Ontwikkeling en evaluatie van oppervlakte gemodificeerde

Onderzoeksgroep Polymer Chemistry & Biomaterials Group Vakgroep Organische Chemie Ontwikkeling en evaluatie van oppervlakte gemodificeerde micropartikels met DNA interagerende eigenschappen Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master of Science in de Chemie door Boris Martens Academiejaar 2012-‐2013 Promotor: prof. dr. Peter Dubruel Copromotor: dr. Sandra Van Vlierberghe Begeleider: Arne Goes
Onderzoeksgroep Polymer Chemistry & Biomaterials Group Vakgroep Organische Chemie Ontwikkeling en evaluatie van oppervlakte gemodificeerde micropartikels met DNA interagerende eigenschappen Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master of Science in de Chemie door Boris Martens Academiejaar 2012-‐2013 Promotor: prof. dr. Peter Dubruel Copromotor: dr. Sandra Van Vlierberghe Begeleider: Arne Goes
Dankwoord Wie wil ik graag allemaal bedanken… ü Mijn ouders voor het aanhoren van onverstaanbare chemische verklaringen en ander gemompel. ü Mijn opa voor alle chemische interesse en steun door de jaren heen en omdat hij waarschijnlijk de enige in de familie is die nog steeds begrijpt waar ik mee bezig ben. ü Mijn vriendin Isabelle voor al haar geduld en hulp bij het uitwerken van de biochemische achtergrond. ü Mijn zusje, die er nog steeds in slaagt met haar grote broer samen te leven. Alle vrienden voor de steun in goede en iets minder goede dagen. ü Arne, voor zijn uitstekende begeleiding gedurende het ganse jaar en voor alle tijd, energie en de vele uitleg. ü Professor Dubruel voor de kans aan dit project te mogen deelnemen. ü Filip Van der Gucht en Ben De Schepper bij Xedev voor de uitstekende samenwerking en het uitlenen van hun apparatuur. ü Ana Dos Santos voor het delen van haar kennis over electrosprayen. ü Thomas Billiet voor het aanleveren van copolymeren met de geschikte eigenschappen voor verdere verwerking. ü Iedereen van de PBM groep voor de open en aangename sfeer in het labo. ü Mijn PC om niet te crashen voor het einde van mijn thesis (fingers crossed). ü En als laatste wil ik mijn thesis opdragen aan Groll, mijn trouwe hond en vaste kameraad die ons na twaalf mooie jaren heeft moeten verlaten. I Inhoudstabel Dankwoord ................................................................................................................................. I Inhoudstabel .............................................................................................................................. II Lijst met afkortingen ................................................................................................................ VII Hoofdstuk 1: Literatuurstudie ................................................................................................... 1 A. Gentherapie ...................................................................................................................... 1 B. Overzicht van verschillende types gen-‐afgiftesystemen ................................................... 2 a. Wat en waarom? ........................................................................................................... 2 b. Virale vectoren .............................................................................................................. 2 c. Niet-‐virale vectoren ....................................................................................................... 4 i. Directe injectie van naakt DNA ................................................................................... 5 ii. Naaldvrije injectie van naakt DNA ............................................................................. 6 iii. Elektroporatie ........................................................................................................... 6 iv. Calciumfosaat-‐DNA coprecipitatie ............................................................................ 6 v. Liposomale gen-‐afgiftesystemen ............................................................................... 7 vi. Cyclodextrinen en dendrimeren ............................................................................... 8 vii. Peptide gebaseerde methoden ................................................................................ 9 viii. Kationische polymeren .......................................................................................... 10 C. Barrières voor genafgifte ................................................................................................. 14 a. DNA-‐complexatie ......................................................................................................... 14 b. Internalisatie: celopname van het complex ................................................................ 15 c. Endosomale vrijstelling ................................................................................................ 15 d. Polyplex dissociatie ...................................................................................................... 16 II e. Translocatie naar de celkern ....................................................................................... 16 D. Toepassingsgebieden ...................................................................................................... 17 a. Gentherapie voor erfelijke genetische ziektes ............................................................ 17 b. Gentherapie voor kanker ............................................................................................ 17 c. Gentherapie voor AIDS ................................................................................................ 18 d. Gentherapie voor de behandeling van andere aandoeningen ................................... 19 E. Biodegradeerbare micropartikels .................................................................................... 20 a. Biodegradeerbare polyesters ...................................................................................... 20 i. Poly(lactide) .............................................................................................................. 20 ii. Poly(ε-‐caprolacton) ................................................................................................. 20 b. Biodegradeerbare micropartikels ............................................................................... 21 F. Doel: intelligente design .................................................................................................. 22 G. Referenties ......................................................................................................................... I Hoofdstuk 2: Synthese van biodegradeerbare poly(-‐L-‐glutamine) derivaten ........................ 23 A. Intelligente design: algemene strategie .......................................................................... 23 B. Synthese van γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat N-‐carboxyanhydride ............................................... 24 C. Polymerisatie van BG-‐NCA met behulp van een primair amine bevattende initiator .... 27 a. Reactiemechanisme .................................................................................................... 28 b. Synthese van poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) ................................................................... 29 D. Post-‐polymerisatie modificatie tot niet-‐virale vectoren ................................................. 32 a. Aminolyse van poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) ................................................................. 32 b. Conversie van primaire amines tot guanidines ........................................................... 33 c. Overzicht van de gesynthetiseerde derivaten ............................................................. 35 i. Synthese van p(HEGx-‐co-‐AEGy-‐co-‐ImEGz) ................................................................. 35 ii. Synthese van p(HEGx-‐co-‐GuAEGy-‐co-‐ImEGz) ............................................................ 36 E. Referenties ......................................................................................................................... I III Hoofdstuk 3: Fysico-‐chemische evaluatie van de kationische polymeren door middel van DNA condensatie ..................................................................................................................... 41 A. Polyplexvorming .............................................................................................................. 41 B. Dynamische licht verstrooiing ......................................................................................... 41 a. Analysemethode .......................................................................................................... 41 b. Effect van het moleculair gewicht van DNA op de condensatie door kationische polymeren ....................................................................................................................... 42 i. Dynamische lichtverstrooiing met kalfsthymus DNA ................................................ 42 ii. DLS met enkelstrengige oligonucleotiden ............................................................... 44 C. Gel-‐elektroforese ............................................................................................................. 45 a. Techniek ....................................................................................................................... 45 b. Agarose gel-‐elektroforese met kalfsthymus DNA ........................................................ 46 c. Polyacrylamide gel-‐elektroforese met oligonucleotiden ............................................. 47 D. Fluorescentietesten ......................................................................................................... 48 a. Fluorescentietesten met kalfsthymus DNA ................................................................. 48 b. Fluorescentietesten met oligonucleotiden .................................................................. 49 E. Referenties ......................................................................................................................... I Hoofdstuk 4: Productie, karakterisatie en oppervlakte modificatie van micropartikels ......... 51 A. Productie van biodegradeerbare micropartikels ............................................................. 51 a. Productie van micropartikels via electrosprayen ........................................................ 52 b. Productie van micropartikels via sproeidrogen ........................................................... 54 c. Vergelijking van electrosprayen t.o.v. sproeidrogen ................................................... 56 B. Ontwikkeling en evaluatie van DNA interagerende micropartikels ................................ 58 a. Plasma oppervlak modificatie ...................................................................................... 58 b. Evaluatie van de gemodificeerde beads ...................................................................... 59 C. Referenties ......................................................................................................................... I IV Hoofdstuk 5: Besluit ................................................................................................................ 61 Bijlage 1: Experimenteel deel ........................................................................................... 61 A. Synthese γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat N-‐carboxyanhydride ..................................................... 61 B. Polymerisatie van poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) met n-‐butylamine ................................. 62 C. Aminolyse van poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) ..................................................................... 63 D. Amine conversie in guanidines ....................................................................................... 64 E. Synthese van tritylaminoethylamine ............................................................................... 65 F. Synthese van p(LA-‐co-‐ε-‐CL) copolymeren ....................................................................... 67 Bijlage 2: Gebruikte technieken voor karakterisatie ........................................................ 70 A. Bepaling van de M/C-‐waarde .......................................................................................... 70 B. Dynamische lichtverstrooiing .......................................................................................... 71 C. Fluorescentie testen ........................................................................................................ 73 D. Agarose gel-‐elektroforese ............................................................................................... 74 E. Polyacrylamide gel-‐elektroforese .................................................................................... 74 F. Gel permeatie chromatografie ........................................................................................ 75 G. Differentiële scanning calorimetrie & thermogravimetrische analyse ........................... 77 H. Scanning elektronen microscopie ................................................................................... 78 I. Atoomkracht microscopie ................................................................................................ 79 J. Statische contacthoek metingen ...................................................................................... 79 K. Dynamische damp sorptie ............................................................................................... 80 Bijlage 3: Productie en modificatie van micropartikels .................................................... 82 A. Invloed van de deeltjes grootte ...................................................................................... 82 B. Productie van micropartikels via emulsie technieken ..................................................... 82 C. Productie van micropartikels via sproeidrogen .............................................................. 83 D. Productie van micropartikels via electrosprayen ........................................................... 86 E. Plasma oppervlak modificatie van micropartikels ........................................................... 87 V F. Spincoating van p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) ................................................................................... 89 Bijlage 4: Cytotoxiciteit en haemotoxiciteit ..................................................................... 90 A. Haemotoxiciteit ............................................................................................................... 90 B. Cytotoxiciteit ................................................................................................................... 91 Referenties bijlagen .................................................................................................................... I Bijlage 5: English report .................................................................................................... 93 VI Lijst met afkortingen A : adenine AIDS : verworven immunodeficiëntiesyndroom AE : aminoethanol AEG : aminoethyl-‐L-‐glutamine AFM : atoomkracht microscopie BG : γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat bp : basenparen C : cytosine CD : cyclodextrine CDCl3 : chloroform-‐D CPP : cel penetrerend peptide D : polydispersiteit DCM : dichloormethaan DLS: dynamische lichtverstrooiing DMF : dimethylformamide DNA : desoxyribonucleïnezuur DP : polymerisatiegraad DSC : differentiële scanning calorimetrie EPR : permeatie en retentie effect ES : electrospraying EtBr : ethidiumbromide EtOAc : ethylacetaat FDA : Amerikaans voedselagentschap FTIR : Fourier transform infrarood spectrometrie G : guanine GOI : gen van interesse GPC : gel permeatie chromatografie Gu : guanidine GuEG : guanidylethyl-‐L-‐glutamine VII HAC : menselijk kunstmatig chromosoom HEG : hydroxyethyl-‐L-‐glutamine His : histamine HIV : humaan immunodeficiëntievirus HSV : herpes simplex virus Im : imidazol ImEG : imidazolethyl-‐L-‐glutamine IPEC : interpolyelektrolyt complexen bp : basenparen LCST : laagste kritische solutie temperatuur LV : ladingsverhouding M/C : massa over lading Mn : numeriek moleculair gewicht MS : multiple sclerose Mw : gewichtsgemiddeld moleculair gewicht n-‐BuNH2 : n-‐butylamine NCA : N-‐carboxyanhydride NLS : nucleair lokalisatie signaal/sequentie NMR : nucleaire magnetische resonantie NPC : nucleaire porie complexen NVP : N-‐vinylpyrrolidon OAc2 : azijnzuuranhydride PAGE: polyacrylamide gel-‐elektroforese PAMAM : poly(amidoamine) PDMAEMA : poly(2-‐(dimethylamino)ethyl methacrylaat) pBG : poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) PBS : fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing PCL : poly(ε-‐caprolacton) PCR : polymerase keten reactie PEG : poly(ethyleenglycol) PEI : poly(ethyleenimine) VIII PEO : poly(ethyleenoxide) PLA : poly(lactide) pLL : poly(L-‐lysine) RBC : rode bloedcellen RNA : ribonucleïnezuur ROP : ringopeningspolymerisatie SCA : statische contacthoek meting SD : sproeidrogen SEC : grootte (size) exclusie chromatografie SEM : scanning elektronen microscopie ssDNA: enkelstrengig DNA SSR : site specifieke recombinase T : thymine TALEN : transcriptie activator nuclease TEA : triethylamine TFA : trifluorazijnzuur Tg : glastransitietemperatuur TGA : thermogravimetrische analyse TIR : totale interne reflectie TrAEA : tritylaminoethylamine ZFN : zink vinger nuclease IX Hoofdstuk 1: Literatuurstudie A. Gentherapie Genetische ziekten worden veroorzaakt door al dan niet overerfbare mutaties in specifieke genen. Hierbij wordt mogelijks de expressie van een bepaald eiwit onderdrukt of een slecht werkend soms levensbedreigend proteïne geproduceerd door het lichaam. Huidige medicatie richt zich op de behandeling van de symptomen van de ziekte terwijl gentherapie rechtstreeks probeert in te grijpen op de onderliggende, genetische oorzaak. Gentherapie beoogt de ultieme oplossing te zijn door een specifieke, efficiënte manier van genezing. Tal van ziekten zoals mucoviscidose (taaislijmziekte) [1, 2], AIDS [3] en zelfs kanker [4] kunnen via gentherapie behandeld worden. Bij gentherapie wordt getracht een defect gen te vervangen door een werkende variant in een bepaald celtype, het target. Het ingebrachte therapeutische gen codeert voor een specifiek proteïne dat het ontbreken of slecht functioneren van een gemuteerd gen kan herstellen en zodoende de aandoening kan verhelpen. Het menselijk lichaam bezit over verschillende verdedigingsmechanismen tegen lichaamsvreemd materiaal. Hierdoor is toediening van naakt desoxyribonucleïnezuur (DNA) via injectie inefficiënt. Zo moeten er fysicochemische en biologische barrières overwonnen worden voordat het therapeutisch gen zijn doelweefsel kan bereiken. [5] DNA kan in de bloedbaan door nucleasen gedegradeerd worden en is bovendien niet in staat om op zichzelf het celmembraan te penetreren. DNA is een omvangrijke molecule die door zijn negatieve ladingsdichtheid afgestoten wordt door het eveneens negatief geladen celmembraan. Om deze barrières te kunnen omzeilen, is er nood aan een geschikte drager of vector. De vector complexeert met het genetisch materiaal om te assisteren bij het bereiken van het doelweefsel. Er bestaan virale vectoren en niet-‐virale vectoren. Virale vectoren zijn afgeleid uit virussen terwijl niet-‐virale vectoren van synthetische aard zijn. [3, 5-‐7] 1 B. Overzicht van verschillende types gen-‐afgiftesystemen a. Wat en waarom? Om een therapeutisch gen in een bepaald weefsel tot expressie te laten komen, moet het eerst een reeks hindernissen overwinnen in het menselijk lichaam. Daarom zijn er vectoren nodig om extern DNA op een stabiele, gecontroleerde manier af te leveren in het doelweefsel. Gen-‐afgiftesystemen bestaan uit een vector gecomplexeerd met genetisch materiaal. In het gen-‐afgiftesysteem is het DNA beschermd tegen nucleasedegradatie. Alsook assisteren ze tijdens het transport bij de internalisatie van het DNA in het cytosol, gevolgd door intracellulaire transport richting de nucleus. Naast een hoge transfectie efficiëntie, moet de vector ook een aanvaardbare veiligheid en cytotoxiciteit bezitten. [8] Het transporteren van het erfelijk materiaal naar de “target” of doelcel kan op 3 verschillende manieren gebeuren: Ex vivo: Voor ex vivo experimenten worden er cellen geïsoleerd uit het lichaam en in vitro verder gecultiveerd waarna het gen-‐afgiftesysteem op deze cellen wordt aangebracht. De cellen kunnen na behandeling terug in het weefsel geïmplanteerd worden. Beenmerg en rode bloedcellen worden hiervoor vaak gebruikt omdat deze gemakkelijk uit het lichaam te halen zijn en eenvoudig terug kunnen worden ingezet. [9] In situ: Bij deze techniek wordt het gen-‐afgiftesysteem ingebracht in het weefsel dat de doelcellen bevat. Deze methode kan toegepast worden voor de behandeling van de genetische longziekte mucoviscidose en longkanker. [2] In vivo: Hierbij wordt de vector en het daaraan gebonden therapeutisch gen direct in de bloedbaan van de patiënt geïnjecteerd. Het is van belang dat de vectoren niet interageren met bloedcomponenten, waaronder het proteïne albumine (50 g/l). In vivo technieken zijn prima geschikt om aan gentherapie te doen dankzij hun eenvoudige toepasbaarheid. b. Virale vectoren Het ligt voor de hand virussen te gebruiken als draagsystemen voor therapeutisch DNA aangezien ze geëvolueerd zijn tot zeer efficiëntie organismen. Virussen zijn in staat tot receptor gemediëerde internalisatie doorheen het celmembraan, vrijstelling in het cytoplasma en gericht transport naar de celkern. [8] Bovendien kunnen virussen het transcriptiemechanisme van de cel gebruiken om hun eigen genoom en proteïnen te (re)produceren. 2 Virale vectoren bestaan uit gemodificeerde virussen waarbij het genetisch materiaal verantwoordelijk voor infectie en replicatie verwijderd zijn. Het genetisch materiaal van het virus wordt gedeeltelijk vervangen door een therapeutisch gen. Hierdoor is het virus volledig onschadelijk gemaakt en wordt enkel zijn functie als drager en intracellulair transportsysteem benut. Het gevaar bestaat dat door aanwezigheid van andere virussen in het lichaam of toevallige mutaties, terug recombinatie optreedt met vorming van potente, infectueuze virussen. [4] Een bijkomend nadeel aan virale vectoren is de moeilijkheid om een grootschalige, stabiele productie te bekomen die kan voldoen aan de noden van de farmaceutische sector voor implementatie op grote schaal. Wanneer dit systeem gebruikt wordt voor het transporteren en tot expressie brengen van een therapeutisch gen, kan dit grote voordelen opleveren voor gentherapie. Virale gen-‐
