15 – Gen regulatie bij eucaryoten

15 – Gen regulatie bij eucaryoten
15.1 Regulataire transcriptie factors
General transcription factors= alle factoren die nodig zijn voor basaal niveau van transcriptie.
Regulatory transcription factors= factoren die de mate waarin transcriptie voorkomt regelen.
2-3% van de genen in mensen zijn transcriptie factors.
Activators binden aan enhancers
Repressors binden aan silencers.
Transcription factors eiwitten betreffen regio’s(domains). Deze hebben specifieke functies.
Heeft een (deel ven een) domain in veel eiwitten de zelfde functie= een motif.
Verschillende motifs zijn:
- Helix-turn-helix: twee α-helixen verbonden zijn door een draai. Deze liggen in de major groove van
het DNA(=regio van het DNA waar de basen met het omliggende water in contact staan)
- Helix-loop-helix: een korte α-helix is door een loop verbonden aan een langere α-helix.
- Zinc finger motif: 1 α-helix en 2 β-sheets verbonden door een zink ion(Zn2+).
- Leucine zipper: Een ‘dimerization’ van 2 transcriptie factor eiwitten; 2 α-helixen in elkaar gedraaid
door leucines.
Twee delzelfde transcriptie factor eiwitten vormen een homodimer.
Twee verschillende transcriptie factor eiwitten vormen een heterodimer.
Up regulation: stimulatie van transcriptie(10- tot 1000-keer)
Down regulation: activiteiten van silencers.
Orientation-independent(bidirectional)= regulatie element kan twee kanten op functioneren.
Meeste regulatie transcriptie factoren binden niet direct aan RNA polymerase. Twee regelen dit:
-TFIID: bindt aan de TATA-box, en verzameld RNA polymerase II. Activatoren kunnen het effect van
TFIID verhogen. Activator eiwitten vergroten hun effecten door coactivatoren.
-Mediator: bemiddeld de interactie tussen RNA polymerase II en regulatie transcriptie factoren.
De functies van regulatie transcriptie factoren worden beheerst door:
1) de binding van een ‘small effector molecule’
Steroïden hormonen, endocrinen, secretie in de bloedbaan -> opgenomen door cellen -> initiate
iets in een cel(glucocorticoid, gonadocorticoids)-> gaan de cel in.
De meeste hechten daarentegen aan receptoreiwitten op het membraan(CREB-eiwit)
2) protein-protein interactions
3) covalente modificaties
15.2 Chromatide herinrichting etc.
Chromatin remodeling= dynamische veranderingen in de structuren van de chromatiden. Uitgevoerd
door ATP-afhankelijke chromatin-remodeling complexes.
Wanneer de chromatide in zijn ‘closed formation’ is, transcriptie is moeilijk of niet mogelijk.
Wanneer de chromatide in zijn ‘open conformation’ is, is hij makkelijker toegankelijk voor
transcriptie factoren.
Het veranderingsproces wordt door een eiwitcomplex dat nucleosomen herkent uitgevoerd. Elk
complex heeft een catalic ATPase subunit(DNA translocases). Eukaryoten hebben meerdere families
die chromatiden herinrichten: SWI/SNF, ISWI, INO80, Mi-2.
Herinrichting gaat op 3 manieren:
1) Verandering van de locatie van nucleosomen(verplaatsing, ruimte verandering)
2) Verwijderen van histonen (maken van gaten)
3) Verandering van de compositie van nucleosomen (wisselen van normale histonen in varianten)
Er zijn 5 histone genen: H1, H2A, H2B, H3 en H4.
Alle(behalve H4) kunnen door verzamelde mutaties die de aminozuur sequence van het histone eiwit
veranderd, variant worden.
Deze varianten spelen een rol bij de regulatie van de chromatide structuur en dus bij gen transcriptie.
cenH3: zorgt voor binding van kinetochore eiwitten.
macroH2A: bij de niet actieve X chromosome bij vrouwen
spH2B: bij de telomeren in sperma cellen
H2A.X: wordt gefosforyleerd bij dubble stranded DNA breaks.
