ze verzorgen eveneens verhoogde antigeenpresentatie door de 13 Inleiding opregulatie van MHC-I en MHC-II moleculen. Hogere MHC-I expressie induceert een CTL respons. Hogere expressie van de MHC-II moleculen leidt tot een Th cel respons waardoor CKs, ILs en IFNn geproduceerd worden betrokken bij de activatie van zowel B-cellen als Tcellen en NK cellen (Perry et al, 2005). Hiernaast induceren de type I IFNn een anti-virale respons door de virale replicatie tegen te gaan (Pollard et al, 2013a; Trinchieri, 2010). Deze antivirale resistentie wekt de productie van het eiwit proteïne kinase R (PKR) op. Dit enzym fosforyleert de α-subunit van de eukaryotische translatie initiatiefactor 2 (eIF-2α) waardoor de mRNA translatie gereduceerd wordt (Fig. 7) (Kato et al, 2005; Perry et al, 2005; Pollard et al, 2013a). De eIF-2α is namelijk noodzakelijk voor de initiatie van translatie doordat het de binding van transfer RNA methionine (tRNAmet) aan het ribosoom medieert op een guaninetrifsofaat (GTP)-afhankelijke manier. Fosforylatie van eIF-2α inhibeert de uitwisseling tussen guaninedifosfaat (GDP) en GTP dat bindt op de γ-subunit van eIF2 waardoor de eIF2 steeds in zijn inactieve vorm blijft. Verder induceren de type I IFNn eveneens RNAse-L via activatie van het 2’-5’ oligoadenylate synthetase (2’-5’ OAS). Het RNAse-L breekt het mRNA af waardoor de eiwitsynthese van zowel virale als gastheergenen op deze manier ook gereduceerd wordt (Perry et al, 2005; Pollard et al, 2013a). Tenslotte stimuleren de type I IFNn nog een aantal andere genen waaronder het adenosine deaminase (ADA) dat leidt tot mRNA deaminatie (Pollard et al, 2013a). Figuur 7 | Mechanismen van eIF2. Een aantal eIF-2α kinasen zoals PKR fosforyleren de eIF-2 op de α-subunit waardoor de eIF2B zijn functie niet meer kan uitoefenen. Hierdoor blijft de eIF-2α in zijn inactieve GDP-gebonden status waardoor de translatie initiatie geïnhibeerd wordt. De eIF-2α-GTP vorm met zal namelijk tRNA binden en mediëren naar de 40S subunit van het ribosoom waardoor de translatie kan starten. eIF-2α: eukaryotische translatie initiatiefactor 2 α-subunit. PERK: PKRlike ER kinase. PKR: proteïne kinase R. GCN2: general control nonderepressible-2. HRI: hemeregulated inhibitor. GDP: guaninedifosfaat. GTP: met guaninetrifosfaat. Met-tRNA : transfer methionine RNA . Figuur afkomstig van: (Donnelly et al, 2013). 1.3.5 mRNA-modificatie Wanneer tijdens therapeutische mRNA-vaccinatie mRNA geïntroduceerd wordt, kan dit herkend worden als niet-eigen mRNA waardoor er IFNn gesecreteerd worden en het mRNA afgebroken wordt. Dit leidt uiteindelijk tot een lage antigeenexpressie wat een nadelige invloed heeft op de sterkte van het opgewekte immuunantwoord (Pollard et al, 2013b). Het is belangrijk de positieve effecten van de IFNn te behouden, namelijk het induceren van een 14 Inleiding immuunrespons en de negatieve effecten, de afbraak en translatiestop van mRNA te omzeilen. Er kunnen modificaties aan het mRNA toegebracht worden om deze type I IFN respons te reduceren. Door het aanbrengen van modificaties aan het transcript zoals pseudo-uridine (Ψ-uridine) en 5-methylcytidine worden de meeste TLRs niet meer geactiveerd (Kariko et al, 2008). Incorporatie van Ψ-uridine verhindert bovendien secretie van type I IFNn doordat deze modificatie de activatie van RIG-I blokkeert (Kormann et al, 2011). RIGI-I wordt namelijk geactiveerd door 5’-trifosfaat mRNA en niet door mRNA gemodificeerd met Ψ-uridine. Door het mRNA te modificeren kan activatie van Rnase-L en PKR door de type I IFNn geïnhibeerd worden waardoor het mRNA stabieler wordt en antigeenexpressie verhoogd wordt (Anderson et al, 2010; Kariko et al, 2008). Echter, dit leidt niet tot een beter immuunantwoord aangezien naast de type I IFNn eveneens andere cytokines onderdrukt worden door mRNA-modificatie die noodzakelijk zijn voor de activering van T-cellen. Vandaar moet tijdens vaccinatie met gemodificeerd mRNA adjuvantia toegediend worden om de immunogeniciteit te verhogen. 1.4 mRNA-vaccinatie strategieën 1.4.1 Lipidegebaseerde strategie met DOTAP/DOPE mRNA-vaccins kunnen op verschillende manieren toegediend worden. Niet-virale methoden worden geprefereerd boven virale methoden aangezien deze laatste een aantal limitaties met zich meedragen zoals cytotoxiciteit, gelimiteerde nucleïnezuur ladingscapaciteit en hoge productiekosten (McCarthy et al, 2014). In dit project komen drie verschillende mRNAvaccinatie strategieën aan bod. Het eerste is lipoplexvorming waarbij kationische lipiden gecomplexeerd worden met het polyanionisch mRNA wat ervoor zorgt dat de partikels zich gaan gedragen als microorganismen. Dit verzekert enerzijds de stabiliteit van het mRNA en anderzijds een efficiënte opname door DCn waardoor het antigeen gepresenteerd zal worden aan CD8+ T-cellen (De Haes et al, 2013). Een voorbeeld hiervan is complexatie van mRNA met 1,2-dioleoyl-3trimethylammonium-propane/1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOTAP/DOPE), een toepassing waar de onderzoekseenheid al ruime tijd ervaring mee heeft (Pollard et al, 2013b). DOTAP is een kationische lipide dat samen met het mRNA een positief geladen complex vormt, lipoplex genaamd. DOPE is een neutrale helper lipide dat mRNA vrijlating na endocytose gaat bevorderen dankzij zijn membraan destabiliserende effecten bij lage pH. DOPE vormt namelijk een omgekeerde hexagonale structuur in het liposoom dat leidt tot zijn membraan destabiliserend effect. DOPE is vereist om de positieve lading van DOTAP te neutraliseren zodat het mRNA efficiënt gescheiden kan worden van het lipoplex tijdens transfectie (Balazs & Godbey, 2011). 15 Inleiding 1.4.2 Peptidegebaseerde strategie met RALA Een tweede mogelijke vaccinatie strategie is de toediening van mRNA-RALA nanopartikels. Hierbij wordt het mRNA gecomplexeerd met het synthetisch RALA-peptide. Het RALApeptide bestaat uit 30 aminozuren en omvat arginine (R) – alanine (A) – leucine (L) - alanine (A) (RALA) repeats. De positief geladen arginine domeinen helpen nucleïnezuurbinding terwijl de hydrofobische leucine domeinen interageren met lipide membranen. De alanine domeinen geven het peptide een amfipatisch karakter (McCarthy et al, 2014). Complexatie van nucleïnezuren met het RALA-peptide verzekert dat deze nucleïnezuren stabiel en functioneel zijn zowel in vitro als in vivo. Door het ontwikkelen van nanopartikels zijn de nucleïnezuren in staat om door de cellulaire membranen te migreren, te ontsnappen van de endosomen en de nucleus te bereiken (McCarthy et al, 2014). Het ontwikkelen van nanopartikels door complexatie van DNA met het synthetisch RALA-peptide werd reeds onderzocht binnen het kader van gentherapie en lijkt veelbelovend. Of dit systeem toepasbaar is binnen kader van vaccinatie, en/of voor de toediening van mRNA werd nog niet beschreven in de literatuur. 1.4.3 In vivo electroporatie In dit project ligt de focus op in vivo electroporatie. Hierbij wordt een elektrisch veld gegenereerd waardoor het celmembraan tijdelijk permeabel wordt en kleine moleculen zoals mRNA de cel kunnen binnendringen (Andre & Mir, 2004; Burgain-Chain, 2013). Electroporatie als mRNA-vaccinatie strategie zou verschillende voordelen kunnen bieden. Zo verleent de techniek een hoge transfectie-efficiëntie vergeleken met lipidencomplexatie (Burgain-Chain, 2013; Muramatsu et al, 1998). Daarnaast kan elke cel of elk weefsel getransfecteerd worden (Burgain-Chain, 2013). Voorts kan de techniek snel uitgevoerd worden en is herhaalde transfectie mogelijk (Andre & Mir, 2004; Muramatsu et al, 1998). Electroporatie veroorzaakt bovendien schade aan het weefsel waardoor gevarensignalen, damage-associated molecular pattern moleculen (DAMPs) opgewekt worden. Vandaar dat het gebruikte voltage en de grootte van de electrode gecontroleerd moeten worden (Appasani, 2005). Het doel van het gebruik van in vivo electroporatie als mRNA-vaccinatie strategie, is de weefselschade als adjuvant te gebruiken. De vrijstelling van DAMPs moet het aangeboren immuunantwoord activeren maar mag uiteraard niet te sterk zijn. Deze gevarensignalen gaan APCn activeren wat een efficiënte antigeenpresentatie toelaat (Babiuk et al, 2004; Murtaugh & Foss, 2002). De toedieningroute heeft een impact op het type en de sterkte van de immuunresponsen die geïnduceerd worden na in vivo electroporatie. Zo werd ondervonden dat het toedienen van een pDNA vaccin via de ear pinna leidt tot een krachtige CTL respons samen met een sterke en langdurige eiwitexpressie wat noodzakelijk is tijdens mRNA vaccinatie (Vandermeulen et al, 2015). In vivo electroporatie als pDNA-vaccinatie strategie werd reeds onderzocht en werkzaam geacht binnen het kader van gentherapie en vaccinatie (Burgain-Chain, 2013; Kutzler & Weiner, 2008). De vraag of deze methode ook potentieel biedt voor het toedienen van mRNA-vaccins is nog niet beantwoord in de literatuur. 16 Doelstelling Deel 2 Doelstelling Ondanks de vooruitgang in de reeds toegepaste kankerbehandelingen zoals radio-, chemotherapie en chirurgie, blijft de behandeling van gemetastaseerde kanker uiterst moeilijk. De laatste jaren is er veel onderzoek gevoerd en vooruitgang geboekt in het veld van therapeutische mRNA-kanker vaccinatie. Nucleïnezuurgebaseerde vaccins zijn in tegenstelling tot eiwitgebaseerde vaccins wel in staat om CTL immuunresponsen op te wekken. Binnen het veld van nucleïnezuurgebaseerde kankervaccins heeft mRNA-vaccinatie vele voordelen ten opzichte van pDNA-vaccinatie. Zo moet mRNA niet door de nucleaire enveloppe geraken om tot expressie te komen. Hierdoor is transfectie van trage, niet delende cellen mogelijk. Bovendien is het toedienen van mRNA veiliger aangezien het risico op genoomintegratie onbestaand is. Desondanks is mRNA-vaccinatie in zijn huidige vorm nog suboptimaal en is er ruimte voor verbetering, onder andere in de vaccinatietechnieken om mRNA-vaccins efficiënt naar hun doelwitcellen te transfereren. De mRNA-vaccinatie strategie oefent namelijk een grote invloed uit op de sterkte van het cytotoxisch CD8+ T-cel immuunantwoord, wat mede aan de basis ligt van de anti-tumorale efficiëntie van het vaccin. Er zijn verschillende strategieën toepasbaar voor het toedienen van nucleïnezuurgebaseerde vaccins. Ten eerste is er de lipidegebaseerde techniek waarbij het mRNA complexeert met kationische lipiden zoals DOTAP/DOPE ter vorming van lipoplexen. Ten tweede kunnen nanopartikels gevormd worden na interactie tussen mRNA en een bepaalde peptidesequentie zoals RALA. Ten derde kan in vivo electroporatie toegepast worden om het mRNA in het cytosol van de gastheer te transfereren. Een geschikte vaccinatie strategie moet een hoge antigeenexpressie bekomen in aanwezigheid van een goede activatie van het immuunantwoord. De onderzoekseenheid heeft al ruime tijd ervaring met de formatie van mRNA lipoplexen met DOTAP/DOPE en zijn toepasbaarheid als vaccinatie strategie. Zo werd reeds aangetoond dat complexatie met DOTAP/DOPE een sterke immuunactivatie induceert maar slechts een zwakke antigeenexpressie stimuleert. Vandaar wordt in dit project in vivo electroporatie onderzocht als potentiële vaccinatie strategie voor het toedienen van mRNA als therapeutisch kankervaccin. Met deze techniek willen we een hoge antigeenexpressie bekomen en wordt verwacht dat er DAMPs vrijgesteld worden die het aangeboren immuunantwoord activeren. Indien DAMP vrijstelling onvoldoende is om immuunantwoorden op te wekken zullen we electroporatie combineren met mRNA coderend voor flagelline, een immuunactiverend eiwit. Allereerst bestuderen we in vivo electroporatie op vlak van CD8+ T-cel proliferatie. Hiervoor wordt een in vivo proliferatie assay uitgevoerd waarbij OT-I cellen gelabeld worden met carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) en getransfereerd worden naar donormuizen. OT-I cellen zijn CD8+ T-cellen die een transgene T-cel receptor expresseren die specifiek ovalbumine-residuen gebonden op MHC-I herkent. Twee dagen later vindt immunisatie plaats met ovalbumine (OVA) coderend mRNA. Drie dagen later wordt OT-I proliferatie bestudeerd door middel van flow cytometrie. Doordat de OT-I cellen gelabeld worden met CFSE kan hun proliferatie gevolgd worden door flow cytometrische analyse waarbij een 17 Doelstelling specifieke antilichaamcocktail toegediend wordt. Naarmate de sterkte of de immunocompetentie van het vaccin zal een verre deling van de CD8+ T-cellen gevisualiseerd worden. Vervolgens trachten we in vivo electroporatie te analyseren op vlak van antigeenexpressie. Vooraleer het antigeen via MHC-I moleculen gepresenteerd kan worden aan de CD8+ Tcellen moet het antigene mRNA tot expressie komen in het cytosol. Hiertoe worden C57BL/6 muizen geëlectroporeerd na injectie van luciferase coderend mRNA. Door het toedienen van Firefly D-luciferine kan mRNA expressie geanalyseerd worden door in vivo bioluminescentie imaging. Voorts wordt de invloed van type I IFNn op antigeenexpressie bestudeerd in een IFNAR knock out (KO) model. In IFNAR KO muizen kan het mRNA wel nog de expressie van type I IFNn activeren, maar deze kunnen niet meer binden op hun IFNAR receptor waardoor de inductie van IFN induceerbare genen wordt geïnhibeerd. Tot slot wordt getracht om de hoge antigeenexpressie bekomen door in vivo electroporatie te combineren met een sterke activatie en proliferatie van CD8+ T-cellen. Hiervoor wordt nagegaan of de coformulatie van mRNA coderend voor flagelline leidt tot een hogere inductie van het pro-inflammatoire cytokineprofiel na in vitro electroporatie van beenmergafgeleide dendritische cellen (BMDCs). De transcriptieniveaus van de pro-inflammatoire cytokines IL-6, IL-1β, IFN-β en TNF wordt bepaald. Het uiteindelijke doel van dit project is het valideren van in vivo electroporatie als mRNAvaccinatie strategie in vergelijking met een lipidegebaseerde (DOTAP/DOPE) en peptidegebaseerde (RALA) strategie om de efficiëntie van mRNA kankervaccinatie te verhogen. 18 Resultaten Deel 3 Resultaten 3.1 Analyse van in vivo electroporatie als mRNA-vaccinatie strategie voor het induceren van CD8+ T-cel proliferatie 3.1.1 OT-I proliferatie assay Allereerst trachten we in vivo electroporatie te bestuderen als een nieuwe mRNA-vaccinatie strategie voor het induceren van CD8+ T-cel proliferatie. Het doel van therapeutische kankervaccinatie is immers het opwekken van een anti-tumorale CD8+ T-celrespons. Binnen de onderzoeksgroep werd reeds aangetoond dat immunisatie met naakt mRNA niet voldoende is voor het opwekken van een CD8+ T-cel respons. In de zoektocht naar een gepaste carrier werd echter aangetoond dat wanneer het mRNA gecomplexeerd wordt met lipiden zoals DOTAP/DOPE er wel antigeenspecifieke functionele T-cel responsen geïnduceerd worden (Pollard et al, 2013b). In dit opzet willen we nagaan of in vivo electroporatie als mRNA-vaccinatie strategie in staat is om CD8+ T-cel deling op te wekken. Om deze deling te onderzoeken werd een in vivo proliferatie assay uitgevoerd op OT-I cellen. OT-I cellen zijn CD8+ T-cellen die een transgene T-cel receptor expresseren die specifiek ovalbumine-residuen gebonden op MHC-I herkent. Deze antigeenspecifieke CD8+ T-cellen worden voorafgaand gelabeld en intraveneus (i.v.) getransfereerd naar donormuizen waarna hun delingsprofiel bepaald wordt door middel van flow cytometrie. Naarmate de sterkte of de immunocompetentie van de mRNA-vaccinatie strategie zal een verre deling van de CD8+ T-cellen gevisualiseerd worden. Een sterke CD8+ T-cel proliferatie na in vivo electroporatie van antigeen mRNA wijst dus op een eventuele capaciteit van de techniek als geschikte mRNA-kanker vaccinatiestrategie. Figuur 8 | Schematische voorstelling van de in vivo OT-I proliferatie assay. Op dag 0 werden de OT-I cellen geïsoleerd en gelabeld met CFSE. Hierna werden 1 miljoen CFSE gelabelde OT-I cellen i.v. getransfereerd in de staart vene van een WT C57BL/6 muis. Op dag 2 vond immunisatie plaats met OVA mRNA. Op dag 5 werden de lymfeknopen (oor en inguinaal) geïsoleerd en werd de CD8+ T-cel proliferatie nagegaan door flow cytometrie na het toedienen van een specifieke antilichaamcocktail. CFSE: carboxyfluorescein succinimidyl ester. i.v.: intraveneus. OVA: ovalbumine. WT: wild type. 19 Resultaten Op dag 0 werden OT-I cellen gelabeld met CFSE en getransfereerd naar donormuizen (Fig. 8). De OT-I cellen werden gesorteerd met behulp van MACS sortering door de niet doelwitcellen (zoals Th cellen, B-cellen, NK cellen, DCn en macrofagen) magnetisch te labelen. Deze magnetisch gelabelde cellen werden gescheiden van de ongelabelde OT-I cellen aangezien de eerstgenoemde weerhouden werden door het magnetisch veld van de MACS kolom. De OT-I cellen vloeien door de kolom en werden gecollecteerd en gelabeld met 10 µM CFSE. Hierna werden 1 miljoen CFSE gelabelde OT-I cellen i.v. geïnjecteerd in de staart vene van een WT C57BL/6 muis. Cellen zijn permeabel voor CFSE waardoor deze fluorescerende stof eenvoudig kan binnendringen tot in het cytoplasma. Tijdens celdeling wordt CFSE gelijk verdeeld over de dochtercellen waardoor celproliferatie van de CFSE gelabelde CD8+ Tcellen kan gevolgd worden. Twee dagen later vond immunisatie plaats met ongemodificeerd ovalbumine (OVA) mRNA (TriLink) (Fig. 8). OVA is een kippeneiwit dat gehanteerd wordt als modelantigeen. Afhankelijk van het experiment werden immunisaties uitgevoerd door in vivo electroporatie van het mRNA of door mRNA-complexatie met DOTAP/DOPE of RALA. Op dag 5 werd OT-I proliferatie bestudeerd door middel van flow cytometrie (triple-laser LSR-II flow cytometer, Becton Dickinson) (Fig. 8). Hiervoor werden de drainerende lymfeknopen (oor en inguinaal) geïsoleerd. Door het toedienen van een antilichaamcocktail kan de proliferatie van OVA-specifieke CD8+ T-cellen bestudeerd worden. De antilichamen gaan bepaalde antigenen herkennen en zijn gebonden aan fluorochromen. In deze opstelling werd specifiek volgende antilichaamcocktail toegediend: dextrameer-OVA-PE, een fluorescent gelabelde MHC-I multimeer dat het SIINFEKL peptide van OVA bindt en zo dus OVA-specifieke CD8+ T-cellen herkent; aqua live/dead (L/D)-AmCyan dat dode cellen gaat merken; CD3-Pacific Blue dat T-cellen herkent; CD8-PerCP dat CD8+ T-cellen bindt en CD19APC wat een B-cel merker is. Figuur 9 geeft de gating strategie weer die werd toegepast tijdens de flow cytometrische analyse. 20 Resultaten Figuur 9 | Gating strategie voor de flow cytometrische analyse van OVA specifieke CD8+ T-cellen. Op dag 5 werden lymfeknopen (oor en inguinaal) geïsoleerd van WT C57BL/6 muizen die i.v. geïnjecteerd werden met CFSE gelabelde OT-I cellen en geïmmuniseerd werden met OVA-mRNA. De cellen werden gecollecteerd en geïncubeerd met een specifieke antilichaamcocktail: aqua L/D-AmCyan (merkt dode cellen), CD3-Pacific Blue (T-cel merker), CD19-APC (B-cel merker), CD8-PerCP (CD8+ T-cel merker), Fc-block en dextrameer-OVA-PE (detecteert CD8+ T-cellen met een TCR voor OVA). M.b.v. flow cytometrie werden cellen gedetecteerd op basis van de FSC en SSC. Levende cellen werden gedetecteerd als L/D negatief. T-cellen werden herkend als CD3+ CD19-. Uit deze populatie werden CD8+ T-cellen herkend als CD3+ CD8+ waaruit tenslotte OVA specifieke CD8+ T-cellen herkend werden als OVA-PE+ CD8+. Hun proliferatie wordt weergegeven door een histogram dat het CFSE signaal representeert. FSC: forward scatter. SSC: side scatter. L/D: live/dead. OVA: ovalbumine. Voor de analyse van de CD8+ T-cel proliferatie met behulp van flow cytometrie werd een bepaalde gating strategie gevolgd (Fig. 9). Op basis van de forward scatter (FSC) en side scatter (SC) werden intacte cellen geïdentificeerd. De voorwaartse lichtverstrooiing geeft informatie over de grootte van de cel terwijl de zijwaartse lichtverstrooiing informatie geeft over de interne structuur, granulariteit. Vervolgens werden de levende cellen geselecteerd als live/dead negatieve cellen. Deze merker kan namelijk enkel het celmembraan van dode cellen kruisen en interageren met vrije amines in het cytoplasma van de dode cel. Hierna werden T-cellen geïdentificeerd als CD3+ CD19- cellen. Uit deze populatie werden de CD8+ T-cellen verder geselecteerd als CD3+ CD8+ cellen daar CD8+ T-cellen gekenmerkt worden door de CD8-coreceptor. Tenslotte werden de OVA-specifieke CD8+ T-cellen herkend als OVA-PE+ CD8+ cellen door incubatie met een dextrameeroplossing dat OVA residuen bindt (SIINFEKL peptide) die herkend worden door de OVA-specifieke CD8+ T-cellen. Van de OVA-specifieke CD8+ T-cel populatie werd een histogram geconstrueerd dat de proliferatie weergeeft (Fig. 9). Zoals reeds vermeld werden de OT-I cellen gelabeld met CFSE waardoor celproliferatie van de CFSE gelabelde OT-I cellen kon gevolgd worden. 