afgiftesystemen zijn dan ook veel selectiever om een bepaald cel-‐ of weefseltype te lokaliseren dan niet-‐virale gen-‐afgiftesystemen. Een nadeel is dat er mogelijks toxische neveneffecten en immuunreacties kunnen optreden. Verder mogen de te transporteren genen ook niet te groot zijn (maximale capaciteit tussen de 8 en 40 kilobasenparen of kb). [10] Virale vectoren kunnen zorgen voor integratie van het therapeutisch gen in het genoom van de target cel, wat in sommige gevallen tot een permanente expressie kan leiden. Wanneer het therapeutisch DNA echter tussen een essentieel gen geïnsereerd wordt (mutagenese), kan dit leiden tot een verhoogde of verstoorde expressie van dit gen. Dit kan kwalijke neveneffecten zoals tumorvorming en in extreme gevallen zelfs de dood van de patiënt veroorzaken. [4, 10] Er zijn drie soorten virussen die ingezet worden als vector voor gentherapie: Adenovirussen: Het genoom van adenovirussen bestaat uit lineair, dubbelstrengig DNA. Na infectie blijft het virale genoom episomaal in de celkern, waardoor er enkel transiënte expressie van het therapeutisch gen kan optreden. De limiet voor het te integreren therapeutisch DNA ligt rond de 8 kb. Niet gemodificeerde adenovirussen veroorzaken vooral infecties aan de bovenste luchtwegen, specifiek in de epitheelcellen van het ademhalingstelsel. Dit maakt hen interessant voor long gerelateerde genetische aandoeningen zoals mucoviscidose en longkanker. Momenteel concentreren een groot deel 3 van de klinische testen zich op adenovirussen. Een nadeel is dat de meeste mensen al antilichamen bezitten tegen deze virussen, wat kan zorgen voor immuunreacties. [4, 11, 12] Retrovirussen: Retrovirussen bezitten een enzym Reverse Transcriptase dat hen in staat stelt om zijn genoom, bestaande uit enkelstrengig RNA om te zetten naar dubbelstrengig DNA. Dit geeft een stabiele integratie en expressie van het transgen in het genoom van de gastheercel. De insertie van het gen van interesse (GOI) gebeurt echter willekeurig wat kan zorgen voor potentiële mutagenese. De maximale coderende capaciteit voor ingevoerde DNA sequenties bedraagt ongeveer 10 kb, wat voor vele therapeutische genen te klein is. Bovendien infecteren retrovirussen selectief delende cellen, aangezien de virussen te groot (±120 nm) zijn om door de poriën van de nucleus getransporteerd te worden. Hierdoor worden de virussen enkel tijdens de mitose opgenomen in de celkern. Het bekendste voorbeeld van een retrovirus is het menselijke immunodeficiëntie virus (HIV). De voor gentherapie gebruikte retrovirussen zijn meestal afgeleid van het Molony Murine Leukemia Virus. [4, 11, 12] Herpes simplex virus: Het genoom van het herpes simplex virus (HSV) is opgebouwd uit lineair dubbelstrengig DNA. HSV is in staat om therapeutische genen tot 50 kb binnen te brengen in het genoom van de gastheercel. Enkel (post)mitotische cellen worden geïnfecteerd en dit leidt tot een permanente expressie van het transgen. HSV kan ingezet worden voor de transductie van een therapeutisch gen naar neuronen (zenuwcellen) en andere moeilijk te bereiken cellen voor de meest gangbare virale vectoren. De reden dat HSV enkel voor zulke doeleinden toegepast wordt, is het gevolg van zijn moeilijk te manipuleren ingewikkelde levenscyclus. Mogelijke toepassingen van deze virale vector liggen in neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, Alzheimer, multiple sclerose (MS) of epilepsie. [4, 11, 12] c. Niet-‐virale vectoren Niet-‐virale gen-‐afgiftesystemen vormen een veiliger en niet pathogeen alternatief ten opzichte van virale vectoren. De eigenschappen van de synthetische vector kunnen gericht aangepast worden. Bovendien is de grootte van het af te geven gen minder sterk gelimiteerd aangezien deze vectoren beschikken over een grotere draagcapaciteit. Een bijkomend voordeel is dat niet-‐virale vectoren gemakkelijker op grote schaal te produceren zijn door de lagere kostprijs. Ze kunnen ook voor langere tijd stabiel opgeslagen worden. In tegenstelling 4 tot virale vectoren treedt er slechts transiënte expressie op, aangezien het therapeutisch DNA niet in het genoom geïnsereerd wordt. Het grootste probleem bij niet-‐virale gentherapie is de lage transfectie efficiëntie als gevolg van de degradatie door nucleasen en de vele te overwinnen cellulaire barrières. De lage transfectie efficiëntie is geen onoverbrugbaar probleem aangezien er slechts transfectie van enkele DNA moleculen nodig is om expressie te krijgen van het therapeutisch gen in de doelcellen. Een verhoogde transfectie efficiëntie kan bekomen worden door een verbeterde selectiviteit naar bepaalde celtypes toe. Dit wordt bereikt door middel van specifieke proteïnen die herkend worden door eiwitcomplexen in het celmembranen of helpen bij transport richting de celkern. [5, 7, 8, 13] Bij de ontwikkeling van niet-‐virale vectoren moet al bij de design rekening gehouden worden met intra-‐ en extracellulaire barrières zoals: aanhechting aan het celoppervlak, penetreren van het celmembraan door opname via endocytose of fagocytose (internalisatie), ontsnappen aan het endosoom (vrijstelling in het cytosol) en de afgifte van therapeutisch DNA zodat dit tot expressie kan gebracht worden in de celkern. [5] In wat volgt zullen een aantal gen-‐afgiftesystemen berustend op niet-‐virale technieken verder toegelicht worden. i. Directe injectie van naakt DNA De directe injectie van naakt DNA is inefficiënt doordat DNA moleculen door nucleasen in de bloedbaan vroegtijdig kunnen afgebroken worden. DNA is negatief geladen door de aanwezige fosfaatgroepen in de backbone. Aangezien de dubbele fosfolipidelaag ook negatief geladen is, verhindert dit het binnendringen van celmembranen. Bovendien heeft ongecomplexeerd DNA een te grote omvang om celmembranen te doorkruisen. [5] Het is echter wel mogelijk DNA met een microscopische naald rechtstreeks in de celkern te injecteren. Deze methode is zeer arbeidsintensief daar hierbij slechts één cel per keer getransfecteerd kan worden. Vroeger werd deze techniek enkel ex vivo gebruikt. Tegenwoordig kan die ook in vivo toegepast worden om virale antigenen tot expressie te brengen. [11] Ondanks het feit dat de hoogste transfectie efficiëntie kan bekomen worden voor niet-‐virale gen-‐afgiftesystemen, is deze methode voornamelijk beperkt tot spier-‐ en huidcellen. [9, 11] 5 ii. Naaldvrije injectie van naakt DNA Een genpistool of deeltjesbombardement maakt gebruik van gouden micropartikels die gecoat zijn met plasmide DNA en door een elektrische ontlading of onder hoge druk afgeschoten worden op het weefseloppervlak. De gegenereerde kinetische energie laat de gecoate deeltjes toe het celmembraan te penetreren. Deze methode is vooral bruikbaar voor de ontwikkeling van genetische vaccins waarbij het DNA direct aan antigen-‐
presenterende cellen afgegeven wordt. [11] Het voordeel van deze techniek is dat een grote hoeveelheid therapeutisch DNA aan een specifiek doelweefsel kan afgegeven worden. Daar staat een gebrekkige in vivo genexpressie op lange termijn tegenover. De genen worden niet ingebouwd in het erfelijk materiaal van de gastheer, maar bevinden zich onder de vorm van episomen in de celkern. Herhaalde bombardementen kunnen een oplossing bieden voor de transiënte expressie. Een bijkomend nadeel is dat de lichaamsvreemde gouden micropartikels in het lichaam achterblijven. [14, 15] iii. Elektroporatie Bij elektroporatie of elektrotransfectie worden de doelcellen onderworpen aan één of meerdere hoog elektrische ontladingen. Door het elektrisch veld worden er hydrofiele poriën gevormd in het celmembraan, die de opname van therapeutisch DNA in het cytosol mogelijk maken. Hoe hoger het toegepaste voltage, hoe groter de gevormde poriën en hoe gemakkelijker internalisatie zal gebeuren. [16] De cytotoxiciteit stijgt echter evenredig met de elektrische veldsterkte. Daarom is het beter de pulstijd van de stroomstoot te vergroten zodat de poriën langer open blijven. Deze techniek is uiterst efficiënt als gen transfer methode, maar het gebruik ervan is gelimiteerd door de hoge celdood na blootstelling aan elektrische spanning. Bovendien kan een hoge transfectiesnelheid en reproduceerbaarheid behaald worden. Elektroporatie leidt steeds tot een transiënte expressie van het getransfecteerde gen. [11, 16] iv. Calciumfosaat-‐DNA coprecipitatie De basis van de calciumfosfaat-‐DNA coprecipitatie methode ligt bij de complexatie van de fosfaatgroepen in de DNA backbone door Ca2+ ionen. Hierbij wordt een oplossing van het therapeutisch DNA samen met CaCl2 toegevoegd aan een gebufferde fosfaatoplossing. De gevormde neerslag, die het calcium-‐DNA complex bevat, wordt rechtstreeks in contact gebracht met de te transfecteren cellen. Vervolgens worden de complexen opgenomen in de 6 doelcellen door middel van zonaal gemediëerde endocytose. [17, 18] De reproduceerbaarheid van deze methode is beperkt aangezien de grootte van de gevormde complexen sterk afhangt van de reactieomstandigheden. Bovendien levert de techniek lage transfectie efficiënties op doordat vrij DNA snel afgebroken wordt door nucleasen. De techniek is in vivo niet bruikbaar omdat calciumfosfaat neerslaat in het lichaam. Daar calciumfosfaat-‐DNA coprecipitatie toch vrij eenvoudig en goedkoop is, wordt het vooral toegepast bij routine onderzoeken voor in vitro expressie testen. [17-‐19] v. Liposomale gen-‐afgiftesystemen Voor liposomale gen-‐afgiftesystemen worden kationische lipiden gebruikt. Algemeen zijn deze amfifiele molecules opgebouwd uit een dubbele hydrofobe staart als alifatisch anker, een ester linkergroep die zorgt voor chemische stabiliteit en een (bij fysiologische pH) positief geladen, hydrofiele aminegroep die zorgt voor interactie met de negatief geladen fosfaatgroepen van DNA. Kationische lipiden kunnen DNA inkapselen door de vorming van holle sferen of sandwich structuren (figuur 1.1). De gevormde liposomen bestaan uit een lipide dubbellaag en de incapsulatie beschermt DNA tegen katalytische degradatie. [11] Het gebruik van liposomen voor in vivo toepassingen is beperkt doordat deze vrij snel uit het plasma verwijderd worden. De cellulaire opname van deze lipoplexen gebeurt via endocytose of fusie met het celmembraan. [10] De lipoplexen bezitten een geringe stabiliteit. Ze aggregeren continu met DNA om hun positieve lading te stabiliseren. Dit ligt aan de basis van de goede DNA interagerende eigenschappen van kationische lipiden, maar leidt tot de vorming van clusters. Hoe groter de gevormde aggregaten, hoe lager de transfectie efficiëntie. Hierdoor moeten de lipoplexen snel na hun vorming in contact gebracht worden met de doelcellen. Door de ketens te verlengen of door neutrale lipiden toe te voegen, kan de saturatiegraad verlaagd worden en een betere transfectie efficiëntie bekomen worden. [20, 21] Een voordeel aan liposomale genafgifte systemen is dat de lipoplexen dankzij hun hydrofobe staart eenvoudig uit het endosoom worden vrijgesteld na internalisatie. Neutrale lipiden als cholesterol kunnen de vrijstelling versnellen. [21] Deze gen-‐afgiftesystemen laten de incapsulatie van vrij grote nucleïnezuren toe, maar de techniek gaat gepaard met lage transfectie efficiënties en, zoals bijna alle niet-‐virale vectoren, met een transiënte genexpressie. [11, 22] 7 DNA
Hydrofiele kop
Hydrofobe staart
Figuur 1.1: Liposoom-‐DNA complex of lipoplex. [22] vi. Cyclodextrinen en dendrimeren Cyclodextrinen en dendrimeren zijn wateroplosbare macromoleculen die DNA kunnen transfecteren met een beperkte toxiciteit en immuunrespons. Cyclodextrinen: Cyclodextrinen (CD) zijn cyclische oligomeren opgebouwd uit glucose units met een unieke amfifiele structuur bestaande uit een hydrofobe caviteit en een hydrofiele buitenkant. Het aantal units bepaald de grootte van de caviteit. Lineaire β-‐CD gebaseerde kationische polymeren zijn in staat compacte complexen te vormen met DNA, die een vergelijkbare transfectie efficiëntie vertonen als poly(ethyleenimine). [23] Hierbij wordt een host-‐guest complex gevormd tussen de caviteit en het DNA. De copolymerisatie van CD-‐
eenheden in kationische polymeren kan de cytotoxiciteit aanzienlijk verminderen. [24, 25] Dendrimeren: Een dendrimeer is een synthetisch, hypervertakt polymeer dat in bepaalde gevallen DNA kan complexeren wanneer het positief geladen eindgroepen bevat. Dankzij hun hoge oppervlaktefunctionaliteit zijn dendrimeren ook beter oplosbaar dan hun lineaire analogen. De transfectie efficiëntie en cytotoxiciteit van dendriplexen hangt af van de grootte van het complex, eventuele incapsulatie en het aantal functionele groepen. Hoe hoger de densiteit aan functionele groepen, hoe efficiënter de complexatie, maar hoe hoger de toxiciteit. [26] Het meest bekende dendrimeer is poly(amidoamine) (PAMAM), waarvan het “starburst polymeer” een goed voorbeeld is (figuur 1.2). Dankzij het multifunctioneel oppervlak bedekt met verschillende soorten amines kan PAMAM efficiënt DNA complexeren. Bovendien hebben de interne amines allen licht verschillende pKa waarden. Hierdoor neemt de buffercapaciteit toe, wat zorgt voor een betere endosomale vrijstelling. [27] Dendriplexen kunnen het gecomplexeerde DNA geheel of gedeeltelijk afschermen waardoor 8 degradatie door nucleasen en peptidasen verminderd wordt. De mogelijkheid tot incapsulatie gecombineerd met een sterke complexatie zorgt ervoor dat dendriplexen hun cargo geleidelijk vrijstellen. Dit opent perspectieven voor gecontroleerde afgifte van DNA over een langere termijn. [28, 29] Figuur 1.2: Derde generatie PAMAM dendrimeer [7] vii. Peptide gebaseerde methoden In wat volgt zullen enkele op peptide gebaseerde methoden kort besproken worden: Cel penetrerende peptiden: Cel penetrerende peptiden (CPP’s) hebben als doel de translocatie van het DNA-‐vector complex doorheen het plasmamembraan te vereenvoudigen. Deze korte peptiden van 5 tot 30 aminozuren lang zijn positief geladen en bezitten een amfifiel karakter. De specifieke aminozuursequentie van de peptiden zijn erop gericht om door het celmembraan opgenomen te worden. Bovendien vertonen ze slechts een lage toxiciteit. Een bekend voorbeeld is het basis domein van het HIV Tat-‐proteïne. [7, 30-‐33] Nucleair lokalisatie signaal: Nucleair transport gebeurt via nucleaire porie complexen (NPC’s). Dit zijn transportkanalen in het kernmembraan. De interne diameter hiervan bedraagt slechts 9 nanometer, wat de passieve diffusie van de veel grotere DNA-‐vector complexen verhindert. Om dit probleem te omzeilen zijn er nucleaire lokalisatie signaal peptiden (NLS) ontwikkeld die therapeutisch DNA naar en doorheen de poriën kunnen 9 gidsen. [7, 10, 33, 34] Zink vinger nucleasen & transcriptor activator effector nucleasen: Het ultieme doel in gentherapie is gentargeting door middel van homologe recombinatie waarbij het defecte gen vervangen wordt door een werkende variant. Zink vinger nucleasen (ZFN) en transcriptor activator effector nucleasen (TALEN) zijn twee technieken die hiervoor ontwikkeld zijn. Hierbij wordt de machinerie van de cel ingezet voor DNA-‐herstel en het bekomen van gentargeting. ZFN kunnen elk GOI zeer specifiek knippen en herkennen een sequentie bestaande uit drie nucleotiden. Deze kunstmatige restrictie-‐enzymen zijn opgebouwd uit een DNA bindend domein gefuseerd aan een niet-‐specifiek DNA restrictie domein. [35, 36] Via TALEN is het mogelijk puntmutaties te creëren en genregulatie te sturen. Een TALEN bestaat uit een centraal herhalend domein dat instaat voor de herkenning van DNA sequenties, gecombineerd met site-‐specifieke endonucleasen die selectief het genoom knippen. [37] viii. Kationische polymeren Een laatste groep vectoren die besproken wordt zijn de kationische polymeren. Kationische polymeren zijn in staat DNA te complexeren daar deze bij fysiologische pH positief geladen zijn. Deze complexatie gebeurt via elektrostatische interacties tussen de positief geladen groepen op de vectoren en de negatief geladen fosfaatgroepen aanwezig in de backbone van DNA. In het gevormde polyelektrolietcomplex is het DNA stabiel voor transport naar de doelcel waar het na opname via endocytose vrijgesteld wordt in het cytoplasma. De sterkte van de interactie is recht evenredig met de landingsdichtheid van het polymeer. Een hoge ladingsdichtheid zorgt voor betere complexatie van DNA doch induceert dit ook een verhoogde cytotoxiciteit. Enkele kationische polymeren zullen verder in detail besproken worden. Poly(ethyleenimine) Poly(ethyleenimine) of PEI is het meest gebruikte polymeer als niet-‐virale vector sinds 1995. [38] Het beschikt over een relatief goede transfectie efficiëntie in een groot aantal celtypes. [26] Hierdoor wordt het ook de gouden standaard van alle niet-‐virale vectoren genoemd. Er bestaan zowel lineaire als vertakte varianten (figuur 1.3). PEI bevat een hoog aantal aminegroepen. Naast de primaire amines in de zijketen bevat de hoofdketen ook secundaire 10 en tertiaire amines. [24] De vele aminegroepen kunnen het DNA sterk complexeren tot homogene sferen van enkele 10-‐tallen nanometer in diameter. De verschillende types aminegroepen zorgen, vanwege hun pKa tussen 5 en 7, voor een zekere buffercapaciteit na opname in de cel. Ze stellen het complex in staat gemakkelijker het endosoom te verlaten wat zorgt voor de relatief hoge transfectie efficiëntie. [24] De endosomale vrijstelling is recht evenredig met de vertakkingsgraad van het gebruikte PEI. De vertakking draagt bij tot de destabilisatie van het endosomale membraan met mogelijks een hogere genexpressie. [26, 27] De transfectie efficiëntie is ook sterk afhankelijk van het moleculair gewicht. Zo vertoont PEI met een laag moleculair gewicht (< 5 kDa) lage transfectie efficiënties, terwijl PEI van 25 kDa juist transfectie efficiënties vertoont die tot 40 maal hoger zijn dan de injectie van naakt DNA. [39] Dit gaat gepaard met een stijging van de cytotoxiciteit. De modificatie van de primaire amines in guanidines kan voor een verhoogde transfectie efficiëntie zorgen. Bovendien verlagen de guanidinegroepen ook de ladingsdichtheid wat gepaard gaat met een lagere cytotoxiciteit. De aanwezigheid van guanidinegroepen op de zijketens bevordert de celopname door waterstofbrugvorming met proteoglycanen aanwezig op de celwand. Bij laag moleculair gewichts PEI (< 5 kDa) kan deze modificatie een aanzienlijke verhoging van de transfectie efficiëntie inhouden (t.o.v. ongemodificeerd PEI) terwijl de toxiciteit laag blijft. [27, 40] Grafting, co-‐polymerisatie of modificatie met polyethyleenglycol (PEG) zijn mogelijke oplossingen om de cytotoxiciteit sterk te reduceren. PEG zorgt voor een ketenextensie, wat de interactie en adsorptie van proteïnen aan het oppervlak van de vector vermijdt. De werking van PEG berust op het hydrofiele karakter van de ketens. Hier spelen twee fenomenen een belangrijke rol: osmotische en sterische repulsie. Osmotische repulsie is te verklaren door de sterke hydratatie en mobiliteit van PEG ketens in water. Door de hoge beweeglijkheid van de ketens kan adsorptie van eveneens sterk gehydrateerde proteïnen verlaagd worden. Het sterische repulsie effect, ook wel entropische repulsie genoemd, schermt het oppervlak van de vector af door de vorming van kluwens in de zijketens. Hierdoor is een zeker volume niet bereikbaar voor interagerende bestandsdelen. Gegrafte PEG ketens vormen zo een soort van borstel op het oppervlak van de vector die de thrombogeniciteit sterk kunnen verminderen (zie bijlage 4). [41] 11 Poly(L-‐lysine) Het lineaire polypeptide poly(L-‐lysine) (pLL) is opgebouwd uit een aaneenschakeling van het aminozuur lysine (figuur 1.3 rechts). Dit polyamide met alifatische primaire amines is in staat om DNA op een zeer efficiënte manier te complexeren tot deeltjes kleiner dan 100 nm. De opname van DNA is bij pLL even efficiënt als PEI, doch vertoont deze een lagere transfectie efficiëntie als gevolg van de betere buffercapaciteit van PEI. Het was tevens één van de eerste polymeren gebruikt als niet-‐virale vector. [27] De hoge concentratie positieve ladingen zorgt naast een goede complexatie ook voor een hoge cytotoxiciteit. [24] Bovendien werken pLL/DNA complexen de agglutinatie van rode bloedcellen (RBC) in de hand alsook de niet-‐specifieke adsorptie van serum proteïnen. Zuiver pLL wordt in vivo niet veel gebruikt als vector omdat de polyplexen slecht oplosbaar zijn in waterig milieu. De biocompatibiliteit van pLL kan verbeterd worden door modificatie met verschillende functionele groepen zoals imidazol of grafting met PEG. [24] Gemodificeerd pLL zal DNA-‐