Core histone eiwitten bestaan uit een globular domain en een amino-terminal tail.
Histonen hebben direct invloed op interacties tussen necleosomen. Positief geladen lysines in de
core histone eiwitten kunnen geacetyleerd worden door histone acetyltransferase -> de verbinding
tussen het histone eiwit en de DNA backbone verslapt.
Histone modifications gebeuren in patronen, die worden herkent door eiwitten.
Dit patroon van covalente modificaties van de amino-terminal tail verzorgt een bindingsplaats voor
eiwitten die vervolgens transcriptie beïnvloeden.
Onderzoek op histonen(ChIP-Seq):
Levende cellen -> behandeld met formaldehyde -> cel breekt open -> cel wordt blootgesteld aan
hoge concentratie micrococculnase(MNase) -> breekt bindingen tussen nucleosomen af -> miljoenen
losse nucleosomen met DNA eraan vast -> toevoeging antibodies die histone eiwtitten herkennen ->
necleosomen klonteren samen en slaan neer(=immunoprecipitation) -> bindingen tussen DNA en
histonen worden zijn verbroken -> DNA wordt aangebracht op gel electrophorasis.
Eucaryoten hebben vaak een zelfde organisatie van nucleosomen. De core promotor ligt in een
NFR(mist dus histonen), ±150 bp lang. Een NFR wordt geflankeerd door 2 goed-gelegen
nucleosomen, aangeduidt met -1 en +1.
Aan het begin en eind van een gen liggen de nucleosomen gelijk verdeeld, in het midden minder.
Histone-verandering enzymen spelen ook een rol bij de verwijdering en de vervanging van histonen
tijdens de transcriptie, ze reizen mee met de RNA polymerase II.
15.3 DNA methylation
DNA methylation= de covalente binding van methylgroepen door DNA methyltransferase. -> 5methylcytosine.
Full methylation= in beide strands.
Hemimethylation= in één strand.
DNA methylation(vorming van CpG-islands) verhinderd transcriptie van een gen, vooral vlakbij de
promotor.
Housekeeping genes: genen die coderen voor eiwitten die nodig zijn in de meeste cellen. De CpG
eilanden zijn dan ook ongemethyleerd.
Tissue-specific genes: veel gereguleerde genen die alleen in bepaalde cellen tot uiting komen. CpG
eilanden kunnen zulke genen stil leggen.
Methylation heeft effect op transcriptie op 2 manieren:
1. CpG islands verhinderen de binding of verhogen de transcriptie factoren bij de promotor regio.
2. Methyl-CpG-binding proteins binden gemethyleerde seqyences. Wanneer deze gebonden zijn
verzamelen ze andere eiwitten die transcriptie verhinderen.
Gemethyleerde DNA sequences worden doorgegeven bij cel deling= maintenance methylation.
15.4 Insulators
Insulator= een DNA segment dat functioneert als een grens tussen twee genen.
- Is een barrière voor chromatin-remodeling of histone-modifying enzymen. Deze binden vaak
eiwitten die chromatin-remodeling of histone-modifying binden.
- Beschermd een gen van de regulatie effecten van een buur-gen. Of het effect van een ernaast
gelegen enhancer. De insulator ligt er dan tussen.
Vaak wordt loop-vorming gebruikt. Hiervoor is CTC-binding factor nodig(CTCF). Deze bindt aan de
insulator en aan een site(een DMR) dat na het gen komt.
15.5 Regulatie van RNA processing etc.
Alternative splicing= splicing van mRNA kan op verschillende manieren en produceert dus twee of
meer polypeptiden met verschillende aminozuren. Waardoor een organisme minder genen met zich
mee hoeft te dragen.
70% van alle menselijke pre-mRNA’s worden alternative-gespliced.