21 Resultaten 3.1.2 In vivo electroporatie Eerst en vooral werd de focus gelegd op in vivo electroporatie als nieuwe mRNA-vaccinatie strategie. Er werd nagegaan of mRNA electroporatie leidt tot een betere T-cel activatie en proliferatie in vergelijking tot injectie van naakt mRNA. Hiervoor werden de muizen enerzijds geïmmuniseerd met 10 µg ongemodificeerd naakt OVA mRNA (TriLink) zowel in de ear pinna (e.a.) als intramusculair (i.m.). Anderzijds vond in vivo electroporatie plaats na injectie van het OVA mRNA. Als negatieve controle werd geëlectroporeerd met PBS. Als positieve controle werd geïmmuniseerd met 10 µg OVA CpG. CpG is een TLR9 ligand en wordt toegevoegd als adjuvant. Het oefent een immuunstimulerende functie uit door het activeren van APCn. Figuur 10 a toont de verschillende proliferatieprofielen. a) Oor: OVA -EP Spier: OVA -EP Oor: OVA +EP Spier: OVA +EP 22 Resultaten Oor: PBS +EP b) Spier: PBS -EP OVA CpG c) Figuur 10 | CD8+ T-cel proliferatieprofiel na in vivo electroporatie met antigeen mRNA. Op dag 0 werden CFSE gelabelde OT-I cellen i.v. getransfereerd naar een WT C57BL/6 muis. Op dag 2 vond in vivo electroporatie plaats met 10 µg ongemodificeerd OVA mRNA (TriLink), i.m. of in de e.a. Op dag 5 werden lymfeknopen (oor en inguinaal) geïsoleerd en vond analyse van de CD8+ T-cel proliferatie plaats door flow cytometrie (triple-laser LSR-II flow cytometer, Becton Dickinson). (a) geeft het CD8+ T-cel proliferatieprofiel weer voor elke immunisatie. Er wordt telkens één profiel van de triplicaten weergegeven met de hoogste CD8+ T-cel proliferatie. (b) geeft een vergelijking tussen electroporatie of geen electroporatie van het antigeen mRNA in het oor t.o.v. een negatieve (PBS) en positieve (OVA CpG) controle. (c) geeft een vergelijking tussen electroporatie of geen electroporatie van het antigeen mRNA in de spier. Voor de analyse werden steeds de profielen met hoogste proliferatie vergeleken. OVA: ovalbumine. EP: electroporatie. 23 Resultaten Uit de verschillende proliferatieprofielen (Fig. 10 a) kan men reeds opmerken dat net zoals immunisatie met naakt mRNA er geen CD8+ T-cel proliferatie optreedt na in vivo electroporatie, zowel wanneer er in de e.a. geëlectroporeerd wordt als wanneer er i.m. geëlectroporeerd wordt. Zoals verwacht vertoont de negatieve controle (PBS) geen proliferatie en induceert de positieve controle (OVA CpG) wel een sterke proliferatie. Figuur 10 b toont dat er geen CD8+ T-cel proliferatie optreedt na electroporatie van antigeen mRNA in de ear pinna in vergelijking met immunisatie met OVA CpG, de positieve controle. Hetzelfde wordt waargenomen na intramusculaire electroporatie van antigeen mRNA (Fig. 10 c). 3.1.3 DOTAP/DOPE-mRNA vaccinatie Aangezien binnen de onderzoekseenheid reeds aangetoond werd dat lipoplexvorming van mRNA met DOTAP/DOPE sterk immunogeen is, werd een studie opgesteld waarbij in vivo electroporatie als mRNA-vaccinatie strategie vergeleken wordt met deze lipidegebaseerde strategie. Muizen werden geïmmuniseerd in de e.a. met 10 µg ongemodificeerd OVA mRNA (TriLink). Het OVA mRNA werd gecomplexeerd met DOTAP/DOPE. Als negatieve controle werd 10 µg naakt OVA mRNA geïnjecteerd. Als positieve controle werd geïmmuniseerd met 10 µg OVA CpG. Figuur 11 a toont de verschillende proliferatieprofielen. a) 10 µg mRNA 10 µg DOTAP/DOPE mRNA OVA CpG 24 Resultaten b) Figuur 11 | CD8+ T-cel proliferatieprofiel na immunisatie met DOTAP/DOPE-mRNA. Op dag 0 werden CFSE gelabelde OT-I cellen i.v. getransfereerd naar een WT C57BL/6 muis. Op dag 2 vond immunisatie plaats in de e.a. met 10 µg ongemodificeerd DOTAP/DOPE-OVA mRNA (TriLink). Op dag 5 werden lymfeknopen (oor en inguinaal) geïsoleerd en vond analyse van de CD8+ T-cel proliferatie plaats door flow cytometrie (triple-laser LSR-II flow cytometer, Becton Dickinson). (a) geeft het CD8+ T-cel proliferatieprofiel weer voor elke immunisatie. Er wordt telkens één profiel van de triplicaten weergegeven met de hoogste CD8+ T-cel proliferatie. (b) geeft een vergelijking tussen immunisatie met ongemodificeerd DOTAP/DOPE-OVA mRNA t.o.v. een negatieve (naakt OVA mRNA) en positieve (OVA CpG) controle. Voor de analyse werden steeds de profielen met hoogste proliferatie vergeleken. OVA: ovalbumine. Uit de verschillende proliferatieprofielen (Fig. 11 a) kan men reeds opmerken dat er een sterke CD8+ T-cel proliferatie optreedt na mRNA-complexatie met DOTAP/DOPE. Zoals verwacht vertoont de negatieve controle (naakt mRNA) geen proliferatie en induceert de positieve controle (OVA CpG) wel een sterke proliferatie. Figuur 11 b toont dat er een sterke CD8+ T-cel proliferatie optreedt na immunisatie met OVA mRNA gecomplexeerd met DOTAP/DOPE in vergelijking met de negatieve controle, waarbij geïmmuniseerd werd met naakt mRNA. 3.1.4 RALA-mRNA vaccinatie Hiernaast werd ter vergelijking eveneens geïmmuniseerd met OVA mRNA na complexatie met de peptidesequentie RALA. Immunisatie van de muizen vond plaats in de e.a. met 10 µg ongemodificeerd OVA mRNA (TriLink). Als negatieve controle werd 10 µg naakt OVA mRNA geïnjecteerd. Als positieve controle werd geïmmuniseerd met 10 µg OVA CpG. Figuur 12 a toont de verschillende proliferatieprofielen. 25 Resultaten a) 10 µg mRNA 10 µg RALA mRNA OVA CpG b) Figuur 12 | CD8+ T-cel proliferatieprofiel na imunisatie met RALA-mRNA. Op dag 0 werden CFSE gelabelde OT-I cellen i.v. geïnjecteerd in een WT C57BL/6 muis. Op dag 2 vond immunisatie plaats in de e.a. met 10 µg ongemodificeerd RALA-OVA mRNA (TriLink). Op dag 5 werden lymfeknopen (oor en inguinaal) geïsoleerd en vond analyse van de CD8+ T-cel proliferatie plaats door flow cytometrie (triple-laser LSR-II flow cytometer, Becton Dickinson). (a) geeft het CD8+ T-cel proliferatieprofiel weer voor elke immunisatie. Er wordt telkens één profiel van de triplicaten weergegeven met de hoogste CD8+ T-cel proliferatie. (b) geeft een vergelijking tussen immunisatie met ongemodificeerd RALA-OVA mRNA t.o.v. een negatieve (naakt OVA mRNA) en positieve (OVA CpG) controle. Voor de analyse werden steeds de profielen met hoogste proliferatie vergeleken. OVA: ovalbumine. 26 Resultaten Uit de verschillende proliferatieprofielen (Fig. 12 a) kan men reeds opmerken dat er slechts een zwakke CD8+ T-cel proliferatie optreedt na mRNA-complexatie met RALA. Zoals verwacht vertoont de negatieve controle (naakt mRNA) geen proliferatie en induceert de positieve controle (OVA CpG) wel een sterke proliferatie. Men kan vaststellen dat er geen sterke CD8+ T-cel proliferatie optreedt na immunisatie met OVA mRNA gecomplexeerd met RALA in vergelijking met immunisatie met OVA CpG, de positieve controle (Fig. 12 b). 3.1.5 Vergelijking tussen in vivo electroporatie, DOTAP/DOPE en RALA Tot slot werd de inductie van CD8+ T-cel proliferatie door de verschillende mRNA-vaccinatie strategieën met elkaar vergeleken in Figuur 13. Er vond immunisatie in de e.a. plaats met 10 µg ongemodificeerd OVA mRNA (TriLink). Als positieve controle werd geïmmuniseerd met 10 µg OVA CpG. Figuur 13 | In vivo electroporatie met antigeen coderend mRNA leidt niet tot CD8+ T-cel proliferatie. Op dag 0 werden CFSE gelabelde OT-I cellen i.v. getransfereerd naar een WT C57BL/6 muis. Op dag 2 vond immunisatie plaats in de e.a. met 10 µg ongemodificeerd OVA mRNA (TriLink). Op dag 5 werden lymfeknopen (oor en inguinaal) geïsoleerd en vond analyse van de CD8+ T-cel proliferatie plaats door flow cytometrie (triple-laser LSR-II flow cytometer, Becton Dickinson). Als positieve controle werd geïmmuniseerd met OVA CpG. Voor de analyse werden steeds de profielen met hoogste proliferatie vergeleken. OVA: ovalbumine. EP: electroporatie. Zoals reeds opgemerkt induceert in vivo electroporatie van antigeen coderend mRNA in de e.a. geen CD8+ T-cel proliferatie (Fig. 13). Immunisatie met antigeen coderend mRNA dat gecomplexeerd werd met RALA vertoont een zwakke CD8+ T-cel proliferatie. Daarentegen, immunisatie met lipoplexen waarbij het mRNA gecomplexeerd werd met DOTAP/DOPE leidt wel tot sterke CD8+ T-cel proliferatie (Fig. 13). Voor de lipide- en peptidegebaseerde mRNA-vaccinatie strategie werd eveneens het effect van mRNA-modificatie op CD8+ T-cel proliferatie bestudeerd, zie addendum A.1. 27 Resultaten 3.2 Analyse van in vivo electroporatie op vlak van antigeen mRNA-expressie 3.2.1 In vivo bioluminescentie imaging Aangezien in vivo electroporatie geen CD8+ T-cel deling induceert hebben we onderzocht of een zwakke antigeenexpressie hiervan de oorzaak is. Vooraleer het antigeen via MHC-I moleculen gepresenteerd kan worden aan de CD8+ T-cellen moet het antigene mRNA namelijk tot expressie komen. Hierna wordt het eiwit afgebroken tot peptiden door proteasomen. Deze antigene peptiden worden uiteindelijk gepresenteerd aan naïve T-cellen wat leidt tot activatie, proliferatie en differentiatie tot effector T-cellen (Pollard et al, 2013a). Hoe meer mRNA translatie optreedt van het antigene mRNA, hoe meer peptiden er geproduceerd worden door proteasomale degradatie en hoe groter de kans op een sterke CD8+ T-celrespons. In vivo bioluminescentie imaging laat toe om na te gaan of in vivo electroporatie een sterke mRNA-antigeenexpressie induceert. Hiervoor wordt mRNA coderend voor luciferase toegediend dat na expressie in staat is het toegediende Firefly D-luciferine substraat te oxideren. Tijdens deze reactie worden fotonen geproduceerd die gevisualiseerd kunnen worden met een bioluminescentie camera. Door het toedienen van mRNA dat codeert voor het luciferase enzym gevolgd door in vivo electroporatie, kan in vivo electroporatie geanalyseerd worden op vlak van antigeenexpressie. Wanneer een sterk luciferase signaal opgemerkt wordt, wijst dit op een sterke antigeenexpressie. Figuur 14 | Schematische voorstelling van de in vivo bioluminescentie imaging. WT C57BL/6 muizen werden geïnjecteerd met luciferase mRNA (TriLink), ongemodificeerd of gemodificeerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Vier uur later werd Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waana op verschillende tijdspunten het luciferase signaal gemeten werd. Voor het bestuderen van de antigeenexpressie werden WT C57BL/6 muizen geïnjecteerd met luciferase coderend mRNA (Fig. 14). Vier uur later werd i.p. Firefly D-luciferine toegediend waarna op verschillende tijdstippen het luciferase signaal gemeten werd door in vivo bioluminescentie imaging (IVIS lumina II, Xenogen) (Fig. 14). 3.2.2 Invloed van in vivo electroporatie op antigeenexpressie Allereerst werd de invloed van in vivo electroporatie op antigeenexpressie nagegaan. Hiervoor werden muizen geïnjecteerd met luciferase mRNA waarna geëlectroporeerd werd. Het luciferase signaal met en zonder electroporatie werd vergeleken. 28 Resultaten WT C57BL/6 muizen werden i.m. geïnjecteerd met 20 µg luciferase mRNA (TriLink), ongemodificeerd of gemodificeerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Na injectie van het mRNA werden de muizen i.m. geëlectroporeerd. Vier uur na injectie van het luciferase mRNA werd intraperitoneaal (i.p.) 100 µl Firefly D-luciferine geïnjecteerd. Het luciferase signaal werd gedurende twee minuten op verschillende tijdstippen gemeten (4u, 24u, 32u, 48u, 3d, 4d, 5d en 7d na injectie van het luciferase, IVIS lumina II, Xenogen). Als negatieve controle werd PBS toegediend. Het luciferase signaal 24 uur na electroporatie wordt weergegeven in Figuur 15. Er werden regions of interest (ROIs) geselecteerd met identieke grootte en vergeleken met muizen die geïnjecteerd werden met PBS. (-) PBS WT: LUC -EP WT: gemod LUC -EP WT: LUC +EP WT: gemod LUC +EP Figuur 15 | Luciferase expressie 24 uur na in vivo electroporatie van mRNA. WT C57BL/6 muizen werden i.m. geïnjecteerd met 20 µg luciferase mRNA (TriLink). Er werd zowel ongemodificeerd als gemodificeerd mRNA toegediend. Modificatie werd uitgevoerd met Ψuridine, 5-methylcytidine en ARCA. Vier uur nadien werd 100 µl Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waarna op verschillende tijdstippen het luciferase signaal werd gemeten gedurende 2 minuten (IVIS lumina II, Xenogen). Het aantal fotonen per seconde op een vooropgesteld oppervlakte werd gemeten. Als negatieve controle werd PBS toegediend. WT: wild type. LUC: luciferase. EP: electroporatie. Gemod: gemodificeerd. PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing. Figuur 15 toont dat wanneer er electroporatie van luciferase mRNA uitgeoefend wordt er een duidelijk luciferase signaal merkbaar is in vergelijking met de negatieve controle waarbij PBS toegediend werd. 29 Resultaten Figuur 16 a en b tonen het effect van electroporatie op de luciferase expressie. In deze figuur wordt de invloed van in vivo electroporatie in de twee groepen, ongemodificeerd of gemodificeerd luciferase mRNA, gevisualiseerd. Een sterk luciferase signaal wijst op sterke luciferase expressie. a) b) L u c ife ra s e s ig n a a l 61 0 7 L u c ife ra s e s ig n a a l 41 0 7 W T: gem od LU C - EP 41 0 W T: LU C - EP W T: PBS 21 0 7 0 T o t a le flu x (p /s ) T o t a le flu x (p /s ) W T: LUC + EP 7 31 0 7 W T: gem od LUC + EP W T: PBS 21 0 7 11 0 7 0 u u r n a e le c tr o p o r a t ie 8 6 1 1 2 8 6 9 2 7 8 4 2 3 4 2 4 8 6 1 1 2 8 6 9 2 7 8 4 2 3 2 4 -1 1 0 7 4 -2 1 0 7 u u r n a e le c tr o p o r a t ie Figuur 16 | Het effect van in vivo electroporatie op luciferase expressie. WT C57BL/6 muizen werden i.m. geïnjecteerd met 20 µg luciferase mRNA (TriLink). Er werd zowel ongemodificeerd als gemodificeerd mRNA toegediend. Modificatie werd uitgevoerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Vier uur nadien werd 100 µl Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waarna op verschillende tijdstippen het luciferase signaal werd gemeten gedurende 2 minuten (IVIS lumina II, Xenogen). Het aantal fotonen per seconde op een vooropgesteld oppervlakte werd gemeten. Als negatieve controle werd PBS toegediend. (a) en (b) geven het effect van de electroporatie weer. WT: wild type. LUC: luciferase. EP: electroporatie. Gemod: gemodificeerd. PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing. Electroporatie van ongemodificeerd luciferase vertoont gemiddeld een 2 x 107 voudige expressie ten opzichte van geen electroporatie (Fig. 16 a). Er wordt echter geen significant verhoogd signaal waargenomen na electroporatie van gemodificeerd mRNA (Fig. 16 b). Ter vergelijking werd het luciferase signaal na injectie van PBS weergegeven als negatieve controle. 3.2.3 Invloed van mRNA-modificatie op antigeenexpressie Wanneer tijdens therapeutische mRNA-vaccinatie mRNA geïntroduceerd wordt, kan dit herkend worden als niet-eigen mRNA waardoor er IFNn gesecreteerd worden. Type I IFNn activeren Rnase-L dat leidt tot degradatie van het mRNA. Hiernaast gaan type I IFNn het PKR proteïne activeren dat de α-subunit van de eIF2 fosforyleert. Hierdoor wordt de translatieinitiatie geïnhibeerd wat uiteindelijk leidt tot een lage antigeenexpressie dat nadelig is tijdens mRNA-kankervaccinatie (Pollard et al, 2013b). Door het aanbrengen van modificaties aan het mRNA kan de type I IFN respons gereduceerd worden. Wanneer UTP en CTP 100% vervangen worden door Ψ-uridine trifosfaat en 5methylcytidine trifosfaat worden de meeste TLRs niet meer geactiveerd (Kariko et al, 2008). Beide modificaties verlagen type I IFN signalisatie doordat hierdoor het mRNA minder herkend wordt door RIG-I (Kormann et al, 2011). Het mRNA wordt stabieler aangezien het minder vlug gedegradeerd wordt door Rnase-L. Modificatie met Ψ-uridine gaat bovendien 30 Resultaten het PKR eiwit minder activeren waardoor de translatiestop geïnhibeerd wordt (Anderson et al, 2010; Kariko et al, 2008). Om te onderzoeken wat het effect is van mRNA-modificatie op antigeenexpressie na in vivo electroporatie van het mRNA, werd de data van § 3.2.2 op een andere manier geanalyseerd. In deze opstelling werden WT C57BL/6 muizen i.m. geïnjecteerd met 20 µg luciferase mRNA (TriLink), ongemodificeerd of gemodificeerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Na injectie van het mRNA werden de muizen i.m. geëlectroporeerd. Vier uur na injectie van het luciferase mRNA werd i.p. 100 µl Firefly D-luciferine geïnjecteerd. Het luciferase signaal werd gedurende twee minuten op verschillende tijdstippen gemeten (IVIS lumina II, Xenogen). Als negatieve controle werd PBS toegediend. Figuur 17 a en b tonen het effect van mRNA-modificatie op de luciferase expressie. In deze figuur wordt de invloed van mRNA-modificatie in de twee groepen, met of zonder in vivo electroporatie, gevisualiseerd. Een sterk luciferase signaal wijst op sterke luciferase expressie. a) L u c ife ra s e s ig n a a l 61 0 7 b) W T: LUC + EP 41 0 7 T o t a le flu x (p /s ) T o t a le flu x (p /s ) W T: gem od LUC + EP W T: PBS 21 0 7 0 L u c ife ra s e s ig n a a l 41 0 7 W T: gem od LU C - EP W T: LU C - EP 31 0 7 W T: PBS 21 0 7 11 0 7 0 -2 1 0 7 u u r n a e le c tr o p o r a t ie 8 6 1 1 2 8 6 9 2 7 8 4 2 3 4 2 4 8 6 1 1 2 8 6 9 2 7 8 4 2 3 4 2 4 -1 1 0 7 u u r n a e le c tr o p o r a t ie Figuur 17 | Het effect van mRNA-modificatie op luciferase expressie. WT C57BL/6 muizen werden i.m. geïnjecteerd met 20 µg luciferase mRNA (TriLink). Er werd zowel ongemodificeerd als gemodificeerd mRNA toegediend. Modificatie werd uitgevoerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Vier uur nadien werd 100 µl Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waarna op verschillende tijdstippen het luciferase signaal werd gemeten gedurende 2 minuten (IVIS lumina II, Xenogen). Het aantal fotonen per seconde op een vooropgesteld oppervlakte werd gemeten. Als negatieve controle werd PBS toegediend. (a) en (b) geven het effect van mRNAmodificatie weer. WT: wild type. LUC: luciferase. EP: electroporatie. Gemod: gemodificeerd. PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing. Uit Figuur 17 a kan men opmerken dat er geen groot verschil optreedt tussen de expressie van ongemodificeerd en gemodificeerd luciferase mRNA na het uitvoeren van electroporatie. Wanneer er geen electroporatie uitgevoerd wordt, waarbij injectie van mRNA niet gevolgd wordt door electroporatie, vertoont het gemodificeerd luciferase hogere expressie levels (Fig. 17 b). Ter vergelijking werd het luciferase signaal na injectie van PBS weergegeven als negatieve controle. 31 Resultaten 3.2.4 Antigeenexpressie na in vivo electroporatie Tot slot worden de verschillende condities met elkaar vergeleken in Figuur 18. Er vond i.m. injectie plaats van WT muizen met 20 µg ongemodificeerd of gemodificeerd luciferase mRNA (TriLink), met of zonder in vivo electroporatie. Als negatieve controle werd PBS toegediend. L u c ife ra s e s ig n a a l 61 0 7 T o t a le flu x (p /s ) W T: LUC + EP W T: gem od LU C - EP 41 0 7 W T: gem od LUC + EP W T: LU C - EP 21 0 W T: PBS 7 0 8 6 1 1 2 8 6 9 2 7 8 4 2 3 4 2 4 -2 1 0 7 u u r n a e le c tr o p o r a t ie Figuur 18 | In vivo electroporatie induceert een hoge maar transiënte antigeenexpressie. WT C57BL/6 muizen werden i.m. geïnjecteerd met 20 µg luciferase mRNA (TriLink). Er werd zowel ongemodificeerd als gemodificeerd mRNA toegediend. Modificatie werd uitgevoerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Vier uur nadien werd 100 µl Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waarna op verschillende tijdstippen het luciferase signaal werd gemeten gedurende 2 minuten (IVIS lumina II, Xenogen). Het aantal fotonen per seconde op een vooropgesteld oppervlakte werd gemeten. Als negatieve controle werd PBS toegediend. WT: wild type. LUC: luciferase. EP: electroporatie. Gemod: gemodificeerd. PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing. Men kan opmerken dat in vivo electroporatie leidt tot een hoge maar transiënte antigeenexpressie (Fig. 18, rode lijnen). Hiernaast kan men waarnemen dat modificatie van het mRNA geen meerwaarde geeft op vlak van antigeenexpressie wanneer er electroporatie wordt uitgeoefend (Fig. 18, rode lijn met kleinste stipjes). Ter vergelijking werd het luciferase signaal na injectie van PBS weergegeven als negatieve controle. 3.2.5 Antigeenexpressie na DOTAP/DOPE- en RALA-mRNA vaccinatie Aangezien binnen de onderzoekseenheid reeds aangetoond werd dat lipoplexvorming van mRNA met DOTAP/DOPE sterk immunogeen is, werden een lipidegebaseerde strategie (DOTAP/DOPE) en een peptidegebaseerde strategie (RALA) eveneens bestudeerd op vlak van antigeenexpressie. Hiertoe werden WT C57BL/6 muizen in de e.a. geïnjecteerd met 10 µg luciferase mRNA (TriLink) gemodificeerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Acht uur na injectie van het luciferase mRNA werd i.p. 100 µl Firefly D-luciferine geïnjecteerd. Exact 10 minuten later werd het luciferase signaal gedurende twee minuten gemeten. Als negatieve controle werd PBS toegediend. 