University of Groningen Modification of (bio)material surfaces using

University of Groningen
Modification of (bio)material surfaces using hydrophobins
Janssen, Meike Irene
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2004
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Janssen, M. I. (2004). Modification of (bio)material surfaces using hydrophobins s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
Nederlandse samenvatting
Het gebruik van hydrofobines
om (bio)materiaal-oppervlakken te veranderen
Nederlandse samenvatting
90
Nederlandse samenvatting
Nederlandse samenvatting
Hydrofobines zijn eiwitten van ongeveer honderd aminozuren die door draadvormige
(filamenteuze) schimmels in hun celwand of in het waterig milieu worden uitgescheiden. Zij
vervullen een groot aantal functies in de groei en ontwikkeling van deze schimmels [Wessels,
1997; Wö sten en Wessels, 1997; Wö sten, 2001]. Door de oppervlaktespanning van het waterig
substraat te verlagen zorgen hydrofobines ervoor dat schimmeldraden (hyfen) uit het substraat
kunnen ontsnappen om zo in de lucht sporenvormende structuren (zoals paddestoelen) te kunnen
vormen. Deze luchtstructuren worden door hydrofobines gecoat, waardoor ze waterafstotend
worden. Hierdoor kan de schimmel niet terug groeien in het waterig substraat groeien, worden
sporen efficiënt door wind en insecten verspreid, en is gasuitwisseling in paddestoelen mogelijk
zelfs als het vochtig is. Voorts hechten hyfen zich middels hydrofobines aan waterafstotende
vaste materialen.
Hydrofobines vervullen hun functies in de natuur door op het grensvlak van een
waterminnend en waterafstotend oppervlak een 10 nm (één honderdduizendste millimeter) dikke
film te vormen. Dit zijn bijvoorbeeld de grensvlakken tussen water en lucht, tussen het
oppervlak van de schimmel en de lucht, of tussen het oppervlak van de schimmel en een
waterafstotend vast materiaal. Een dergelijk waterafstotend vast materiaal kan het oppervlak zijn
van een gastheer (zoals een plant) of een stuk Teflon, wat we kennen als het materiaal dat wordt
gebruikt in anti-aanbakpannen. Tijdens het vormen van de film, wat assemblage wordt genoemd,
ondergaat het hydrofobine verschillende vormveranderingen [Wö sten en de Vocht, 2000]. Het
oplosbare eiwit gaat via een tussenvorm, die de a-helix vorm wordt genoemd, over in een
stabiele eindvorm die de b-sheet vorm wordt genoemd. Op het grensvlak tussen water en Teflon
wordt het hydrofobine in de a-helix vorm gehouden. De overgang naar de b-sheet eindvorm
vindt alleen plaats door het gecoate materiaal te behandelen met een zeepoplossing (zoals 2 %
SDS) bij hogere temperatuur. De hydrofobine film heeft net als een zeep een waterafstotende en
een waterminnende zijde. De film is echter zeer onoplosbaar en hecht sterk aan waterafstotende
vaste materialen. Door assemblage van het hydrofobine op Teflon, wordt het oppervlak van het
materiaal ineens goed te bevochtigen. De mate waarop het bevochtigd kan worden hangt af van
het hydrofobine dat wordt gebruikt [Wö sten 2001].
De oppervlakte modificerende eigenschappen van hydrofobines maakt dat deze
eiwitten interessant zijn voor tal van medische en technische toepassingen. Het gebruik van
hydrofobines in medische toepassingen werd in dit proefschrift onderzocht, waarbij met name
werd gekeken naar implantaat materiaal. SC3 en SC4 van Schizophyllum commune werden
hiertoe gebruikt als model hydrofobines, terwijl Teflon als model voor biomaterialen werd
gebruikt.
91
Nederlandse samenvatting
Het coaten van waterafstotende materialen met natuurlijke en genetisch gemodificeerde
hydrofobines
Het feit dat Teflon slecht bevochtigd kan worden wordt geïllustreerd door de hoge
contacthoeken (115 graden) van waterdruppels op dit materiaal. De mogelijkheid tot
bevochtiging neemt enorm toe indien Teflon met SC3 of SC4 in de a-helix vorm werd gecoat.
De watercontacthoeken werden verlaagd tot respectievelijk 36 en 54 graden [Hoofdstuk 3 en 4].
Middels scanning elektronen-microscopie and X-ray fotoelectron spectroscopie werd
aangetoond dat de hydrofobines het Teflon egaal bedekken [Hoofdstuk 4]. Terwijl 1.5 mg SC3
[Wö sten et al., 1994a] en 2.7 mg SC4 [Hoofdstuk 4] per vierkante meter Teflon binden,
adsorbeert slechts 0.1 mg serum albumine of fibronectine [Hoofdstuk 5]. Deze laatste eiwitten
coaten het Teflon dan ook niet met een homogene laag [Murthy et al., 1987].
Indien de hydrofobine coatings werden behandeld met hete 2 % SDS om de overgang
van de a-helix vorm naar de b-sheet vorm te induceren, werd 20 % en 30 % van respectievelijk
het SC3 en SC4 verwijderd van het oppervlak. Dit ging gepaard met een verminderde
mogelijkheid tot bevochtiging (watercontacthoeken van respectievelijk 55 en 68 graden) en de
vorming van poriën in de hydrofobine film. Deze poriën hadden een diameter van ongeveer 50
nm [Hoofdstuk 4]. De hydrofobine coatings in de a-helix vorm en de b-sheet vorm bleken
stabiel in eiwitoplossingen [Hoofdstuk 5]. Met andere woorden, deze eiwitten bleken niet in
staat de hydrofobines van het oppervlak weg te competeren.