complexen vormen die een reductie in ladingsdichtheid en cytotoxiciteit zullen vertonen. pLL-‐PEG copolymeren zijn veel minder gevoelig voor adsorptie, verhinderen de aggregatie van RBC, zijn beter oplosbaar en bezitten bovendien een betere complexstabiliteit. [24, 42] De aanwezigheid van heterocyclische imidazolgroepen zal daarentegen de transfectie efficiëntie verhogen door de verbeterde buffercapaciteit. De bufferende eigenschappen zorgen voor het “proton spons effect” en helpen bij de vrijstelling van het polyplex uit het endosoom. [27] Dit “proton spons effect” valt te verklaren door de protonatie van amines in het zure endosoom en daaropvolgende stijging van de osmotische druk. Figuur 1.3: Chemische structuur van lineair PEI (links), vertakt PEI (midden) en pLL (rechts) 12 De polypeptide ruggengraat van pLL is volledig biodegradeerbaar door inwerking van peptidasen. Het is ook mogelijk om specifieke componenten zoals suikers, antilichamen, CPP’s of andere liganden met de complexen te conjugeren om zo een betere doelgerichtheid te verkrijgen. Dit laat toe om selectieve transfectie in een bepaald cel-‐ of weefseltype te verkrijgen. [24, 26, 27] Poly(methacrylaten) Methacrylaat gebaseerde polymeren met DNA complexerende groepen kunnen ingezet worden als vector. In sommige gevallen zijn poly(methacrylaten) biocompatibel en kunnen ze hoge transfectie efficiënties vertonen. Bijkomende voordelen zijn hun eenvoudige synthese en lage kostprijs. Daarentegen zijn poly(methacrylaten) niet biodegradeerbaar door hun alifatische hoofdketen. [26] Figuur 1.4: Chemische structuur van poly(2-‐(dimethylamino)ethyl methacrylaat). Polymeren zoals poly(2-‐(dimethylamino)ethyl methacrylaat) (PDMAEMA) zijn een logische keuze als niet-‐viraal gen-‐afgiftesysteem (figuur 1.4). PDMAEMA is een water oplosbaar kationisch polymeer met een tertiair amine in de zijketen. Het tertiaire amine met een pKa van 7,5 zorgt voor een endosomaal buffereffect. [24, 43] Veelal worden copolymeren gesynthetiseerd met N-‐vinylpyrrolidon (NVP) als hydrofiel comonomeer. Deze P(DMAEMA-‐co-‐NVP) copolymeren bezitten een hogere transfectie efficiëntie en een lagere cytotoxiciteit vergeleken met het homopolymeer. [26] In vivo experimenten wezen uit dat PDMAEMA/DNA complexen vooral in de lever en longen accumuleerden, wat deze vectoren uitermate geschikt maakt voor de behandeling van defecten in deze organen. [44] 13 C. Barrières voor genafgifte Het lichaam heeft zich doorheen de evolutie geoptimaliseerd om zichzelf te beschermen tegen lichaamsvreemd DNA. Voordat een gen-‐afgiftesysteem beladen met DNA zijn cargo kan afleveren in de celkern dienen extra-‐ en intracellulaire barrières overwonnen te worden (figuur 1.5). Eerst moet het polyplex weerstaan aan agglutinatie in de bloedstroom. Vervolgens moet het geïnternaliseerd worden doorheen het celmembraan waarna het dient te ontsnappen aan het endosoom. Uiteindelijk wordt het gen, na dissociatie van het polyplex, getransporteerd naar de nucleus om daar tot expressie te komen. Deze natuurlijke hindernissen zorgen ervoor dat slechts een kleine fractie van het therapeutisch gen tot expressie komt. In het ideale geval wordt het therapeutisch DNA exclusief aan de doelcellen afgegeven door middel van gecontroleerde, doelgerichte gen-‐afgifte. [27] Figuur 1.5: Schematische voorstelling van DNA-‐afgifte en de cellulaire barrières: I) DNA-‐complex vorming II) opname in de cel via endocytose III) ontsnappen aan het endosoom IV) dissociatie van de vector V) translocatie naar de celkern VI) genexpressie [7] a. DNA-‐complexatie Naakt DNA wordt na toediening snel afgebroken door nucleasen. Bovendien is de kans dat DNA op zichzelf de cel binnendringt nihil. Dit komt omdat negatieve ladingen van het celmembraan en de fosfaatgroepen elkaar afstoten. Daarom is het noodzakelijk DNA te condenseren tot een compacte, geneutraliseerde structuur. Dit kan bereikt worden door complexatie met een vector. Naast een verbeterde interactie met het plasmamembraan dient DNA-‐complexatie zowel het transport te bevorderen als bescherming te bieden tegen 14 degradatie. Geschikte moleculen bezitten positieve ladingen die met de negatief geladen nucleïnezuren kunnen interageren via elektrostatische interacties en deze (gedeeltelijk) kunnen neutraliseren. De ladingen op de vectoren kunnen aangeleverd worden via amines aangezien de meeste amines geprotoneerd zijn bij fysiologische (neutrale) pH. [26, 45] b. Internalisatie: celopname van het complex De eerste cellulaire barrière is de translocatie doorheen het plasmamembraan. De internalisatie gebeurt door een interactie van de positief geladen gen-‐afgiftesystemen met de anionische dubbele fosfolipide laag van het plasmamembraan. Ook aantrekking door negatief geladen proteoglycanen in de extracellulaire matrix kunnen een rol spelen bij de celopname van de complexen. [26] Zonder deze interacties zijn de polyplexen niet in staat om door te dringen in het cytosol. Meestal verloopt de celopname van de DNA-‐vector complexen via niet-‐specifieke interacties gevolgd door endocytose. Grotere deeltjes worden via fagocytose opgenomen. [5] Algemeen wordt aangenomen dat kleinere polyplexen beter opgenomen worden dan grotere. [46] Daarom is een goede condensatie van het DNA belangrijk aangezien dit de afmeting van het complex bepaalt. Door de polymeren te modificeren met celspecifieke liganden die membraanproteïnen herkennen en binden, kan de internalisatie efficiëntie van de polyplexen sterk verbeterd worden. Wanneer er specifieke interacties optreden tussen ligand en receptor wordt er gesproken van receptor gemediëerde endocytose. [26, 27] c. Endosomale vrijstelling Na celopname bevindt het polyplex zich in een endosoom die verschillende routes kan volgen in de cel. Zo kunnen ze gerecycleerd worden naar het celoppervlak, afgeleverd worden aan celorganellen zoals het Golgi-‐apparaat of versmelten met lysosomen. Wanneer een endosoom versmelt met een lysosoom worden de complexen blootgesteld aan enzymatische degradatie. De complexen dienen hieraan te ontsnappen om vrijgesteld te worden in het cytoplasma. Ontsnappen aan het endosoom kan door gebruik te maken van het zogenaamde “proton spons effect”. [47] Dit effect kan verklaard worden door de aanwezigheid van protoneerbare aminegroepen op de kationische polymeren. De aanwezigheid van secundaire en tertiaire amines (pKa tussen 9 en 4,5) en imidazolgroepen zorgt voor een zekere buffercapaciteit als gevolg van het nabuureffect. Dit nabuureffect 15 zorgt voor een daling van de pKa van naburige amines. Hierdoor worden deze geprotoneerd in het zure milieu van het endosoom (pH 5-‐5,5). De protonatie van deze amines zorgt voor een zwelling als gevolg van de accumulatie van tegenionen door osmose. De ontstane osmotische druk resulteert in het openbreken van het endosomale membraan en opeenvolgende vrijstelling van de polyplexen in het cytosol. [5, 26, 27] d. Polyplex dissociatie De DNA/vector polyplexen dienen stabiel te zijn om de cellulaire barrières te overwinnen, maar moeten ook de dissociatie van het therapeutisch gen toelaten. Om blootstelling van het gedissocieerde DNA aan nucleasen te minimaliseren, gebeurt de loskoppeling van de vector preferentieel net voor de translocatie naar de celkern. Dezelfde enzymen, die geassocieerd zijn met de transcriptie van het therapeutisch gen, zorgen in vele gevallen ook voor de vrijstelling van het DNA. [5] e. Translocatie naar de celkern De laatste barrière bestaat uit het transport doorheen het cytosol richting de nucleus en de penetratie van de nucleaire envelop. Passieve diffusie van macromoleculen in het cytoplasma is sterk afhankelijk van de deeltjesgrootte. Vrije mobiliteit doorheen het cytoplasma is beperkt tot DNA moleculen kleiner dan 250 bp. Het cytoskelet speelt daarom een essentiële rol in de translocatie van DNA naar de celkern. Deze kunnen aan de anionische microtubuli of actine microfilamenten binden en zo met behulp van het cytoskelet migreren richting het kernmembraan. [5, 27] Polyplexen die te snel uit het endosoom vrijgesteld zijn, bevinden zich te ver van de celkern en zullen niet richting nucleus migreren. Door de modificatie met nucleaire lokalisatie signaal (NLS) liganden kan de residentietijd in het cytosol aanzienlijk ingekort worden en een gevoelige verhoging van de transfectie efficiëntie bekomen worden. NLS functioneren als een soort identificatielabel voor receptoren op de nucleaire envelop. [27] Deze kunnen gericht ingezet worden om nucleaire porie complexen (NPC) te bereiken. NPC zijn opgebouwd uit 100 verschillende proteïne subunits die de passieve diffusie van proteïnen kleiner dan 10 nm toelaten. Grotere polyplexen hebben hulp nodig van specifieke nucleaire import proteïnen (vb. NLS sequenties) om door de nucleaire poriën te diffunderen. Een alternatief mechanisme voor de translocatie van polyplexen naar de nucleus richt zich op 16 delende cellen tijdens de mitose, wanneer het kernmembraan tijdelijk ontbonden is. Deze aanpak is vooral geschikt voor snel delende cellen. [26, 27] D. Toepassingsgebieden a. Gentherapie voor erfelijke genetische ziektes Duizenden aandoeningen worden veroorzaakt door een genetische afwijking. Hierbij wordt mogelijks de expressie van een eiwit onderdrukt of een slecht werkend proteïne geproduceerd. Gentherapie is veelbelovend voor het genezen van tal van erfelijke genetische ziekten. Er wordt getracht het defecte gen te vervangen door een werkende variant. Het therapeutisch gen kan dan coderen voor een ontbrekend proteïne of een schadelijke metaboliet inhiberen. Taaislijmziekte en multiple sclerose (MS) zijn overerfbare ziekten waar momenteel veel onderzoek op gebeurt. [48] Mucoviscidose of taaislijmziekte is een recessief overerfbare ziekte. De basis ligt bij een defect in een gen dat instaat voor de aanmaak van chloridekanalen in de celwand. Hierdoor wordt het transport van water in epitheelcellen verstoord. De symptomen uiten zich vooral door de overproductie van taaislijm in de longen. Het taaislijm induceert chronische infecties aan de luchtwegen die de levensverwachting van de patiënt sterk verlagen. [49] De in vivo afgifte van een normale kopie van het gen in het longepitheel is vrij eenvoudig via inhalatie van micropartikels. [2] Aangezien epitheelweefsel vrij snel vernieuwd wordt in het lichaam, zijn herhaalde toedieningen noodzakelijk. b. Gentherapie voor kanker Huidige behandelingsmethoden voor kanker zoals chirurgie, radiotherapie en chemotherapie tasten naast tumoren ook gezonde cellen en weefsels aan doordat ze een lage specificiteit vertonen. Chemotherapie heeft overigens veel toxische nevenwerkingen en kan leiden tot de aanmaak van resistente fenotypes. Bovendien kan radiotherapie door de bestraling aanleiding geven tot secundaire kankers. Gentherapie biedt een meer gerichte oplossing aangezien kanker meestal veroorzaakt wordt door een mutatie in een oncogen of een afwijking in een tumor onderdrukkend gen. Dit kan leiden tot ongecontroleerde celproliferatie en tumorvorming. Ongeveer 70% van alle klinische testen voor gentherapie zijn op kanker gericht. [50] Kanker kan via verschillende (gen)therapeutische technieken behandeld worden. Enkele voorbeelden zijn zelfmoord 17 gentherapie, knockout gentherapie, antisense oligonucleotiden en genvervanging of replicatie. [4, 27, 51] De gerichte transfectie van tumoren is vrij eenvoudig dankzij het verbeterde permeatie en retentie effect (EPR). [52] Dit laat nanopartikels toe tumoren selectief te bereiken op een passieve manier. Dat is het gevolg van de vele haarvaten rond tumoren. Door snelle groei zijn er lekkende haarvaten aanwezig, wat geïnjecteerde nanopartikels of macromoleculen toelaat te accumuleren in tumoren. [26] Op deze manier kunnen vectoren beladen met een cytotoxisch zelfmoord gen efficiënt en gericht ingebracht worden. Wanneer de promotor van dit zelfmoord gen geactiveerd wordt door specifieke condities voorkomend in tumorcellen (vb. tekort aan voedingsstoffen of zuurstof) kan de schade aan omliggend weefsel gereduceerd worden. [4, 27, 51] “Knock-‐out” gentherapie streeft naar inactivatie of attenuatie van oncogenen om ongecontroleerde celproliferatie te inhiberen. Hiervoor wordt een gen geïntroduceerd dat codeert voor een antisense RNA dat kan hybridiseren met het target RNA. Het gehybridiseerde RNA wordt snel afgebroken en het target oncogen is specifiek geïnhibeerd. [27] Antisense oligonucleotiden onderdrukken de expressie van specifieke genen. Hierbij wordt de doelsequentie geblokkeerd door de binding van een synthetisch oligonucleotide met complementair mRNA. Na hybridisatie met het mRNA treedt er restrictie van het RNA op. Hierdoor wordt de translatie verhinderd en zo ook de productie van proteïnen die de tumor veroorzaken. Door de blokkage van genen betrokken in resistentie worden kankercellen gevoeliger voor chemotherapie. [27] c. Gentherapie voor AIDS Het verworven immunodeficiëntiesyndroom (AIDS) wordt veroorzaakt door het humaan immunodeficiëntievirus (HIV). Het virus valt de T-‐helper cellen in het lichaam aan en hierdoor gaat het immuunsysteem van de besmette patiënt achteruit. Wereldwijd zijn meer dan 30 miljoen mensen besmet met HIV. Overdracht gebeurt door contact van slijmvlies of de bloedsomloop met besmette lichaamsvloeistoffen zoals bloed en sperma. Een echt medicijn of vaccin is tot op heden nog niet voorhanden. De huidige behandeling bestaat uit het onderdrukken van de symptomen. Hierbij dient er dagelijks een cocktail van verschillende medicijnen ingenomen te worden, wat de behandeling zeer duur maakt. 18 Gentherapie biedt eventueel een oplossing. Een mogelijke aanpak voor de ontwikkeling van een vaccin bestaat uit de insertie van therapeutisch DNA dat codeert voor een HIV-‐
neutraliserend antilichaam. Spiercellen worden getransfecteerd door een genetisch gemodificeerd adenovirus en ingezet als productie eenheden voor de neutraliserende antilichamen. Hierbij is slechts één injectie noodzakelijk om een immuunrespons op te wekken. [53] Een andere behandeling focust zich op de transfectie van T-‐lymfocyten om de verspreiding van het virus tegen te gaan. Hierbij wordt verhinderd dat het virus de cel kan binnendringen, wat HIV replicatie onmogelijk maakt. De celopname kan geïnhibeerd worden door de aanmaak van bepaalde transmembraan proteïnen te stimuleren. Deze interfereren met proteïnen aanwezig op het celmembraan van het virus die gebruikt worden om de cel binnen te dringen. [54-‐56] De assemblage en replicatie van het virus kan ook tegengegaan worden via gerichte gentherapie. [56] Dit kan door zelfmoord genen of siRNA (kleine interfererend RNA) moleculen in te zetten die enkel geactiveerd worden in geïnfecteerde cellen. [55] d. Gentherapie voor de behandeling van andere aandoeningen Naast de genezing van ziekten waar slechts één gen een cruciale rol speelt, kan gentherapie ook ingezet worden bij aandoeningen waar er meerdere genen van belang zijn. Artritis en diabetes behoren tot deze groep. Diabetes wordt behandeld door dagelijkse insulineïnjecties om de bloedsuikerspiegel te verlagen. Een mogelijk alternatief bestaat erin om levercellen te transfecteren met genen die glucose gevoelige elementen bevatten. Zo wordt een gereguleerde insuline expressie bekomen en de natuurlijke balans van het lichaam hersteld. [4] Artritis is een reumatische aandoening die gepaard gaat met chronische en pijnlijke ontstekingen van de gewrichten. Door toediening van induceerbare therapeutische genen kan gentherapie de onderliggende oorzaak van artritis behandelen. Deze genen coderen voor ontstekingswerende proteïnen. [4] Door locale injecties in te getroffen gewrichten zullen de transgenen tot expressie komen in celtypes geassocieerd met de ziekte. [57] 19 E. Biodegradeerbare micropartikels a. Biodegradeerbare polyesters De esterfuncties in de backbone van kunnen hydrolytisch afgebroken worden tot hun monomeren na reactie met water en/of enzymen. In het geval van poly(lactide) (PLA) of poly(ε-‐caprolacton) (PCL) zijn deze componenten wateroplosbaar. Naast chemische degradatie zal ook fysische degradatie een rol spelen. Hier zal vooral de mate en snelheid waarin water kan penetreren van belang zijn. Wanneer de degradatiesnelheid groter is dan snelheid van de water penetratie, zal oppervlakte erosie overheersen. In het omgekeerde geval spreken we van bulkerosie. [58] Verschillende factoren zullen een belangrijke invloed hebben op de degradatiesnelheid. Een polymeer zal trager degraderen wanneer het een groter moleculair gewicht heeft, meer kristallijn is, een grotere chemische stabiliteit bezit en/of beschikt over een hydrofoob karakter. Ook de porositeit zal een rol spelen. [58] i. Poly(lactide) Poly(lactide) of polymelkzuur is een biocompatibel en biodegradeerbaar polyester dat gebruikt wordt in tal van biomedische applicaties (vb. scaffolds, gecontroleerde afgiftesystemen, …). [59] PLA heeft een Tg rond 60 °C. Er bestaan twee chirale vormen van PLA. De L-‐vorm (figuur 1.6) is semi-‐kristallijn en ondergaat een iets tragere degradatie, terwijl de D-‐vorm en het racemisch mengsel sneller degraderen als gevolg van hun amorf voorkomen. [60] Beide vormen worden door de hydrolyse van de esterfuncties en enzymatische degradatie op enkele weken tijd afgebroken tot niet-‐cytotoxisch melkzuur. L-‐melkzuur wordt na afbraak vlotter geassimileerd aangezien het een lichaamseigen stof is die voorkomt als afbraakproduct van anaerobe suikerafbraak in spierweefsel. [61, 62] Het gebruik van PLA voor biomedische applicaties is goedgekeurd door het Amerikaans voedselagentschap (FDA). [63] ii. Poly(ε-‐caprolacton) Poly(ε-‐caprolacton) (figuur 1.6) is een semi-‐kristallijn polyester met een lage Tg (-‐60 °C) en smeltpunt (60 °C). Het is eveneens biodegradeerbaar en goedgekeurd door de FDA als biomateriaal, maar beschikt over een langere degradatietijd (> 2 jaar). Een bijkomend nadeel is de sterke hydrofobiciteit van PCL, wat celadhesie en proliferatie limiteert. [64, 65] Door copolymerisatie van lactide (LA) en ε-‐caprolacton (CL) kan een snellere degradatiesnelheid bekomen worden. [59, 66] 20 Figuur 1.6: Chemische structuur van PCL (links) en P(L)LA (rechts). b. Biodegradeerbare micropartikels Poly(lactide) en poly(ε-‐caprolacton) zijn twee polymeren die kunnen ingezet worden voor de productie van biodegradeerbare micropartikels. Biodegradeerbare micropartikels zijn interessant als drager voor gen-‐afgiftesystemen aangezien ze na transfectie afgebroken worden tot niet-‐toxische, laagmoleculaire producten. Dit vermijdt accumulatie in het doelweefsel en zorgt voor een gereduceerde cytotoxiciteit. [65] Micropartikels kunnen ook ingezet worden als kweekbodem voor celculturen. Door deze te coaten met een vector en vervolgens te beladen met een therapeutisch gen kunnen cellen ex vivo gecultiveerd en getransfecteerd worden. In een volgend stadium kunnen de getransfecteerde cellen geïmplanteerd worden in het doelweefsel. CultiSpher-‐S is een voorbeeld van enzymatisch degradeerbare micropartikels die het oogsten van de cellen vergemakkelijken doordat de nood tot scheiden van cellen en partikels geëlimineerd is. [67] Twee technieken die kunnen toegepast worden voor de productie van micropartikels zijn electrosprayen (ES) en sproeidrogen (SD): Electrosprayen: Via ES is het mogelijk om reproduceerbare micropartikels te bekomen met een nauwe grootte-‐distributie en gecontroleerde morfologie. [68] De techniek bestaat uit de atomisatie van een vloeistof met behulp van een sterk elektrisch veld. [69] De bekomen partikel diameter kan aangepast worden door parameters als schermafstand, diameter van de naald, flow rate, polymeerconcetratie en toegepaste voltage bij te regelen. Sproeidrogen: De basis van SD berust op de verneveling van een polymeeroplossing door een fijne nozzle in een warme luchtstroom en de onmiddellijke verdamping van het solvent. De gevormde micropartikels worden in poedervorm afgescheiden door middel van centrifugatie in een cycloon. [70, 71] Samples met een reikwijdte van enkele milligrammen tot enkele kilo’s product kunnen verwerkt worden via deze techniek. [72] Voor een meer gedetailleerde uitwerking van deze technieken zie hoofdstuk 4 en bijlage 3. 21 F. Doel: intelligente design Het doel van deze thesis bestaat erin om via een intelligente aanpak en combinatie van reeds bestaande technieken, een efficiënt gen-‐afgiftesysteem te bekomen. Zo kan er opnieuw een stap dichter gezet worden bij de realisatie van gentherapie als ultieme genezingsmethode. De thesis kan opgesplitst worden in 2 luiken. Ten eerste is er de synthese van gemodificeerd poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) (pBG) als niet-‐viraal gen-‐
afgiftesysteem binnen het kader van gentherapie. Het tweede luik bestaat uit de productie en coating van micropartikels. Er wordt uitgegaan van het gemodificeerd, kationische pBG als niet-‐virale vector voor de complexatie van therapeutisch DNA. De modificatie van de zijketens houdt het invoeren van primaire amines, imidazolgroepen, hydroxyethyl spacers en de verdere omzetting van de primaire amines naar guanidines in. Op deze manier wordt zowel de niet-‐specifieke adsorptie van proteïnen (met behulp van de hydroxyl zijgroepen) [41], een verhoging van de transfectie efficiëntie (dmv. de imidazolgroepen) [26] als de elektrostatische complexatie van DNA (via de amines) aangepakt. De verdere omzetting van de primaire amines in guanidines zorgt voor een verlaging van de cytotoxiciteit als gevolg van ladingsdelokalisatie. Hierbij behouden de vectoren het vermogen tot complexatie van DNA. [40] Bovendien zorgen de modificaties van de zijgroepen ervoor dat pBG wateroplosbaar wordt. pBG vormt ook α-‐helixen in oplossing, wat de polymeren een betere compatibiliteit met DNA zou geven. De α-‐helix structuur laat toe om te fuseren met het endosomale membraan en dit te destabiliseren via de vorming van poriën. Dit bevordert de vrijstelling uit het endosoom. [3, 6, 73, 74] In een tweede stap worden er micropartikels gegenereerd bestaande uit p(D,L-‐LA-‐ε-‐CL) copolymeren. [75] Deze worden zowel via electrosprayen als sproeidrogen geproduceerd om beide technieken te evalueren ten opzichte van elkaar. De sproeidroog techniek wordt aangeboden door Xedev, terwijl het electrosprayen volledig binnenshuis gebeurt. De micropartikels kunnen vervolgens gecoat worden met de gesynthetiseerde vectoren via plasma activatie. Deze DNA interagerende micropartikels kunnen ingezet worden als groeibodem om cellen op te kweken. Dit laat de ex vivo transfectie van celweefsel toe dat nadien terug in het lichaam kan ingebracht worden. 22 G. Referenties 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. Griesenbach, U. and A.C. Boyd, Pre-‐clinical and clinical endpoint assays for cystic fibrosis gene therapy. Journal of Cystic Fibrosis, 2005. 4(2): p. 89-‐100. Curiel, D.T., J.M. Pilewski, and S.M. Albelda, Gene therapy approaches for inherited and acquired lung diseases. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996. 14(1): p. 1-‐18. Dubruel, P., L. Dekie, and E. Schacht, Poly-‐L-‐glutamic acid derivatives as multifunctional vectors for gene delivery. Part A. Synthesis and physicochemical evaluation. Biomacromolecules, 2003. 4(5): p. 1168-‐1176. Goverdhana, S., et al., Regulatable Gene Expression Systems for Gene Therapy Applications: Progress and Future Challenges. Molecular Therapy, 2005. 12(2): p. 189-‐