32 Resultaten Het luciferase signaal acht uur na injectie van gecomplexeerd mRNA wordt weergegeven in Figuur 19. Er werden ROIs geselecteerd met identieke grootte en vergeleken met muizen die geïnjecteerd werden met PBS. RALA LUC DOTAP/DOPE LUC Figuur 19 | Luciferase expressie acht uur na injectie van gecomplexeerd mRNA. WT C57BL/6 muizen werden in de e.a. geïnjecteerd met 10 µg luciferase mRNA (TriLink) gemodificeerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Acht uur nadien werd 100 µl Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waarna exact 10 minuten later het luciferase signaal werd gemeten gedurende 2 minuten (IVIS lumina II, Xenogen). Het aantal fotonen per seconde op een vooropgesteld oppervlakte werd gemeten. LUC: luciferase. Figuur 19 toont dat wanneer mRNA gecomplexeerd wordt met RALA, er geen luciferase signaal merkbaar is. Complexatie van het mRNA met DOTAP/DOPE daarentegen vertoont wel een sterk luciferase signaal. Figuur 20 toont de luciferase expressie acht uur na injectie van mRNA, gecomplexeerd met DOTAP/DOPE of RALA. Ter vergelijking werd het luciferase signaal na injectie van PBS weergegeven als negatieve controle. 33 Resultaten lu c ife ra s e s ig n a a l 21 0 7 T o t a le flu x (p /s ) * 11 0 7 51 0 6 C L D O T A P /D R O A P L E A P L U U B S C 0 Figuur 20 | Kwantificatie van het luciferase signaal acht uur na injectie van gecomplexeerd mRNA. WT C57BL/6 muizen werden in de e.a. geïnjecteerd met 10 µg luciferase mRNA (TriLink) gemodificeerd met Ψuridine, 5-methylcytidine en ARCA. Acht uur nadien werd 100 µl Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waarna exact 10 minuten later het luciferase signaal werd gemeten gedurende 2 minuten (IVIS lumina II, Xenogen). Het aantal fotonen per seconde op een vooropgesteld oppervlakte werd gemeten. Als negatieve controle werd PBS toegediend. Weergegeven resultaten stellen de afzonderlijke metingen voor, het gemiddelde en ± standaarddeviatie. De data werden statistisch geanalyseerd met een one-way anova test. *: p < 0,05. PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing. LUC: luciferase. Figuur 20 toont dat injectie van DOTAP/DOPE-luciferase mRNA resulteerde in een significante luciferase expressie (p < 0,5). Dit in tegenstelling tot injectie van RALA-luciferase mRNA dat net zoals de negatieve controle waarbij PBS toegediend werd, geen luciferase expressie vertoont. 34 Resultaten 3.3 Onderzoek naar de invloed van type I interferonen op antigeenexpressie na in vivo electroporatie 3.3.1 Rol van type I IFN na in vivo electroporatie: IFNAR KO model Na het bestuderen van in vivo electroporatie op vlak van antigeenexpressie werd de invloed van type I IFNn op deze antigeenexpressie bestudeerd. Hoewel type I IFNn de DC maturatie en T-cel priming bevorderen, oefenen ze eveneens een negatief effect uit op de mRNAstabilisatie en translatie door de inductie van antivirale responsen. Zoals reeds aangehaald zullen type I IFNn degradatie van het mRNA induceren door activatie van Rnase-L en zullen ze een translatiestop opwekken door activatie van het proteïne PKR dat de α-subunit van de eIF2 fosforyleert (Pollard et al, 2013b). Om te onderzoeken of deze type I IFNn een effect uitoefenen op de antigeenexpressie na in vivo electroporatie werd de antigeenexpressie bestudeerd door middel van in vivo bioluminescentie imaging in een IFNAR KO model. Deze techniek werd reeds besproken in § 3.2.1. Door de antigeenexpressie te vergelijken tussen WT en IFNAR KO muizen kan de invloed van type I IFNn op antigeenexpressie geanalyseerd worden. In IFNAR KO muizen kan het mRNA wel nog de expressie van type I IFNn activeren, maar deze kunnen niet meer binden op hun IFNAR receptor waardoor de inductie van IFN induceerbare genen zoals PKR en Rnase-L wordt geïnhibeerd. Indien er een verschillend luciferase signaal opgemerkt wordt, dan toont dit aan dat het inhiberen van de type I IFN signalisatie een effect uitoefent op antigeenexpressie na in vivo electroporatie. Een sterk luciferase signaal wijst op een sterke antigeenexpressie. Figuur 21 | Schematische voorstelling van de in vivo bioluminescentie imaging. WT of IFNAR KO muizen werden i.m. geïnjecteerd met 20 µg luciferase mRNA (TriLink), ongemodificeerd of gemodificeerd met Ψuridine, 5-methylcytidine en ARCA. Na injectie van het luciferase mRNA vond i.m. electroporatie plaats. Vier uur later werd Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waana op verschillende tijdspunten het luciferase signaal gemeten werd. Om te onderzoeken wat de invloed van type I IFNn is op antigeenexpressie na in vivo electroporatie werden zowel WT als IFNAR KO C57BL/6 muizen i.m. geïnjecteerd met 20 µg luciferase mRNA (TriLink), ongemodificeerd of gemodificeerd met Ψ-uridine, 535 Resultaten methylcytidine en ARCA (Fig. 21). Na injectie van het mRNA werden de muizen i.m. geëlectroporeerd. Vier uur na injectie van het luciferase mRNA werd i.p. 100 µl Firefly Dluciferine geïnjecteerd (Fig. 21). Hierdoor kan mRNA expressie geanalyseerd worden door in vivo bioluminescentie. Het luciferase signaal werd gedurende twee minuten op verschillende tijdstippen gemeten (4u, 24u, 32u, 48u, 3d, 4d, 5d en 7d na injectie van het luciferase, IVIS lumina II, Xenogen). Als negatieve controle werd PBS toegediend. Het luciferase signaal 24 uur na electroporatie wordt weergegeven in Figuur 22. Er werden ROIs geselecteerd met gelijke grootte en vergeleken met muizen die geïnjecteerd werden met PBS. (-) PBS WT: LUC +EP IFNAR KO: LUC +EP WT: gemod LUC +EP IFNAR KO: gemod LUC +EP Figuur 22 | Luciferase expressie 24 uur na in vivo electroporatie van mRNA. WT of IFNAR KO C57BL/6 muizen werden i.m. geïnjecteerd met 20 µg luciferase mRNA (TriLink). Er werd zowel ongemodificeerd als gemodificeerd mRNA toegediend. Modificatie werd uitgevoerd met Ψuridine, 5-methylcytidine en ARCA. Vier uur nadien werd 100 µl Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waarna op verschillende tijdstippen het luciferase signaal werd gemeten gedurende 2 minuten (IVIS lumina II, Xenogen). Het aantal fotonen per seconde op een vooropgesteld oppervlakte werd gemeten. Als negatieve controle werd PBS toegediend. PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing. IFNAR KO: IFN-α receptor knock out. LUC: luciferase. EP: electroporatie. Gemod: gemodificeerd. Figuur 22 toont dat wanneer er electroporatie van het luciferase mRNA uitgeoefend wordt in IFNAR KO muizen, er een sterker luciferase signaal merkbaar is in vergelijking tot electroporatie van luciferase mRNA bij WT muizen. 36 Resultaten Figuur 23 a en b tonen het effect IFNAR KO op de luciferase expressie na in vivo electroporatie. In deze figuur wordt de invloed van IFNAR KO in de twee groepen, ongemodificeerd of gemodificeerd luciferase mRNA, gevisualiseerd. Een sterk luciferase signaal wijst op sterke luciferase expressie. a) L u c ife ra s e s ig n a a l L u c ife ra s e s ig n a a l IF N A R K O : o n g e m o d L U C + E P 6 .0 1 0 7 1 .5 1 0 8 IF N 1 .0 1 0 8 PB W T: ongem od LUC + EP W T o t a le flu x (p /s ) 2 .0 1 0 7 0 b) IF N A R K O : g e m o d L U C + E P 1 .0 1 0 8 PBS W T: gem od LU C +EP 5 .0 1 0 7 0 8 6 1 1 2 8 6 9 2 7 8 4 2 3 4 - 5 .0 1 0 7 2 2 8 6 9 1 L u c ife ra s e s ig n a a l 1 .5 1 0 8 4 2 u u r n a e le c tr o p o r a t ie LUC + EP T o t a le flu x (p /s ) 7 8 2 4 2 3 4 6 1 1 2 8 8 6 9 2 7 8 4 2 3 4 2 u u r n a e le c tr o p o r a t ie gem od LUC +EP 0 - 5 .0 1 0 7 4 - 2 .0 1 0 7 5 .0 1 0 7 4 T o t a le flu x (p /s ) PBS 4 .0 1 0 7 u u r n a e le c tr o p o r a t ie Figuur 23 | Kwantificatie van het luciferase signaal na in vivo electroporatie van luciferase mRNA in WT en IFNAR KO muizen. WT en IFNAR KO C57BL/6 muizen werden i.m. geïnjecteerd met 20 µg luciferase mRNA (TriLink). Er werd zowel ongemodificeerd als gemodificeerd mRNA toegediend. Modificatie werd uitgevoerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Vier uur nadien werd 100 µl Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waarna op verschillende tijdstippen het luciferase signaal werd gemeten gedurende 2 minuten (IVIS lumina II, Xenogen). Het aantal fotonen per seconde op een vooropgesteld oppervlakte werd gemeten. Als negatieve controle werd PBS toegediend. (a) vergelijkt het luciferase signaal tussen IFNAR KO en WT na electroporatie met ongemodificeerd luciferase mRNA. (b) doet hetzelfde maar voor gemodificeerd luciferase mRNA. IFNAR KO: IFN-α receptor knock out. Ongemod: ongemodificeerd. LUC: luciferase. EP: electroporatie. PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing. Gemod: gemodificeerd. Expressie van zowel ongemodificeerd als gemodificeerd luciferase mRNA is veel hoger in de IFNAR KO conditie in vergelijking tot de WT conditie (Fig. 23). Het luciferase signaal na injectie van PBS wordt weergegeven als negatieve controle. Tot slot worden de verschillende condities met elkaar vergeleken in Figuur 24. Er vond i.m. injectie plaats van zowel WT als IFNAR KO muizen met 20 µg ongemodificeerd of gemodificeerd luciferase mRNA (TriLink), gevolgd door in vivo electroporatie. Als negatieve controle werd PBS toegediend. 37 Resultaten L u c ife ra s e s ig n a a l 1 .5 1 0 8 IF N A R K O : g e m o d L U C + E P T o t a le flu x (p /s ) IF N A R K O : o n g e m o d L U C + E P 1 .0 1 0 8 W T: ongem od LUC + EP W T: gem od LUC + EP PBS 5 .0 1 0 7 0 8 6 1 1 2 8 6 9 2 7 8 4 2 3 4 2 4 - 5 .0 1 0 7 u u r n a e le c tr o p o r a t ie Figuur 24 | Type I IFNn inhiberen de antigeenexpressie na in vivo electroporatie. IFNAR KO en WT C57BL/6 muizen werden i.m. geïnjecteerd met 20 µg luciferase mRNA (TriLink). Er werd zowel ongemodificeerd als gemodificeerd mRNA toegediend. Modificatie werd uitgevoerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Vier uur nadien werd 100 µl Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waarna op verschillende tijdstippen het luciferase signaal werd gemeten gedurende 2 minuten (IVIS lumina II, Xenogen). Het aantal fotonen per seconde op een vooropgesteld oppervlakte werd gemeten. Als negatieve controle werd PBS toegediend. IFNAR KO: IFN-α receptor knock out. Gemod: gemodificeerd. LUC: luciferase. EP: electroporatie. Ongemod: ongemodificeerd. WT: wild type. PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing. Men kan opmerken dat in vivo electroporatie van luciferase mRNA in IFNAR KO muizen (Fig. 24, oranje lijnen) een sterkere antigeenexpressie induceert in vergelijking met electroporatie in WT muizen (Fig. 24, groene lijnen). Hiernaast kan men waarnemen dat modificatie van het mRNA bovendien een meerwaarde geeft op vlak van antigeenexpressie wanneer er electroporatie wordt uitgeoefend in IFNAR KO muizen (Fig. 24, oranje lijn met kleinste stipjes). Ter vergelijking werd het luciferase signaal na injectie van PBS weergegeven als negatieve controle. Voor de lipide- en peptidegebaseerde mRNA-vaccinatie strategie werd eveneens de inductie van IFN-β bestudeerd, zie addendum A.2. 38 Resultaten 3.4 Karakterisatie van de adjuvantscapaciteit van flagelline na in vitro electroporatie 3.4.1 Gebruikte validatietechniek Uit onze vorige resultaten kon men afleiden dat in vivo electroporatie van antigeen coderend mRNA zich niet vertaalt in een sterke inductie van CD8+ T-cel proliferatie hoewel er hoge antigeenexpressielevels opgemerkt worden, zie § 3.1.2 en § 3.2.4. Vandaar wordt er getracht om de hoge antigeenexpressie te combineren met een sterkere activatie en proliferatie van CD8+ T-cellen. We gaan na of de coformulatie van mRNA coderend voor flagelline leidt tot een hogere inductie van het pro-inflammatoire cytokineprofiel na in vitro electroporatie van beenmerg-afgeleide dendritische cellen (BMDCs). Flagelline wordt namelijk herkend door de TLR5 en bevordert hierdoor de cytokineproductie (Rumbo et al, 2006). Hiernaast activeert flagelline het Ipaf inflammasoom in het cytosol waardoor het eiwit de activatie van inflammatoire responsen stimuleert door maturatie van IL-1β via caspase 1 (Miao et al, 2006). Om de transcriptieniveaus van de pro-inflammatoire cytokines IL-6, IL-1β, IFN-β en TNF te bepalen werd een qPCR uitgevoerd. Een qPCR wordt gebruikt om amplificatie van DNA kwantitatief te meten, gebruik makend van fluorescente probes. Het principe van qPCR is gebaseerd op het detecteren van een fluorescent signaal dat optreedt tijdens het amplificatieproces. In dit onderzoek hebben we gebruik gemaakt van SYBR Green I, een DNA-specifiek intercalerende fluorescente molecule. De uitvoering van een qPCR maakt het mogelijk om de transcriptieniveaus van een aantal genen te bepalen door het toedienen van specifieke primers. Met behulp van een qPCR kan de gemiddelde N-voudige inductie weergegeven worden van de transcriptieniveaus van een aantal genen ten opzichte van een negatieve controle. De resultaten worden genormaliseerd ten opzicht van een huishoudgen. Een sterke N-voudige inductie wijst dus op hoge transcriptieniveaus van het betreffende gen. Wanneer coformulatie met flagelline leidt tot sterke inductie van het cytokineprofiel, dan bevestigt dit de hypothese dat flagelline mRNA toegepast kan worden als adjuvant bij in vitro electroporatie. Figuur 25 | Schematische voorstelling van het protocol voor onderzoek naar het pro-inflammatoire cytokineprofiel na in vitro electroporatie met gemodificeerd flagelline mRNA. Op dag 0 werd uit WT C57BL/6 muizen het beenmerg geïsoleerd en werden BMDCs in cultuur gebracht. Op dag 3 en dag 6 werd er vers cRPMI medium toegediend, gesupplementeerd met GM-CSF. Op dag 7 werden de cellen geoogst en per opstelling 6 werden 3 x 10 cellen in vitro geëlectroporeerd met de gewenste condities, afhankelijk van het experiment. Na zes uur incubatie werd een qPCR uitgevoerd. BMDCs: beenmerg-afgeleide dendritische cellen. qPCR: quantitatieve PCR. 39 Resultaten Op dag 0 vond cultivatie van BMDCs plaats (Fig. 25). Hiervoor werd het beenmerg van WT C57BL/6 muizen geïsoleerd en werden BMDCs geïncubeerd in compleet RPMI (cRPMI) medium bij 37°C, 5% CO2. Het medium werd gesupplementeerd met 20 ng/ml granulocytemacrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) dat stamcellen stimuleert om monocyten te produceren die uiteindelijk zullen matureren tot DCn. Op dag 3 en dag 6 werd het medium ververst. Op dag 7 werden de BMDCs in vitro geëlectroporeerd (Fig. 25). Hiertoe werden de nietadherente BMDCs geoogst en per opstelling werden 3 x 106 cellen geëlectroporeerd met de gewenste condities, afhankelijk van het experiment. Na electroporatie werd voor elk staal de inhoud overgebracht naar een 6-wellplaat waarin reeds cRPMI medium werd toegevoegd ter incubatie bij 37°C, 5% CO2. Zes uur later vond analyse van de transcriptieniveaus plaats door middel van qPCR (Fig. 25). De cellen werd geoogst na zes uur incubatie en er werden cellysaten bereid waaruit mRNA geïsoleerd werd. Tenslotte werd een qPCR uitgevoerd nadat cDNA werd aangemaakt van het geïsoleerde mRNA (LightCycler480, Roche). Normalisatie werd uitgevoerd met het stabiele huishoudgen mitochondrial ribosomal protein 13a (mRPL 13a). 3.4.2 Pro-inflammatoire cytokineprofiel Om te bestuderen of de coformulatie van mRNA coderend voor flagelline leidt tot een hogere inductie van het pro-inflammatoire cytokineprofiel werden BMDCs op verschillende wijzen getransfecteerd. Enerzijds vond transfectie plaats met 2,5 µg OVA mRNA. Anderzijds werd getransfecteerd met 5 µg flagelline mRNA. Voor het testen van de adjuvantscapaciteit van flagelline werd eveneens getransfecteerd met een coformulatie van 2,5 µg OVA mRNA samen met 5 µg flagelline mRNA. Na transfectie werden de BMDCs geëlectroporeerd. Als positieve controle vond electroporatie plaats met 2,5 µg OVA mRNA dat opgezuiverd werd door middel van LiCl precipitatie. Deze opzuiveringstechniek leidt tot precipitatie van alle nucleotiden, ook van de niet ingebouwde nucleotiden. Als negatieve controle vond transfectie plaats met PBS, gevolgd door electroporatie. Voorts werden eveneens BMDCs getransfecteerd met PBS zonder het uitvoeren van electroporatie nadien, als extra negatieve controle. Figuur 26 geeft de N-voudige inductie van de pro-inflammatoire cytokines weer na in vitro electroporatie. De N-voudige inductie van de transcriptieniveaus werd bepaald ten opzichte van transfectie met PBS, de negatieve controle. Normalisatie vond plaats ten opzichte van het huishoudgen mRPL 13a. Een sterke N-voudige inductie wijst op hoge transcriptieniveaus van het betreffende gen. 40 Resultaten a) c) b) d) Figuur 26 | Transcriptieniveaus van pro-inflammatoire cytokines na in vitro electroporatie. Per opstelling 6 werden 3 x 10 BMDCs in vitro geëlectroporeerd met de gewenste condities, afhankelijk van het experiment. Na zes uur incubatie werden de transcriptieniveaus bepaald via qPCR (LightCycler480, Roche). De resultaten stellen de gemiddelde N-voudige inductie weer van biologische duplicaten t.o.v. PBS getransfecteerde stalen ± standaarddeviatie. Normalisatie t.o.v. het huishoudgen mRPL 13a. IL: interleukine. IFN: interferon. TNF: tumor necrosis factor. OVA: ovalbumine. Flag: flagelline. EP: electroporatie. PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing. Merkbaar is dat de positieve controle slechts een zwakke inductie (Fig. 26 a, b en d) of geen inductie (Fig. 26 c) vertoont op het transcriptieniveau van de betreffende cytokines. Dit is onverwacht aangezien hier getransfecteerd werd met 5 µg OVA mRNA dat opgezuiverd werd door middel van LiCl precipitatie. Deze opzuiveringstechniek leidt tot precipitatie van alle nucleotiden, ook van de niet ingebouwde nucleotiden, dus hier verwacht men een hoge inductie van de cytokines. Verder valt ook op te merken dat transfectie met 5 µg gemodificeerd flagelline mRNA eveneens slechts een zwakke inductie (Fig. 26 a, b en d) of geen inductie (Fig. 26 c) veroorzaakte van het transcriptieniveau van de betreffende cytokines. Dit is tevens 41 Resultaten onverwacht aangezien flagelline de TLR5 bindt en de cytokineproductie hierdoor stimuleert. Uit de resultaten lijkt het dat het flagelline mRNA niet tot expressie is gekomen. Wanneer men de coformulatie van 2,5 µg gemodificeerd OVA mRNA met 5 µg gemodificeerd flagelline mRNA bestudeert dan wordt inderdaad slechts een lichte stijging in de inductie van de betreffende cytokines opgemerkt. Om een conclusie te kunnen trekken uit deze gegevens werd een Western blot uitgevoerd om de expressielevels van het flagelline mRNA na te gaan. 3.4.3 Expressieniveau flagelline mRNA Om de functionaliteit van het ontworpen flagelline te testen wordt nagegaan via een Western blot in welke mate het tot expressie komt. Om concrete conclusies te trekken uit de qPCR data is het belangrijk te controleren of het flagelline mRNA wel tot expressie is gekomen. Een Western blot wordt gebruikt om een specifiek eiwit in een mengsel van eiwitten te detecteren met behulp van primaire en secundaire antilichamen. Het secundaire antilichaam is gelabeld met horseradish peroxidase (HRP) en produceert licht wanneer chemiluminescente substraten toegediend worden. Wanneer dus een lichtsignaal opgemerkt wordt na de toediening van specifieke antilichamen die het eiwit van interesse binden, toont dit expressie van het eiwit van interesse aan. Figuur 27 | Schematische voorstelling van het protocol voor het bestuderen van het expressieniveau van flagelline mRNA na in vitro electroporatie. Op dag 0 werd uit WT C57BL/6 muizen het beenmerg geïsoleerd en 6 werden 3 x 10 BMDCs in cultuur gebracht. Op dag 3 en dag 6 werd er vers cRPMI medium toegediend, 6 gesupplementeerd met GM-CSF. Op dag 7 werden de cellen geoogst en per opstelling werden 3 x 10 cellen in vitro geëlectroporeerd met de gewenste condities, afhankelijk van het experiment. Na 20 uur incubatie werd een Western blot uitgevoerd. BMDCs: beenmerg-afgeleide dendritische cellen. Voor het nagaan van de flagelline expressie werden eveneens BMDCs in cultuur gebracht (Fig. 27). Op dag 7 werden 3 x 106 cellen in vitro geëlectroporeerd werden met verschillende dosissen flagelline mRNA (Fig. 27). Zo vond electroporatie plaats met 2,5 µg; 5 µg of 10 µg gemodificeerd flagelline mRNA. Als negatieve controle werd er getransfecteerd met PBS. De stalen werden geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2. Na 20 uur incubatie werden de cellen geoogst en werden cellysaten bereid. Hierna werd een Western blot (WB) uitgevoerd (Fig. 27). De flagelline pDNA sequentie die omgezet werd in mRNA via in vitro transcriptie bevat Nterminaal een Myc-tag. Hierdoor is het mogelijk om via een Western blot de expressielevels van het flagelline mRNA na te gaan met behulp van een anti-Myc antilichaam. Als primair 42 Resultaten antilichaam werd geïncubeerd met het mouse anti-Myc tag antilichaam en als secundair antilichaam werd het ECL anti-mouse IgG HRP linked antilichaam toegediend. Analyse van de WB vond plaats met de Amersham Imager 600, GE Healthcare Bio-Sciences. Figuur 28 geeft het resultaat van de WB weer. a) kDa 250 150 100 75 50 37 10 µg Flag 5 µg Flag 2,5 µg Flag PBS Actine 42 kDa 25 b) kDa 250 150 100 75 50 Flagelline 52 kDa 37 25 10 µg Flag 5 µg Flag 2,5 µg Flag PBS 6 Figuur 28 | Expressieniveaus van flagelline mRNA na in vitro electroporatie. Per opstelling werden 3 x 10 BMDCs in vitro geëlectroporeerd met de gewenste condities, afhankelijk van het experiment. Na 20 uur incubatie werden de expressieniveaus van het flagelline mRNA bepaald via WB (Amersham Imager 600, GE Healthcare Bio-Sciences). (a) geeft het expressieniveau van het huishoudgen actine weer. (b) geeft het expressieniveau van het flagelline mRNA weer. Flag: flagelline. PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing. Als controle werd de aanwezigheid van het huishoudgen actine onderzocht, wat duidelijk tot expressie kwam (Fig. 28 a). Het is duidelijk dat het flagelline mRNA niet tot expressie kwam (Fig. 28 b). 