Constitutive exons= exons die hoe dan ook aanwezig zijn in mRNA in elke cel.
Alternative exons= exons die niet altijd aanwezig zijn.
Bij splicing zijn de splicing factors(eiwitten) van invloed. Bijv. SR-proteins; betrokken bij proteinprotein herkenning.
Splicing factors hun voornaamste effect is het moduleren van de mogelijkheid van het spliceosome
om de keus tussen splice sites te maken. Dit op twee manieren:
1) Als repressor zodat het spliceosome de splice site niet herkent(=exon skipping).
2) Als enhancer zodat de spliceosome bepaalde gebieden (juist) herkent.
mRNA kan zo gereguleerd worden dat zijn half-life verkort of verlengd wordt. Stabiliteit van het
mRNA heeft invloed op de concentratie.
- PolyA-tail is zo’n regulatie factor. Hij wordt herkent door de polyA-binding protein, deze vergroot de
mRNA stabiliteit. De polyA staart moet dan wel meer dan 10-30 adenosines lang zijn, anders kan het
polyA-binding protein niet meer binden en wordt het mRNA snel afgebroken.
- Ook zijn er de UTR’s, fungeren als destabilisatie elementen. Beïnvloeden of een mRNA wel of niet
snel worden afgebroken.
-Double-stranded RNA kan zorgen dan mRNA afgebroken of verhinderd wordt. Wanneer een kloon
gen(met een eigen promotor) willekeurig aangebracht wordt en toevallig naast een promotor komt,
wordt hij twee keer gemaakt -> double stranded RNA.
-RNA interference. miRNAs & siRNAs, 21-23 nucleotiden lang. miRNAs zijn deels complementair en
siRNAs zijn geheel complementair met een bepaald mRNA -> binding -> verhindering van
translatie/afbreken van mRNA. Ze worden gevormd en klappen als pre-mi/siRNA dubbel(hairpin
structure) en worden geknipt door een dicer -> double stranded RNA, wat samenwerkt met cellulaire
eiwitten tot een complex(= RNA-induced silencing complex(RISC)). Éen van de strands wordt
afgebroken en de ander kan binden aan een mRNA. RNAi bied een nieuwe mogelijkheid als
afweersysteem tegen virussen.
Phosphorylation
Phosphorylation van verschillende initiation factoren hebben effect op de translatie. Twee factoren
zijn van belang: eIF2α (verhinderd) en aIF4F(vergroot).
Als geactiveert, eIFα protein kinase phospholyseerd eIFα -> eIFα bind aan eIF2B(wat nodig is voor het
maken van tRNAMet) -> eIF2B verliest zijn functie -> geen translatie.
Iron metabolism
Ijzer komt in de bloedbaan en wordt meteen gebonden aan eiwit transferrin. Dit complex wordt
herkent door een receptor op het membraan van een cel -> bind hieraan en word door endocytosis
de cytosol ingebracht -> ijzer wordt losgelaten en bind aan enzymen die hem nodig hebben.
Te veel ijzer wordt opgeslagen in een hol spherical eiwit= ferritin.
Ijzer is gevaarlijk en wordt daarom gereguleerd:
mRNAs die voor ferritin en transferrin receptor coderen, zijn onder invloed van een RNA-binding
protein(=IRP).
IRP bind aan iron responce element(IRE). Ferritin heeft deze in de 5’UTR.
IRP bindt aan IRE -> geen translatie van mRNA.
Is er heel veel ijzer -> ijzer bindt aan IRP -> IRP bindt niet aan IRE -> wel translatie.
Transferrin receptor heeft de IRE in de 3’UTR.
IRP bindt aan IRE -> stabiliteit van mRNA wordt groter -> vergroting hoeveelheid transferrin receptor
in een cel met weinig ijzer.
Is er heel veel ijzer -> ijzer bindt aan IRP -> mRNA wordt snel afgebroken -> minder transferrin
receptoren -> voorkomt de opname van nog meer ijzer.