211. Pouton, C.W. and L.W. Seymour, Key issues in non-‐viral gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 1998. 34(1): p. 3-‐19. Dubruel, P., et al., Poly-‐L-‐glutamic acid derivatives as multifunctional vectors for gene delivery. Part B. Biological evaluation (vol 4, pg 1177, 2003). Biomacromolecules, 2003. 4(6): p. 1868-‐1868. Wong, S.Y., J.M. Pelet, and D. Putnam, Polymer systems for gene delivery—Past, present, and future. Progress in Polymer Science, 2007. 32(8–9): p. 799-‐837. Shim, M.S., Kwon, Young Jik, Stimuli-‐responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Advanced Drug Delivery Reviews, 2012. 64(11): p. 1046-‐1059. Goes, A., Synthese en evaluatie van poly-‐L-‐glutamine derivaten als niet-‐virale gen-‐
afgiftesystemen, in Onderzoeksgroep Polymer Chemistry & Biomaterials Group 2010, UGent: Vakgroep Organische Chemie. p. 121. Glover, D.J., H.J. Lipps, and D.A. Jans, Towards safe, non-‐viral therapeutic gene expression in humans. Nat Rev Genet, 2005. 6(4): p. 299-‐310. Van Tendeloo, V.F.I., C. Van Broeckhoven, and Z.N. Berneman, Gene therapy: principles and applications to hematopoietic cells. Leukemia, 2001. 15: p. 523-‐544. Robbins, P.D. and S.C. Ghivizzani, Viral Vectors for Gene Therapy. Pharmacology &amp; Therapeutics, 1998. 80(1): p. 35-‐47. Luo, D. and W.M. Saltzman, Synthetic DNA delivery systems. Nat Biotechnol, 2000. 18(1): p. 33-‐7. Tang, D.C., M. DeVit, and S.A. Johnston, Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature, 1992. 356(6365): p. 152-‐4. Johnston, S.A. and D.C. Tang, Gene gun transfection of animal cells and genetic immunization. Methods Cell Biol, 1994. 43 Pt A: p. 353-‐65. Neumann, E., S. Kakorin, and K. Toensing, Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes. Bioelectrochem Bioenerg, 1999. 48(1): p. 3-‐16. Martin, J., A. Schallhorn, and F.M. Wurm, Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-‐phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Research, 1996. 24(4): p. 596-‐601. Roy, I., et al., Calcium phosphate nanoparticles as novel non-‐viral vectors for targeted gene delivery. International Journal of Pharmaceutics, 2003. 250(1): p. 25-‐33. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. Loyter, A., et al., Mechanisms of DNA entry into mammalian cells: II. Phagocytosis of calcium phosphate DNA co-‐precipitate visualized by electron microscopy. Experimental Cell Research, 1982. 139(1): p. 223-‐234. Lai, E. and J.H. van Zanten, Real time monitoring of lipoplex molar mass, size and density. Journal of Controlled Release, 2002. 82(1): p. 149-‐158. Ma, B., et al., Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. Journal of Controlled Release, 2007. 123(3): p. 184-‐194. Spuch, C. and C. Navarro, Liposomes for Targeted Delivery of Active Agents against Neurodegenerative Diseases. Journal of Drug Delivery, 2011. 2011: p. 12. Gonzalez, H., S.J. Hwang, and M.E. Davis, New Class of Polymers for the Delivery of Macromolecular Therapeutics. Bioconjugate Chemistry, 1999. 10(6): p. 1068-‐1074. Park, T.G., J.H. Jeong, and S.W. Kim, Current status of polymeric gene delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews, 2006. 58(4): p. 467-‐486. Hwang, S.J., N.C. Bellocq, and M.E. Davis, Effects of Structure of β-‐Cyclodextrin-‐
Containing Polymers on Gene Delivery. Bioconjugate Chemistry, 2001. 12(2): p. 280-‐
290. Jeong, J.H., S.W. Kim, and T.G. Park, Molecular design of functional polymers for gene therapy. Progress in Polymer Science, 2007. 32(11): p. 1239-‐1274. Merdan, T., J. Kopecĕk, and T. Kissel, Prospects for cationic polymers in gene and oligonucleotide therapy against cancer. Advanced Drug Delivery Reviews, 2002. 54(5): p. 715-‐758. Carlmark, A., et al., New methodologies in the construction of dendritic materials. Chemical Society Reviews, 2009. 38(2): p. 352-‐362. Voulgarakis, N.K., K.Ø. Rasmussen, and P.M. Welch, Dendrimers as synthetic gene vectors: Cell membrane attachment. J. Chem. Phys., 2009. 130. Munyendo, W.L., et al., Cell Penetrating Peptides in the Delivery of Biopharmaceuticals. Biomolecules, 2012. 2(2): p. 187-‐202. Lindgren, M., et al., Cell-‐penetrating peptides. Trends in Pharmacological Sciences, 2000. 21(3): p. 99-‐103. Vivès, E., J. Schmidt, and A. Pèlegrin, Cell-‐penetrating and cell-‐targeting peptides in drug delivery. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -‐ Reviews on Cancer, 2008. 1786(2): p. 126-‐138. Bolhassani, A., Potential efficacy of cell-‐penetrating peptides for nucleic acid and drug delivery in cancer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -‐ Reviews on Cancer, 2011. 1816(2): p. 232-‐246. Zanta, M.A., P. Belguise-‐Valladier, and J.-‐P. Behr, Gene delivery: A single nuclear localization signal peptide is sufficient to carry DNA to the cell nucleus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. 96: p. 91-‐96. Wilson, J.H., Pointing fingers at the limiting step in gene targeting. Nat Biotech, 2003. 21(7): p. 759-‐760. Porteus, M.H., Mammalian Gene Targeting with Designed Zinc Finger Nucleases. Mol Ther, 2006. 13(2): p. 438-‐446. Miller, J.C., et al., A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nature Biotechnology, 2011. 29(2): p. 143-‐148. Boussif, O., et al., A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(16): p. 7297-‐
301. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. Shi, L., et al., Repeated intrathecal administration of plasmid DNA complexed with polyethylene glycol-‐grafted polyethylenimine led to prolonged transgene expression in the spinal cord. Gene Ther, 0000. 10(14): p. 1179-‐1188. Lee, Y., et al., Enhancement of the Transfection Efficiency of Poly(ethylenimine) by Guanidylation. Bull. Korean Chem. Soc., 2008. 29(3): p. 666-‐668. Lee, H.B., J.H. Lee, and J.D. Andrade, Blood compatibility of polyethylene oxide surfaces. Progress in Polymer Science, 1995. 20(6): p. 1043-‐1079. Toncheva, V., et al., Novel vectors for gene delivery formed by self-‐assembly of DNA with poly(L-‐lysine) grafted with hydrophilic polymers. Biochim Biophys Acta, 1998. 1380(3): p. 354-‐68. Dubruel, P. and E.H. Schacht, Effect of Polyethylene Oxide Blocks or Grafts on the Physicochemical Properties of Poly(2-‐N-‐(Dimethylaminoethyl) Methacrylate) DNA Complexes. Journal of Bioactive and Compatible Polymers, 2000. 15(4): p. 279-‐296. Verbaan, F., et al., Intravenous fate of poly(2-‐(dimethylamino)ethyl methacrylate)-‐
based polyplexes. Eur J Pharm Sci, 2003. 20(4-‐5): p. 419-‐27. Freitag, R., Synthetic polymers for biotechnology and medicine2003: Eurekah.com. Gebhart, C.L. and A.V. Kabanov, Evaluation of polyplexes as gene transfer agents. J Control Release, 2001. 73(2-‐3): p. 401-‐16. Akinc, A., et al., Exploring polyethylenimine-‐mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. The Journal of Gene Medicine, 2005. 7(5): p. 657-‐663. Fischer, A. and M. Cavazzana-‐Calvo, Gene therapy of inherited diseases. The Lancet, 2008. 371(9629): p. 2044-‐2047. Jonge, H.d. Kan Cystic Fibrosis genezen worden? Giordano, C., F. Causa, and G. Candiani, Gene therapy: The state of the art and future directions. J Appl Biomater Biomech, 2006. 4(2): p. 73-‐9. Chiellini, E., et al., Biomedical polymers and polymer therapeutics2002: Kluwer Academic Publishers. Maeda, H., The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: the key role of tumor-‐selective macromolecular drug targeting. Adv Enzyme Regul, 2001. 41: p. 189-‐207. Gravitz, L., Gene therapy can protect against HIV, in Nature News2011, Nature Publishing Group. Zaia, J.A., Problems and solutions to successful gene-‐transfer based therapies for HIV. Clinical and Applied Immunology Reviews, 2003. 3(4–5): p. 199-‐211. Wolkowicz, R. and G.P. Nolan, Gene therapy progress and prospects: Novel gene therapy approaches for AIDS. Gene Ther, 2005. 12(6): p. 467-‐476. Joshi, A., et al., Targeting the HIV entry, assembly and release pathways for anti-‐HIV gene therapy. Virology, 2011. 415(2): p. 95-‐106. Pan, R.Y., et al., Disease-‐inducible transgene expression from a recombinant adeno-‐
associated virus vector in a rat arthritis model. J Virol, 1999. 73(4): p. 3410-‐7. Ratner, B.D., et al., Biomaterials science : an introduction to materials in medicine. Vol. 2. 2004: Elsevier Academic Press. Lassalle, V. and M.L. Ferreira, PLA nano-‐ and microparticles for drug delivery: An overview of the methods of preparation. Macromolecular Bioscience, 2007. 7(6): p. 767-‐783. Dubruel, P. and E. Schacht, Polymers for biomedical applications 2011. Vroman, I. and L. Tighzert, Biodegradable polymers. Materials, 2009. 2: p. 307-‐344. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. Auras, R., B. Harte, and S. Selke, An Overview of Polylactides as Packaging Materials. Macromolecular Bioscience, 2004. 4(9): p. 835-‐864. Declercq, H.A., et al., Osteoblast behaviour on in situ photopolymerizable three-‐
dimensional scaffolds based on D, L-‐lactide, epsilon-‐caprolactone and trimethylene carbonate. J Mater Sci Mater Med, 2006. 17(2): p. 113-‐22. Chong, M.S., C.N. Lee, and S.H. Teoh, Characterization of smooth muscle cells on poly(ε-‐caprolactone) films. Materials Science and Engineering: C, 2007. 27(2): p. 309-‐
312. Chen, D.R., J.Z. Bei, and S.G. Wang, Polycaprolactone microparticles and their biodegradation. Polymer Degradation and Stability, 2000. 67(3): p. 455-‐459. Huang, M.H., S. Li, and M. Vert, Synthesis and degradation of PLA–PCL–PLA triblock copolymer prepared by successive polymerization of ε-‐caprolactone and dl-‐lactide. Polymer, 2004. 45(26): p. 8675-‐8681. Fernandes, A.M., et al., Mouse embryonic stem cell expansion in a microcarrier-‐based stirred culture system. Journal of Biotechnology, 2007. 132(2): p. 227-‐236. Bock, N., et al., Electrospraying, a Reproducible Method for Production of Polymeric Microspheres for Biomedical Applications. Polymers, 2011. 3(1): p. 131-‐149149. Jaworek, A. and A.T. Sobczyk, Electrospraying route to nanotechnology: An overview. Journal of Electrostatics, 2008. 66(3–4): p. 197-‐219. Van der Gucht, F., R&D Spray Drying, 2012, Procept. p. 54. Van der Gucht, F., The ProCepT 4M8 Spray Dryer for R&D, 2011. p. 6. Vanwesenbeeck, J., F. Van der Gucht, and M. Gil, Spray Drying Scale-‐Up from mg to kg Scale, Lessius, Editor 2011. Dubruel, P., et al., Synthetic polyamines as vectors for gene delivery. Polymer International, 2002. 51(10): p. 948-‐957. Dekie, L., et al., Poly-‐l-‐glutamic acid derivatives as vectors for gene therapy. Journal of Controlled Release, 2000. 65(1–2): p. 187-‐202. Hissink, E.C., et al., DL-‐lactide caprolactone copolymers, 2002, Polyganics BV. p. 11. Hoofdstuk 2: Synthese van biodegradeerbare poly(-‐L-‐glutamine) derivaten A. Intelligente design: algemene strategie Poly(-‐L-‐glutamine) derivaten met DNA interagerende eigenschappen bezitten enkele kenmerken die ze aantrekkelijk maakt als niet-‐virale vectoren voor gentherapie. [1] Bovendien kunnen de eigenschappen van de vectoren aangepast worden via een intelligente design. Modificatie van de vectoren kan zorgen voor een verhoogde transfectie efficiëntie, een verbeterde celspecificiteit, een vereenvoudigde endosomale vrijstelling en/of een verlaging van de cytotoxiciteit. [2, 3] De gerichte design biedt voordelen ten opzichte van reeds geëxploreerde niet-‐virale vectoren als PEI, PLL, dendrimeren en pDMAEMA afgeleiden die veelal een aanzienlijke haemo-‐ en cytotoxiciteit bezitten. [4] Een bijkomend voordeel aan poly(-‐L-‐glutamine) derivaten is dat ze ook biodegradeerbaar zijn door de aanwezigheid van amidefuncties in de hoofdketen. Dit opent de mogelijkheid voor het herhaaldelijk toedienen in het lichaam zonder problemen te veroorzaken door accumulatie in celweefsel. Een laatste positieve eigenschap is de α-‐helix structuur van de backbone die de vrijstelling uit het endosoom bevordert. [5] Voor de synthese van de niet-‐virale vectoren wordt gestart van γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat (figuur 2.1). Dit wordt omgevormd tot een polymeriseerbaar monomeer door transformatie tot een cyclisch N-‐carboxyanhydride (NCA). Vervolgens kan dit op een gecontroleerde manier gepolymeriseerd worden tot poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) (pBG) via een bijna levende polymerisatie. Aangezien pBG op zich nog geen DNA complexerende eigenschappen heeft, dient dit verder gederivatiseerd te worden. De post-‐polymerisatie modificatie via aminolyse laat het inbouwen van specifieke zijgroepen langs de backbone toe. Zo kunnen er imidazol-‐, hydroxyl-‐ en guanidine zijgroepen ingebouwd worden. De aanwezigheid van imidazolgroepen in de zijketen zorgt voor een verhoogde transfectie efficiëntie. [6] Het aanbrengen van hydroxyethyl spacers verhoogt de wateroplosbaarheid en kan niet-‐
specifieke adsorptie van proteïnen vermijden (zie bijlage 4). [7] Zonder de aanwezigheid van 23 positieve ladingen, ontbreekt bij de vectoren de mogelijkheid om polyplexen te vormen. Primaire amines zijn positief geladen bij fysiologisch pH en in staat DNA te complexeren. Dit gaat echter gepaard met een zekere cytotoxiciteit (zie bijlage 4). Het omzetten in guanidines kan hiervoor een oplossing bieden. [8] Figuur 2.1: Overzicht synthese van poly(-‐L-‐glutamine) derivaten als niet-‐virale vectoren voor gentherapie. Cyclisatie van γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat (BG) tot γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat N-‐carboxyanhydride (BG-‐NCA), gevolgd door de polymerisatie tot poly(-‐γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) (pBG) en derivatisatie door middel van aminolyse. B. Synthese van γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat N-‐carboxyanhydride Voor de synthese van een polyamide bestaande uit een opeenvolging van hetzelfde aminozuur moet er een polymeriseerbaar monomeer beschikbaar zijn. Hier wordt uitgegaan van γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat (BG), afkomstig van L-‐glutaminezuur via een selectieve verestering. [9] L-‐glutaminezuur is een niet-‐essentieel, natuurlijk voorkomend aminozuur in het menselijk 24 lichaam en geeft daardoor aanleiding tot niet-‐toxische nevenproducten na degradatie van het gevormde polyamide. Een polymeriseerbare vorm van γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat kan bekomen worden door de synthese van het cyclische N-‐carboxyanhydride derivaat, ook wel Leuch’s anhydride genoemd. [10] De ringopeningspolymerisatie (ROP) van een N-‐carboxyanhydride is een veelgebruikte methode voor het bekomen van polypeptiden met een gecontroleerd moleculair gewicht. [11] De eenvoudigste methode voor het bekomen van het N-‐carboxyanhydride van γ-‐benzyl-‐L-‐
glutamaat (BG-‐NCA) bestaat uit de reactie van BG met fosgeen. Hierbij wordt de directe fosgenatie van het aminozuur verricht met vorming van een N-‐chloroformylaminozuur intermediair en cyclisatie met het verlies van zoutzuur. Deze methode werd ontwikkeld door Fuchs-‐Farthing, maar is niet ongevaarlijk door het gebruik van fosgeengas. Fosgeengas is niet alleen zeer toxisch maar moet bovendien ook in grote hoeveelheden aan de reactie worden toegevoegd om deze te laten doorgaan. [12] De nadelen geassocieerd met het gebruik van fosgeengas hebben geleid tot de inzet van difosgeen en trifosgeen bij de synthese van BG-‐NCA. Trifosgeen is een stabiel, kristallijn product bij kamertemperatuur. Difosgeen daarentegen is gemakkelijker uit het mengsel te halen en is vloeibaar bij kamertemperatuur. Hierdoor is het veiliger dan fosgeen. [13] Voor de synthese van BG-‐NCA werd aan een suspensie van γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat in droge ethylacetaat (60 °C) langzaam een oplossing difosgeen in EtOAc (15 w/v%) toe gedruppeld (figuur 2.2). Dit gebeurt in kleine porties (10 ml). Na toedruppelen van een portie en 20 minuten reactietijd, wordt het gevormde zoutzuur (HCl) uit het reactiemengsel verwijderd. Hiervoor dient er gedurende 10 minuten argongas doorheen de oplossing geborreld te worden. De eliminatie van HCl is noodzakelijk om nevenreacties te vermijden. Deze cyclus dient herhaald te worden tot de suspensie overgegaan is in een transparante oplossing. Hierbij is alle BG omgezet in BG-‐NCA. Vervolgens wordt er een uur ontgast en na afkoelen tot kamertemperatuur wordt opnieuw gedurende een uur argon door het medium gestuurd. Hierna wordt de oplossing afgefilterd en het filtraat deels ingedampt (tot ± 100 ml) zodat dit kan neergeslaan worden in koude pentaan. Het geïsoleerde precipitaat wordt verder opgezuiverd door herhaalde omkristallisaties in EtOAc tot het chloridegehalte minder dan 0,02% bedraagt. De lage chloride concentratie is noodzakelijk omdat contaminatie met HCl kan zorgen voor 25 inactivatie van de initiator tijdens de polymerisatie door zoutvorming. [12] Het resterende chloridegehalte kan bepaald worden door middel van een chloridetest. Hierbij wordt een spatelpunt BG-‐NCA opgelost in HNO3 (2M) en verwarmd. Vervolgens worden enkele druppels AgNO3 toegevoegd en wordt gekeken of de troebelheid lager is dan deze van kraantjeswater. Wanneer dit het geval is, is BG-‐NCA voldoende zuiver om op een gecontroleerde manier gepolymeriseerd te worden. Figuur 2.2: Reactiemechanisme voor de synthese van γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat N-‐carboxy anhydride (BG-‐NCA). Na opzuivering werd BG-‐NCA gekarakteriseerd door middel van IR spectroscopie en 1H-‐NMR. Analyse van het IR-‐spectrum toont twee karakteristieke pieken afkomstig van de rekvibratie van de carbonylgroepen aanwezig in de NCA-‐ring (figuur 2.3). De piek rond 1770 cm-‐1 is afkomstig van de vibratie van de carbonyl naast het stikstofatoom, terwijl de piek rond 1860 cm-‐1 voorkomt uit de vibratie van de carbonyl naast het α-‐koolstofatoom. [14] De rekvibratie veroorzaakt door de ester in de zijketen is aanwezig rond 1720 cm-‐1. Verder kan de N-‐H amide rekvibratie onderscheiden worden (± 3330 cm-‐1). 4
2
4
3
1
Figuur 2.3: IR-‐spectrum van BG-‐NCA. 26 Karakterisatie via 1H-‐NMR (figuur 2.4) in CDCl3 toont de aanwezigheid van de vijf aromatische waterstoffen op de benzyl bij 7,3 ppm. Het waterstof op het stikstofatoom is terug te vinden op 6,15 ppm. De chemische verschuiving van de 2 waterstofatomen op de koolstof naast de benzylgroep is te zien bij 5,1 ppm. Verder zijn beide β-‐waterstofatomen onderhevig aan piekopspitsing bij 2,05 en 2,2 ppm aangezien het β-‐koolstof gebonden is aan een stereocenter. De piek hiernaast (2,55 ppm) is afkomstig van de γ-‐waterstofatomen. De chemische verschuiving van het α-‐waterstof is aanwezig in het spectrum als een triplet bij 4,3 ppm. α
Aromatische H’s
5H
β
CHCl3
γ
δ
2H
Aromatische H’s
δ
γ
2H
β
α
2H
1H
HN
H 2O
Vacuumvet
1
Figuur 2.4: H-‐NMR spectrum van BG-‐NCA. C. Polymerisatie van BG-‐NCA met behulp van een primair amine bevattende initiator Het homopolymeer van γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat kan gevormd worden via de ROP van het overeenkomstige NCA. Nadelen aan de ROP zijn het optreden van nevenreacties (zoals ketentransfer en terminatie reacties) en de beperkte controle over het moleculair gewicht. Dit kan zorgen voor brede moleculair gewichtsdistributies. [11] Toch is het mogelijk om BG-‐
NCA te polymeriseren via een bijna levende polymerisatie. De keuze van een geschikt solvent en de verhouding monomeer tot initiator spelen een belangrijke rol bij de controle van het moleculair gewicht. [15] 27 a. Reactiemechanisme Primaire amines zoals n-‐butylamine (n-‐BuNH2) bezitten meer nucleofiel dan basisch karakter en zijn over het algemeen goede initiatoren voor NCA-‐monomeren. Het reactiemechanisme verloopt via het “amine mechanisme” waarbij de ROP een evenredige ketengroei vertoont met de monomeer conversie. [11] De polymerisatiereactie wordt geïnitieerd door de nucleofiele aanval van het amine op de C(2) carbonylgroep (figuur 2.5). Dit gebeurt selectief omdat de carbonyl op de C(1) positie minder nucleofiel is door elektronendelokalisatie van het vrije elektronenpaar op de naburige stikstof. Na ringopening wordt een carbaminezuurderivaat gevormd. Dit instabiele intermediair wordt spontaan gedecarboxyleerd tot een nieuw primair amine. Deze kan op zijn beurt verder propageren met andere BG-‐NCA’s tot pBG. De propagatie verloopt via een geconcerteerd mechanisme met vrijstelling van CO2. De stikstofatomen in een amidebinding en het α-‐koostof bezitten weinig of geen nucleofiliciteit en nemen dus niet deel aan de reactie (figuur 2.6). [12] Voor het bekomen van een gecontroleerde, levende polymerisatiereactie is de zuiverheid van het monomeer van groot belang. Sporen HCl kunnen zorgen voor quenching van propagerende ketens. Bovendien kunnen onzuiverheden zoals water optreden als ketentransfer reagentia of zelf dienen als katalysator voor ongewenste nevenreacties. [11] Figuur 2.5: Mechanisme van de initiatiestap met n-‐BuNH2 + aanduiding nummering C(1) en C(2) carbonyl
Figuur 2.6: Mechanisme van de propagatie van geactiveerd BG-‐NCA tot pBG. 28 .