43 Discussie Deel 4 Discussie mRNA-gebaseerde vaccinatiestrategie voor het induceren van CTL responsen De laatste jaren is er veel onderzoek gevoerd en vooruitgang geboekt in het veld van nucleïnezuurgebaseerde vaccinatie met oog op inductie van cellulaire immuunresponsen. Zo is voor de bestrijding van intracellulaire infectieziekten zoals HIV, net zoals de bestrijding van kanker een cellulair immuunantwoord vereist voor een efficiënte afweerreactie. In tegenstelling tot eiwitgebaseerde vaccins zijn nucleïnezuurgebaseerde vaccins wel in staat om CTL immuunresponsen op te wekken (Liu, 2010). mRNA-gecodeerde antigenen ondergaan namelijk in het cytosol proteasomale degradatie en worden vervolgens gepresenteerd aan CD8+ T-cellen. Eiwitgecodeerde antigenen daarentegen worden na opname door DCn afgebroken door endolysomale proteasen en worden vervolgens gepresenteerd aan CD4+ T-cellen (Pollard et al, 2013a). Dankzij de moleculaire identificatie van TAAs werd antigeen-specifieke kankervaccinatie mogelijk waarbij een immuunreactie opgebouwd wordt tegen het toegediende TAA, gecodeerd door mRNA (Madan & Gulley, 2015; Palucka & Banchereau, 2012). Het uiteindelijke doel van therapeutische kankervaccinatie is het opwekken van een antitumorale CD8+ T-celrespons die leidt tot tumorregressie. In vergelijking tot DNA of virale vectoren ontwikkelde mRNA-vaccinatie zich tot een veelbelovend en veilig alternatief door de afwezigheid van het risico op genoomintegratie (Kallen & Thess, 2014; Kreiter et al, 2011; Pascolo, 2008). Hiernaast resulteert immunisatie met mRNA in een transiënte expressie van het eiwit waardoor de blootstelling aan het antigeen meer gecontroleerd is en het risico voor tolerantie ook lager is (Kreiter et al, 2011; Pollard et al, 2013b). Bovendien kunnen er indien gewenst verscheidene modificaties eenvoudig worden aangebracht en vindt antigeentranslatie van het mRNA plaats in het cytosol waardoor transfectie van trage, niet delende cellen zoals DCn mogelijk is (Bettinger et al, 2001; Schlake et al, 2012). Al deze factoren maken het toedienen van mRNA-vaccins een aantrekkelijke optie binnen het kader van kankervaccinatie. In vivo electroporatie, een potentiële mRNA-vaccinatie strategie Er zijn verschillende vaccinatiestrategieën toepasbaar om nucleïnezuurgebaseerde vaccins efficiënt naar hun doelwitcellen te transfereren. Deze strategieën oefenen een grote invloed uit op de sterkte van de CTL responsen, wat mede aan de basis ligt van de anti-tumorale efficiëntie van het vaccin. De onderzoekseenheid heeft al heel wat ervaring met lipidegebaseerde mRNA-vaccins waarbij mRNA gecomplexeerd wordt met DOTAP/DOPE ter vorming van lipoplexen. Zo werd reeds aangetoond dat immunisatie met DOTAP/DOPE gecomplexeerd mRNA sterke, antigeenspecifieke T-cel responsen induceert maar dat type I IFNn de expressie van het antigeencoderend mRNA inhiberen (Pollard et al, 2013b). Naast een lipidegebaseerde strategie is ook een peptidegebaseerde vaccinatiestrategie toepasbaar waarbij nanopartikels gevormd worden na interactie tussen het mRNA en een bepaalde peptidesequentie zoals RALA. 44 Discussie In dit project trachten we in vivo electroporatie te bestuderen als een nieuwe mRNAvaccinatie strategie voor het induceren van CD8+ T-cel proliferatie. Een geschikte vaccinatie strategie moet een hoge antigeenexpressie induceren in aanwezigheid van een sterke activatie van het immuunantwoord. In de literatuur werd reeds beschreven dat in vivo electroporatie als pDNA-vaccinatie strategie werkzaam is binnen het kader van gentherapie en vaccinatie (Burgain-Chain, 2013; Kutzler & Weiner, 2008). De vraag of deze methode ook potentieel biedt voor het toedienen van mRNA-vaccins is nog niet beantwoord. In vivo electroporatie leidt niet tot CD8+ T-cel proliferatie In het eerste gedeelte van dit project werd nagegaan of in vivo electroporatie van antigeen coderend mRNA CD8+ T-cel proliferatie induceert. Het doel van therapeutische kankervaccinatie is immers het opwekken van een anti-tumorale CD8+ T-celrespons. De in vivo studies toonden aan dat in vivo electroporatie noch in de ear pinna noch intramusculair CD8+ T-cel proliferatie induceert in de drainerende lymfeknopen, in tegenstelling tot immunisatie met DOTAP/DOPE gecomplexeerd mRNA dat wel een sterke CD8+ T-cel proliferatie vertoont. Immunisatie met RALA gecomplexeerd mRNA vertoonde eveneens CD8+ T-cel proliferatie, weliswaar indien het mRNA gemodificeerd werd. De observatie dat in vivo electroporatie van mRNA geen CD8+ T-cel proliferatie induceert, is onverwacht aangezien in de literatuur reeds beschreven werd dat electroporatie van pDNA wel CD8+ T-cel proliferatie stimuleert en sterk immunogeen is (Lee et al, 2015; Paster et al, 2003; Vandermeulen et al, 2015). Electroporatie induceert namelijk schade aan het weefsel waardoor DAMPs opgewekt worden. Deze gevarensignalen gaan APCn activeren wat een efficiënte antigeenpresentatie toelaat (Babiuk et al, 2004; Murtaugh & Foss, 2002). Hiernaast stimuleert electroporatie locale inflammatie waardoor pro-inflammatoire chemokines en stressgenen geactiveerd worden (Chiarella et al, 2008; Fagone P. et al, 2011; Peng et al, 2007; Wang et al, 2014). Bovendien worden na electroporatie eveneens immuuncellen zoals inflammatoire monocyten en macrofagen naar de administratieplaats gerecruteerd (Chiarella et al, 2008; Fagone P. et al, 2011; Liu et al, 2008b; Peng et al, 2007; Wang et al, 2014). Een potentiële verklaring voor deze tegenstrijdigheid is de mogelijkheid dat het geëlectroporeerde mRNA niet herkend wordt door de TLRs en zo geen immuunsignalisatie induceert. Door het uitvoeren van electroporatie wordt het mRNA namelijk meteen in het cytosol getransfereerd (Luft & Ketteler, 2015; Yamamoto et al, 2009). Nanopartikels daarentegen (mRNA complexen met DOTAP/DOPE of RALA) worden door de cel opgenomen door middel van endocytose waardoor het mRNA herkend wordt door de endosomale TLRn. Bijgevolg kan het immuunsysteem wel geactiveerd worden (Luft & Ketteler, 2015; Ziello et al, 2010). Daarnaast kan een verschillend immuunantwoord optreden afhankelijk van welk type cellen het mRNA-vaccin gaan opnemen. Zo bestaat er de mogelijkheid dat mRNA na electroporatie voornamelijk wordt opgenomen door structurele cellen en dat nanopartikels (mRNA complexen met DOTAP/DOPE of RALA) hoofdzakelijk APCn zoals DCn binnendringen en zo een sterk immuunantwoord kunnen induceren (Ludewig et al, 2000; Zhao et al, 2014). 45 Discussie Voorts bestaat er de mogelijkheid dat electroporatie van antigeencoderend mRNA een tolerantie opwekt tegen het gecodeerde eiwit en zo immuunactivatie vermijdt. Dit werd door Mingozzi et al. reeds beschreven na het toedienen van een transgen met behulp van een adenovirale vector binnen het kader van gentherapie (Mingozzi et al, 2003). Vandaar is het belangrijk om in de toekomst een prime en boost experiment uit te voeren aangezien in dit experiment slechts éénmalig geïmmuniseerd werd. Door het toedienen van een oplosbaar antigeencoderend eiwit een aantal dagen na in vivo electroporatie met hetzelfde antigeencoderend mRNA, kan onderzocht worden of in vivo electroporatie van mRNA een antigeenspecifieke immunologische tolerantie induceert of niet. Bovendien is een rekrutering van APCn naar het lymfoïde weefsel een noodzakelijke eerste stap voor T-cel priming. Vandaar zou in een toekomstig experiment de influx van APCn naar de drainerende lymfeknopen achterhaald kunnen worden met behulp van flow cytometrie. Deze resultaten werden bekomen via een OT-I proliferatie assay waarbij de celdeling van OVA-specifieke CD8+ T-cellen bestudeerd wordt met behulp van flow cytometrie. Alternatief kan met een in vivo killing assay de overleving en afdoding van antigeenspecifieke doelwitcellen bestudeerd worden. Antigeenspecifieke T-cel responsen kunnen eveneens bestudeerd worden met een ELISPOT of via tetrameer staining. Met behulp van een ELISPOT kan men in vitro onderzoeken of er functionele CD8+ T-cellen opgewekt worden. Een tetrameer staining wordt toegepast op bloed dus deze techniek maakt gebruik van nietlymfoïde cellen. Uit de supplementaire data kon men concluderen dat wanneer het mRNA gecomplexeerd wordt met het RALA-peptide er slechts een sterke CD8+ T-cel proliferatie optreedt indien het mRNA gemodificeerd werd met Ψ-uridine en 5-methylcytidine. Dit toont aan dat het RALApeptide op zich hier de adjuvantcapaciteit bezit aangezien mRNA-modificatie type I IFN signalisatie inhibeert en zo het immunogene karakter van het mRNA weghaalt. Type I IFNn stimuleren namelijk T-cel proliferatie, overleving en differentiatie, belangrijk voor de cellulaire immuniteit (Huber & Farrar, 2011; Tough, 2012). Complexatie van het mRNA met DOTAP/DOPE daarentegen vertoonde wel een sterke CD8+ T-cel proliferatie na immunisatie met ongemodificeerd mRNA, wat aantoont dat hier het mRNA zelf immunogeen is en het adjuvanteffect bezit. Afhankelijk van de carrier wordt het immuunsysteem dus op een verschillende manier geactiveerd. In vivo electroporatie induceert een transiënte antigeenexpressie Aangezien in vivo electroporatie geen CD8+ T-cel deling induceert hebben we onderzocht of een zwakke antigeenexpressie hiervan de oorzaak is. Vooraleer het antigeen via MHC-I moleculen gepresenteerd kan worden aan de immature CD8+ T-cellen moet het antigene mRNA namelijk tot expressie komen in het cytosol (Babiuk et al, 2004). De antigeenexpressie werd bestudeerd met behulp van in vivo bioluminescentie imaging waarbij de expressie van luciferase coderend mRNA geanalyseerd wordt door het toedienen van D-luciferine. Uit de resultaten kon men algemeen concluderen dat intramusculaire in vivo electroporatie een hoge maar transiënte expressie induceert in vergelijking tot naakt mRNA zonder electroporatie. Dit stemt overeen met een studie van Roos et al. waarin intradermale in vivo electroporatie van pDNA eveneens een sterke expressie induceert (Roos 46 Discussie et al, 2009). Bovendien wezen onze resultaten aan dat reeds vier uur na electroporatie van het mRNA verhoogde luciferaselevels op te merken waren, wat aantoont dat er een snelle, efficiënte translatie van het gecodeerde eiwit plaatsvond. Dit toont aan dat electroporatie gepaard gaat met een hoge transfectie-efficiëntie en dat een zwakke antigeenexpressie niet aan de basis ligt van de afwezigheid van een immuunantwoord na in vivo electroporatie van antigeen coderend mRNA. mRNA-modificatie biedt geen meerwaarde op vlak van antigeenexpressie na in vivo electroporatie Herkenning van exogeen mRNA door onder andere TLR3 en TLR7 induceert een snelle secretie van type I IFNn dat resulteert in degradatie van het mRNA en translatie-inhibitie door activatie van respectievelijk Rnase-L en het PKR proteïne (Ceppi et al, 2005; Kariko et al, 2004; Pollard et al, 2013b). Naast de activatie van het aangeboren immuunsysteem stimuleren de type I IFNn eveneens T-cel proliferatie, overleving en differentiatie, belangrijk voor de cellulaire immuniteit (Huber & Farrar, 2011; Tough, 2012). Door het aanbrengen van modificaties aan het mRNA kan de type I IFN respons gereduceerd worden waardoor het mRNA stabieler wordt. Door modificaties aan het transcript aan te brengen zoals Ψ-uridine en 5-methylcytidine worden de meeste TLRs niet meer geactiveerd (Kariko et al, 2008). Het mRNA wordt eveneens minder herkend door RIG-I waardoor IFN signalisatie gereduceerd wordt (Kormann et al, 2011). Zo kan activatie van Rnase-L en PKR geïnhibeerd worden waardoor het mRNA stabieler wordt (Anderson et al, 2010; Kariko et al, 2008). Om deze zaken te confirmeren op vlak van in vivo electroporatie werd allereerst het effect van electroporatie op antigeenexpressie van zowel ongemodificeerd als gemodificeerd mRNA geanalyseerd. De resultaten toonden aan dat er een hogere expressie waarneembaar was van ongemodificeerd luciferase mRNA wanneer electroporatie uitgevoerd werd in vergelijking tot geen electroporatie. Electroporatie biedt dus een voordeel op vlak van expressie van ongemodificeerd mRNA. Deze resultaten bevestigen dat ongemodificeerd mRNA minder stabiel is. Additioneel werd het effect van electroporatie op expressie van gemodificeerd mRNA bestudeerd. We konden vaststellen dat expressie van gemodificeerd luciferase mRNA minder afhankelijk is van electroporatie. Dit confirmeert eveneens dat gemodificeerd mRNA stabieler is. Electroporatie verleent in dit geval geen meerwaarde op vlak van expressie. Voorts werd het effect van mRNA-modificatie op antigeenexpressie na in vivo electroporatie bestudeerd. De resultaten toonden aan dat er geen groot verschil optreedt tussen de expressie van ongemodificeerd en gemodificeerd luciferase mRNA na het uitvoeren van electroporatie. Modificatie van het mRNA geeft dus geen meerwaarde op vlak van antigeenexpressie wanneer er electroporatie wordt uitgeoefend. Ter vergelijking werd onderzocht hoe sterk het gemodificeerde luciferase mRNA tot expressie kwam na complexatie met DOTAP/DOPE of RALA. Complexatie van gemodificeerd mRNA met DOTAP/DOPE induceerde een sterke antigeenexpressie in tegenstelling tot complexatie met RALA. Dit toont aan dat de expressie van lipoplexen positief beïnvloed wordt door mRNA-modificatie. Dit stemt overeen met een studie van Pollard et al. waarin 47 Discussie beschreven werd dat er slechts een zwakke expressie plaatsvond van ongemodificeerd DOTAP/DOPE-mRNA doordat type I IFNn de expressie inhiberen (Pollard et al, 2013b). Er kan geconcludeerd worden dat in vivo electroporatie een hoge, transiënte antigeenexpressie induceert en dat electroporatie enkel een meerwaarde biedt op vlak van antigeenexpressie wanneer geëlectroporeerd wordt met ongemodificeerd mRNA in tegenstelling tot electroporatie van gemodificeerd mRNA. Tot slot werd ook opgemerkt dat mRNA-modificatie geen voordeel biedt op vlak van antigeenexpressie wanneer electroporatie wordt uitgevoerd. Type I interferonen inhiberen antigeenexpressie na in vivo electroporatie van mRNA Naast het bestuderen van de invloed van mRNA-modificatie op antigeenexpressie werd onderzocht of de type I IFNn wel degelijk de antigeenexpressie inhiberen na in vivo electroporatie. Zoals reeds vermeld resulteren type I IFNn in degradatie van het mRNA door activatie van Rnase-L en induceren ze translatie-inhibitie door middel van het PKR proteïne (Ceppi et al, 2005; Kariko et al, 2004; Pollard et al, 2013b). Hiertoe werd de antigeenexpressie geanalyseerd in IFNAR KO muizen. In deze muizen kan het mRNA wel nog de expressie van type I IFNn activeren maar deze kunnen niet meer binden op hun receptor (IFNAR) waardoor de inductie van IFN induceerbare genen zoals PKR en Rnase-L wordt geïnhibeerd. In de IFNAR KO conditie werd een sterkere antigeenexpressie waargenomen in vergelijking met de WT conditie. Hiernaast kon men waarnemen dat modificatie van het mRNA bovendien een meerwaarde geeft op vlak van antigeenexpressie wanneer er electroporatie wordt uitgeoefend in IFNAR KO muizen. Deze resultaten tonen aan dat type I IFNn wel degelijk mRNA expressie inhiberen na in vivo electroporatie en zo negatief kunnen interfereren met de geïnduceerde T-cel responsen. Om dit te confirmeren kunnen in een toekomstig experiment de effecten van deze type I IFNn bestudeerd worden door het uitvoeren van een in vivo killing assay in IFNAR KO muizen. Andere factoren zoals IL-12 kunnen namelijk eveneens T-cel differentiatie drijven waardoor type I IFN signalisatie niet noodzakelijk is voor de differentiatie van CD8+ T-cellen naar cytotoxische T-cellen (Athie-Morales et al, 2004). Hiernaast kan een therapeutisch tumorexperiment uitgevoerd worden in WT versus IFNAR KO muizen om te onderzoeken of de negatieve effecten van de type I IFNn op antigeenexpressie domineren over de positieve effecten, namelijk het reduceren van tumorgroei. Type I IFNn kunnen immers apoptose van kwaadaardige tumorcellen induceren enerzijds door cytotoxische effecten uit te oefenen en anderzijds door tumorsuppressor genen en anti-angiogenese te induceren (Herzer et al, 2009; Papageorgiou et al, 2007; Thyrell et al, 2002). Verder werd reeds aangetoond dat type I IFN signalisatie, NK cellen en plamsacytoïde DCn activeert die uiteindelijk de tumorcellen gaan elimineren (Drobits et al, 2012; Liu et al, 2008a). Tenslotte kan de inductie van IFN-β na in vivo electroporatie van zowel ongemodificeerd als gemodificeerd antigeen coderend mRNA in IFN-β luciferase repotermuizen geanalyseerd worden. Deze reportermuizen bevatten het luciferase gen voorafgegaan door de IFN-β promotor. In het geval dat IFN-β geïnduceerd wordt, komt het luciferase gen tot expressie. 48 Discussie Flagelline mRNA als adjuvant voor het induceren van een sterk immuunantwoord na in vivo electroporatie We hebben reeds aangetoond dat in vivo electroporatie van antigeen coderend mRNA geen CD8+ T-cel proliferatie induceert hoewel de techniek een hoge antigeenexpressie stimuleert. Aangezien DAMP vrijstelling door electroporatie onvoldoende is om immuunantwoorden op te wekken hadden we als doel te onderzoeken of het toedienen van mRNA coderend voor flagelline, een immuunactiverend eiwit, leidt tot een hogere inductie van het proinflammatoire cytokineprofiel. Flagelline wordt herkend door de TLR5 en bevordert hierdoor de cytokineproductie (Rumbo et al, 2006). De toevoeging van TLR liganden is een veelgebruikte strategie om de doeltreffendheid van eiwitgebaseerde of nucleïnezuurgebaseerde vaccins te verhogen (Lahiri et al, 2008). Activatie van de TLR5 mobiliseert NF-κB en stimuleert onder andere TNF productie. Hiernaast activeert flagelline het Ipaf inflammasoom in het cytosol wat leidt tot maturatie van IL-1β via caspase 1 waardoor inflammatoire responsen gestimuleerd worden (Miao et al, 2006). De transcriptieniveaus van de pro-inflammatoire cytokines IL-6, IL-1β, IFN-β en TNF werden bepaald met behulp van een qPCR. Om de functionaliteit van het ontworpen flagelline te testen werd nagegaan via een Western blot in welke mate het tot expressie kwam. De Western blot toonde aan dat het flagelline mRNA niet tot expressie kwam waardoor de qPCR data niet bruikbaar zijn. Vandaar kunnen er geen conclusies getrokken worden en moet dit experiment herhaald worden. Vooraleer het experiment herhaald kan worden moet onderzocht worden waarom er geen expressie plaatsvond. De grootte van het mRNA werd reeds gecontroleerd door agarose gel electroforese en bleek in orde te zijn. Hiernaast kan het plasmide waaruit het mRNA aangemaakt werd, gesequeneerd worden om te controleren of het startcodon, de leader sequentie, het stopcodon en splicingsites aanwezig zijn, allen noodzakelijk voor een efficiënte translatie. In vivo electroporatie binnen het kader van gentherapie Samenvattend tonen deze bevindingen aan dat in vivo electroporatie niet geschikt is voor vaccinatiedoeleinden aangezien de hoge antigeenexpressie niet vertaald wordt in een sterk immuunantwoord. Vandaar is in vivo electroporatie een ideale techniek voor gentherapie waarbij een transiënte transgenexpressie vereist wordt in de afwezigheid van interfererende immuunresponsen. Tijdens gentherapie wordt genetisch materiaal (DNA of mRNA) toegediend waarmee men wenst een ziekte te voorkomen of de progressie van een bepaalde ziekte te vertragen. Het is een alternatief voor het toedienen van drugs of het uitvoeren van operaties. Het gebruik van lipoplexen voor het toedienen van antigeen coderend mRNA wordt dus verkozen boven in vivo electroporatie als vaccinatie strategie door zijn sterke immunogene eigenschappen. Om in vivo electroporatie toepasbaar te maken als vaccinatie strategie moet men verder op zoek gaan naar een geschikt adjuvant dat toelaat een sterk immuunantwoord te induceren. De eerste stappen voor onderzoek naar flagelline mRNA als een potentieel adjuvant tijdens in vivo electroporatie van een mRNA-vaccin werden reeds gezet. 