De eigenschappen van de SC3 film konden worden veranderd door genetische
modificatie van het N-terminale uiteinde van het eiwit [Hoofdstuk 2]. Het verwijderen van 25
aminozuren (TrSC3) en/of het introduceren van het celbindingsdomein Arg-Gly-Asp (RGD) van
fibronectine (respectievelijk RGD-SC3 en RGD-TrSC3) had geen invloed op het vermogen tot
assembleren [Hoofdstuk 2]. Ook de geringe mogelijkheid de waterafstotende zijde van de
hydrofobine film te bevochtigen bleek onveranderd, evenals de sterke adsorptie van deze zijde
aan waterafstotende oppervlakken. Echter, de mogelijkheid tot bevochtiging van de
waterminnende zijde bleek wel veranderd. De RGD-SC3 coating had watercontacthoeken van
46 graden, terwijl die van TrSC3 en RGD-TrSC3 respectievelijk 69 en 57 graden waren
[Hoofdstuk 2 en 3].
Beïnvloeding van adsorptie van moleculen aan oppervlakken door het gebruik van hydrofobine
coatings
Functionaliteit van biomaterialen wordt vaak negatief beï nvloed door a-specifieke binding van
eiwitten aan het oppervlak van het materiaal. Verschillende moleculen zijn beschreven die deze
adsorptie verminderen [zie Hoofdstuk 1]. De mogelijkheid om hydrofobines hiervoor te
gebruiken werd onderzocht in Hoofdstuk 5. Echter, adsorptie van eiwit afkomstig van cel culture
medium, sera, of traanvocht aan Teflon bleek niet te veranderen door de aanwezigheid van een
hydrofobine coating. Alleen fibronectine bleek sterker aan SC4 gecoat Teflon te binden dan aan
kaal of SC3-gecoat Teflon. De vorm van het geadsorbeerde eiwit kan echter wel degelijk
92
Nederlandse samenvatting
worden beïnvloed door de hydrofobine coating [Patent publicatie Nr. WO 04/000880].
Aangezien hydrofobines ontvouwing van eiwitten blijken tegen te gaan zijn deze coatings zeer
interessant om eiwitten in hun actieve vorm te binden aan een oppervlak.
Gebruik van hydrofobine coatings om groei van cellen te bevorderen
SC3 en TrSC3 bleken niet toxisch voor muize fibroblasten wanneer oplosbare of
geassembleerde vormen van deze eiwitten in het medium werden aangeboden [Hoofdstuk 3]. Dit
resultaat is uiteraard van groot belang voor het gebruik van hydrofobines in medische
toepassingen.
Om na te gaan of hydrofobine coatings gebruikt kunnen worden om groei van
fibroblasten op Teflon te bevorderen, werden dergelijke cellen van de mens en van de muis
gegroeid op kaal Teflon of op Teflon gecoat met natuurlijk of genetisch gemodificeerd
hydrofobine [Hoofdstuk 2-4]. Groei van humane fibroblasten was minimaal op kaal Teflon. Het
aantal cellen bleek groter op Teflon gecoat met SC3 of SC4 in de a-helix vorm. Ook de
morfologie van de cellen was verbeterd en de mitochondriele activiteit waren toegenomen.
Echter, celgroei in afwezigheid van gecoat of ongecoat Teflon bleek nog altijd het beste
[Hoofdstuk 3]. In tegenstelling tot de humane cellen, bleken de muize fibroblasten wel op kaal
Teflon te groeien. Dit kan verklaard worden door het feit dat de muizecellen van een tumorlijn
afkomstig zijn. De cellen bleken echter afgerond en niet gespreid zoals cellen in de afwezigheid
van Teflon. Hieruit kan geconcludeerd worden dat de cellen slecht hechten. Muize fibroblasten
bleken beter te groeien op Teflon gecoat met RGD-SC3. Het aantal cellen bleek nog hoger op
TrSC3- en SC4-gecoat Teflon, terwijl ook de morfologie van de cellen erg leek op die van cellen
in een weefselkweek zonder Teflon. Uit het feit dat de aminozuurvolgorde van deze twee
hydrofobine eiwitten maar voor 45 % identiek is, maar dat de mogelijkheid tot bevochtiging van
de waterminnende zijdes overeenkomstig is, wordt geconcludeerd dat de mogelijkheid tot
bevochtiging de bepalende factor is in het stimuleren van de celgroei.
Ofschoon groei van muize fibroblasten verbeterde door het Teflon te coaten met
natuurlijke of genetisch gemodificeerde hydrofobines in de a-helix vorm, bleek de
mitochondriele activiteit gereduceerd tot 25-60 % [Hoofdstuk 3]. De afname was het sterkst in
het geval van SC3, terwijl TrSC3 de activiteit het minst remde. Echter, remming van
mitochondriele activiteit werd praktisch niet waargenomen indien SC3 en SC4 in de b-sheet
vorm werden gebruikt [Hoofdstuk 4]. Zolang de implicatie van een gereduceerde cellulaire
activiteit niet duidelijk is, lijken hydrofobines in de b-sheet vorm het meest veelbelovend om in
medische toepassingen te gebruiken.
De resultaten die in dit proefschrift zijn beschreven laten zien dat natuurlijke en
genetisch gemodificeerde hydrofobines inderdaad gebruikt zouden kunnen worden in medische
toepassingen zoals het coaten van implantaten. In de toekomst zullen dergelijke coatings verder
geoptimaliseerd dienen te worden gebruikmakend van genetische modificatie, chemische crosslinking of door directe adsorptie van moleculen.
93
Nederlandse samenvatting
94