De balans tussen de nucleofiliciteit van de geactiveerde amines en de monomeer/initiator ratio (M/I) bepaalt het verdere verloop van de polymerisatie. Bij gecontroleerde polymerisaties verloopt de initiatie sneller dan de propagatie. Elke initiator geeft aanleiding tot een groeiende polymeerketen. Dit is het geval wanneer de initiator nucleofieler is dan het actief ketenuiteinde zoals bij n-‐BuNH2. [12] De polymerisatiegraad (DP) kan volgens onderstaande vergelijking bepaald worden voor M/I kleiner dan 100. Dit laat toe om polymeren te synthetiseren met een gecontroleerd moleculair gewicht. DP =
M % conversie
∗
I
100
De polymerisatie zal steeds afwijkingen vertonen van het levend karakter. De verhoging van de viscositeit en verlaagde ketenmobiliteit bij groeiende ketens kan leiden tot een fysische inactivatie van de actieve uiteinden. [16] Naast fysieke inactivatie zorgen terminatiereacties ook voor een afwijking van het levend karakter van de polymerisatie. Hierbij valt een actief ketenuiteinde aan op een esterfunctie in de zijketen waardoor een eindstandige pyrrolidinering ontstaat (figuur 2.7). [12] Terminatiereacties treden vooral op bij hogere moleculaire gewichten, wat de polymerisatie van BG-‐NCA met een primair amine beperkt tot ongeveer 35 kDa. [17] Figuur 2.7: Mechanisme van de intramoleculaire terminatiereactie in pBG met vorming van eindstandige pyrrolidinering. b. Synthese van poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) BG-‐NCA wordt gepolymeriseerd tot pBG door het monomeer op te lossen in een mengsel van dichloormethaan/ethylacetaat (6/1) en na toevoegen van n-‐BuNH2 als initiator te roeren bij kamertemperatuur. Na 48h wordt de reactie stopgezet door triethylamine (TEA) en azijnzuuranhydride (OAc2) aan het reactiemengsel toe te voegen (figuur 2.8). Hierbij worden alle actieve keteneindes getermineerd. Nadien wordt pBG geprecipiteerd in een overmaat koude diethylether/methanol (4/1). 29 Figuur 2.8: Synthese pBG met n-‐BuNH2 als initiator en TEA en OAc2 als terminator. Het polymeer wordt gekarakteriseerd via IR-‐spectroscopie (figuur 2.9) en 1H-‐NMR. De karakteristieke rekvibraties van NCA maken plaats voor rekvibraties bij 1650 cm-‐1 (C=O rek) en 1540 cm-‐1 (C-‐N rek) die kenmerkend zijn voor een amide binding. De brede piek bij 3289 cm-‐1 is afkomstig van de N-‐H rekvibratie van het amide. Daarnaast is er een rekvibratie bij 1730 cm-‐1 terug te vinden afkomstig van de ester in de benzylische zijketen. Opnieuw kunnen de C-‐H rekvibraties van de fenylgroep onderscheiden worden bij een piek rond 3000 cm-‐1. 4
2
1
2
3
Figuur 2.9: IR-‐spectrum van pBG. 1
De analyse van het H-‐NMR spectrum (figuur 2.10) in gedeutereerd trifluorazijnzuur (TFA-‐d) met een longitudinale relaxatietijd van 5s toont een chemische verschuiving van 7,35 ppm voor de aromatische waterstoffen op de benzylgroep. De piek van de twee β-‐waterstoffen is opgesplitst (2,05 ppm en 2,3 ppm) door de aanwezigheid van het stereocenter. Hiernaast is een piek van de γ-‐waterstoffen terug te vinden bij 2,6 ppm. De piek bij 5,2 ppm is afkomstig van de benzylische CH2. De α-‐waterstof geeft een chemische verschuiving van 4,8 ppm en 30 wordt gebruikt voor de bepaling van het moleculair gewicht via integratie t.o.v. de eindstandige methylgroep afkomstig van n-‐BuNH2. Dit komt omdat de initiator covalent gebonden is aan de polymeerketen en verantwoordelijk is voor de enige methylgroep in het spectrum (1,0 ppm). Deze integreert voor 3 waterstoffen. Wanneer dit in rekening gebracht wordt, kan de polymerisatiegraad (DP) bepaald worden via de integratiewaarde van het α-‐waterstof. Door de DP te vermenigvuldigen met het moleculair gewicht van een structuureenheid (219,234 g/mol) wordt het moleculair gewicht van de gesynthetiseerde polymeren bekomen. α
β
γ
5H
δ
δ
γ
2H
2H
α
β
1H
2H
1
Figuur 2.10: H-‐NMR spectrum van pBG (10 kDa) met n-‐butylamine als initiator. Onderstaande tabel 2.1 toont aan dat het wel degelijk mogelijk was om pBG op een vrij gecontroleerde manier te polymeriseren. Tabel 2.1: Overzicht van de gesynthestiseerde polymeren. M/I ratio Beoogd Mw (Da) Bekomen Mw (Da) via NMR 22,8 5000 5200 45,6 10 000 10600 91,2 20 000 18100 31 D. Post-‐polymerisatie modificatie tot niet-‐virale vectoren a. Aminolyse van poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) Het gesynthetiseerde pBG bezit nog geen DNA complexerende eigenschappen en dient dus verder gemodificeerd te worden. Post-‐polymerisatie reacties via aminolyse laten het inbouwen van functionele groepen toe (figuur 2.11). Via deze weg kunnen er specifieke imidazol-‐, hydroxyl-‐ en amine zijgroepen aangebracht worden. Naast een DNA complexerende functie (amines) kunnen deze ook dienen als transfectie verhogende groepen (imidazol) of zorgen voor een betere oplosbaarheid, ladingsseparatie en reductie van niet-‐specifieke proteïne adsorptie (hydroxyl). [6, 7] Figuur 2.11: Post-‐polymerisatie modificatie via aminolyse van pBG. Door aminolyse van de esterfuncties in de zijketens daalt het moleculair gewicht van het polymeer. Er wordt tevens een lichtjes grotere polydispersiteit bekomen. Dit is te verklaren door het optreden van transamidering van de peptide ruggengraat als nevenreactie tijdens de aminolyse. [18] De selectiviteit van de reactie kan echter verbeterd worden door het gebruik van 2-‐hydroxypyridine (2-‐HP) als bifunctionele katalysator. Het toevoegen van een vijfvoudige overmaat 2-‐HP (t.o.v. het aantal esters in de zijketen) zorgt voor selectieve aminolyse van de zijketens en een sterke reductie in de ketendoorbraak. Hierdoor kan tot 70% van het oorspronkelijke moleculair gewicht behouden blijven. [19] 2-‐HP katalyseert de aminolyse reactie via een cyclische transitietoestand (figuur 2.12). De katalysator bevat een nucleofiele pyridine stikstof en een hydroxylfunctie die een tautomerisatie kunnen ondergaan (figuur 2.12). De ruimtelijke oriëntatie van beide groepen zorgt voor een optimale interactie met de benzylische ester in de zijketen en laat een 32 protontransfer van het aanvallend amine toe. [20] Door deze selectieve verestering blijft het moleculair gewichtsverlies tijdens de reactie beperkt. Figuur 2.12: Tautomere vormen van 2-‐HP (links) en de transitietoestand van de aminolysereactie met 2-‐HP als bifunctionele katalysator (rechts). Voor de aminolysereactie wordt pBG opgelost in dimethylformamide (DMF) in aanwezigheid van een 5-‐voudige overmaat 2-‐HP bij een temperatuur van 50°C. Hieraan wordt eerst tritylaminoethylamine (TrAEA) toegevoegd en na overnacht roeren worden ook ethanolamine (AE) en histamine in overmaat toegevoegd. De gebruikte verhouding van de reagentia bepaalt de samenstelling van het gemodificeerde polymeer na aminolyse. Het vooraf toevoegen van het minst reactieve TrAEA laat toch toe om een zekere hoeveelheid primaire amines in te bouwen. De lage reactiviteit is het gevolg van de sterische hindering door de tritylgroep. Na 48h reactie wordt nog eens een vijfvoudige overmaat AE toegevoegd om volledige conversie van de estergroepen te verkrijgen. Uiteindelijk wordt het gemodificeerd polymeer na 72h geïsoleerd door neer te slaan in koude diethylether. Door deze te koelen in vloeibare stikstof kan een beter filtreerbare neerslag bekomen worden. Vervolgens wordt de tritylgroep ontschermd op te lossen in TFA en daarna opnieuw te precipiteren in gekoelde diethylether. De ontscherming in TFA is (naast transamidering) de tweede reden waardoor het moleculair gewicht daalt. Na dialyse (opeenvolgend in milli Q, 0,1 M NaCl, 0,05 M HCl, milli Q) en lyofilisatie wordt het eindproduct bekomen. b. Conversie van primaire amines tot guanidines Primaire amines aanwezig in de zijketen beschikken over een grote positieve ladingsdensiteit. Dit zorgt niet alleen voor een sterke DNA-‐complexatie, maar ook voor een sterke elektrostatische interactie met het plasmamembraan. Hierdoor kan het plasmamembraan gedestabiliseerd worden en zelfs openbarsten. [21] Daarom worden de 33 aanwezige amines omgezet in guanidines aangezien deze zorgen voor een delokalisatie van de positieve lading. Dit geeft een verlaging van de cytotoxiciteit met het behoudt van de mogelijkheid tot DNA-‐complexatie. [8] Guanidinegroepen zorgen ook voor een verhoging van de transfectie efficiëntie van de vectoren. Aangezien guanidinegroepen altijd positief geladen zijn bij fysiologische pH (pKa 12,5) kunnen deze sterke bidentate waterstofbruggen aangaan met fosfaten, sulfaten en carboxylaten aanwezig op het celmembraan. [22] Dit biedt hulp bij de internalisatie door vorming van lipofiele ionenparen die de lipide dubbellaag kunnen binnendringen. Een overmaat aan guanidinegroepen heeft dan weer een negatieve invloed op de transfectie efficiëntie. Een te sterke interactie met de membraanproteïnen kan ervoor zorgen dat de vector niet meer loskomt van het celmembraan. [23] Figuur 2.13: Reactiemechanisme van de guanidinylering van een primair amine. De guanidinylering gebeurt slechts in de laatste synthesestap aangezien de derivaten moeilijk oplossen in courante organische solventen en een sterk basisch karakter vertonen. De primaire amines worden omgezet in guanidines door het gemodificeerde polymeer op te lossen in ultrazuiver water en hieraan een 16-‐voudige overmaat 3,5-‐dimethyl-‐1-‐
guanylpyrazool (DMGP) t.o.v. het aantal primaire amines toe te voegen (figuur 2.13). Hiervoor is eerst een aparte oplossing van DMGP op pH 9,5 gebracht d.m.v. kaliumhydroxide. Dit stelt alle amines beschikbaar voor reactie door deprotonatie. Vervolgens wordt kaliumjodide aan het reactiemengsel toegevoegd tot een concentratie van 6 M voor het creëren van een macromoleculair effect. [17] Dit zorgt ervoor dat de conversie van de primaire amines volledig kan doorgaan. Na 24h reactie wordt het reactiemengsel in zijn geheel onderworpen aan een dialyse t.o.v. ultrazuiver water. Hierna wordt de oplossing 34 aangezuurd tot pH 4 om de polymeren opnieuw te protoneren en zo beter wateroplosbaar te maken. De verdere opzuivering verloopt via een standaard dialyse gevolgd door isolatie van het eindproduct via een vriesdroog proces. c. Overzicht van de gesynthetiseerde derivaten Het inbouwen van specifieke groepen in de zijketens is gebaseerd op eerdere bevindingen en met het oog op een intelligente design van niet-‐virale vectoren. [2, 17, 24] Er werd gestreefd naar een minimale cytotoxiciteit in combinatie met goede DNA complexerende eigenschappen. i. Synthese van p(HEGx-‐co-‐AEGy-‐co-‐ImEGz) In de eerste derivatisatiestap worden er primaire amines, hydroxyl-‐ en imidazolgroepen ingebouwd in het polymeer. Dit gebeurt via de eerder beschreven aminolyse reactie en geeft poly(hydroxyethyl-‐L-‐glutamine-‐co-‐aminoethyl-‐L-‐glutamine-‐co-‐imidazolethyl-‐L-‐glutamine) of p(HEGx-‐co-‐AEGy-‐co-‐ImEGz) (figuur 2.14). Figuur 2.14: Synthese van p(HEGx-‐co-‐AEGy-‐co-‐ImEGz). De samenstelling van het p(HEGx-‐co-‐AEGy-‐co-‐ImEGz) wordt bepaald via analyse met 1H-‐NMR in D2O (figuur 2.15). De α-‐piek is terug te vinden bij 2,25 ppm, de piek afkomstig van de γ-‐
waterstoffen bij 2,3 ppm en de opgesplitste piek behorend tot de β-‐waterstoffen bij 2,05 en 1,9 ppm. De CH2’s (A en B) van de imidazolgroep geven aanleiding tot een chemische verschuiving van 3,55 en 3,25 ppm. Overigens kunnen de CH2’s (C en D) van de aminoethyl zijgroepen gelinkt worden aan pieken bij 3,1 en 3,5 ppm. De chemische verschuiving van de CH2’s (E en F) behorende tot de hydroxyethylgroepen ligt respectievelijk bij 3,3 en 3,75 ppm. Er waren ook enkele spookpieken zichtbaar tussen 2,5 en 3 en bij 1,7 ppm die niet konden toegewezen worden na integratie. Deze zijn hoogstwaarschijnlijk afkomstig zijn van de 35 oxidatie van de primaire amines wat een andere chemische verschuiving geeft als gevolg van de verschillende chemische omgeving. De percentages aan primaire amines, hydroxylgroepen of imidazolgroepen kunnen bepaald worden via integratie. Dit wordt gedaan door piek E, A en C of piek F, B en D samen te integreren en gelijk te stellen aan 100. Vervolgens wordt de aparte integratie van elke piek genomen om de procentuele samenstelling te bepalen. Deze samenstelling is van belang voor de verdere conversie van de primaire amines in guanidines en het bepalen van de massa per ladingsverhouding. F
α
E
DMF
α
α
β
β
β
γ
γ
γ
E
C
A
F
D
B
D
C
A
B
γ
β
α
1
Figuur 2.15: H-‐NMR van p(HEGx-‐co-‐AEGy-‐co-‐ImEGz). ii. Synthese van p(HEGx-‐co-‐GuAEGy-‐co-‐ImEGz) In de tweede stap van de derivatisatie worden de aanwezige primaire amines omgezet in guanidinegroepen. Dit gebeurt via de eerder beschreven guanilydering en geeft poly(hydroxyethyl-‐L-‐glutamine-‐co-‐guanidylethyl-‐L-‐glutamine-‐co-‐imidazolethyl-‐L-‐glutamine) of p(HEGx-‐co-‐GuAEGy-‐co-‐ImEGz) copolymeren (figuur 2.16). 36 Figuur 2.16: Synthese van p(HEGx-‐co-‐GuAEGy-‐co-‐ImEGz). De conversie van de amines naar guanidines kan eveneens gevolgd worden door middel van 1
H-‐NMR in D2O (figuur 2.17). Piek A en B bij 6,25 en 8,4 ppm zijn afkomstig van de waterstoffen op de imidazolring. De intense piek bij 4,7 ppm is afkomstig van het solvent. De chemische verschuiving van het α-‐waterstof is terug te vinden bij 4,25 ppm. Verder liggen CH2’s (E en F) van de hydroxyethyl zijketens respectievelijk bij 3,25 en 3,55 ppm. De CH2’s (C en D) aanpalend aan de guanidinegroep geven aanleiding tot een chemische verschuiving van 3,05 en 3,35 ppm. De pieken bij 2,85 en 2,95 ppm worden veroorzaakt door aanwezige resten DMF. De piek afkomstig van de γ-‐waterstoffen is opgesplitst in drie afzonderlijke pieken bij 2,2, 2,3 en 2,4 ppm als gevolg van de verschillende chemische omgeving van de gemodificeerde zijketens. De opgesplitste β-‐piek geeft aanleiding tot een chemische verschuiving van 1,9 en 2,05 ppm. Tenslotte is er nog een kleine triplet zichtbaar bij 1,25 ppm als gevolg van de eindstandige methylgroep van de initiator. Om vast te stellen of alle primaire amines volledig omgezet zijn in guanidines kan de integratie van de α-‐piek opnieuw gelijk gesteld wordt aan 100%. Zo kan het percentage guanidines bepaalt worden uit de integratie van piek C of D afkomstig van de CH2’s van de guanidine zijgroepen. Er wordt een voorkeur gegeven aan piek C aangezien piek D soms in overlap komt te liggen met piek F van hydroxyethylgroep. Het is ook mogelijk om opnieuw de procentuele samenstelling van de andere functionaliteiten in de zijgroepen te bepalen, maar dit is niet altijd eenvoudig wegens mogelijke piekoverlap. 37 α
α
α
β
β
β
γ
γ
γ
γ
H 20
E
C
F
D
A
B
His
E
A
C
α
B
F
DMF
β
D
triplet
initiator
1
Figuur 2.17: H-‐NMR van p(HEGx-‐co-‐GuAEGy-‐co-‐ImEGz) De samenstelling van de gesynthetiseerde p(HEGx-‐co-‐GuAEGy-‐co-‐ImEGz) derivaten hangt af van de verhoudingen van de gebruikte reagentia (tabel 2.2). Tabel 2.2: Overzicht van de chemische samenstelling en moleculair gewicht van de gesynthetiseerde p(HEGx-‐co-‐GuAEGy-‐
co-‐ImEGz) copolymeren. Copolymeer: p(HEGx-‐co-‐GuAEGy-‐co-‐ImEGz) Overmaat reagentia Mn (Da) AE TrAEA His Samenstelling (%) Hydroxyl Guanidines Imidazol (HEG) (GuAEG) (ImEG) opl. (aq) kleur gesynthetiseerd uit 1e reeks pBG 9600 10 10 1/4 60 30 10 -‐ wit-‐groen 17934 10 10 1/4 41 27 32 ± wit-‐geel 9600 10 20 1/4 53 16 31 + wit 5000 10 10 5 21 12 67 + wit 5000 10 10 1 22 19 59 + wit gesynthetiseerd uit 2e reeks pBG 18600 10 10 1/4 8 88 4 + wit-‐geel 18600 10 10 1 15 78 7 ± geel-‐oranje 18600 10 10 5 45 43 12 ± oranje 10600 10 20 1/4 22 60 18 + geel-‐oranje 5700 10 10 1/4 55 32 17 + oranje 5900 10 10 1 66 14 20 + oranje-‐rood 5800 10 10 5 61 26 13 + wit 38 In totaal werden twee reeksen modificaties uitgevoerd van pBG. Er kon echter geen rechtstreeks verband afgeleid worden voor de inbouw van de reagentia op de zijketens in functie van de gebruikte reagens concentraties (tabel 2.2). Wel bleek dat histamine reeds bij ¼ ondermaat substantieel werd ingebouwd. Toevoegen van een overmaat had geen grote invloed op het percentage imidazolgroepen in de polymeren. Daarnaast kan een hoger percentage hydroxyethylgroepen teruggevonden worden bij lagere moleculaire gewichten. Voor de inbouw van amines kon geen duidelijke trend vastgesteld worden. De zuiverheid van TrAEA heeft een sterke invloed op diens incorporatie. Na het opnieuw synthetiseren en opzuiveren van TrAEA (zie bijlage 1) bleek een groter percentage amines in de zijketens aanwezig te zijn na aminolyse (reeks 2, tabel 2.2). Dit is duidelijk te zien in reeks 2 bij dezelfde overmaat aan TrAEA t.o.v. reeks 1 (tabel 2.2). Een hoog percentage amines kan ook gelinkt worden aan de mate waarin de gemodificeerde polymeren verkleuren (vb. p(HEG15%-‐
co-‐GuAEG78%-‐co-‐ImEG7%)). Deze verkleuring is mogelijks te wijten aan de oxidatie van de amines of guanidines. [25] Vermoedelijk trad de oxidatie op tijdens de dialyse. De eerste reeks pBG werd gepolymeriseerd uit BG-‐NCA dat al een tijd gestockeerd was. Nu blijkt echter dat BG-‐NCA niet stabiel blijft voor langere tijdspannes, zelfs niet bij -‐20°C. Sporen water aanwezig in BG-‐NCA kunnen langzaam polymerisatie van het NCA in de solid state veroorzaken. [5] Dit gaf problemen met oplosbaarheid van de eerste reeks derivaten door de mogelijke aanwezigheid van prepolymeren (vb. p(HEG60%-‐co-‐GuAEG30%-‐co-‐