49 Discussie Verder onderzoek naar in vivo electroporatie, hetzij als gentherapie, hetzij als vaccinatie strategie, kan ons veel bijbrengen over een efficiënte bestrijding van een breed spectrum aan ziektes. Als gentherapie kan de techniek toegepast worden voor het toedienen van transgen coderend mRNA waarvan een transiënte expressie vereist is. Hiernaast kan, indien een geschikt adjuvant gevonden wordt, de techniek toegepast worden voor het toedienen van mRNA-vaccins tegen zowel kanker als infectieziektes waarbij een cellulair immuunantwoord vereist is voor een efficiënte, beschermende immuunrespons. 50 Materialen en methoden Deel 5 Materialen en methoden 5.1 Muizen Er werd gewerkt met C57BL/6 muizen van 8-12 weken oud aangekocht van Janvier (Le Genest Saint Isle, Frankrijk). Hiernaast werd ook gewerkt met IFN-β luciferase reportermuizen en OT-I muizen die gekweekt werden in de DMBR Transgenic Mice Core Facility in het Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB). IFN-β luciferase reportermuizen bevatten het luciferase gen voorafgegaan door de IFN-β promotor. OT-I muizen bevatten CD8+ T-cellen die een TCR expresseren dat specifiek OVA-residuen gebonden op MHC-I herkent. Alle experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie voor dierproeven (Universiteit Gent, België) en werden uitgevoerd volgens hun richtlijnen. De muizen werden gehuisvest in individueel geventileerde kooien, in specific pathogen free (SPF) condities. Ze werden blootgesteld aan een 14u-10u dag-nacht cyclus en werden ad libitum gevoed. 5.2 Genotypering Voor de genotypering werd per muis een teentje of een tipje van de staart afgeknipt en hieruit werd DNA geïsoleerd door incubatie bij 56°C met proteïnasen. Door toevoegen van isoporopanol werd het DNA geprecipiteerd. Een PCR werd uitgevoerd met het Taq DNA polymerase (5U / µl, Invitrogen). Door middel van DNA electroforese werd het genotype van de muizen achterhaald. De PCR werd uitgevoerd op de PTC-200 Peltier Thermal Cycler (BioRad) 5.3 mRNA aanmaak Voor de aanmaak van het mRNA (luciferase, OVA, flagelline) werden competente E. coli bacteriën (MC 1061) getransformeerd met een plasmide dat codeert voor het betreffende gen en verschillende restrictie-enzymsites bevat. De pDNAs die gebruikt werden zijn: pGEM4Z / HBB / luciferase / UTR / A60; pGEM4Z / HBB / ovalbumine / UTR / A60 en pGEM4Z / HBB / flagelline / UTR / A60. Een deel van deze bacteriecultuur werd afgezonderd om het plasmide te isoleren met de Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Kit (Promega). Het plasmide werd gelineariseerd door restrictie met het SpeI enzyme (10 U / µl, Promega) en opgezuiverd met de QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). Het DNA werd omgezet in mRNA met behulp van de T7 MEGAscript Ambion kit die gebruik maakt van de T7 promoter om via in vitro transcriptie het pDNA om te zetten in mRNA. Het geproduceerde mRNA werd opgezuiverd met de MEGAClear Kit Procedure (Ambion) of door LiCl mRNA precipitatie, afhankelijk van het experiment. Het mRNA werd voor sommige opstellingen gemodificeerd 51 Materialen en methoden met 5-methylcytidine (100mM, TriLink), ᴪ-uridine (100mM,TriLink) en ARCA (100mM, Ambion) om de stabiliteit van het mRNA te verhogen en een hogere translatie te verzekeren. 5.4 Cultivatie van beenmerg-afgeleide dendritische cellen Op dag 0 werd een WT C57BL/6 muis ge-euthanaseerd door cervicale dislocatie en het bovenbeen (femur) en onderbeen (tibia) werden verwijderd. Hierna werd het beenmerg geïsoleerd door het flushen van de beentjes met PBS (Lonza BioWhittaker). Een homogene celsuspensie werd bekomen door het op en neer pipetteren met behulp van een naald (26G). Resterend debris werd verwijderd door de celsuspensie over een cellstrainer (Falcon, ø 70 µm) te halen. Rode bloedcellen werden verwijderd door het staal te behandelen met ACK hypotonische lyse buffer (Lonza BioWhittaker). De cellen werden gecentrifugeerd (7 minuten, 4°C en 400 g) waarna de pellet geresuspendeerd werd met cRPMI medium en het celaantal bepaald werd door het tellen met behulp van een Bürker telraam. Per petriplaat (Nunc, ø 90 mm) werden 3 x 106 cellen uitgeplaat en aangelengd tot 10ml met cRPMI medium gesupplementeerd met GM-CSF (Protein Service Facility, VIB) in een finale concentratie van 20 ng/ml. De cellen werden in de incubator geplaatst bij 37°C, 5% CO2. Het cRPMI medium bevat RPMI-1640 (GIBCO), gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum (FCS, SigmaAldrich), 250x natrium pyruvaat LPS- (Lonza), 500x penicilline/streptomycine (Lonza) en 100x glutamine (Lonza). Op dag 3 werd het medium ververst door toevoegen van 10 ml vers cRPMI waarin GM-CSF werd toegevoegd aan 20 ng/ml. Op dag 6 werd 10 ml medium afgenomen en gecentrifugeerd (7 minuten, 4°C en 400 g) waarna de pellet geresuspendeerd werd in vers 10 ml cRPMI medium waarin GM-CSF werd toegevoegd aan 10 ng/ml. Op dag 7 werden de niet-adherente BMDCs geoogst door de petriplaten twee maal te wassen met ijskoude PBS (Lonza BioWhittaker). 5.5 In vitro electroporatie BMDCs Na het oogsten van de niet-adherente BMDCs op dag 7 werden de cellen gecentrifugeerd (7 minuten, 4°C en 400 g) waarna de celpellet geresuspendeerd werd in Opti-MEM medium (Gibco). De cellen werden geteld met behulp van een Bürker telraam. Per opstelling werden 3 x 106 cellen getransfecteerd met de gewenste condities, afhankelijk van het experiment, door in vitro electroporatie met de Bio-Rad Electroporator (instellingen: exponentional; V = 300 V; Cap = 150 µF; Res: oneindig; cuvette: 4 mm). Na electroporatie werd voor elk staal de inhoud van het cuvetje overgebracht naar een 6-wellplaat (Falcon) waarin reeds cRPMI medium werd toegevoegd ter incubatie bij 37°C, 5% CO2. 5.6 In vivo bioluminescentie imaging C57BL/6 muizen werden verdoofd met isofluraan (100% IsoFlo, Abbott, 4% inductie en 3% onderhoud). Hierna volgde injectie van het ongemodificeerd luciferase mRNA (L-6307, 52 Materialen en methoden TriLink) of gemodificeerd luciferase mRNA (L- 6107, TriLink). Ten eerste werd luciferase mRNA geïnjecteerd dat gecomplexeerd werd met DOTAP/DOPE, zie § 5.7. Ten tweede werden mRNA-RALA partikels geïnjecteerd, zie § 5.8. Ten derde werd luciferase mRNA geïnjecteerd dat opgelost werd in glucosewater, gevolgd door in vivo electroporatie, zie § 5.9. Er werden verschillende toedieningroutes onderzocht afhankelijk van het experiment (i.m. en via de e.a.). Enige tijd later, afhankelijk van het experiment, werd 100 µl Firefly Dluciferine (30 mg / ml in DPBS, Promega) i.p. toegediend waarna de luciferase expressie geanalyseerd door het plaatsen van de muizen onder een bioluminescentie camera (IVIS lumina II, Xenogen). Hiervoor werden de muizen opnieuw verdoofd met isofluraan (100% IsoFlo, Abbott, 4% inductie en 3% onderhoud). Afhankelijk van het experiment werd de luciferase expressie gemeten op verschillende tijdstippen. Data-analyse werd uitgevoerd met Living Image 4.2 software. De muizen werden finaal ge-euthanaseerd door cervicale dislocatie of gerecupereerd voor andere experimenten. 5.7 DOTAP/DOPE complexatie De chloroform-DOTAP en -DOPE oplossingen (25 mg/ml, Avanti Polar Lipids) werden geëvaporeerd met een vloeibare stikstofbron. De overblijvende film werd opgelost door te vortexen met nuclease vrij water (Ambion) en verschillende beads tot een finale concentratie van 5 mM. De inhoud werd gesonificeerd in een glazen vial. mRNA partikels werden gevormd net voor de immunisatie per groep van 3 muizen. Hiervoor werd per groep mRNA samengevoegd met DOTAP/DOPE en gebufferd in 5% glucosewater. Dit mengsel werd 15 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur zodat er complexen gevormd werden. Er werd een bepaalde hoeveelheid van het mRNA-DOTAP/DOPE complex i.m. of in de e.a. geïnjecteerd, afhankelijk van het experiment. 5.8 RALA complexatie Voor complexatie werden mRNA partikels gevormd net voor de immunisatie per groep van 3 muizen. mRNA werd gecomplexeerd met RALA aan N/P ratio 5. 20 minuten na incubatie bij kamertemperatuur werd de oplossing geïnjecteerd i.m. of in de e.a., afhankelijk van het experiment. 5.9 In vivo electroporatie C57BL/6 muizen werden i.p. verdoofd met ketamine/xylazine (Ketamine 1000, Ceva / 2% xylazine, Rompun, Bayer). Hiervoor werd 17 ml PBS, 2 ml ketamine en 1 ml xylazine samengebracht. De immunisaties werden uitgevoerd via verschillende toedieningroutes: intramusculair in de craniale spieren van de tibius voor elk achterbeentje en in de dermis van de ear pinna voor beide oortjes. Voor de in vivo proliferatie assay (§ 5.10) werd twee maal 15 µl van het vaccin geïnjecteerd, op twee verschillende sites. De injectiesites werden indien nodig eerst geschoren en steeds ingewreven met een geleidende gel (Aquasonic 100, 53 Materialen en methoden ultrasound transmission gel, Parker, USA) zodat elektrisch contact met de huid verzekerd werd. Voor de electroporatie in de e.a. werd de injectiesite tussen twee electrodes geplaatst en werd er een korte high voltage puls (700 V/cm, 100 μs) gevolgd door een low voltage puls (200 V/cm, 400 ms). Voor de i.m. electroporatie werd een achtvoudige golf uitgezonden (200 V/cm, 20 ms, 2 Hz). De electroporaties werden uitgevoerd met een Cliniporator systeem (Cliniporator, IGEA, Italy). In vivo electroporaties in de e.a. werden uitgevoerd door Gaëlle Vandermeulen, in samenwerking met Université catholique de Louvain. I.m. electroporaties werden zelf uitgevoerd. 5.10 In vivo proliferatie assay Op dag 0 werden zowel de milt als zoveel mogelijk lymfeknopen van de OT-I transgene muizen geïsoleerd en gesorteerd met de CD8+ T Cell Isolation Kit for mice (Miltenyi Biotec). Zoals reeds vermeld zijn OT-I cellen CD8+ T-cellen die een transgene TCR expresseren dat specifiek OVA-residuen gebonden op MHC-I herkent. Tijdens de MACS sortering werden de milt en lymfeknopen drie maal over een cellstrainer (Falcon, ø 70 µm) gebracht door te pletten en wassen met PBS (Lonza BioWhittaker). Er werd eveneens een rode bloedcel lyse uitgevoerd door toevoegen van de ACK hypotonische lyse buffer (Lonza BioWhittaker). De niet doelwitcellen (zoals Th cellen, B-cellen, NK cellen, DCn en macrofagen) werden magnetisch gelabeled met een cocktail van biotine geconjugeerde monoclonale antilichamen als primaire reagent en met anti-biotine monoclonale antilichamen geconjugeerd aan microbeads als secundaire reagent. Deze magnetisch gelabelde niet doelwitcellen werden gescheiden van de ongelabelde doelwitcellen (OVA-specifieke CD8+ Tcellen) aangezien de eerstgenoemde weerhouden werden door het magnetisch veld van de MACS kolom. De ongelabelde doelwitcellen vloeien door de kolom en werden gecollecteerd. De gesorteerde OT-I cellen werden gelabeld met CFSE (5mM, Life Technologies). Hiervoor werden de cellen twee maal gewassen met medium zonder serum en naar een concentratie van 50 x 106 cellen/ml gebracht. Na incubatie werd de verdunde CFSE oplossing toegevoegd (20 µl 10x CFSE oplossing per ml celsuspensie). De reactie werd vervolgens geblokkeerd door twee maal te wassen met medium waaraan serum werd toegevoegd. WT C57BL/6 muizen werden i.v. geïnjecteerd in de staart vene met 1 miljoen CFSE gelabelde OT-I cellen, in een totaalvolume van 200 µl. Op dag 2 vond immunisatie plaats met ongemodificeerd OVA mRNA (L-6328, TriLink) of gemodificeerd OVA mRNA (L- 6128, TriLink). Immunisatie werd uitgevoerd door middel van verschillende technieken. Enerzijds werden mRNA lipoplexen met DOTAP/DOPE toegediend, zie § 5.7. Anderzijds werden er mRNA nanopartikels toegediend na complexatie met het RALA-peptide, zie § 5.8. Tenslotte werd ook in vivo electroporatie van mRNA onderzocht, zie § 5.9. Op dag 5 werden de lymfeknopen (oor en inguinaal) geïsoleerd en twee maal over een cellstrainer (Falcon, ø 70 µm) gebracht door te pletten en wassen met PBS (Lonza BioWhittaker). Celpellets werden na centrifugatie gekleurd met een antilichaamcocktail voor flow cytometrische analyse, zie § 5.11. 54 Materialen en methoden 5.11 Flow cytometrie Celpellets werden geresuspendeerd met 50 µl 10x dextrameeroplossing (SIINFEKL H-2kb PE, Immudex, Denemarken). Na centrifugatie (7 minuten, 4°C en 400 g) werd de celpellet geresuspendeerd in 50 µl antilichaamcocktail, gevolgd door 30 minuten incubatie bij 4°C. De antilichaamcocktail bevatte volgende merkers: aqua L/D-AmCyan (Invitrogen); CD3-Pacific Blue; CD8-PerCP; Fc-block en CD19-APC, afkomstig van BD Biosciences. Na de kleuring werd elk staal gewassen met ijskoude PBS (Lonza BioWhittaker). Hierna werden de stalen gecentrifugeerd (7 minuten, 4°C en 400 g) waarna de celpellet geresuspendeerd werd in 200 µl PBS (Lonza BioWhittaker). Metingen werden uitgevoerd met een triple-laser (B-V-R) LSR-II flow cytometer (Becton Dickinson), FACSDiva software. Data-analyse werd uitgevoerd met FlowJo (Treestar) software. 5.12 Bradford assay De cellen werden geoogst door de petriplaten twee maal te wassen met ijskoude PBS (Lonza BioWhittaker). Hierna werden de cellen gecentrifugeerd (7 minuten, 4°C en 400 g) waarna de celpellet geresuspendeerd werd met dendritische cel lysebuffer. De absorbantie werd gemeten bij 595nm met de spectrofotometer (iMark Microplate Reader, Bio-Rad). De gebruikte kit voor Bradford bepaling was van Bio-Rad. De eiwitconcentraties van de stalen werden berekend aan de hand van een BSA standaard reeks. 5.13 Western blot Voor de sodium dodecyl sulfate (SDS) Page werd 6x SDS loading dye (3x Laemmli buffer + βmercaptoethanol) toegevoegd aan de stalen. Na opkoken en vortexen werden de stalen geladen in de gel. Na de SDS Page volgde het blotten op een nitrocellulosemembraan (0,45 µm pore size, Whatman) waarna het membraan geblokkeerd werd met TBS Tween met 5% melk. Hierna volgde achtereenvolgens incubatie met het primair antilichaam (mouse antiMyc tag antilichaam, 05-724, Merck Millipore) en het secundaire antilichaam (ECL antimouse IgG HRP linked antilichaam, NA931V, GE Healthcare Bio-Sciences) voor detectie van het flagelline eiwit. ECL detectie vond plaats met het ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific). De aanwezigheid van het huishoudgen actine werd eveneens onderzocht. De analyse werd uitgevoerd op de Amersham Imager 600 (GE Healthcare BioSciences). 5.14 qPCR Na in vitro transfectie werden de cellen geoogst en werden er cellysaten bereid door het toedienen van de RLT lysebuffer (QIAGEN) waaraan β-mercaptoethanol werd toegevoegd. Hierna werd mRNA geïsoleerd uit de cellysaten met behulp van de RNeasy plus minikit 55 Materialen en methoden (QIAGEN). mRNA hoeveelheden werden gemeten met de Nanodrop ND-1000 (Isogen LifeScience). cDNA werd aangemaakt van het geïsoleerde mRNA met behulp van de iScript cDNA kit (Bio-Rad). De PCR werd uitgevoerd op de PTC-200 Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad). Er werd een qPCR uitgevoerd met de SensiFAST SYBR kit (Bioline). Voor normalisatie werd het stabiele huishoudgen mitochondrial ribosomal protein 13a (mRPL 13a) toegevoegd. De qPCR werd uitgevoerd op de LightCycler480 (Roche). 5.15 Statistische analyse De statistische analyse werd uitgevoerd aan de hand van GraphPad Prism 5 software. De statistische significantie werd bepaald door een one-way Anova test met een 95% betrouwbaarheidsinterval. 56 Referenties Referenties Ademokun AA, Dunn-Walters D (2010) Immune Responses: Primary and Secondary. eLS Amanna IJ, Slifka MK (2011) Contributions of humoral and cellular immunity to vaccine-induced protection in humans. Virology 411: 206-215 Anderson BR, Muramatsu H, Nallagatla SR, Bevilacqua PC, Sansing LH, Weissman D, Kariko K (2010) Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res 38: 5884-5892 Andre F, Mir LM (2004) DNA electrotransfer: its principles and an updated review of its therapeutic applications. Gene therapy 11 Suppl 1: S33-42 Appasani K (2005) RNA Interference Technology: From Basic Science to Drug Development. Cambridge University Press: 212 Athie-Morales V, Smits HH, Cantrell DA, Hilkens CM (2004) Sustained IL-12 signaling is required for Th1 development. Journal of immunology 172: 61-69 Babiuk S, Baca-Estrada ME, Foldvari M, Middleton DM, Rabussay D, Widera G, Babiuk LA (2004) Increased gene expression and inflammatory cell infiltration caused by electroporation are both important for improving the efficacy of DNA vaccines. Journal of biotechnology 110: 1-10 Balazs DA, Godbey W (2011) Liposomes for use in gene delivery. Journal of drug delivery 2011: 326497 Benteyn D, Heirman C, Bonehill A, Thielemans K, Breckpot K (2014) mRNA-based dendritic cell vaccines. Expert review of vaccines: 1-16 Bettinger T, Carlisle RC, Read ML, Ogris M, Seymour LW (2001) Peptide-mediated RNA delivery: a novel approach for enhanced transfection of primary and post-mitotic cells. Nucleic Acids Res 29: 3882-3891 Braga CJ, Massis LM, Sbrogio-Almeida ME, Alencar BC, Bargieri DY, Boscardin SB, Rodrigues MM, Ferreira LC (2010) CD8+ T cell adjuvant effects of Salmonella FliCd flagellin in live vaccine vectors or as purified protein. Vaccine 28: 1373-1382 Burgain-Chain S (2013) DNA Electrotransfer: An Effective Tool for Gene Therapy. Intech Cannon G, Weissman D (2002) RNA based vaccines. DNA and cell biology 21: 953-961 Ceppi M, Ruggli N, Tache V, Gerber H, McCullough KC, Summerfield A (2005) Double-stranded secondary structures on mRNA induce type I interferon (IFN alpha/beta) production and maturation of mRNA-transfected monocyte-derived dendritic cells. The journal of gene medicine 7: 452-465 57 Referenties Chiarella P, Massi E, De Robertis M, Sibilio A, Parrella P, Fazio VM, Signori E (2008) Electroporation of skeletal muscle induces danger signal release and antigen-presenting cell recruitment independently of DNA vaccine administration. Expert opinion on biological therapy 8: 1645-1657 Couzin-Frankel J (2010) Immune therapy steps up the attack. Science 330: 440-443 Couzin-Frankel J (2013) Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science 342: 1432-1433 Cuadros C, Lopez-Hernandez FJ, Dominguez AL, McClelland M, Lustgarten J (2004a) Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses. Infection and immunity 72: 2810-2816 Cuadros C, Lopez-Hernandez FJ, Dominguez AL, McClelland M, Lustgarten J (2004b) Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines induce specific immune responses. Infection and immunity 72: 2810-2816 De Geest BG, Willart MA, Hammad H, Lambrecht BN, Pollard C, Bogaert P, De Filette M, Saelens X, Vervaet C, Remon JP, Grooten J, De Koker S (2012) Polymeric multilayer capsule-mediated vaccination induces protective immunity against cancer and viral infection. ACS nano 6: 2136-2149 De Haes W, Rejman J, Pollard C, Merlin C, Vekemans M, Florence E, De Smedt SC, Grooten J, Vanham G, De Koker S, Van Gulck E (2013) Lipoplexes carrying mRNA encoding Gag protein modulate dendritic cells to stimulate HIV-specific immune responses. Nanomedicine 8: 77-87 Delany I, Rappuoli R, De Gregorio E (2014) Vaccines for the 21st century. EMBO molecular medicine 6: 708-720 Delves PJ, Roitt IM (2000) The immune system. First of two parts. The New England journal of medicine 343: 3749 Donnelly N, Gorman AM, Gupta S, Samali A (2013) The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and molecular life sciences : CMLS 70: 3493-3511 Drobits B, Holcmann M, Amberg N, Swiecki M, Grundtner R, Hammer M, Colonna M, Sibilia M (2012) Imiquimod clears tumors in mice independent of adaptive immunity by converting pDCs into tumor-killing effector cells. The Journal of clinical investigation 122: 575-585 Esser MT, Marchese RD, Kierstead LS, Tussey LG, Wang F, Chirmule N, Washabaugh MW (2003) Memory T cells and vaccines. Vaccine 21: 419-430 Fagone P., Shedlock D. J., Kemmerer S., Rabussay D., Weiner DB (2011) Electroporation-Mediated DNA Vaccination. In Clinical Aspects of Electroporation, chapter 18. New York: Springer Press Gurunathan S, Klinman DM, Seder RA (2000) DNA vaccines: immunology, application, and optimization*. Annual review of immunology 18: 927-974 Herzer K, Hofmann TG, Teufel A, Schimanski CC, Moehler M, Kanzler S, Schulze-Bergkamen H, Galle PR (2009) IFN-alpha-induced apoptosis in hepatocellular carcinoma involves promyelocytic leukemia protein and TRAIL independently of p53. Cancer research 69: 855-862 58 Referenties Holtkamp S, Kreiter S, Selmi A, Simon P, Koslowski M, Huber C, Tureci O, Sahin U (2006) Modification of antigen-encoding RNA increases stability, translational efficacy, and T-cell stimulatory capacity of dendritic cells. Blood 108: 4009-4017 Huber JP, Farrar JD (2011) Regulation of effector and memory T-cell functions by type I interferon. Immunology 132: 466-474 Huleatt JW, Jacobs AR, Tang J, Desai P, Kopp EB, Huang Y, Song L, Nakaar V, Powell TJ (2007) Vaccination with recombinant fusion proteins