ImEG10%)). Bovendien werden lage rendementen bekomen door het feit dat er mogelijks prepolymeren gevormd waren die zo’n laag moleculair gewicht hadden dat ze door het membraan migreerden. Deze hypothese wordt ondersteund door het feit dat derivaten afkomstig van de tweede reeks pBG (afkomstig van nieuw gesynthetiseerd BG-‐NCA) een aanzienlijk betere oplosbaarheid en controle over het moleculair gewicht vertonen. Tabel 2.3: Verloop van het moleculair gewicht (in Da) tijdens aminolyse en guanidinylering. Aminolyse Copolymeer p(HEGx%-‐co-‐GuEGy%-‐co-‐ImEGz%) Mn Mw D Mn Mw D p(HEG15%-‐co-‐GuEG78%-‐co-‐ImEG7%) 5700 6200 1.1 5400 7400 1.37 p(HEG66%-‐co-‐GuEG14%-‐co-‐ImEG20%) 6800 7200 1.05 5900 7800 1.32 p(HEG41%-‐co-‐GuEG27%-‐co-‐ImEG32%) 21200 31200 1.47 39 Guanidinylering 17900 23900 1.34 Wanneer de evolutie van het moleculair gewicht (bepaald via gel permeatie chromatografie) na modificatie opgenomen wordt, is een afname van het Mn zichtbaar (tabel 2.3). Dit wordt veroorzaakt doordat 2-‐HP de transamidering tijdens de aminolyse niet voldoende kan verhinderen en het gebruik van TFA bij de ontscherming van de tritylgroep. Een verdere schijnbare afname tijdens de amine conversie in guanidines is louter te wijten aan een verschil in retentietijd op de GPC kolom als gevolg van de veranderde chemische samenstelling. Hierdoor krijgen de polymeren een kleiner hydrodynamisch volume (als gevolg van de gewijzigde interactie met het solvent) en een schijnbaar lager moleculair gewicht. Wat ook opviel zijn de lage polydispersiteiten in tegenstelling tot wat verwacht werd via deze polymerisatiemethode. 40 E. Referenties 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Dubruel, P., et al., Poly-‐L-‐glutamic acid derivatives as multifunctional vectors for gene delivery. Part B. Biological evaluation (vol 4, pg 1177, 2003). Biomacromolecules, 2003. 4(6): p. 1868-‐1868. Dubruel, P., L. Dekie, and E. Schacht, Poly-‐L-‐glutamic acid derivatives as multifunctional vectors for gene delivery. Part A. Synthesis and physicochemical evaluation. Biomacromolecules, 2003. 4(5): p. 1168-‐1176. Luo, D. and W.M. Saltzman, Synthetic DNA delivery systems. Nat Biotechnol, 2000. 18(1): p. 33-‐7. Park, T.G., J.H. Jeong, and S.W. Kim, Current status of polymeric gene delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews, 2006. 58(4): p. 467-‐486. Kricheldorf, H.R., Polypeptides and 100 years of chemistry of alpha-‐amino acid N-‐
carboxyanhydrides. Angew Chem Int Ed Engl, 2006. 45(35): p. 5752-‐84. Jeong, J.H., S.W. Kim, and T.G. Park, Molecular design of functional polymers for gene therapy. Progress in Polymer Science, 2007. 32(11): p. 1239-‐1274. Lee, H.B., J.H. Lee, and J.D. Andrade, Blood compatibility of polyethylene oxide surfaces. Progress in Polymer Science, 1995. 20(6): p. 1043-‐1079. Lee, Y., et al., Enhancement of the Transfection Efficiency of Poly(ethylenimine) by Guanidylation. Bull. Korean Chem. Soc., 2008. 29(3): p. 666-‐668. Blout, E.R. and R.H. Karlson, Polypeptides. III. The Synthesis of High Molecular Weight Poly-‐γ-‐benzyl-‐L-‐glutamates1. Journal of the American Chemical Society, 1956. 78(5): p. 941-‐946. Kovacs, J., H.N. Kovacs, and R. Ballina, Glutamic and Aspartic Anhydrides. Rearrangement of N-‐Carboxyglutamic 1,5-‐Anhydride to the Leuchs' Anhydride and Conversion of the Latter to Pyroglutamic Acid. Journal of the American Chemical Society, 1963. 85(12): p. 1839-‐1844. Cheng, J. and T.J. Deming, Synthesis of polypeptides by ring-‐opening polymerization of alpha-‐amino acid N-‐carboxyanhydrides. Top Curr Chem, 2012. 310: p. 1-‐26. Kralingen, L.v., Controlled Polymerization of Amino acid Derivatives, 2008, Stellenbosch University. Katakai, R., et al., Stepwise synthesis of oligopeptides with N-‐carboxy-‐.alpha.-‐amino acid anhydrides. IV. N-‐Carboxyglycine anhydride. The Journal of Organic Chemistry, 1972. 37(2): p. 327-‐329. Block, H., α-‐aminoacid-‐N-‐carboxyanhydrides and related heterocycles: Syntheses, properties, peptide synthesis, polymerization H. R. Kricheldorf, Springer-‐Verlag, Berlin, 1987. pp. x + 214, price DM 158.00. ISBN 3-‐540-‐17072-‐3. British Polymer Journal, 1989. 21(2): p. 182-‐182. Deming, T.J., Living polymerization of α-‐amino acid-‐N-‐carboxyanhydrides. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 2000. 38(17): p. 3011-‐3018. Lundberg, R.D. and P. Doty, Polypeptides. XVII. A Study of the Kinetics of the Primary Amine-‐initiated Polymerization of N-‐Carboxy-‐anhydrides with Special Reference to Configurational and Stereochemical Effects. Journal of the American Chemical Society, 1957. 79(15): p. 3961-‐3972. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. Goes, A., Synthese en evaluatie van poly-‐L-‐glutamine derivaten als niet-‐virale gen-‐
afgiftesystemen, in Onderzoeksgroep Polymer Chemistry & Biomaterials Group 2010, UGent: Vakgroep Organische Chemie. p. 121. Lupu-‐Lotan, N., et al., Conformation changes in the nonionizable water-‐soluble synthetic polypeptide poly-‐N5-‐(3-‐hydroxypropyl) -‐L-‐glutamine. Biopolymers, 1965. 3(6): p. 625-‐655. De Marre, A., et al., Improved method for the preparation of poly[N5-‐(2-‐
hydroxyethyl)-‐l-‐glutamine] by aminolysis of poly(γ-‐benzyl-‐l-‐glutamate). Polymer, 1994. 35(11): p. 2443-‐2446. Soyez, H., Doctoraatswerk, 1997, Ghent University. Gebhart, C.L. and A.V. Kabanov, Evaluation of polyplexes as gene transfer agents. J Control Release, 2001. 73(2-‐3): p. 401-‐16. Nakase, I., et al., Methodological and cellular aspects that govern the internalization mechanisms of arginine-‐rich cell-‐penetrating peptides. Adv Drug Deliv Rev, 2008. 60(4-‐5): p. 598-‐607. Rothbard, J.B., T.C. Jessop, and P.A. Wender, Adaptive translocation: the role of hydrogen bonding and membrane potential in the uptake of guanidinium-‐rich transporters into cells. Adv Drug Deliv Rev, 2005. 57(4): p. 495-‐504. Dekie, L., et al., Poly-‐l-‐glutamic acid derivatives as vectors for gene therapy. Journal of Controlled Release, 2000. 65(1–2): p. 187-‐202. Pitts, J.N., et al., Photooxidation of aliphatic amines under simulated atmospheric conditions: formation of nitrosamines, nitramines, amides, and photochemical oxidant. Environmental Science & Technology, 1978. 12(8): p. 946-‐953. Hoofdstuk 3: Fysico-‐chemische evaluatie van de kationische polymeren door middel van DNA condensatie A. Polyplexvorming Het doel van de fysico-‐chemische evaluatie is om aan te tonen of het p(HEGx-‐co-‐GuAEGy-‐co-‐
ImEGz) in staat is om met DNA te interageren en te condenseren. De hoeveelheid polymeer nodig om DNA efficiënt te complexeren hangt af van de ladingsdensiteit en de aard van de zijgroepen (primaire amines, guanidines, imidazol). De ladingsverhouding (LV) waarbij volledige complexatie van het DNA optreedt heet het condensatiepunt. De benodigde hoeveelheid polymeer bij een bepaalde LV kan berekend worden via onderstaande formule en vereist kennis van de massa op ladingsverhouding (M/C) van de polyelektroliet en het DNA. De M/C van het polyelektroliet is afhankelijk van zijn samenstelling en is de massa nodig om één mol lading te bekomen. De M/C van kalfsthymus DNA is 325 g/mol en wordt berekend uit het gewogen gemiddelde van de vier organische basen (A, G, C, T), de fosfaatgroep en de desoxyribose eenheid. [1] Een meer uitgebreide uitleg hierover kan teruggevonden worden in bijlage 2. De polyelektrolietcomplexen worden geanalyseerd met dynamische lichtverstrooiing (DLS), gel-‐
elektroforese en fluorescentietesten. µμ𝑔 𝑝𝑜𝑙𝑦𝑚𝑒𝑒𝑟 =
40 µμ𝑔 𝐷𝑁𝐴
∗ 𝑀 𝐶 𝑝𝑜𝑙𝑦𝑚𝑒𝑒𝑟 ∗ 𝐿𝑉 𝑀 𝐶 𝐷𝑁𝐴
B. Dynamische licht verstrooiing a. Analysemethode Dynamische licht verstrooiing (DLS) is een techniek die kan aangewend worden om te bepalen of de gesynthetiseerde vectoren al dan niet DNA kunnen condenseren tot een compacte vorm. De grootte en distributie van de deeltjes in oplossing wordt bepaald aan de hand van de intensiteit van de verstrooide lichtstralen. Grotere deeltjes zullen aanleiding geven tot een intense verstrooiing van het ingestraalde licht. Hoe beter de complexatie, hoe compacter de gemeten polyplexen zullen zijn. Bij DLS metingen wordt de grootte van de 41 DNA/polymeer complexen bij drie verschillende ladingsverhoudingen geanalyseerd. Er worden polymeer/DNA ratio’s met een LV van 1/1, 2/1 en 4/1 gemeten. b. Effect van het moleculair gewicht van DNA op de condensatie door kationische polymeren i. Dynamische lichtverstrooiing met kalfsthymus DNA De analyse van de opgemeten stalen toont aan dat de vectoren in staat zijn om kalfsthymus DNA in beperkte mate te complexeren. Een toenemende ladingsverhouding geeft in vele distributies een verschuiving van de pieken naar kleinere afmetingen (figuur 3.1). Bovendien zijn er steeds pieken tussen 20 en 50 nm terug te vinden wat beantwoordt aan de diameter van de polymeer/DNA complexen (tabel 3.1). Algemeen wordt aangenomen dat grootte distributies onder 200 nm een bewijs zijn dat polyplexvorming optreedt. Figuur 3.1: DLS grafiek met verschuiving grootte distributie naar kleinere afmetingen voor polyplexen met toenemende LV van 1/1 naar 4/1 van p(HEG21%-‐co-‐GuAEG12%-‐co-‐ImEG67%). Er wordt in vele gevallen echter een bimodale verdeling waargenomen. Bloomfield postuleerde een theorie voor het optreden van “schijnpieken” in de opgemeten stalen die een plausibele verklaring biedt aan de gevonden verdeling. Wanneer een deel niet of partieel gecomplexeerd DNA in oplossing aanwezig is, zal dit zorgen voor het detecteren van pieken met een grotere partikeldiameter. Er wordt gesteld dat de grotere fractie in de deeltjesdistributie te wijten is aan “cylindervormige” complexen. [2-‐5] Dit kan verklaard worden doordat cilindervormige structuren zich in oplossing zullen gedragen als grote sferen. Door beweging en rotatie in oplossing zullen deze door de analyseapparatuur onterecht als sferisch worden aanzien. Een tweede verklaring kan te wijten zijn aan aggregatie van de gevormde polymeer-‐DNA complexen. [6] Als er overgegaan wordt van een volumedistributie naar een numerieke distributie (figuur 42 3.2) valt het op dat de piek afkomstig van de grote deeltjes wegvalt. De volumedistributie brengt reeds de hogere intensiteit van grotere moleculen in rekening als gevolg van sterkere lichtverstrooiing. De numerieke distributie is een afgeleide hiervan en brengt ook het aantal moleculen in oplossing in rekening. Hieruit kan besloten worden dat het merendeel van de DNA fragmenten wel gecondenseerd zijn. Dit kan gezien worden aan de afname van de bijdrage van de deeltjes met grote dimensies. Figuur 3.2: Vergelijking van de volumedistributie (boven) t.o.v. de numerieke distributie (onder) van p(HEG53%-‐co-‐GuAEG16%-‐co-‐ImEG31%) voor LV 1/1. De gesynthetiseerde polymeren zijn niet in staat om hoog Mw DNA (uit kalfsthymus) volledig te condenseren tot compacte complexen, doch bezitten ze genoeg ladingen. Er zijn twee mogelijke redenen voor de gedeeltelijke complexatie van het DNA. De eerste is te wijten aan de mogelijke oxidatie van de aanwezige guanidine groepen tijdens de synthese. Dit zou kunnen leiden tot de gedeeltelijke neutralisatie van de vectoren en dus verlies aan complexerende eigenschappen. Een tweede reden valt toe te schrijven aan het lage moleculaire gewicht van de ontwikkelde polymeren (5-‐10-‐20 kDa) t.o.v. de grote DNA fragmenten (<= 2000 bp, ± 1300 kDa) geïsoleerd uit kalfsthymus. Door het grote verschil in massa tussen het geselecteerde DNA en de vectoren kan er geanticipeerd worden dat de interactie tussen beide macromoleculen niet optimaal kan verlopen. Vermoedelijk zijn er meerdere vectoren nodig voor de condensatie van een enkele DNA molecule. 43 Tabel 3.1: Overzicht deeltjesgrootte van de polyplexen bij LV 1/1, 2/1, 4/1 en overeenkomstige M/C 100%. Deeltjesgrootte (nm) bij LV polymeer M/C 100% p(HEG53%-‐co-‐GuAEG16%-‐co-‐ImEG31%) 670,6 35,2/752 47,7/449 p(HEG21%-‐co-‐GuAEG12%-‐co-‐ImEG67%) 525,9 51,4/616 43,9/444 26,7/444 p(HEG22%-‐co-‐GuAEG19%-‐co-‐ImEG59%) 490,3 24,2/328 25,1/250 23,3/213 p(HEG16%-‐co-‐GuAEG74%-‐co-‐ImEG10%) 299,9 22,3/327 25,1/268 20,5/355 p(HEG10%-‐co-‐GuAEG80%-‐co-‐ImEG10%) 284,9 31,3/222 p(HEG22%-‐co-‐GuAEG60%-‐co-‐ImEG18%) 339,4 36,8/251 32,8/191 25,2/201 p(HEG8%-‐co-‐GuAEG88%-‐co-‐ImEG4%) 270,5 29,5/272 31,9/305 29,2/264 p(HEG15%-‐co-‐GuAEG78%-‐co-‐ImEG7%) 293,2 22/137 26,4/187 22,1/104 p(HEG45%-‐co-‐GuAEG43%-‐co-‐ImEG12%) 441,8 316 25,3/199 25,4/323 p(HEG51%-‐co-‐GuAEG32%-‐co-‐ImEG17%) 520,2 49,9 68,5 27,1/235 p(HEG66%-‐co-‐GuAEG14%-‐co-‐ImEG20%) 832,9 112,6 619 23,3/291 p(HEG61%-‐co-‐GuAEG26%-‐co-‐ImEG13%) 619,7 36 40,4 56,4 LV 1/1 LV 2/1 32/153 LV 4/1 45,7 30/228 ii. DLS met enkelstrengige oligonucleotiden Het probleem met de incompatibiliteit in moleculair gewicht tussen de vectoren en de gebruikte DNA fragmenten opent tegelijkertijd nieuwe perspectieven. Op basis van de ladingsdichtheid moeten er toch zekere DNA complexerende eigenschappen aanwezig zijn in het polymeer. Daarom is er overgeschakeld op korter enkelstrengig DNA omdat dit een lager moleculair gewicht heeft. Hierbij wordt verwacht dat het kleine verschil in massa goede complexatie zal opleveren. Kortere DNA strains zoals enkelstrengige oligonucleotiden vertonen hopelijk een betere interactie met de vectoren. Indien de testen positief zijn kunnen de vectoren mogelijks ingezet worden als antisense delivery systemen. Voor de vorming van de polyplexen werd een enkelstrengig oligonucleotide (ssDNA) van 21 basen gebruikt met een moleculair gewicht van 6450 g/mol. De 21-‐mer sequentie bestaat uit een opeenvolging van volgende nucleotiden: GAA-‐AAA-‐AAA-‐TGA-‐CGT-‐CTT-‐CGG. In de DLS distributies kon steeds een fractie met een zeer kleine diameter teruggevonden worden (< 10 nm). Dit wijst op de vorming van zeer compacte condensaten. Hiernaast is er meestal ook een grotere distributie zichtbaar rond 200 à 300 nm. Vermoedelijk is dit gelegen aan een verschillende interactie van de vectoren met kleinere DNA fragmenten waardoor geaggregeerde condensaten gevormd worden. [5] 44 Bij alle geteste polymeren kon bovendien een verschuiving van de pieken naar kleinere afmetingen vastgesteld worden bij toenemende LV. Bij p(HEG21%-‐co-‐GuAEG12%-‐co-‐ImEG67%), p(HEG22%-‐co-‐GuAEG19%-‐co-‐ImEG59%), p(HEG8%-‐co-‐GuAEG88%-‐co-‐ImEG4%) en p(HEG61%-‐co-‐
GuAEG26%-‐co-‐ImEG13%) kan een volledige complexatie tot compacte deeltjes vastgesteld worden bij LV 4/1. p(HEG55%-‐co-‐GuAEG32%-‐co-‐ImEG17%) en p(HEG66%-‐co-‐GuAEG14%-‐co-‐
ImEG20%) daarentegen vertonen al een sterke condensatie van het ssDNA bij LV 2/1 (figuur 3.3). p(HEG45%-‐co-‐GuAEG43%-‐co-‐ImEG12%) vertoont reeds complexatie bij LV 1/1, maar vertoond ook bij hogere LV nog steeds een piek rond 270 nm. Bij de meeste vectoren wordt reeds bij LV 1/1 een fractie ssDNA tot compacte partikels gecondenseerd (<10 nm). Ongecomplexeerd ssDNA heeft een hydrodynamische afmeting van ongeveer 70 nm in oplossing. Dit is bij geen enkel polymeer aanwezig. Wat bewijst dat elk polymeer DNA complexerende eigenschappen bezit. Figuur 3.3: DLS numerieke distributie met verschuiving van de pieken voor de polyplexen naar kleinere afmetingen met toenemende LV van 1/1 naar 4/1 van p(HEG55%-‐co-‐GuAEG32%-‐co-‐ImEG17%). Volledige condensatie tot compacte complexen treedt reeds op bij LV 2. C. Gel-‐elektroforese a. Techniek Met agarose gel-‐elektroforese (AGE) kan bepaald worden bij welke LV de vorming van DNA/polymeer complexen optreedt en hoe sterk de complexatie is. De basis ligt bij de vermindering van de mobiliteit van DNA na condensatie. Gel-‐elektroforese voert een scheiding op basis van lading uit onder invloed van een elektrisch veld. Niet gecondenseerd DNA zal door zijn negatieve lading migreren naar de positieve pool of anode. Hoe sterker de complexvorming, hoe minder uitgesproken deze lading is door (gedeeltelijke) neutralisatie met positief geladen polyelektrolieten. De neutralisatie door polyplexvorming vermindert 45 tevens de mobiliteit doorheen de gel. Uiteindelijk wordt er retentie van de polyplexen in de “wells” bekomen bij het condensatiepunt. Een meer uitgebreide uitleg over de gebruikte procedure kan in bijlage 2 teruggevonden worden. b. Agarose gel-‐elektroforese met kalfsthymus DNA De resultaten wezen uit dat p(HEG21%-‐co-‐GuAEG12%-‐co-‐ImEG67%), p(HEG22%-‐co-‐GuAEG19%-‐co-‐
ImEG59%), p(HEG45%-‐co-‐GuAEG43%-‐co-‐ImEG12%) en p(HEG61%-‐co-‐GuAEG26%-‐co-‐ImEG13%) in staat waren om DNA te complexeren met respectievelijke condensatiepunten bij een LV van 1,5, 4, 1,2 en 3 (figuur 3.4). Ook p(HEG22%-‐co-‐GuAEG60%-‐co-‐ImEG18%), p(HEG55%-‐co-‐GuAEG32%-‐co-‐
ImEG17%) en p(HEG66%-‐co-‐GuAEG14%-‐co-‐ImEG20%) vertoonden enige DNA complexerende eigenschappen maar in een mindere mate (> LV 4/1). Deze resultaten vertonen een gelijkaardige trend als bij DLS. Figuur 3.4: Agaraose gelelektroforese van polymeren met DNA-‐complexerende eigenschappen en overeenkomstig condensatiepunt (onderlijnd). Van links naar rechts: versie p(HEG21%-‐co-‐GuAEG12%-‐co-‐ImEG67%), p(HEG22%-‐co-‐GuAEG19%-‐