incorporating Toll-like receptor ligands induces rapid cellular and humoral immunity. Vaccine 25: 763-775 Janeway C (2005) Immunobiology : the immune system in health and disease, 6th edn. New York: Garland Science. Kallen KJ, Thess A (2014) A development that may evolve into a revolution in medicine: mRNA as the basis for novel, nucleotide-based vaccines and drugs. Therapeutic advances in vaccines 2: 10-31 Kariko K, Muramatsu H, Welsh FA, Ludwig J, Kato H, Akira S, Weissman D (2008) Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 16: 1833-1840 Kariko K, Ni H, Capodici J, Lamphier M, Weissman D (2004) mRNA is an endogenous ligand for Toll-like receptor 3. The Journal of biological chemistry 279: 12542-12550 Kato H, Sato S, Yoneyama M, Yamamoto M, Uematsu S, Matsui K, Tsujimura T, Takeda K, Fujita T, Takeuchi O, Akira S (2005) Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity 23: 19-28 Klebanoff CA, Acquavella N, Yu Z, Restifo NP (2011) Therapeutic cancer vaccines: are we there yet? Immunological reviews 239: 27-44 Kormann MS, Hasenpusch G, Aneja MK, Nica G, Flemmer AW, Herber-Jonat S, Huppmann M, Mays LE, Illenyi M, Schams A, Griese M, Bittmann I, Handgretinger R, Hartl D, Rosenecker J, Rudolph C (2011) Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature biotechnology 29: 154-157 Kreiter S, Diken M, Selmi A, Tureci O, Sahin U (2011) Tumor vaccination using messenger RNA: prospects of a future therapy. Current opinion in immunology 23: 399-406 Kuhn AN, Diken M, Kreiter S, Vallazza B, Tureci O, Sahin U (2011) Determinants of intracellular RNA pharmacokinetics: Implications for RNA-based immunotherapeutics. RNA biology 8: 35-43 Kutzler MA, Weiner DB (2008) DNA vaccines: ready for prime time? Nature reviews Genetics 9: 776-788 Lahiri A, Das P, Chakravortty D (2008) Engagement of TLR signaling as adjuvant: towards smarter vaccine and beyond. Vaccine 26: 6777-6783 Lee SH, Danishmalik SN, Sin JI (2015) DNA Vaccines, electroporation and their applications in cancer treatment. Human vaccines & immunotherapeutics: 0 59 Referenties Liu C, Lou Y, Lizee G, Qin H, Liu S, Rabinovich B, Kim GJ, Wang YH, Ye Y, Sikora AG, Overwijk WW, Liu YJ, Wang G, Hwu P (2008a) Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell crosspriming and tumor regression in mice. The Journal of clinical investigation 118: 1165-1175 Liu J, Kjeken R, Mathiesen I, Barouch DH (2008b) Recruitment of antigen-presenting cells to the site of inoculation and augmentation of human immunodeficiency virus type 1 DNA vaccine immunogenicity by in vivo electroporation. Journal of virology 82: 5643-5649 Liu MA (2010) Immunologic basis of vaccine vectors. Immunity 33: 504-515 Ludewig B, Barchiesi F, Pericin M, Zinkernagel RM, Hengartner H, Schwendener RA (2000) In vivo antigen loading and activation of dendritic cells via a liposomal peptide vaccine mediates protective antiviral and antitumour immunity. Vaccine 19: 23-32 Luft C, Ketteler R (2015) Electroporation Knows No Boundaries: The Use of Electrostimulation for siRNA Delivery in Cells and Tissues. Journal of biomolecular screening Madan RA, Gulley JL (2015) (R)Evolutionary therapy: the potential of immunotherapy to fulfill the promise of personalized cancer treatment. Journal of the National Cancer Institute 107 Mäkelä PH (2000) Vaccines, coming of age after 200 years. FEMS microbiology reviews 24: 9-20 McCarthy HO, McCaffrey J, McCrudden CM, Zholobenko A, Ali AA, McBride JW, Massey AS, Pentlavalli S, Chen KH, Cole G, Loughran SP, Dunne NJ, Donnelly RF, Kett VL, Robson T (2014) Development and characterization of self-assembling nanoparticles using a bio-inspired amphipathic peptide for gene delivery. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society 189: 141-149 Miao EA, Alpuche-Aranda CM, Dors M, Clark AE, Bader MW, Miller SI, Aderem A (2006) Cytoplasmic flagellin activates caspase-1 and secretion of interleukin 1beta via Ipaf. Nature immunology 7: 569-575 Mingozzi F, Liu YL, Dobrzynski E, Kaufhold A, Liu JH, Wang Y, Arruda VR, High KA, Herzog RW (2003) Induction of immune tolerance to coagulation factor IX antigen by in vivo hepatic gene transfer. The Journal of clinical investigation 111: 1347-1356 Mizel SB, Bates JT (2010) Flagellin as an adjuvant: cellular mechanisms and potential. Journal of immunology 185: 5677-5682 Monneur A, Bertucci F, Viens P, Goncalves A (2014) Systemic treatments of inflammatory breast cancer: an overview. Bulletin du cancer Muramatsu T, Nakamura A, Park HM (1998) In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review). International journal of molecular medicine 1: 55-62 Murtaugh MP, Foss DL (2002) Inflammatory cytokines and antigen presenting cell activation. Veterinary immunology and immunopathology 87: 109-121 Oncosec. (2013) Chemotherapy, Radiation Therapy and Immunotherapy. Palucka K, Banchereau J (2012) Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nature reviews Cancer 12: 265-277 60 Referenties Papageorgiou A, Dinney CP, McConkey DJ (2007) Interferon-alpha induces TRAIL expression and cell death via an IRF-1-dependent mechanism in human bladder cancer cells. Cancer biology & therapy 6: 872-879 Pardoll DM (2012) The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature reviews Cancer 12: 252-264 Parkin J, Cohen B (2001) An overview of the immune system. Lancet 357: 1777-1789 Pascolo S (2008) Vaccination with messenger RNA (mRNA). Handbook of experimental pharmacology: 221-235 Paster W, Zehetner M, Kalat M, Schuller S, Schweighoffer T (2003) In vivo plasmid DNA electroporation generates exceptionally high levels of epitope-specific CD8+ T-cell responses. Gene therapy 10: 717-724 Peng B, Zhao Y, Xu L, Xu Y (2007) Electric pulses applied prior to intramuscular DNA vaccination greatly improve the vaccine immunogenicity. Vaccine 25: 2064-2073 Perry AK, Chen G, Zheng D, Tang H, Cheng G (2005) The host type I interferon response to viral and bacterial infections. Cell research 15: 407-422 Petrovsky N, Aguilar JC (2004) Vaccine adjuvants: current state and future trends. Immunology and cell biology 82: 488-496 Pollard C, De Koker S, Saelens X, Vanham G, Grooten J (2013a) Challenges and advances towards the rational design of mRNA vaccines. Trends in molecular medicine 19: 705-713 Pollard C, Rejman J, De Haes W, Verrier B, Van Gulck E, Naessens T, De Smedt S, Bogaert P, Grooten J, Vanham G, De Koker S (2013b) Type I IFN counteracts the induction of antigen-specific immune responses by lipid-based delivery of mRNA vaccines. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 21: 251259 Pulendran B, Ahmed R (2006) Translating innate immunity into immunological memory: implications for vaccine development. Cell 124: 849-863 Roos AK, Eriksson F, Timmons JA, Gerhardt J, Nyman U, Gudmundsdotter L, Brave A, Wahren B, Pisa P (2009) Skin electroporation: effects on transgene expression, DNA persistence and local tissue environment. PloS one 4: e7226 Rumbo M, Nempont C, Kraehenbuhl JP, Sirard JC (2006) Mucosal interplay among commensal and pathogenic bacteria: Lessons from flagellin and Toll-like receptor 5. Febs Lett 580: 2976-2984 Schlake T, Thess A, Fotin-Mleczek M, Kallen KJ (2012) Developing mRNA-vaccine technologies. RNA biology 9: 1319-1330 Smith-Garvin JE, Sigal LJ (2013) Immunology: Memory cells sound the alarm. Nature 497: 194-196 Thyrell L, Erickson S, Zhivotovsky B, Pokrovskaja K, Sangfelt O, Castro J, Einhorn S, Grander D (2002) Mechanisms of Interferon-alpha induced apoptosis in malignant cells. Oncogene 21: 1251-1262 61 Referenties Tough DF (2012) Modulation of T-cell function by type I interferon. Immunology and cell biology 90: 492-497 Trapani JA, Smyth MJ (2002) Functional significance of the perforin/granzyme cell death pathway. Nature reviews Immunology 2: 735-747 Trinchieri G (2010) Type I interferon: friend or foe? The Journal of experimental medicine 207: 2053-2063 Turvey SE, Broide DH (2010) Innate immunity. The Journal of allergy and clinical immunology 125: S24-32 Uematsu S, Akira S (2007) Toll-like receptors and Type I interferons. The Journal of biological chemistry 282: 15319-15323 van den Brink MR, Burakoff SJ (2002) Cytolytic pathways in haematopoietic stem-cell transplantation. Nature reviews Immunology 2: 273-281 Vandermeulen G, Vanvarenberg K, De Beuckelaer A, De Koker S, Lambricht L, Uyttenhove C, Reschner A, Vanderplasschen A, Grooten J, Preat V (2015) The site of administration influences both the type and the magnitude of the immune response induced by DNA vaccine electroporation. Vaccine Wang Q, Jiang W, Chen Y, Liu P, Sheng C, Chen S, Zhang H, Pan C, Gao S, Huang W (2014) In vivo electroporation of minicircle DNA as a novel method of vaccine delivery to enhance HIV-1-specific immune responses. Journal of virology 88: 1924-1934 Yamamoto A, Kormann M, Rosenecker J, Rudolph C (2009) Current prospects for mRNA gene delivery. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV 71: 484-489 Yang L, Ng KY, Lillehei KO (2003) Cell-mediated immunotherapy: a new approach to the treatment of malignant glioma. Cancer control : journal of the Moffitt Cancer Center 10: 138-147 Zhao L, Seth A, Wibowo N, Zhao CX, Mitter N, Yu C, Middelberg AP (2014) Nanoparticle vaccines. Vaccine 32: 327-337 Zhou Z, Hamming OJ, Ank N, Paludan SR, Nielsen AL, Hartmann R (2007) Type III interferon (IFN) induces a type I IFN-like response in a restricted subset of cells through signaling pathways involving both the Jak-STAT pathway and the mitogen-activated protein kinases. Journal of virology 81: 7749-7758 Ziello JE, Huang Y, Jovin IS (2010) Cellular endocytosis and gene delivery. Molecular medicine 16: 222-229 62 Addendum Addendum Supplementaire data A.1 Het effect van mRNA-modificatie op CD8+ T-cel proliferatie na immunisatie met lipideen peptidegebaseerde mRNA vaccinatie strategieën Zoals reeds vermeld kan mRNA-modificatie de type I IFN signalisatie inhiberen waardoor degradatie van het mRNA gereduceerd wordt en ook de translatiestop verhinderd wordt (Anderson et al, 2010; Kariko et al, 2008; Kormann et al, 2011). Vandaar is het interessant om het effect van mRNA-modificatie na te gaan op vlak van CD8+ T-cel deling. Voor het bestuderen van de celdeling werd een in vivo proliferatie assay uitgevoerd, zie § 3.1.1. Immunisatie vond plaats in de e.a. met 10 µg gemodificeerd OVA mRNA (TriLink). Het mRNA werd gemodificeerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Als negatieve controle werd geïmmuniseerd met 10 µg gemodificeerd naakt OVA mRNA. Als positieve controle werd geïmmuniseerd met 10 µg OVA CpG (Fig. A.1 a en b). Afhankelijk van het experiment werden immunisaties uitgevoerd na complexatie van het mRNA met DOTAP/DOPE of RALA. 63 Addendum a) c) b) d) 64 Addendum e) f) Figuur A.1 | CD8+ T-cel proliferatieprofiel voor verschillende vaccinatie strategieën. Op dag 0 werden CFSE gelabelde OT-I cellen i.v. geïnjecteerd in een WT C57BL/6 muis. Op dag 2 vond immunisatie plaats in de e.a. met 10 µg gemodificeerd OVA mRNA (TriLink), ofwel gecomplexeerd met DOTAP/DOPE, ofwel gecomplexeerd met RALA. Op dag 5 werden lymfeknopen (oor en inguinaal) geïsoleerd en vond analyse van de CD8+ T-cel proliferatie plaats door flow cytometrie (triple-laser LSR-II flow cytometer, Becton Dickinson). (a) en (b) geven het CD8+ T-cel proliferatieprofiel weer voor elke immunisatie t.o.v. een negatieve (gemodificeerd naakt OVA mRNA) en positieve (OVA CpG) controle. (c) en (d) geven een vergelijking tussen immunisatie met ongemodificeerd en gemodificeerd OVA mRNA. (e) vergelijkt het immunogene karakter van beide vaccinatie strategieën na immunisatie met gemodificeerd OVA mRNA. (f) vergelijkt de meest immunogene groepen met elkaar. Voor de analyse werden steeds de profielen met hoogste proliferatie vergeleken. Gemod: gemodificeerd. OVA: ovalbumine. EP: electroporatie. Wanneer het mRNA gecomplexeerd wordt met RALA dan merkt men een sterkere CD8+ Tcel proliferatie op na immunisatie met gemodificeerd OVA mRNA (Fig. A.1 c). Wanneer het mRNA gecomplexeerd wordt met DOTAP/DOPE kan men opmerken dat er een sterkere CD8+ T-cel proliferatie optreedt na immunisatie met ongemodificeerd OVA mRNA (Fig. A.1 d). Beide vaccinatie strategieën werden met elkaar vergeleken in Figuur A.1 e. Zoals reeds opgemerkt induceert modificatie van het mRNA tijdens complexatie met RALA een sterke CD8+ T-cel proliferatie. Tot slot werden de meest immunogene groepen vergeleken met in vivo electroporatie. Uit onze vorige resultaten kon men reeds vaststellen dat in vivo electroporatie geen CD8+ T-cel proliferatie induceert, zie § 3.1.2. Figuur A.1 f toont dat immunisatie met ongemodificeerd DOTAP/DOPE-antigeen mRNA een sterke immuunrespons induceert, net zoals immunisatie met gemodificeerd RALA-antigeen mRNA. 65 Addendum A.2 De inductie van IFN-β na immunisatie met lipide- en peptidegebaseerde mRNA vaccinatie strategieën Additioneel werd de inductie van IFN-β geanalyseerd na immunisatie met antigeen mRNA door middel van een lipide- en peptidegebaseerde mRNA-vaccinatie strategie. IFN-β is een type I IFN. Type I IFNn gaan een gewenste immuunrespons induceren maar stimuleren eveneens degradatie en een translatiestop van het mRNA (Pollard et al, 2013b). In deze opstelling wordt onderzocht of er verschillen in IFN-β opregulatie waargenomen worden na immunisatie met ongemodificeerd of gemodificeerd mRNA. Door het aanbrengen van modificaties aan het mRNA kan de type I IFN respons gereduceerd worden aangezien mRNA-modificaties de type I IFN signalisatie reduceren, zoals reeds eerder besproken. Voor het bestuderen van IFN-β inductie werden IFN-β luciferase reportermuizen geïmmuniseerd met OVA coderend mRNA. IFN-β luciferase reportermuizen bevatten het luciferase gen voorafgegaan door de IFN-β promotor. In het geval dat IFN-β geïnduceerd wordt, komt het luciferase gen tot expressie. Analyse van luciferase expressie vond plaats door in vivo bioluminescentie imaging, zie § 3.2.1. Een sterk luciferase signaal wijst dus op inductie van IFN-β. Voor het onderzoeken van het effect van mRNA-modificatie op IFN-β inductie werden IFN-β luciferase reportermuizen in de e.a. geïnjecteerd met 10 µg OVA mRNA (TriLink). Er vond zowel immunisatie plaats met ongemodificeerd als gemodificeerd mRNA. Modificatie werd uitgevoerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Na immunisatie werd i.p. 100 µl Dluciferine geïnjecteerd. Exact 8 minuten later werd het luciferase signaal gedurende twee minuten gemeten. Drie uur en zes uur na immunisatie vonden herhaalde metingen plaats. Er werden ROIs geselecteerd met identieke grootte en vergeleken met muizen die geïnjecteerd werden met PBS. Er werden twee groepen met elkaar vergeleken. Ten eerste werd de lipidegebaseerde techniek onderzocht waarbij het mRNA complexeert met DOTAP/DOPE ter vorming van lipoplexen. Ten tweede werd mRNA gecomplexeerd met de peptidesequentie RALA. Het luciferase signaal zes uur na immunisatie wordt weergegeven in Figuur A.2. 66 Addendum ongemod DOTAP/DOPE ongemod RALA gemod DOTAP/DOPE gemod RALA Figuur A.2 | Luciferase expressie zes uur na immunisatie met RALA en DOTAP/DOPE gecomplexeerd antigeen mRNA. IFN-β luciferase reportermuizen werden in de e.a. geïnjecteerd met 10 µg OVA mRNA (TriLink). Er werd zowel ongemodificeerd als gemodificeerd mRNA toegediend. Modificatie werd uitgevoerd met Ψ-uridine, 5methylcytidine en ARCA. Na immunisatie werd 100 µl Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waarna op verschillende tijdstippen het luciferase signaal werd gemeten gedurende 2 minuten (IVIS lumina II, Xenogen). Als negatieve controle werd PBS toegediend. Ongemod: ongemodificeerd. Gemod: gemodificeerd. Uit Figuur A.2 kunnen we afleiden dat mRNA-complexatie met DOTAP/DOPE IFN-β induceert, terwijl dit niet waargenomen wordt wanneer mRNA gecomplexeerd wordt met RALA. 67 Addendum IF N -b s ig n a a l 31 0 6 T o t a le flu x (p /s ) o n g e m o d D O T A P /D O P E g e m o d D O T A P /D O P E 21 0 ongem od R A LA 6 gem od R A LA PBS 11 0 6 0 0 3 6 u u r n a m R N A in je c tie Figuur A.3 | Het effect van mRNA-modificatie op IFN-β inductie na immunisatie met RALA en DOTAP/DOPE gecomplexeerd antigeen mRNA. IFN-β luciferase reportermuizen werden in de e.a. geïnjecteerd met 10 µg OVA mRNA (TriLink). Er werd zowel ongemodificeerd als gemodificeerd mRNA toegediend. Modificatie werd uitgevoerd met Ψ-uridine, 5-methylcytidine en ARCA. Na immunisatie werd 100 µl Firefly D-luciferine i.p. geïnjecteerd waarna op verschillende tijdstippen het luciferase signaal werd gemeten gedurende 2 minuten (IVIS lumina II, Xenogen). Als negatieve controle werd PBS toegediend. Ongemod: ongemodificeerd. Gemod: gemodificeerd. PBS: fosfaat gebufferde zoutoplossing. Gemodificeerd mRNA gecomplexeerd met DOTAP/DOPE vertoont een lagere IFN-β inductie in vergelijking tot ongemodificeerd mRNA (Fig. A.3, rode lijnen). Immunisatie met RALAgecomplexeerd antigeen mRNA vertoont zowel zonder als met modificatie geen IFN-β inductie (Fig. A.3, groene lijnen). 68 Addendum Gedetailleerde protocols Genotypering Staart of teentje DNA voorbereiding: Per staart- of teentjestaal: mix 500µl staartbuffer met 20µl proteïnase K Voeg 520µl aan elk staart- of teentjestaal toe Incubeer overnacht al schuddend (800-950rpm), 56 °C Centrifugeer bij max. snelheid voor 5min Voeg 450µl isopropanol toe aan nieuwe epjes Voeg 450µl supernatans toe aan elk epje Plaats stalen bij -70°C voor 2h om te precipiteren Centrifugeer bij max snelheid, 4°C, 5min Verwijder isopropanol door epje om te draaien Was door 450µl 70% EtOH toe te voegen Centrifugeer bij max snelheid , 4°C, 5min Verwijder EtOH door epje om te draaien Draai de epjes om, laat verdampen tot ze gedroogd zijn voor min. 2h Resuspendeer DNA pellet in 100µl bidi door te schudden gedurende 15min bij 50°C Meet DNA concentratie met de Nanodrop ND-1000 van Isogen LifeScience PCR: Pas DNA concentratie aan tot de gewenste concentratie (10ng/µl ) met bidi en vortex Breng de 500µM primerstock naar 10µM Stel specifieke MasterMix samen (Invitrogen) (maal het aantal stalen): 10x PCR buffer -Mg: 5µl x = 50mM MgCl2: 1,5µl x = 10mM dNTP mix: 1µl x = Primer mix: 2,5µl 10µM forward primer en 2,5µl 10µM reverse primer x = Taq DNA polymerase Invitrogen (5U / µl): 0,2µl x = DNA template: 20µl (aan 10ng/µl is 200ng) Gedemineraliseerd H2O: aanvullen tot 50µl (dus 17,5µl) x = Voeg 20µl DNA template toe aan elk PCR epje (maak ook negatieve controles) Voeg onmiddellijk 30µl MasterMix toe aan elk staal na te vortexen Short spin de PCR strips PCR run: Initiële denaturatie 94°C voor 3min Denaturatie 94°C voor 45sec Annealing 56°C voor 30sec 35 PCR cycli Extensie 72°C voor 90sec Finale extensie 72°C voor 10min Hold 4°C oneindige cyclus Stalen opslaan bij 4°C 69 Addendum DNA (agarose gel) electroforese: Voeg per 50µl staal 10µl loading dye toe (6x met SDS) Maak 1x TBE buffer, vul de electroforesekamer met dit Maak een agarose gel met gewenste concentratie Bereid een casting tray voor met plakband Breng agarosemengsel in de casting tray, verwijder alle luchtbellen, voeg kammetjes in en laat 15min staan Nadat de gel verhard is, verwijder kammetjes en ook de plakband en breng de casting tray in de electroforesekamer, de agarose gel moet volledig ondergedompeld zijn in de 1x TBE buffer Breng 6µl gepaste DNA ladder (Promega) in eerste welletje Breng 10µl van de DNA stalen in de beschikbare welletjes Run 1h bij 140V Plaats gel 20min en EtidiumBromide bad Plaats gel vervolgens 10min in waterbad Maak foto van de gel met het Bio-Rad Gel Doc 2000 toestel Promega 1kb ladder mRNA aanmaak Plasmide transformatie naar E. coli: In LAF ruimte: Breng 2µl van de plasmideoplossing dat het gen van interesse bevat op de E. coli bacteriecultuur voor 20min Hitteshock bij 42°C voor 1min zonder schudden Breng op ijs Voeg 800µl LB medium zonder ampicilline toe Laat 1h bij 37°C shaken Voeg glycerol toe en breng in diepvries bij -80°C 70 Addendum Breng 10ml LB medium waaraan een 1000x verdunning ampicilline werd toegevoegd in een glazen vial en breng in elke vial een tiptopje van de bacteriecultuur getransformeerd met bepaald plasmide Laat overnacht schuddend groeien bij 37°C Plasmide isolatie met de Wizard plus SV Minipreps DNA purification system Kit, centrifugation protocol, Promega: Productie van het lysaat: Breng getransformeerde bacteriecultuur over naar vials van 15ml (per 10ml) Centrifugeer vials 10min bij 3°C, max. snelheid Breng op ijs en neem supernatans af Resuspendeer pellet met 250µl cell resuspension solution en breng over naar klein epje Voeg 250µl cell lysis solution toe aan elk staal en inverteer 4 keer Voeg 10µl alkaline protease solution toe en inverteer 4 keer, incubeer 5min bij kamertemp (niet langer dan 5min, anders breekt DNA af) Voeg 350µl neutralization solution