co-‐ImEG59%), p(HEG61%-‐co-‐GuAEG26%-‐co-‐ImEG13%) (±5 kDa) en p(HEG45%-‐co-‐GuAEG43%-‐co-‐ImEG12%) (±20 kDa) We zien ook dat er een zekere smeer zichtbaar is en geen fijne band na visualisatie. Dit valt te verklaren door de aanwezigheid van DNA fragmenten met verschillende Mw’s in het gebruikte kalfsthymus DNA. De migratiesnelheid hangt af van de grootte van de fragmenten. Sybrgold is extreem gevoelig waardoor ook stukken gedegradeerd DNA en ssDNA (enkelstrengig) gevisualiseerd worden. 46 c. Polyacrylamide gel-‐elektroforese met oligonucleotiden Het lopen van gels met korte DNA fragmenten zoals met de enkelstrengige oligonucleotiden kan niet gebeuren met agarose gels. De poriën van agarose gels bleken zelfs bij hogere percentages agarose (tot 3%) nog te groot om een efficiënte scheiding te bekomen. Een betere scheiding kan bekomen worden door gebruik te maken van gecrosslinkte polyacrylamide gels (PAGE). Het basisprincipe van de scheiding blijft echter gelijk. In plaats van horizontaal worden de gels nu verticaal ontwikkeld. Zoals gedetailleerd beschreven in bijlage 2 wordt er gebruik gemaakt van een 8% acrylamide gel gecrosslinkt met TEMED in een TBE buffer. 0/1 0,2/1 0,4/1 0,6/1 0,8/1 1/1
1,2/1 1,4/1 1,6/1 1,8/1 2/1
0/1 0,2/1 0,4/1 0,6/1 0,8/1 1/1 1,2/1 1,4/1 1,6/1 1,8/1 2/1
Figuur 3.5: Acrylamide gel-‐elektroforese van enkele polymeren met DNA-‐complexerende eigenschappen en overeenkomstig condensatiepunt (onderlijnd). Van boven naar onder: versie p(HEG21%-‐co-‐GuAEG12%-‐co-‐ImEG67%) en p(HEG22%-‐co-‐GuAEG19%-‐co-‐ImEG59%) (±5 kDa) De interpretatie van de resultaten is ook lichtjes verschillend aangezien gecomplexeerd DNA niet in de gel kan dringen. Hierdoor kan er geen stapsgewijze afname van de migratie van het DNA vastgesteld worden. Bovendien is het ook niet mogelijk om retentie in de wells te visualiseren. In plaats hiervan kan er een graduele afname in fluorescentie waargenomen worden in de band van het ongecomplexeerd DNA. Dit is eveneens een indicatie voor een toenemende complexvorming bij hogere LV. 47 Er werd gekeken naar gemodificeerde polymeren die in vorige agarose gel-‐elektroforese testen met kalfsthymus DNA reeds DNA complexerende eigenschappen vertoonden. Zo kon aangetoond worden dat p(HEG21%-‐co-‐GuAEG12%-‐co-‐ImEG67%) en p(HEG22%-‐co-‐GuAEG19%-‐co-‐
ImEG59%) van ongeveer 5 kDa reeds bij LV 1/1 en 1,2/1 in staat is om de enkelstrengige oligonucleotiden volledig te complexeren (in plaats van LV 1,5/1 en 4/1 bij kalfsthymus DNA) (figuur 3.5). Ook p(HEG45%-‐co-‐GuAEG43%-‐co-‐ImEG12%) (20 kDa) en p(HEG61%-‐co-‐GuAEG26%-‐co-‐
ImEG13%) (5kDa) bereikten reeds bij lagere LV (0,8/1) hun condensatiepunt. Dit bevestigt de eerder gestelde hypothese dat er een betere compatibiliteit in moleculair gewicht is tussen de korte vectoren en het ssDNA. D. Fluorescentietesten a. Fluorescentietesten met kalfsthymus DNA Via fluorescentietesten aan de hand van SYBRGold kunnen vergelijkbare DNA condenserende eigenschappen vastgesteld worden als bij gel-‐elektroforese. Beide technieken berusten op een verschillend mechanisme maar kunnen wel een vergelijkbare trend aanwijzen. Fluorescentie berust op de competitie tussen SYBRGold en de polyelektrolieten om DNA te binden. Polyplexvorming zorgt voor een toename in hydrofobiciteit en een plaatselijke ladingsneutralisatie. Hierdoor wordt de intercalatie van SYBRGold in de minor groef verhinderd en neemt de fluorescentie af. De gedetailleerde procedure wordt verder besproken in bijlage 2. Er is slechts een geleidelijke afname in fluorescentie voor alle gesynthetiseerde polymeren waarneembaar na een initiële toename. Bij p(HEG66%-‐co-‐GuAEG14%-‐co-‐ImEG20%) en p(HEG21%-‐
co-‐GuAEG12%-‐co-‐ImEG67%) is er zelfs een toename t.o.v. het beginpunt waarneembaar. Bij een goede complexatie tussen DNA en de vector vindt normaal een sterke afname in fluorescentie plaats. Deze gestage afname kan opnieuw een gevolg zijn van het grote massaverschil. Het korte, laag Mw polymeer (<20 kDa) is niet in staat om het hoog Mw DNA volledig te complexeren. Er zijn dus meerdere korte vectoren nodig om de lange DNA fragmenten te condenseren. Daar de hoeveelheid polymeer slechts gestaag toeneemt, is de onvolledige complexatie dan ook terug te vinden in de langzame afname in fluorescentie (figuur 3.6). 48 relageve ﬂuorescenge (%) Fluorescengetesten dsDNA p(HEG45%-‐co-‐GuAEG43%-‐co-‐ImEG12%) p(HEG21%-‐co-‐GuAEG12%-‐co-‐ImEG67%) 130 p(HEG55%-‐co-‐GuAEG32%-‐co-‐ImEG17%) p(HEG66%-‐co-‐GuAEG14%-‐co-‐ImEG20%) p(HEG61%-‐co-‐GuAEG26%-‐co-‐ImEG13%) 80 0 1 2 ladingsverhouding 3 4 Figuur 3.6: Condensatieprofiel van verschillende p(HEGx%-‐co-‐GuAEGy%-‐co-‐ImEGz%) copolymeren met grote dsDNA fragmenten. In enkele gevallen (vb. p(HEG55%-‐co-‐GuAEG32%-‐co-‐ImEG17%)) wordt eerst een toename i.p.v. een afname van de fluorescentie vastgesteld waarna deze opnieuw geleidelijk afnam. Dit kan verklaard worden door een onvolledige uitstoting van het (eveneens positief geladen) SYBRGold uit de minor groef van het DNA door de polyelektrolieten. Mogelijks zorgt de complexatie voor een verandering in conformatie. Deze ruimtelijke heroriëntatie verhoogd het aantal beschikbare intercalatiesites met een hogere fluorescentie tot gevolg. [7] b. Fluorescentietesten met oligonucleotiden De fluorescentiemetingen met ssDNA konden de bevindingen bij PAGE ondersteunen. De afname in fluorescentie was beduidend beter met het korte ssDNA fragment dan met de grote kalfsthymus DNA fragmenten als gevolg van de betere compatibiliteit in moleculair gewicht tussen de oligonucleotiden en vectoren. In de meeste gevallen trad er reeds bij LV 1/1 een significante daling van de fluorescentie op (figuur 3.7). Bij een ladingsverhouding van 2/1 treedt bij de meeste vectoren volledige condensatie van het ssDNA op. De dalende trend is reeds bij zeer kleine hoeveelheden polyelektroliet (vanaf LV 0,2/1) zichtbaar en is opnieuw een indicatie voor de betere beschikbaarheid van het ssDNA voor interactie met het kationische polymeer. De reden hiervoor is sterisch van aard. [5] Bovendien condenseren bijna alle vectoren het ssDNA tot een stabiele fluorescentie van ongeveer 50 %, bekomen bij LV 4/1. Nochtans is het aantal ladingen van de vectoren verschillend. Dit toont aan dat niet alleen de lading, maar ook de 49 ladingsseparatie door de hydroxylgroepen blijkbaar een invloed uitoefent op de complexatie. Fluorescengetesten met ssDNA Relageve ﬂuorescenge (%) 140 p(HEG8%-‐co-‐GuAEG88%-‐co-‐ImEG4%) 120 p(HEG66%-‐co-‐GuAEG14%-‐co-‐ImEG20%) 100 p(HEG55%-‐co-‐GuAEG32%-‐co-‐ImEG17%) 80 p(HEG61%-‐co-‐GuAEG26%-‐co-‐ImEG13%) 60 p(HEG45%-‐co-‐GuAEG43%-‐co-‐ImEG12%) 40 p(HEG21%-‐co-‐GuAEG12%-‐co-‐ImEG67%) 20 p(HEG22%-‐co-‐GuAEG19%-‐co-‐ImEG59%) 0 0 1 2 3 4 ladingsverhouding Figuur 3.7: Condensatieprofiel van verschillende p(HEGx%-‐co-‐GuAEGy%-‐co-‐ImEGz%) met kleine ssDNA fragmenten. *Curven die starten bij een relatieve fluorescentie hoger dan 100% zijn het gevolg van een verschil in kalibratie tussen de verschillende metingen. 50 E. Referenties 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Chargaff, E., R. Lipshitz, and C. Green, Composition of the desoxypentose nucleic acids of four genera of sea-‐urchin. J Biol Chem, 1952. 195(1): p. 155-‐60. Bloomfield, V.A., Static and dynamic light scattering from aggregating particles. Biopolymers, 2000. 54(3): p. 168-‐172. Wilson, R.W., D.C. Rau, and V.A. Bloomfield, Comparison of polyelectrolyte theories of the binding of cations to DNA. Biophys J, 1980. 30(2): p. 317-‐25. Bloomfield, V.A., R.W. Wilson, and D.C. Rau, Polyelectrolyte effects in DNA condensation by polyamines. Biophysical Chemistry, 1980. 11(3–4): p. 339-‐343. Bloomfield, V.A., et al., Light scattering studies on DNA condensation. Biochem Soc Trans, 1991. 19(2): p. 496. Dubruel, P., Studie van synthetische polymeren als vectoren voor gentherapie, in Vakgroep Organische Chemie Onderzoeksgroep Polymeermaterialen2003, Universiteit Gent. p. 273. Goes, A., Synthese en evaluatie van poly-‐L-‐glutamine derivaten als niet-‐virale gen-‐
afgiftesystemen, in Onderzoeksgroep Polymer Chemistry & Biomaterials Group 2010, UGent: Vakgroep Organische Chemie. p. 121. Hoofdstuk 4: Productie, karakterisatie en oppervlakte modificatie van micropartikels Er werd geopteerd voor biodegradeerbare polyesters voor de productie van micropartikels aangezien deze kunnen afgebroken worden tot niet-‐toxische, laagmoleculaire producten. Dit geeft minder aanleiding tot accumulatie in het doelweefsel en leidt tot een gereduceerde cytotoxiciteit. Zo kunnen de micropartikels ingezet worden als groeibodem voor cellen zonder ze nadien te verwijderen. Als uitgangsmateriaal voor de synthese van biodegradeerbare polyesters werd gekozen voor een p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) copolymeer. Aanpassingen aan de LA/CL ratio laten toe om zowel via electrosprayen als sproeidrogen micropartikels te genereren. Naast de productie van micropartikels met gecontroleerde afmetingen en morfologie is het tevens de bedoeling om beide verwerkingstechnieken met elkaar te vergelijken. PLA, PCL en hun copolymeren zijn tevens biocompatibel en beide goedgekeurd voor gebruik in biomedische toepassingen. [1] A. Productie van biodegradeerbare micropartikels Voor de productie van micropartikels werd er uitgegaan van p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) copolymeren met een 84:16 ratio LA/CL en Mw’s van 50 en 100 kDa (bijlage 1). Het copolymeer werd zodanig gekozen dat de Tg (38 ± 2,4 °C) boven de ondergrens voor de sproeidroog techniek lag (ongeveer 25 °C). Zo kan dit copolymeer gebruikt worden om beide technieken te vergelijken. Voor de toepassing als voedingsbodem hebben de micropartikels idealiter een kleine afmeting (< 10 µm) om door fagocytose opgenomen te worden in de cel. Toch dienen de partikels ook voldoende groot te zijn om een substantiële hoeveelheid DNA te kunnen dragen. [2] De doelstelling is om micropartikels met een diameter van 1 à 5 µm en een gecontroleerde sferische morfologie te produceren met beide technieken. 51 a. Productie van micropartikels via electrosprayen Electrosprayen is een techniek gebaseerd op de atomisatie van een vloeistof met behulp van een sterk elektrisch veld. [3] Hierbij wordt een oplossing langzaam aangevoerd via een positief geladen naald. Aan het uiteinde van de naald worden geladen druppels gevormd. Deze ondergaan een Coulomb expansie wanneer de overmaat aan ladingen de oppervlaktespanning overtreft. Hierdoor exploderen de druppels in kleinere druppels tot enkel (micro)partikels overblijven. Meer info kan teruggevonden worden in bijlage 3. Er werd uitgegaan van een 10 w/v% p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) oplossing met een moleculair gewicht van ongeveer 60 kDa in dichloormethaan (DCM). De gevormde micropartikels werden op glasplaatjes opgevangen voor verdere analyse. De morfologie van de deeltjes werd bestudeerd met een scanning elektronen microscoop (SEM). Er werd een parametrische optimalisatie uitgevoerd waarbij de flow rate tussen 0,2 en 1 ml/h gevarieerd werd en het voltage tussen 10 en 16 kV (figuur 4.1 & figuur 4.2). Uit de resultaten volgt dat een minimale partikelgrootte van 1,6 µm met een standaarddeviatie van 0,55 µm bekomen wordt bij een flow rate van 0,5 ml/h en een voltage van 16 kV. Bij hogere voltages (16 tot 20 kV) wordt echter een zekere mate van vezelvorming opgemerkt (figuur 4.3). Uit de 3D-‐plot kan afgeleid worden dat de partikel diameter toeneemt bij stijgende flow rate en afneemt bij hogere voltages (figuur 4.3, test C, N en P). De standaardafwijking neemt eveneens toe bij de productie van grotere beads. Bij een zeer lage flow rate (0,2 ml/h) worden steeds kleine partikels gevormd met een afmeting tussen 2,6 en 3 µm (figuur 4.1 & figuur 4.2). De deeltjesgrootte bleek onafhankelijk van het toegepaste voltage bij deze flow rate. Figuur 4.1: 3D plot van de parameter optimalisatie bij electrosprayen met bekomen partikel diameters (links) en overeenkomstige standaardafwijkingen (rechts).
52 Boxplot testen electrosprayen 15 10 test P test O test N test M test L test K test J test I test H test G test F test E test D test C 0 test B 5 test A pargkeldiameter (µm) 20 Figuur 4.2: Boxplot met de spreiding in partikeldiameter van de uitgevoerde testen tijdens de parameter optimalisatie van de electrospray techniek. Een tweede reeks testen werd uitgevoerd bij hogere flow rates tussen 1 en 2 ml/h. Deze tonen aan dat er niet alleen grotere partikels gevormd worden bij hogere flow rates maar dat ook de morfologie verandert. Bij een flowrate van 1,5 ml/h en een voltage van 10 kV zijn bijvoorbeeld onregelmatig gevormde en afgeplatte partikels zichtbaar (figuur 4.3, test Q). Bij hogere voltages van 16-‐20 kV gecombineerd met flowrates tussen 1,5 en 2 ml/h nam de hoeveelheid vezelvorming sterk toe (figuur 4.3, test R en S). Uit de experimenten kon vastgesteld worden dat een 10 w/v% oplossing ideaal was om partikels te vormen met een sferische vorm. Bij 5 w/v% oplossingen werden onregelmatigere morfologiën teruggevonden of bleken metingen niet reproduceerbaar te zijn. Aangezien bij lagere concentraties niet al het solvent verdampt is wanneer de partikels het collectorscherm raken, worden er meer afgeplatte of uitgerekte partikels gevormd (vergelijkbare resultaten gevonden bij hoge flow rates). Hieruit kan vastgesteld worden dat er niet alleen een bovengrens is voor de concentratie, maar ook een ondergrens. De bovengrens wordt bepaald door het ontstaan van vezelvorming aangezien er bij hoge concentraties meer ketenverstrengelingen voorkomen. Er wordt dan overgegaan van electrosprayen naar -‐spinnen. 53 C
N
P
Q
R
S
test C N P Q R S flow rate (ml/h) 0,2
1
1
1,5 1,5 2 voltage (kV)
14
12
16
10 16 20 afstand (cm)
25
25
25
20 20 20 µm
2,84 7,71 5,84 7,23 1,77 2,87 0,65 4,30 0,70 3,93 0,69 2,00 stdev
Figuur 4.3: Raster met microscoop beelden van micropartikels bij verschillende instellingen van de electrospraying parameters met aanduiding van de overeenkomstige test (microscoop vergroting 100X, allen in zelfde schaal).
b. Productie van micropartikels via sproeidrogen De basis van sproeidrogen is vrij eenvoudig en berust op de verneveling van een polymeeroplossing met behulp van een warme luchtstroom doorheen een fijne nozzle. Dit gaat gepaard met vorming van polymeerdeeltjes door de onmiddellijke verdamping van het solvent. Hierbij worden micropartikels in poedervorm afgescheiden met een deeltjesgrootte van 1 tot 150 µm door middel van centrifugatie in een cycloon. [16, 17] Meer gedetailleerde info kan teruggevonden worden in bijlage 3. Uit een eerste set verkennende experimenten werd geconcludeerd dat een concentratie van 5 w/v% in DCM ideaal was voor een copolymeer van 50 kDa. Bij een moleculair gewicht van 100 kDa bleken lagere concentraties (≤ 2 w/v%) noodzakelijk. Te hoge concentraties leidden tot blokkage van de nozzle en vezelvorming. De invloed van bepaalde parameters zoals de luchtstroom door de nozzle en koellucht werd nagegaan op de behaalde rendementen en partikelgrootte (tabel 4.1). Hieruit blijkt dat de 54 partikelgrootte daalt met toenemende luchtstroom door de nozzle. Bij hogere doorstroomsnelheden wordt een limiet bereikt aangezien het rendement daalt en een deel van de kleinere partikels verloren gaat. Tabel 4.1: Overzicht van de uitgevoerde testen voor de parameter optimalisatie van de sproeidroog techniek. test 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 w/v % 5 5 5 5 5 2 2 2 2 5 2 5 Mw 50 50 50 50 100 100 100 100 100 50 100 50 cooling air 150 150 150 150 150 150 150 200 100 200 200 200 nozzle air 7 3 1,5 4,4 3 6 2,8 2,8 2,8 5 2,8 4,5 µm / 2,45 3,40 2,86 3,06 2,20 2,20 3,28 2,83 2,37 3,09 2,18 stddev / 0,86 1,39 1,05 1,35 0,69 0,69 0,97 0,93 1,01 1,09 0,73 % rendement 27 53 >100 / 60 8 42 79 8 23 43 32 Boxplot testen sproeidrogen pargkeldiameter (µm) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 test 2 test 3 test 4 test 5 test 6 test 7 test 8 test 9 test 10 test 11 test 12 Figuur 4.4: Boxplot met de spreiding in partikeldiameter van de uitgevoerde testen tijdens de parameter optimalisatie van de sproeidroog techniek. De invloed van de koellucht bleek tweeledig (getest bij 100 kDa en 2 w/v%). Zo gaf een lage koellucht van 100 l/min zeer lage rendementen terwijl de partikeldiameter enkel toenam (test 9, tabel 4.1). Wanneer overgegaan werd naar 150 l/min werden kleinere partikels met een nauwere distributie en hoger rendement bekomen (figuur 4.5, test 7). Een verdere verhoging naar 200 l/min gaf een eveneens een verhoging van het rendement en de partikelafmetingen (figuur 4.5, test 8). De resultaten bij 2 w/v% (100 kDa) bij een nozzle air van 2,8 l/min kunnen geëxtrapoleerd worden naar deze bij 5 w/v% (50 kDa) en een nozzle air van 4,5 à 5 l/min. Beide instellingen vertonen een vergelijkbare deeltjesgrootte en rendement. Dit werd empirisch vastgesteld en berust op de ervaring van de operator met de techniek. 55 Typisch werden gemiddelde partikelgroottes tussen 2,4 en 3,4 µm bekomen met een standaarddeviatie van ± 1 µm (figuur 4.4). Het bleek echter niet altijd eenvoudig om reproduceerbare metingen te bekomen aangezien na verschillende testen reeds een deel van het solvent verdampt was of blokkage van de nozzle optrad. Uit dynamische damp sorptie (DVS) resultaten bleek ook dat de via sproeidrogen geproduceerde micropartikels zich in de amorfe toestand bevinden (bijlage 2). Figuur 4.5: Raster met microscoop beelden van micropartikels bij verschillende instellingen van de sproeidroog parameters met aanduiding van de overeenkomstige test (microscoop vergroting 100X, allen in zelfde schaal).