toe en inverteer 4 keer Centrifugeer bij max. snelheid , 10min, kamertemperatuur Binding van het plasmide DNA: Breng voor elk staal een spin column in een collection tube Neem het supernatans af en breng dit over de kolom (indien te troebel of te moeilijk: breng supernatans over naar een nieuw epje en centrifugeer opnieuw) Centrifugeer bij max. snelheid ,1min, kamertemperatuur Verwijder flowthrough en breng kolom opnieuw in collectie tube Wassen: Voeg 750µl van de wasoplossing toe (ethanol aan toegevoegd) en centrifugeer bij max. snelheid voor 1min, verwijder flowthrough en breng kolom opnieuw in collectie tube Herhaal de voorgaande stap met 250µl wasoplossing Centrifugeer bij max. snelheid, 2min, kamertemperatuur Elutie: Breng de kolom over naar een steriel 1,5ml microcentrifuge tube, wees voorzichtig zodanig dat je geen wasoplossingdruppels mee overbrengt. Indien de kolom nog wasoplossing bevat, centrifugeer opnieuw voor 1min bij max. snelheid Voeg 30µl nuclease vrij water toe aan de kolom, centrifugeer bij max. snelheid, voor 1min bij kamertemperatuur (kolom niet aanraken) Verwijder kolom en meet DNA concentratie met de Nanodrop ND-1000 van Isogen LifeScience 71 Addendum Plasmide restrictie / linearisatie: Maak nieuwe epjes voor elk plasmide Breng in elk epje de gepaste hoeveelheid restrictie-enzyme (afhankelijk van het aantal Units), buffer (meestal 10x), eventuele oligonucleotiden (meestal 50x), BSA indien nodig, plasmide (18µg) en leng aan met gedemineraliseerd water tot 100µl Plaats overnacht bij 37°C DNA opzuivering met de QIAQuick PCR purification kit, QIAGEN: In tissue culture facility: Binding van het DNA aan de kolom: Voeg 5 maal volume bindingsbuffer PB toe aan 1 volume DNA (dus 500µl) Breng voor elk staal een spin column in een collection tube Breng het staal over naar de kolom Centrifugeer 1min, 13.000rpm, kamertemperatuur Verwijder flowthrough en breng de kolom opnieuw in collectie tube Wassen: Was met 750µl wasbuffer PE Centrifugeer 1min, 13.000rpm, kamertemperatuur Verwijder flowthrough en breng kolom over naar nieuw RNAse vrij epje Elutie: Elueer met 30µl RNAse vrij water Centrifugeer 1min, 13.000rpm, kamertemperatuur Plaats plasmide DNA op ijs DNA (agarose gel) electroforese: Breng 2µl loading dye (6x met SDS), 8µl nuclease vrij water en 2µl plasmide samen in een epje voor elk plasmidestaal Maak 1x TBE buffer, vul de electroforesekamer met dit Maak een agarose gel met gewenste concentratie Bereid een casting tray voor met plakband Breng agarosemengsel in de casting tray, verwijder alle luchtbellen, voeg kammetjes in en laat 15min staan Nadat de gel verhard is, verwijder kammetjes en ook de plakband en breng de casting tray in de electroforesekamer, de agarose gel moet volledig ondergedompeld zijn in de 1x TBE buffer Breng 6µl gepaste DNA ladder (Promega) in eerste welletje Breng 12µl van de stalen in de beschikbare welletjes Run 1h bij 70V Plaats gel 20min en EtidiumBromide bad Plaats gel vervolgens 10min in waterbad Maak foto van de gel met het Bio-Rad Gel Doc 2000 toestel 72 Addendum Promega 1kb ladder In vitro mRNA transcriptie met de T7 MEGAscript Ambion kit (SOP): In tissue culture facility: Werk RNAse vrij, spuit met RNAse ZAP in de flow, op pipetpunten en op handschoenen Plaats de RNA polymerase enzyme mix meteen op ijs Vortex de 10x reactie buffer en de 4 ribonucleotide oplossingen tot ze volledig opgelost zijn Bewaar de ribonucleotides op ijs maar plaats de 10x reactiebuffer bij kamertemperatuur Voeg de volgende componenten samen in deze volgorde: Ambion kit Component Nuclease vrij water ATP oplossing (75mM) Methylcytidine trifosfaat TriLink) GTP oplossing (75mM) Pseudo uridine (100mM,TriLink) ARCA (100mM) Lineaire DNA template 10x buffer Enzyme mix Hoeveelheid (totaal 150µl) 33µl 15µl (7,5mM) (100mM, 11,25µl (7,5mM) 3µl (1,5mM) trifosfaat 11,25µl (7,5mM) 9µl (6mM) 30µl (18µg) 15µl 15µl Hoeveelheid (totaal 50µl) 11µl 5µl 3,75µl Hoeveelheid (totaal 20µl) 4,4µl 2µl 1,5µl 1µl 3,75µl 0,4µl 1,5µl 3µl 10µl (6µg) 5µl 5µl 1,2µl 4µl (3µg) 2µl 2µl 73 Addendum Mix goed Centrifugeer kort zodat het reactiemengsel zich aan de onderkant van het epje bevindt Incubeer bij 37°C, 5%CO2 voor minimaal 4h Voeg 7,5µl TURBO Dnase toe (2U/µl, Ambion) indien het totaalvolume 150µl bedraagt, mix goed en incubeer 30min bij 37°C, 5%CO2 Recovery van het RNA MEGAClear Kit Procedure, Ambion: Plaats het RNA steeds op ijs Breng het RNA staal tot 100µl met de elutie oplossing, mix voorzichtig Breng 350µl bindingsoplossing toe, mix voorzichtig Voeg 250µl RNAse vrij 100% ethanol toe, mix voorzichtig Breng het staal over een filter: Breng een filter cartridge in één van de collectie tubes en elutie tubes Pipetteer het RNA mengsel op de cartridge Centrifugeer 30sec bij 10.000rpm Verwijder de flow through en hergebruik de collectie en elutie tubes voor de wasstappen Was met 2x met 500µl wasoplossing, verwijder flow through tussen de twee wasstappen Centrifugeer voor een extra 30sec na de laatste wasstap Elueer het RNA van de filter met 50µl elutie oplossing: Plaats de filter cartridge in een nieuwe collectie tube Voeg 50µl elutieoplossing toe aan de filter Sluit de tube en incubeer in een hitteblock voor 5-10min bij 65°C Recover het geëlueerde RNA door te centrifugeren voor 1min bij 10.000g Herhaal deze elutiestap opnieuw met 50µl elutie oplossing Precipiteer met 5M ammoniumacetaat om het RNA te concentreren: Voeg 10µl (1/10de van totaalvolume) toe van 5M NH4Ac Voeg 2,5 volumes RNAse vrij 100% ethanol toe Mix goed en incubeer bij -20°C voor 30min of overnacht Koel de centrifuge tot 4°C en ontdooi het RNA op ijs Centrifugeer bij max. snelheid voor 15min Verwijder voorzichtig het supernatans Was de pellet met 500µl 70% koude ethanol, centrifugeer opnieuw en verwijder de 70% ethanol Om de laatste sporen van ethanol te verwijderen, spin de tube opnieuw en verwijder overblijvend vloeistof met een fijne pipet of naald Resuspendeer de pellet met 40µl nuclease vrij water Meet de mRNA concentratie met de Nanodrop ND-1000 van Isogen LifeScience, breng hiervoor 1µl van je staal naar een leeg epje, om zo je mRNA oplossing niet bloot te stellen aan een RNAse omgeving Breng mRNA staal tot een concentratie van 1µg/µl Plaats het mRNA vanaf nu altijd op ijs en sla op bij -80°C want mRNA is zeer onstabiel Controleer mRNA op grootte door electroforese en laad 2µl mRNA per staal 74 Addendum Alternatief voor RNA MEGAClear Kit Procedure: LiCl RNA precipitatie: Voeg 1 maal het volume nuclease vrij water en 1 maal het volume LiCl toe Plaats overnacht bij -20°C Centrifugeer mRNA bij 4°C, 15min, 13.000rpm Pellet heroplossen in 1 maal volume nuclease vrij water Meet mRNA concentratie meten met de Nanodrop ND-1000 van Isogen LifeScience, breng hiervoor 1µl van je staal naar een leeg epje, om zo je mRNA oplossing niet bloot te stellen aan een RNAse omgeving Breng mRNA staal tot een concentratie van 1µg/µl Plaats het mRNA vanaf nu altijd op ijs en sla op bij -80°C want mRNA is zeer onstabiel Controleer mRNA op grootte door electroforese en laad 2µl mRNA per staal Plasmide controledigest Plasmide transformatie naar E. Coli: zie protocol mRNA aanmaak Plasmide isolatie met de Wizard plus SV Minipreps DNA purification system Kit, centrifugation protocol: zie protocol mRNA aanmaak Plasmide restrictie: Gebruik het programma Clone Manager om twee restrictie enzymen uit te kiezen en te berekenen welke bandjes verwacht kunnen worden na de controledigest van het betreffende plasmide Kies de restricitie-enzymes zodanig dat de verwachte bandjes te onderscheiden zijn Zoek ook op of de restrictie enzymen die gebruikt worden compatibel zijn: of er met dezelfde buffer kan geknipt worden Breng de gepaste hoeveelheden restrictie enzymes samen (afhankelijk van het aantal Units), buffer (meestal 10x), eventuele oligonucleotiden (meestal 50x), BSA indien nodig, plasmide (2µg is voldoende) en leng aan met gedemineraliseerd water tot 100µl Plaats overnacht bij 37°C DNA (agarose gel) electroforese: Voeg per staal 20µl loading dye toe (6x met SDS) Maak 1x TBE buffer, vul de electroforesekamer met dit Maak een agarose gel met gewenste concentratie Bereid een casting tray voor met plakband Breng agarosemengsel in de casting tray, verwijder alle luchtbellen, voeg kammetjes in en laat 15min staan Nadat de gel verhard is, verwijder kammetjes en ook de plakband en breng de casting tray in de electroforesekamer, de agarose gel moet volledig ondergedompeld zijn in de 1x TBE buffer Breng 6µl gepaste DNA ladder (Promega) in eerste welletje Breng het staal in één van de beschikbare welletjes Run 1h bij 70V Plaats gel 20min en EtidiumBromide bad 75 Addendum Plaats gel vervolgens 10min in waterbad Maak foto van de gel met het Bio-Rad Gel Doc 2000 toestel Promega 1kb ladder Cultivatie van beenmerg-afgeleide dendritische cellen (BMDCs) Dag 0: isolatie van het beenmerg en uitzaaien van de cellen: In animalarium: Euthanaseer een wild type muis door cervicale dislocatie Pin de muis vast met de ventrale zijde naar boven gericht en spuit met ethanol op de muis Verwijder het bovenbeen (femur) en onderbeen (tibia) m.b.v. een schaartje, pincet en scalpel na zoveel mogelijk huid en spierweefsel te hebben verwijderd, werk zo steriel mogelijk (raak de darmen niet) Schraap met een pincet de beentjes verder af Knip de beentjes in twee ter hoogte van de knie Breng de botjes over naar een petriplaat gevuld met PBS Flush de botjes met een bruine naald gevuld met ijskoude PBS (Lonza) boven een nieuwe petridish. Indien de stamcellen en bloedcellen niet goed loskomen: snij het botje een stukje af en probeer opnieuw Maak vervolgens een homogene celsuspensie m.b.v. een zwarte naald en breng over naar een 15ml of 50ml tube en plaats meteen op ijs In tissue culture facility: Maak compleet cRPMI medium en plaats in warmwaterbad: 500ml 10% RPMI-1640 (Gibco), voeg hieraan toe: 2ml Natrium Pyruvaat zonder LPS (250x, Lonza) 5ml Glutamine (100x, Lonza) 1ml Penicilline/Streptomycine (500x, Lonza) 50ml 10% FCS (Sigma-Aldrich) 76 Addendum Breng de celsuspensie over een cellstrainer (70µm) en breng de celsuspensie over naar een nieuwe 15ml tube Centrifugeer 7min bij 400g en 4°C Verwijder supernatans en voer een rode bloedcel lyse uit door de pellet op te lossen in 1ml ACK hypotonische lyse buffer (Lonza). Plaats 2min bij kamertemperatuur. Neutraliseer de celsuspensie met 5ml PBS Centrifugeer 7min, 400g, 4°C Verwijder supernatans en resuspendeer pellet in 5ml cRPMI Tel de cellen met een Bürker telraam. Maak hiervoor een 20x verdunning met trypaanblauw (10µl celsuspensie en 190µl trypaanblauw). Zo weet je het aantal cellen per ml. Aantal cellen per ml = (aantal getelde cellen in 3 hokjes)/3 * 10.000 * je verdunning Uit 1 muis kunnen ongeveer 32 miljoen cellen geïsoleerd worden Verdun de celsuspensie met cRPMI naar 3 miljoen cellen per ml Zaai per petriplaat 3 miljoen cellen uit (dus 1ml na de verdunning) en leng aan tot 10ml met cRPMI medium waarin GM-CSF werd toegevoegd aan 20ng/ml Plaats de cellen in de incubator bij 37°C, 5% CO2 Dag 3: verversen medium: In tissue culture facility: Voeg 10ml extra cRPMI toe waarin GM-CSF werd toegevoegd aan 20ng/ml Plaats de cellen opnieuw in de incubator bij 37°C, 5% CO2 Dag 6: verversen medium: In tissue culture facility: Haal 10ml medium af en centrifugeer 7min, 400g, 4°C Verwijder supernatans en resuspendeer de pellet in nieuw 10ml cRPMI waarin GMCSF werd toegevoegd aan 10ng/ml, en voeg dit opnieuw toe aan de plaat Plaats de cellen opnieuw in de incubator bij 37°C, 5% CO2 In vitro electroporatie BMDCs Dag 7: cellen oogsten en daaropvolgend in vitro transfectie van de BMDCs door electroporatie: In tissue culture facility: Was de petriplaten door het medium op te zuigen en een paar keer over de plaat te brengen alvorens de cellen over te brengen naar 15ml falcons Was de petriplaten twee maal met 1ml ijskoude PBS door het PBS hard over de plaat uit te duwen om extra cellen te verzamelen en breng de cellen naar de falcons Centrifugeer de cellen voor 7min, 400g, 4°C 77 Addendum Resuspendeer pellet in 5ml Opti-MEM medium (Gibco) en pool Tel de cellen met een Bürker telraam. Maak hiervoor een 10x verdunning met trypaanblauw (10µl celsuspensie en 90µl trypaanblauw). Zo weet je het aantal cellen per ml. Per opstelling worden 3 miljoen cellen getransfecteerd, dus verdun de celsuspensie met Opti-MEM medium (Gibco) naar het gewenste aantal cellen per ml In LAF ruimte: Breng per cuvetje 3 miljoen cellen opgelost in Opti-MEM medium (Gibco) Transfecteer de cellen met de gewenste opstelling: bijvoorbeeld 10µl PBS / 10µg OVA mRNA / 10µg OVA pDNA en electroporeer Electroporatie met Bio-Rad Electroporator met als settings: exponentional; V=300V; Cap=150uF; Res: oneindig; cuvette: 4mm Breng na electroporatie bij elke opstelling de inhoud van het cuvetje over naar een wellplaat waarin reeds cRPMI medium werd toegevoegd, zodat de cellen kunnen overleven Was het cuvetje tussen elke opstelling door met Opti-MEM medium (Gibco) Plaats de wellplaat overnacht bij 37°C, 5% CO2 Na een nacht incubatie kan de wellplaat bewaard worden bij -20°C voor latere analyse Isolatie splenocyten In animalarium: Euthanaseer een wild type muis door cervicale dislocatie Leg de muis op zijn rechterzijde en spuit met ethanol op de muis t.h.v. de milt Verwijder de milt m.b.v. een schaartje en pincet, werk zo steriel mogelijk, bewaar de milt in PBS In tissue culture facility: Breng de milt over een cellstrainer (70µm) door te pletten en wassen met PBS. Werk steeds op een kleine petriplaat om verliezen tegen te gaan. Breng de cellen over naar kleine epjes Centrifugeer 7min, 400g, 4°C + shortspin Verwijder supernatans en voer rode bloedcel lyse uit door de pellet op te lossen in 1ml ACK hypotonische lysebuffer (Lonza). Plaats 2min bij kamertemperatuur en breng over naar cellstrainer (70µm) over petriplaat. Breng de cellen over naar kleine epjes Neutraliseer door toevoegen van PBS Centrifugeer 7min, 400g, 4°C + shortspin Verwijder supernatans en resuspendeer pellet met PBS Breng over naar cellstrainer (70µm) over petriplaat zodat absoluut geen vet achter blijft 78 Addendum Breng de cellen over naar kleine epjes Centrifugeer 7min, 400g, 4°C + shortspin Verwijder supernatans en resuspendeer pellet naar gewenst aantal cellen per ml In vivo bioluminescentie imaging In animalarium: Verdoof een wild type muis m.b.v. isofluraan (4% inductie en 3% onderhoud) Het gemodificeerd luciferase mRNA moet op voorhand aangemaakt worden, aangezien dit enkele dagen duurt, zie protocol mRNA aanmaak Vaccineer de muis door injectie van het (on)gemodificeerd luciferase mRNA: ofwel gecomplexeerd met DOTAP/DOPE, ofwel als nanopartikels door complexatie met RALA, ofwel door in vivo electroporatie (zie verder) De plaats van vaccinatie is afhankelijk van het experiment: intramusculair of via de ear pinna Injecteer 8u later intraperitoneaal 100µl Firefly D-luciferine (30mg/ml DPBS) Verdoof de muizen opnieuw m.b.v. isofluraan (4% inductie en 3% onderhoud) Analyseer exact 10min. later de luciferase expressie door de muizen onder een bioluminescentie camera (IVIS lumina II) te brengen Analyseer de data met de Living Image 4.2. software Euthanaseer de muizen d.m.v. cervicale dislocatie DOTAP/DOPE complexatie DOTAP/DOPE aanmaak: Breng 100ul van de chloroform-DOTAP oplossing (25 mg/ml) en 100ul van de chloroform-DOPE oplossing (25 mg/ml) over naar een propere kolf van 10ml Evaporeer de chloroform m.b.v. een vloeibare stikstofbron Los de film die achterblijft op de kolf op door te vortexen met 2500µl nuclease vrij water en een 3tal beads Breng de inhoud over naar donkere glazen vials Sonificeer 5min. in warmwaterbad zodat de lipiden niet segregeren Bewaar bij 4°C, kan 3-4 dagen bewaard blijven Inkapselen van het mRNA in DOTAP/DOPE: Vorm mRNA partikels net voor de immunisatie Werk per groep van 3 muizen 3 muizen x 40µl = 140µl per groep en 8µg mRNA per 40µl of per muis: Per groep: 28µg mRNA +55,5µl DOTAP/DOPE 28µl glucosewater + 28µl glucosewater 79 Addendum Immunisatie: In animalarium: Verdoof de muizen intraperitoneaal met 150-200µl ketamine/xylazine Laat mRNA DOTAP/DOPE complex 15 minuten incuberen bij kamertemperatuur en injecteer dan 20µl in beide voetzolen RALA complexatie Inkapselen van het mRNA in RALA: Vorm mRNA partikels net voor de immunisatie Werk per groep van 3 muizen N/P ratio 5: 2,5 µg mRNA met 18,125 µg RALA, opgelost in water Immunisatie: In animalarium: Verdoof de muizen intraperitoneaal met 150-200µl ketamine/xylazine Laat mRNA RALA complex 20 minuten incuberen bij kamertemperatuur en injecteer dan In vivo electroporatie In animalarium: Verdoof de muizen intraperitoneaal met 150-200µl ketamine/xylazine Injecteer het vaccin: twee maal 15µl mRNA, op twee verschillende sites Dit kan via verschillende toedieningroutes: ten eerste intramusculair in de craniale spieren van de tibius voor elk achterbeentje. Ten tweede in de dermis van de ear pinna voor beide oortjes. Ten derde intradermaal in de dermis t.h.v. de buik. Deze sites worden indien nodig eerst geschoren. Voor het uitvoeren van de electroporatie wordt de betreffende plaats ingewreven met een geleidende gel (Aquasonic 100, ultrasound transmission gel, Parker, USA), zodat elektrisch contact met de huid verzekerd wordt. De injectiesites worden tussen twee electrodes geplaatst. Tijdens electroporatie in de ear pinna wordt een korte High Voltage puls (700 V/cm 100μs) gevolgd door een Low Voltage puls (200 V/cm 400ms), uitgevoerd met een Cliniporator system (Cliniporator, IGEA, Italy). Later worden de betreffende lymfeknopen geïsoleerd voor analyse. Voor intramusculaire electroporatie wordt een achtvoudige golf uitgezonden (200 V/cm, 20 ms, 2 Hz) Voeg ook negatieve controles toe per groep: injecteer 30µl PBS 80 Addendum De in vivo electroporaties werden uitgevoerd door Gaëlle Vandermeulen, in samenwerking met Université catholique de Louvain. In vivo proliferatie assay Dag 0: MACS sortering van OT-I cellen: Gebruik de CD8+ T Cell Isolation Kit for mice van Miltenyi Biotec Voorbereiding single cell suspension: In animalarium: Isoleer zowel de milt als zoveel mogelijk lymfeknopen van de OT-I muizen en breng deze in PBS In tissue culture facility: Breng de milt en lymfeknopen over een cellstrainer (70µm) door te pletten en wassen met PBS. Werk steeds op een kleine petriplaat om verliezen tegen te gaan. Breng de cellen over naar kleine epjes Centrifugeer 7min, 400g, 4°C + shortspin Verwijder supernatans en voer rode bloedcel lyse uit door de pellet op te lossen in 1ml ACK hypotonische lysebuffer (Lonza). Plaats 2min bij kamertemperatuur en breng over naar cellstrainer (70µm) over petriplaat. Breng de cellen over naar kleine epjes Neutraliseer door toevoegen van PBS Centrifugeer 7min, 400g, 4°C + shortspin Verwijder supernatans en resuspendeer pellet met PBS Breng over naar cellstrainer (70µm) over petriplaat zodat absoluut geen vet achter blijft die de kolom zou kunnen verstoppen Breng de cellen over naar kleine epjes Centrifugeer 7min, 400g, 4°C + shortspin Verwijder supernatans Magnetische labeling: Resuspendeer celpellet in 40µl MACS buffer per 107 cellen. We verwachten 100miljoen cellen per muis dus doe 40µl maal 10 voor 1 muis. Voeg 10µl biotine-antilichaam cocktail toe per 107 cellen Mix goed en incubeer voor 15min in de koude kamer bij 4°C Voeg 30µl MACS buffer toe per 107 cellen Voeg 20µl anti-biotine microbeads toe per 107 cellen Mix goed en incubeer voor 15min in de koude kamer bij 4°C 81 Addendum Magnetische scheiding: Plaats de LS kolom in het magnetische veld van de MACS separator Was de kolom met 3ml MACS buffer Breng de celsuspensie over de LS kolom en vang de flowthrough (niet gelabelde OT-I cellen) op in een tube Was de kolom met 3ml MACS buffer. Vang de overblijvende niet gelabelde OT-I cellen op en verdeel ze over kleine epjes CFSE labeling: In tissue culture facility: Was de cellen twee maal in medium zonder serum Resuspendeer de cellen in medium zonder serum, voor T-cellen: breng naar 50 * 106 cellen/ml Incubeer bij 37°C in waterbad Verdun CFSE in medium zonder serum meteen voor gebruik, voor T-cellen: 1/10 tot 0,5mM Voeg CFSE verdunning toe aan de cellen: 10µl CFSE verdunning per ml celsuspensie voor in vitro applicaties 20µl CFSE verdunning per ml celsuspensie voor in vivo applicaties Incubeer 10min ronddraaiend bij 37°C Voeg een overmaat van ijskoud medium toe met serum om de reactie te blokkeren Was de cellen twee maal in medium met serum Intraveneuze injectie van CFSE gelabelde OT-I of OT-II cellen: In animalarium: Plaats de B6 WT muizen max. 6 minuten onder de rode lamp zodat de staart vene zichtbaar worden Injecteer 200ul celoplossing (CFSE gelabelde OT-I of OT-II cellen) in de staart vene (1miljoen cellen per 200µl) Dag 2: mRNA aanmaak: Zie protocol mRNA aanmaak. mRNA moet op voorhand aangemaakt worden want dit duurt meerdere dagen. Bewaar mRNA bij -80°C aangezien het heel onstabiel is. mRNA (of pDNA) immunisatie: Immunisatie met gemodificeerd OVA mRNA dat zelf aangemaakt werd of met aangekocht OVA mRNA van TriLink. Immunisatie werd uitgevoerd d.m.v. verschillende technieken. Enerzijds werden mRNA lipoplexen met DOTAP/DOPE toegediend, zie protocol DOTAP/DOPE 82 Addendum complexatie. Anderzijds werden er mRNA nanopartikels toegediend, na combinatie met RALA peptiden, zie protocol RALA complexatie. Tenslotte werd ook in vivo electroporatie van mRNA onderzocht, zie protocol in vivo electroporatie. Dag 5: In vivo T-cel proliferatie onderzoek door flow cytometrie: Isoleer de betreffende lymfekopen (oor en inguinaal) en breng deze in PBS. Isoleer eveneens de milt en lymfeknopen van een controle muis om later single stains van te maken. Plet de lymfeknopen over een cellstrainer (70µm), was met PBS en breng alles naar kleine epjes Centrifugeer 7min, 4°C, 400g en shortspin Neem supernatans af en voer rode bloedcel lyse uit door de pellet op te lossen in 1ml ACK hypotonische lyse buffer (Lonza). Plaats 2min bij kamertemperatuur. Neutraliseer met PBS Breng opnieuw over een cellstrainer (70µm), was met PBS en breng alles naar kleine epjes, zet op ijs Centrifugeer 7min, 400g, 4°C en shortspin Neem supernatans af en resuspendeer pellet in bepaalde kleuring afhankelijk van het experiment, voor flow cytometrische analyse, zie hieronder Flow cytometrie Voor in vivo OT-I proliferatie onderzoek: Maak een 10x verdunning van het dextrameer (5µl dextrameer in 50µl PBS mét serum, maak totaal volume afhankelijk van je aantal stalen) (SIINFEKL H-2kb PE, Immudex) Resuspendeer pellet met 50µl oplossing waarin het dextrameer Breng je stalen 20min. op kamertemperatuur in het donker aangezien het dextrameer lichtgevoelig is Centrifugeer 7min, 400g, 4°C, shortspin, neem supernatans af Resuspendeer pellet met 50µl specifieke antilichaam mastermix Plaats stalen 30min. bij 4°C Antilichaam mastermix (afhankelijk van het experiment): Antilichamen traag shortspinnen (400g) voor gebruik! Maak genoeg afhankelijk van het totaal aantal stalen, wetende dat aan elk staal 50µl moet worden toegevoegd, en maak volgende verdunningen van de merkers in PBS zonder serum: CD3 merker (Pacific Blue): 100x (T-cel merker) CD8 merker (PerCP): 100x (CD8+ T-cel merker) L/D merker (AmCyan): 1000x (merkt de dode cellen) Fc block: 500x (om kleuring door aspecifieke binding te vermijden) CD 19 (APC): 200x (B-cel merker) 83 Addendum Voor de single stains: slechts 1 antilichaam oplossen in de juiste verdunning met PBS zonder serum en hiervan 50µl nemen en pellet resuspenderen. Maak ook een blanco: pellet resuspenderen in 50µl PBS én een single stain voor CFSE: pellet resuspenderen in 50µl PBS. Na de kleuring: Voeg per epje 200µl ijskoude PBS toe om te wassen Centrifugeer 7min, 400g, 4°C, shortspin, neem supernatans af Resuspendeer pellet met 200µl PBS Breng voor elk staal 200µl op een well van een 96-well plaat met V-bodem Analyse van T-cel proliferatie met triple-laser (B-V-R) LSR-II flow cytometer (Becton Dickinson) Bradford assay Met deze assay worden de eiwitconcentraties voor elk staal bepaald zodanig dat de stalen naar dezelfde eiwitconcentratie kunnen gebracht worden Bewaar alle componenten op ijs Breng de stalen over naar 15ml tubes na te oogsten en centrifugeer de stalen bij 4°C , 7min, 400g en resuspendeer de pellet met 300µl RLT lysebuffer (van de QIAgen RNeasy plus mini kit) waaraan β-mercapto-ethanol (100x) werd toegevoegd, doe dit onder de flow Controleer de lysebuffer m.b.v. verschillende verdunningen (met nuclease vrij water) en gebruik de juiste verdunning waarbij geen achtergrond te zien is Verdun je stalen naar de juiste verdunning (met nuclease vrij water), afhankelijk van de voorgaande stap Maak een verdunningsreeks aan, breng op een 96 wellplaat per verdunning 250µl Bradford met 5µl BSA aan een bepaalde concentratie, maak ook een blanco Laad 5µl gelyseerd staal samen met 250µl Bradford Incubeer minstens 5min bij kamertemperatuur Meet de absorbantie bij 595nm met de spectrofotometer (Bio-Rad iMark Microplate Reader) Breng de stalen naar de laagste concentratie door te verdunnen met nuclease vrij water Bewaar de stalen bij -20°C Western blot In eiwit electroforese lokaal: SDS Page: Gebruik glasplaten van 1,5mm en reinig ze met 70% ethanol Breng dikke en dunne glasplaat samen en plaats ze in de groene houder, steek dit vast in de groene klem, zorg ervoor dat de onderkanten diep genoeg zitten zodat de gel niet gaat lekken 84 Addendum Maak een running gel, werk hiervoor in de flow want acrylamide is neurotoxisch, voeg TEMED en APS respectievelijk als voorlaatste en laatste toe, percentage van de gel is afhankelijk van de grootte van de eiwitten Eiwit grootte (kDa) 4-40 12-45 10-70 15-100 25-200 Gel percentage (%) 20 15 12,5 10 8 Breng de gel met pipetboy tussen de glasplaten, ongeveer 10ml per gel Breng een laagje isopropanol over de running gel, dit gaat de gel afsluiten van lucht en zorgt voor snellere plymerisatie, vermijd luchtbellen Laat 30min stollen Giet isopropanol weg en was met bidi, neem met een Whatmann papiertje het overige water weg maar raak de gel niet aan Maak een stacking gel, ongeveer 5ml per gel 85 Addendum Breng de gel met pipetboy tussen de glasplaten tot bovenaan en breng de kammetjes van 1,5mm in, vermijd luchtbellen Laat 30min stollen Nadat de gel gestold is, haal de kammetjes er uit Plaats nu de gel in houder met de kleine glasplaat naar binnen toe en breng dit naar een grote bak, duw naar beneden en klik vast Vul het middelste stuk volledig met verse 1xTG running buffer, vul het buitenste stuk tot aan de helft 10x Running Buffer (1 liter): 144,2g glycine + 30,3g Tris base + 5g SDS (onder trekkast) Laad de merker (15µl van Invitrogen of 6µl van Fermentas of 5µl van Bio-Rad) Voeg 6x SDS loading dye (3x Laemmli buffer + β-mercaptoethanol) toe aan de stalen, opkoken voor 10min bij 95°C en vortex 30s-1min tot er geen viskeuze oplossing meer is Laad de stalen: 20-120µg, je kan kiezen hoeveel µg je laadt, max 60µl Loop de gel bij 100V tot de staaltjes door de stacking gel zijn (ongeveer 15min), verhoog voltage dan tot 170V Stop met lopen als het front bijna van de gel gaat lopen, ongeveer na 1u Blotten: Snij Whatmann papiertjes en nitrocellulose membraan (6,5 x 8,5 cm) Vul een aantal schaaltjes met de 1x Transfer Buffer en drenk de Whatmann papiertjes, cellulose membranen (zonder blauw papier) en de sponsje er in 10x Transfer Buffer (1 liter): 144,2g glycine + 30,3g Tris 1x Transfer Buffer (1 liter): 100ml 10x Transfer Buffer + 200ml Methanol + 700ml water Haal de glasplaten uit de dragers en giet de running buffer weg Haal voorzichtig de dunne glasplaat van de gel en snij de stacking gel met het front af Snij de zijkanten los van de glasplaat Laad de cassette in deze volgorde: (+) witte kant cassette – spons – 3 Whatmann papiertjes – nitrocellulose membraan – eiwitgel - 3 Whatmann papiertjes – spons – zwarte kant cassette (-) Let op dat er geen luchtbellen gevormd worden, snij een hoekje af van het nitrocellulosemembraan aan de ladder zodat je weet aan welke kant de eiwitten zich zullen bevinden Breng de cassette in de tank, wit aan de + zijde (rood) en zwart aan de – zijde (zwart) Vul de tank met 1x Transfer Buffer Breng een koelelement in aan de zwarte zijde Blot 1u bij 100V 86 Addendum Blokkeren membraan: Blokkeer membraan al schuddend met 10ml TBST met 5% melk of 5% BSA, 1u bij kamertemperatuur of overnacht bij 4°C, de kant van het nitrocellulosemembraan waar de gel op lag, moet bovenaan liggen in het bakje 10xTBS (1 liter): 80g/l NaCl + 24,2 g/l Tris pH 7,4 met HCl 5% melk, 0,1% Tween: 25gr melkpoeder + 500μl Tween20 aanlengen tot 500ml met 1xTBS Toedienen primair antilichaam: Verdun het primair antilichaam in TBST Incubeer het membraan met het primair antilichaam al schuddend, 1u bij kamertemperatuur of overnacht bij 4°C Toedienen secundair antilichaam: Was het membraan drie maal met TBST, telkens 10min Incubeer het membraan met het secundair antilichaam 1u bij kamertemperatuur ECL detectie met ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific): Was het membraan drie maal met TBST, telkens 10min Kuis de cassette uit met ethanol Let op dat het membraan niet uitdroogt Knip 2 plastic folies op de juiste maat van de cassette en plak ze vast aan elkaar in de cassette Maak een 1:1 verdunning van de detectie-oplossing 1 en 2, doe dit pas net voordat je het membraan in de oplossing dept Leg het membraan in de cassette met eiwitten naar boven, breng een druppel detectie-oplossing op het membraan en bedek met transparant, vermijd luchtbellen Breng de lichtgevoelige film in het Amersham Imager 600 toestel (GE Healthcare BioSciences AB) Precision Plus Protein All Blue Standards (Bio-Rad) 87 Addendum qPCR mRNA isolatie met de RNeasy plus minikit van QIAGEN: Werk RNAse vrij, spuit met RNAse ZAP op de bench, pipetpunten en handschoenen Oogst de cellen na in vitro transfectie, was met ijskoude PBS Bereid cellysaten door 350µl RLT lysebuffer (QIAGEN) toe te voegen waaraan 1% βmercaptoethanol werd toegevoegd; 10µl β-mercaptoethanol per 1ml RLT-buffer Breng het cellysaat over naar een gDNA eliminatiekolom die in een collectietube geplaatst wordt Centrifugeer 30s, max. snelheid bij 4°C en collecteer de doorloop Voeg 1 volume 70% ethanol toe aan de doorloop en mix goed Breng het staal over naar een RNeasy spin kolom die in een collectietube geplaatst wordt Centrifugeer 30s, max. snelheid bij 4°C en verwijder doorloop Breng 700µl RW1 buffer op de kolom Centrifugeer 30s, max. snelheid bij 4°C en verwijder doorloop Breng 500µl RPE buffer op de kolom Centrifugeer 30s, max. snelheid bij 4°C en verwijder doorloop Breng 500µl 80% ethanolbuffer op de kolom Centrifugeer 2min., max. snelheid bij 4°C en verwijder doorloop Plaats de kolom in een nieuw RNase vrij epje Centrifugeer 5min., max. snelheid bij 4°C en verwijder doorloop, let op dat alle ethanol weg is Breng de kolom naar een nieuw RNase vrij epje Breng 15µl nuclease vrij water rechtstreeks op de kolom en centrifugeer 1min., max. snelheid bij 4°C om het mRNA te elueren Plaats het mRNA steeds op ijs Meet mRNA concentratie met de Nanodrop ND-1000 van Isogen LifeScience cDNA synthese met de iScript cDNA kit van Bio-Rad: Werk RNAse vrij, spuit met RNAse ZAP op de bench, pipetpunten en handschoenen Bepaal a.d.h.v. de laagste mRNA-concentratie hoeveel cDNA er kan gesynthetiseerd worden. Per staal wordt dezelfde mRNA concentratie gebruikt om hieruit cDNA aan te maken. Verdun dus elk mRNA staal naar dezelfde concentratie. Zorg ervoor dat het totale volume 15µl bedraagt. Breng deze stalen naar de PCR tubes. Voeg vervolgens 4μl 5x iScript reaction mix en 1μl iScript reverse transcriptase toe per reactie. Short spin de PCR strips PCR run: 25°C voor 5min 42°C voor 30min 85°C voor 5min Hold 4°C 88 Addendum qPCR met de SensiFAST SYBR kit van Bioline: Maak een overzicht van de wellplaat: per blok is het dezelfde conditie DNA, per rij is het dezelfde primer, werk steeds met triplicaten Breng de cDNA stalen naar 4ng/µl door te verdunnen met nuclease-vrij water Breng 2µl cDNA (dus 8ng cDNA) per welletje in een 384-well plaat Voeg vervolgens aan elk welletje 5µl SensiFAST SYBR mix toe Je kan hiervoor per blok een mix maken van je mastermix samen met je cDNA Voeg voor elke reactie 3µl gepaste forward en reverse primer (1µM) toe Je kan hiervoor per rij een mix maken van forward en reverse primer Sluit de plaat af met de gepaste folie Spin de 384-well plaat en breng de plaat in de qPCR machine LightCycler480 (Roche) Vergeet niet een stabiel huishoudgen toe te voegen voor normalisatie (zoals actine, mRPL en TBP) Klonering PCR: PCR product creëren zodat gen van interesse (NS1, IRF2, gemuteerd en niet gemuteerd eIF2α) omringd wordt door gepaste knipsites (BamHI en AflII), noodzakelijk voor ligatie in standaardvector. Breng de 500µM primerstock naar 1µM (maak een tussenverdunning) Breng voor de PCR reactie volgende componenten samen in een nuclease vrij epje: 10x Pfu DNA Polymerase Buffer met MgSO4: 5µl 10mM dNTP mix: 1µl Primer mix: 1,5ul 1µM upstream primer en 1,5ul 1µM downstream primer (die gewenste knipsites bevatten) DNA template: 1µl (aan 1µg/µl is 1µg) Pfu DNA Polymerase Promega (3U / µl): 1µl Gedemineraliseerd H2O: aanvullen tot 50µl (dus 39µl) Voeg het Pfu DNA polymerase slechts toe na het toevoegen van de dNTP’s, aangezien de proofreading activiteit van het polymerase anders de primers zou afbreken wat zou leiden tot een aspecifieke amplificatie en verlaagde opbrengst. Maak ook een negatieve controle waaraan geen DNA template wordt toegevoegd Short spin de PCR strips PCR run: Initiële denaturatie 95°C voor 1-2min Denaturatie 95°C voor 0,5-1min Annealing 60°C voor 30sec 25-35 PCR cycli Extensie 72-74°C voor 2min Finale extensie 72-74°C voor 5min Hold 4°C oneindige cyclus Stalen opslaan bij 4°C 89 Addendum DNA opzuivering met de QIAQuick PCR purification kit, QIAGEN: In tissue culture facility: Binding van het DNA aan de kolom: Voeg 5 maal volume bindingsbuffer PB toe aan 1 volume DNA (dus 250µl) Breng voor elk staal een spin column in een collection tube Breng het staal over naar de kolom Centrifugeer 1min, 13.000rpm, kamertemperatuur Verwijder flow through en breng de kolom opnieuw in collectie tube Wassen: Was met 750µl wasbuffer PE Centrifugeer 1min, 13.000rpm, kamertemperatuur Verwijder flow through en breng kolom over naar nieuw RNAse vrij epje Elutie: Elueer met 30µl RNAse vrij water Centrifugeer 1min, 13.000rpm, kamertemperatuur Plaats plasmide DNA op ijs DNA (agarose gel) electroforese: Controleren of PCR goed gelukt is Voeg aan 5µl staal 1µl loading dye toe (6x met SDS) Maak 1x TBE buffer, vul de electroforesekamer met dit Maak een agarose gel met gewenste concentratie Bereid een casting tray voor met plakband Breng agarosemengsel in de casting tray, verwijder alle luchtbellen, voeg kammetjes in en laat 15min staan Nadat de gel verhard is, verwijder kammetjes en ook de plakband en breng de casting tray in de electroforesekamer, de agarose gel moet volledig ondergedompeld zijn in de 1x TBE buffer Breng 6µl gepaste DNA ladder (Promega) in eerste welletje Breng PCR product in beschikbaar welletje Run 1h bij 70V Plaats gel 20min en EtidiumBromide bad Plaats gel vervolgens 10min in waterbad Maak foto van de gel met het Bio-Rad Gel Doc 2000 toestel 90 Addendum Promega 1kb ladder Restrictiedigest: Zowel het acceptor plasmide als het PCR product worden verknipt met BamHI en AflII. Indien mogelijk kan er tegelijk geknipt worden met beide restrictie-enzymes. In dit geval is dit niet mogelijk aangezien er star activity zal optreden indien we de CutSmart buffer gebruiken. Vandaar dat we de restrictiedigesten apart uitvoeren. PCR product verknippen met AflII, voeg hiervoor volgende componenten samen: 25µl PCR product (alles) 10x CutSmart buffer: 10µl 20 units AflII (20.000U/ml, BioLabs): 5µl (overmaat) aanlengen tot 100µl oplossing met nucleasevrij water (hier 60µl) Plaats overnacht bij 37°C DNA opzuivering met de QIAQuick PCR purification kit zie hierboven. PCR product verder knippen met BamHI, voeg hiervoor volgende componenten samen: 30µl PCR product (alles) 10x 3.1 buffer: 10µl 10 units BamHII (20.000U/ml, BioLabs): 5ul (overmaat) aanlengen tot 100µl oplossing met nucleasevrij water (hier 55µl) Plaats overnacht bij 37°C Acceptor plasmide verknippen met AflII, we gebruiken de pGEM4Z vector waar al luciferase in gekloneerd werd en we gaan het luciferase er nu uithalen. Dit plasmide werd bewaard aan 450ng/µl, neem hiervan 3µg dus 6,6µl. 10x CutSmart buffer: 10µl 20 units AflII (20.000U/ml, BioLabs): 5µl overmaat aanlengen tot 100µl oplossing met nucleasevrij water (hier 78,4µl) Plaats overnacht bij 37°C DNA opzuivering met de QIAQuick PCR purification kit zie hierboven. 91 Addendum Acceptor plasmide verder knippen met BamHI, voeg hiervoor volgende componenten samen: 30µl PCR product (alles) 10x 3.1 buffer: 10µl 10 units BamHII (20.000U/ml, BioLabs): 5ul (overmaat) aanlengen tot 100µl oplossing met nucleasevrij water (hier 55µl) Plaats overnacht bij 37°C DNA (agarose gel) electroforese: Voordat de ligatie wordt ingezet moet het acceptor plasmide gescheiden worden op grootte en kan ook het PCR product gecontroleerd worden op grootte om na te gaan of er correct geknipt werd. Hiervoor wordt een agarose gel gelopen waarna de bandjes van correcte grootte gepurificeerd worden met de gel purificatie kit. Protocol agarose gel zie hierboven: 50µl staal + 10µl loading dye (6x). Purificatie DNA met de QIAQuick Gel Extraction kit, QIAGEN: Snij het DNA fragment uit de agarosegel met een steriel, scherp pincet Weeg het gelstukje in een kleurloze tube en voeg 3 volumes QG buffer toe (100mg ~ 100μl). Voor >2% agarosegels voeg 6 volumes QG buffer toe. Incubeer bij 50°C voor 10min en vortex de tube elke 2-3min om de gel te laten oplossen Nadat het gelstukje volledig is opgelost, controleer of er een gele kleur ontstaan is. Indien de kleur van het mengsel oranje of paars is, voeg dan 10µl 3M natriumacetaat met pH 5,0 toe en mix. De kleur van het mengsel zal geel worden. Voeg 1 volume isopropanol toe en mix Plaats een QIAquick spin column in een 2ml collection tube Om het DNA te binden, breng het staal op de kolom en centrifugeer 1min, 13.000rpm Verwijder flowtrough en plaats de kolom opnieuw in de tube Indien het DNA later gebruikt wordt voor sequenering, in vitro transcriptie of microinjectie, voeg dan 0,5ml QG buffer toe aan de kolom en centrifugeer 1min, 13.000rpm, verwijder flowtrough en plaats de kolom opnieuw in de tube Voeg 0,75ml PE buffer toe aan de kolom om te wassen en centrifugeer 1min, 13.000rpm Verwijder flowtrough en plaats de kolom opnieuw in de tube Indien het DNA zal gebruikt worden voor zoutgevoelige toepassingen zoals sequenering en blunt-ended ligatie, laat de kolom dan 2-5min staan na toevoeging van de PE buffer Centrifugeer opnieuw 1min, 13.000rpm om de wasbuffer te verwijderen Plaats de kolom in een nieuw, steriel 1,5ml epje Voeg 30µl nuclease vrij water toe aan de kolom voor elutie en centrifugeer 1min, 13.000rpm 92 Addendum Ligatie van het PCR product en acceptor plasmide: Wij maken gebruik van een 1:3 ratio vector:insert DNA Voeg volgende componenten samen: 2µl vector DNA 6µl insert DNA 1µl ligase 10x buffer 1µl T4 DNA ligase (3U/µl, Promega) Leng aan met nuclease vrij water indien nodig tot 10µl Incubeer 20min bij kamertemperatuur of overnacht bij 4°C of 4-18u bij 15°C De ligatie kan gecontroleerd worden op gel Transformatie naar E. coli: In LAF ruimte: Breng 2µl van de ligatie-oplossing over naar 200µl competente E. coli en plaats 20min op ijs Hitteshock bij 42°C voor 1min zonder schudden Breng meteen op ijs voor 20min Voeg 800µl LB medium zonder ampicilline toe aan getransformeerde E. coli Laat 1h bij 37°C shaken Plaat uit op ampicilline platen door 100µl over te brengen en strijk open met beads Laat overnacht schuddend groeien bij 37°C Kolonie PCR: Breng de 500µM primerstock naar 10µM Stel voor de PCR reactie een MasterMix samen in een nuclease vrij epje (maal het aantal stalen): 10x buffer: 5µl x = 5mM MgCl2: 2µl x = 10mM dNTP mix: 1,5µl x = Primer mix: 5ul 5µM forward primer en reverse primer x = DMSO: 2,5µl x = Taq DNA Polymerase (Invitrogen (5U / µl): 0,3µl x = Gedemineraliseerd H2O: aanvullen tot 50µl x = Voeg het Taq DNA polymerase als laatste toe Breng 50µl MasterMix in elk PCR epje na te vortexen Pik één kolonie en dip dit in het PCR epje, plaat hierna je kolonie opnieuw uit op een LB plaat met ampicilline aan toegevoegd en plaats in de incubator bij 37°C. Pik 10 kolonies per staal en voer voor elke kolonie een kolonie PCR uit. Hierna kan op gel gecontroleerd worden of de correcte kolonie gepikt werd en dan kan van de positieve kolonies een vloeibare bacteriecultuur van gestart worden om te laten sequeneren. Maak ook een negatieve controle waaraan geen kolonie wordt toegevoegd Short spin de PCR strips 93 Addendum PCR run: Initiële denaturatie 96°C voor 3min Denaturatie 96°C voor 45sec Annealing 54°C voor 30sec 25-35 PCR cycli Extensie 72°C voor 2min30sec Finale extensie 72°C voor 10min Hold 4°C oneindige cyclus Stalen opslaan bij 4°C DNA (agarose gel) electroforese: Protocol agarose gel zie hierboven: 2µl loading dye (6x met SDS), 8µl nuclease vrij water en 2µl PCR product in een epje voor elk plasmidestaal. Vloeibare bacteriecultuur aanmaken: Pik met een pipetpunt een positieve kolonie op van het correcte PCR staal Breng dit over naar een glazen vial met 5ml TB medium waaraan een 1000x verdunning ampicilline werd toegevoegd Laat overnacht schuddend groeien bij 37°C Stuur een staal op voor sequenering 94