c. Vergelijking van electrosprayen t.o.v. sproeidrogen Uit scanning electronen microscopie (SEM) beelden blijkt dat het electrosprayen van micropartikels leidt tot de vorming van partikels met gladde oppervlakten (figuur 4.6). Sproeidrogen genereert meer poreuze deeltjes met een ruwer oppervlak. Beide technieken geven aanleiding tot sferische partikels met een zekere spreiding in grootte. De standaardafwijking hangt af van de gebruikte parameters en partikelgrootte, maar is het kleinst voor de sproeidroog techniek (± 1 µm). Uit de distributie van de micropartikels blijkt dat beide technieken aanleiding geven tot een normale verdeling (figuur 4.7). Wanneer echter gestreefd wordt naar de productie van zo klein mogelijke micropartikels is electrosprayen (bij instelling van de correcte parameters) de meest aangewezen methode voor de verwerking van p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL). 56 -‐Ruwe micropartikels
-‐ 5 w/v % in DCM
-‐ Sferisch
-‐ Snel, op grote schaal
Electrosprayen
Sproeidrogen
-‐ Gladde micropartikels
-‐ 10 w/v % in DCM
-‐ Sferisch
-‐ Traag, kleinschalig
Figuur 4.6: SEM beelden van micropartikels geproduceerd via sproeidrogen (links) en electrosprayen (rechts) met duiding van de belangrijkste verschillen tussen beide technieken. Het grote verschil tussen beide technieken is de schaalbaarheid (figuur 4.6). Sproeidrogen kan toegepast worden van enkele milli-‐ tot kilogram product bij flow rates van enkele ml/min. Bij electrosprayen is dit theoretisch ook mogelijk, maar door de lage flow rates (<1 ml/h) zou dit enorm veel tijd in beslag nemen en hierdoor is de techniek eerder geschikt voor kleinschalige applicaties. Electrosprayen Frequenge Frequenge Sproeidrogen 10 0 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 Pargkeldiameter (µm) 15 10 5 0 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 Pargkeldiameter (µm) Figuur 4.7: Histogram met de grootte distributie van micropartikels geproduceerd via sproeidrogen (partikeldiameter: 2,83 µm, standaarddeviatie: 0,93 µm) (links) en electrosprayen (partikeldiameter: 2,94 µm, standaarddeviatie: 1,61 µm) (rechts). Beide technieken functioneerden niet optimaal bij dezelfde concentratie. Voor electrosprayen bleek dat 10 w/v% de ideale concentratie was, terwijl sproeidrogen voor hetzelfde moleculair gewicht (50 kDa) betere resultaten gaf bij lagere concentraties. Dit kan 57 verklaard worden door de eerder besproken limieten van beide technieken. Bij electrosprayen moet rekening gehouden worden met een boven-‐ en ondergrens (vezelvorming versus volledig verdamping van het solvent) en bij sproeidrogen blokkeert de naaldtip bij te hoge concentraties of worden er vezelachtige structuren gevormd. B. Ontwikkeling en evaluatie van DNA interagerende micropartikels De geproduceerde p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) micropartikels kunnen ingezet worden als drager voor niet-‐virale gen-‐afgiftesystemen. De benodigde DNA interagerende eigenschappen worden verkregen door deze te coaten met p(HEGx-‐co-‐GuAEGy-‐co-‐ImEGz) na plasma-‐activatie. Nadien worden deze beladen met een therapeutisch gen en ingezet als groeibodem om cellen op te kweken. Op deze manier kunnen cellen ex vivo gecultiveerd en getransfecteerd worden. Waarna het gemodificeerde celweefsel terug in het lichaam kan gebracht worden. De biodegradeerbaarheid van zowel de drager als vector zorgt ervoor dat de micropartikels niet moeten gescheiden worden van de cellen voor implanting. Enkele preliminaire testen werden uitgevoerd om te zien of de beads kunnen ingezet worden om therapeutisch DNA af te leveren. Hiervoor worden de p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) polymeren gespincoat en gemodificeerd met p(HEGx-‐co-‐GuAEGy-‐co-‐ImEGz). Nadien worden de plaatjes bestudeerd aan de hand van statische contacthoekmetingen (SCA), atoomkrachtmicroscopie (AFM) en SEM. a. Plasma oppervlak modificatie Voor de oppervlakte modificatie van de p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) micropartikels (gesproeidroogd, test 12) werd gebruik gemaakt van een laag temperatuursplasma met stikstof. Wanneer stikstof gebruikt wordt als gas worden er voornamelijk radicalen geïntroduceerd op het oppervlak. Deze radicalen zullen verder reageren met luchtzuurstof en peroxides vormen. [4] Bovendien worden er ook amine-‐ en amidefuncties geïntroduceerd. [5] De actieve sites kunnen verder reageren en helpen bij de immobilisatie van de vectoren op het oppervlak van de geactiveerde beads. Meer details over de toegepaste procedure kunnen teruggevonden worden in bijlage 3. In een volgende stap worden de geactiveerde partikels in een 10 mg/ml oplossing van p(HEG15%-‐co-‐GuAEG78%-‐co-‐ImEG7%) in water gebracht en zo gecoat met de vectoren. Op deze manier wordt een oppervlakte modificatie uitgevoerd via covalente aanhechting terwijl de bulk eigenschappen van de micropartikels behouden blijven. [6] Bovendien wordt het 58 oppervlak van de beads op deze manier minder hydrofoob waardoor een betere celadhesie mag verwacht worden. [4] Aangezien de vectoren positief geladen aminegroepen bevatten wordt ook de aantrekking van cellen naar het oppervlak vergroot. Verder werd er gewerkt met poreuze beads (geproduceerd via sproeidrogen) waardoor cellen zich beter aan het oppervlak van de beads kunnen vasthechten. b. Evaluatie van de gemodificeerde beads De beads worden visueel beoordeeld via SEM. Hieruit kan besloten worden dat er geen aggregatie van de partikels optreedt na incubatie in PBS (meer info zie bijlage 3). Deze resultaten blijken onafhankelijk van de tijdsduur of activatie via plasma (figuur 4.7). Verder kon de aanhechting van de p(HEG15%-‐co-‐GuAEG78%-‐co-‐ImEG7%) vectoren aan het oppervlak van de beads niet visueel waargenomen worden. Aangezien de oppervlakte modificatie niet kon aangetoond worden via SEM werden er testen uitgevoerd op gespincoat p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) van 60 kDa. Hierbij werd telkens zowel een niet-‐geactiveerd, plasma geactiveerd en oppervlakte gemodificeerd staal gemeten. Figuur 4.7: SEM afbeelding beads (test 12, sproeidrogen) na plasma oppervlakte modificatie met p(HEG15%-‐co-‐GuAEG78%-‐
co-‐ImEG7%) en 7 dagen incubatie in PBS. SCA metingen (principe zie bijlage 2) van de gespincoate p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) stalen tonen aan dat het materiaal na plasma activatie met stikstofgas van het oppervlak een sterke toename in hydrofiliciteit vertoonde (tabel 4.2). Dit resulteerde in een bijna complete bevochtiging van het oppervlak. Na incubatie van het geactiveerde staal in een 10 mg/ml p(HEG15%-‐co-‐
GuAEG78%-‐co-‐ImEG7%) oplossing werd opnieuw een toename van de contacthoek vastgesteld t.o.v. niet-‐geactiveerd p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL). De verandering van de contacthoek is een indicatie dat de oppervlakte modificatie succesvol was. Verdere testen moeten uitsluitsel geven maar dit was wegens tijdsgebrek niet meer mogelijk. 59 Tabel 4.2: Statische contacthoekmetingen van gespincoat p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) voor (links) en na (midden) plasma activatie en oppervlakte modificatie met p(HEG15%-‐co-‐GuAEG78%-‐co-‐ImEG7%) (rechts). Niet-‐geactiveerd p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) 77,4 ± 0,7 ° Geactiveerd Geactiveerd p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) + p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) p(HEG15%-‐co-‐GuAEG78%-‐co-‐ImEG7%) 14,3 ° 30,5 ± 2,0 ° Beelden verkregen via AFM geven een bijkomende indicatie dat het oppervlak succesvol gemodificeerd werd met p(HEG15%-‐co-‐GuAEG78%-‐co-‐ImEG7%) (principe zie bijlage 2). Er is een duidelijke verandering waarneembaar in de topologie van het oppervlak voor en na plasma activatie en na oppervlakte modificatie (figuur 4.8). Figuur 4.8: AFM afbeeldingen van het p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) oppervlak na spincoaten (links), na plasma activatie (rechts) en na oppervlakte modificatie met p(HEGx-‐co-‐GuAEGy-‐co-‐ImEGz) (midden).
60 C. Referenties 1. 2. 3. 4. 5. 6. Declercq, H.A., et al., Osteoblast behaviour on in situ photopolymerizable three-‐
dimensional scaffolds based on D, L-‐lactide, epsilon-‐caprolactone and trimethylene carbonate. J Mater Sci Mater Med, 2006. 17(2): p. 113-‐22. Tran, V.-‐T., J.-‐P. Benoît, and M.-‐C. Venier-‐Julienne, Why and how to prepare biodegradable, monodispersed, polymeric microparticles in the field of pharmacy? International Journal of Pharmaceutics, 2011. 407(1–2): p. 1-‐11. Jaworek, A. and A.T. Sobczyk, Electrospraying route to nanotechnology: An overview. Journal of Electrostatics, 2008. 66(3–4): p. 197-‐219. Desmet, T., et al., Post-‐Plasma Grafting of AEMA as a Versatile Tool to Biofunctionalise Polyesters for Tissue Engineering. Macromolecular Bioscience, 2010. 10(12): p. 1484-‐1494. Vesel, A. and M. Mozetic, Modification of PET surface by nitrogen plasma treatment. Journal of Physics: Conference Series, 2008. 100(1): p. 012027. Bazaka, K., et al., Plasma-‐assisted surface modification of organic biopolymers to prevent bacterial attachment. Acta Biomaterialia, 2011. 7(5): p. 2015-‐2028. Hoofdstuk 5: Besluit De synthese van laag moleculaire vectoren gebaseerd op p(HEGx%-‐co-‐GuAEGy%-‐co-‐ImEGz%) geeft aanleiding tot moeilijker te synthetiseren polyelektrolieten. Dit was deels te wijten aan de gelimiteerde stabiliteit van het BG-‐NCA monomeer. Na verdere modificatie en opzuivering d.m.v. dialyse trad er mogelijks oxidatie van de ingevoerde amine functionaliteiten op. Dit verklaart enigszins de verkleuring van de gesynthetiseerde derivaten. Om poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) te derivatiseren, gebruik makende van een intelligente design, werden specifieke functionaliteiten zoals hydroxyl-‐, imidazol-‐ en guanidinegroepen in de zijketens ingevoerd. Deze functionaliteiten zorgen voor een goede wateroplosbaarheid in combinatie met DNA complexerende eigenschappen. Fysico-‐chemische evaluatie van de vectoren via DLS, fluorescentie en gel-‐elektroforese wees uit dat de derivaten in staat zijn om DNA te complexeren via elektrostatische interacties. De resultaten toonden aan dat de laag moleculaire vectoren ongeschikt zijn om grote DNA fragmenten te condenseren. Dit resulteerde in een gedeeltelijke condensatie en vereiste te grote hoeveelheden kationische polymeren. De gen-‐afgiftesystemen bleken beter geschikt te zijn voor de complexatie van korte DNA fragmenten. Uit experimenten met enkelstrengige oligonucleotiden werd reeds complexatie bij lagere concentraties p(HEGx%-‐
co-‐GuAEGy%-‐co-‐ImEGz%) aangetoond. Door het lagere Mw is de beschikbaarheid van de korte DNA fragmenten voor interactie met het kationische polymeren blijkbaar hoger. Dit opent perspectieven voor het gebruik van de gesynthetiseerde polyelektrolieten als antisense delivery systemen. De verwerking van p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) via sproeidrogen en elektrosprayen toonde aan dat beide technieken geschikt zijn voor de productie van micropartikels met een gecontroleerde diameter en sferische morfologie. Elektrosprayen van micropartikels leidt tot de vorming van partikels met gladde oppervlakten. Sproeidrogen genereert meer poreuze en ruwere deeltjes. Optimalisatie van de parameters resulteerde in micropartikels tussen 1 en 5 µm met een nauwe distributie. Het grote verschil tussen beide technieken is de schaalbaarheid. 61 Sproeidrogen geeft een grote opbrengst bij flow rates van enkele ml/min, terwijl bij elektrosprayen slechts met flow rates kleiner dan 1 ml/h kan gewerkt te worden. Hierdoor vergt de productie van micropartikels via elektrosprayen veel tijd om een substantiële hoeveelheid te bekomen. De modificatie van de micropartikels met p(HEGx%-‐co-‐GuAEGy%-‐co-‐ImEGz%) via plasma-‐
activatie is veelbelovend. Uit de eerste testen (AFM, SCA, …) op gespincoate stalen blijkt dat het oppervlak succesvol gecoat werd met de kationische polymeren. Hierdoor kunnen de oppervlakte gemodificeerde beads benut worden als niet-‐virale gen-‐afgiftesystemen. Met DNA beladen micropartikels kunnen zo ingezet worden als substraat om cellen te cultiveren en ex vivo te transfecteren. 62 Bijlage 1: Experimenteel deel A. Synthese γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat N-‐carboxyanhydride Voor de synthese van het cyclische N-‐carboxy anhydride wordt 15 g γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat gesuspendeerd in 250 ml droge ethylacetaat bij een temperatuur van 60 °C. Vervolgens wordt een oplossing van 10,5 ml difosgeen in 59,5 ml EtOAc (15% w/v) langzaam toegedruppeld aan het reactiemengsel. Dit gebeurt in 7 kleine porties van 10 ml. Na toevoeging van een portie en 20 minuten reactietijd wordt er 10 min met argon doorgeborreld om de gevormde HCl uit het mengsel te verwijderen. Deze procedure dient herhaald te worden tot alle γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat omgezet is tot γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat NCA. Daarna wordt het reactiemengsel 1h ontgast met argon op 60°C en na afkoelen tot kamertemperatuur verder geflushed gedurende 1h. Vervolgens wordt het mengsel afgefiltreerd en wordt het filtraat ingedampt tot 100 ml aan de rotavapor. Hieruit wordt het product geprecipiteerd in een overmaat (500 ml) koude pentaan en dient het verscheidene keren omgekristalliseerd te worden om de laatste resten chloride te verwijderen. De omkristallisatie gebeurt door het product op te lossen in een minimale hoeveelheid EtOAc en te refluxen, waarna het product opnieuw neergeslaan wordt in een overmaat koude pentaan. Tenslotte dient het product opnieuw afgefiltreerd en gedroogd te worden aan de oliepomp. De aanwezigheid van resterende sporen Cl-‐ kan opgespoord worden met de chloride test. Hiervoor wordt een kleine hoeveelheid (10 mg) BG-‐NCA opgelost in 1 ml HNO3 (2 M) en verwarmd in een bunsenbrander. Daar worden enkele druppels AgNO3 (0,05 M) aan toegevoegd. De troebelheid van deze oplossing mag niet hoger zijn dan dit van leidingwater bij hetzelfde experiment vooraleer het BG-‐NCA voldoende Cl-‐ vrij is. Rendement: 63 % Karakterisatie: FTIR, NMR 61 B. Polymerisatie van poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) met n-‐butylamine De synthese van poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) wordt uitgevoerd met n-‐butylamine (n-‐BuNH2) als initiator. Hiervoor dient 0,4 g BG-‐NCA opgelost te worden in 4,5 ml DCM/EtOAc (6:1 v/v). Het bekomen moleculair gewicht wordt bepaald door de verhouding van monomeer ten opzichte van de hoeveelheid initiator volgens onderstaande formule: 𝑥 𝑔
𝑀𝑤
[𝑀]
263,1568 𝑔/𝑚𝑜𝑙
𝐷𝑃 =
=
=
𝑦 𝑚𝑙 ∗ 0,74 𝑔/𝑚𝑙
219,234
[𝐼]
73,13 𝑔/𝑚𝑜𝑙
DP = polymerisatiegraad Mw = gewenste moleculair gewicht [M] = aantal mol monomeer [I] = aantal mol initiator x = aantal gram BG-‐NCA afgewogen y = aantal ml n-‐BuNH2 nodig Voor het bekomen van een Mw van 10 kDa dient dus 3,42 µl n-‐BuNH2 aan het reactiemengsel toegevoegd worden. De reactie wordt voor 48h geroerd onder argon atmosfeer en de polymerisatie wordt gestopt door het toevoegen van een overmaat (10x t.o.v. het aantal eindstandige esters) triethylamine (TEA, 20,1 µl) en azijnzuuranhydride (13,6 µl). Vervolgens wordt er nog 3h geroerd en dient het eindproduct geprecipiteerd te worden in een overmaat koude diethylether/methanol (4:1). Na filtratie en naspoelen wordt het pBG gedroogd aan de oliepomp. Rendement: 91 % Karakterisatie: FTIR, NMR 62 C. Aminolyse van poly(γ-‐benzyl-‐L-‐glutamaat) De post-‐polymerisatie modificatie van pBG gebeurt via een aminolyse reactie. Voor het bekomen van p(HEGx-‐co-‐AEGy-‐co-‐ImEGz) met 60% hydroxylgroepen, 24% primaire amines en 16% Imidazolgroepen, zijn de verhoudingen van de overmaat reagentia t.o.v. het aantal esters van belang. Eerst wordt een oplossing van 297 mg pBG (1,36 mmol esters) in 5 ml droge DMF opgewarmd onder inerte atmosfeer in aanwezigheid van een 5-‐voudige overmaat 2-‐HP (0,65 g). Vervolgens wordt TrAEA in een 20-‐voudige overmaat (7,79 g) toegevoegd. Na een nacht roeren wordt een 10-‐voudige overmaat AE (0,82 ml) en ¼ ondermaat histamine (0,04 g) aan het reactiemengsel toegevoegd. Na 48h reactie wordt er een 5-‐voudige overmaat AE (0,41 ml) toegevoegd om een volledige conversie van alle estergroepen te verkrijgen. Uiteindelijk wordt het eindproduct na 72h neergeslaan in gekoelde diethylether en na filtratie opnieuw opgelost in TFA. Vervolgens dient dit geprecipiteerd te worden, waarna het gederivatiseerde pBG wordt opgelost in ultrazuiver water (milli Q). De verdere opzuivering gebeurt door het product te onderwerpen aan een dialyse (opeenvolgend in milli Q, 0,1 M NaCl, 0,05 M HCl, milli Q) en het polymeer te isoleren via lyofilisatie (vriesdrogen). Rendement: 50-‐70% Karakterisatie: FTIR, NMR, GPC 63 D. Amine conversie in guanidines De guanidinylering van p(HEGx-‐co-‐AEGy-‐co-‐ImEGz) tot p(HEGx-‐co-‐GuEGy-‐co-‐ImEGz) laat de volledige conversie van de primaire amines in guanidines toe. Er wordt 267 mg polymeer opgelost in 7 ml ultra zuiver water. Hieraan wordt een oplossing met een 16-‐voudige overmaat DMGP (1,25g) in 4 ml ultra zuiver water aan toegevoegd. Deze oplossing werd eerst op pH 9,5 gebracht met een 4 M KOH oplossing. Vervolgens wordt er KI toegevoegd aan het reactiemengsel tot een concentratie van 6M en 24h geroerd. Hierna wordt de oplossing onderworpen aan een dialyse t.o.v. ultrazuiver water. Na aanzuren tot pH 4 wordt er een standaard dialyse uitgevoerd voor de verdere opzuivering. Hiervoor wordt er achtereenvolgens gezuiverd d.m.v. milli Q, een 0,1 M NaCl oplossing, een 0,05M HCl oplossing en opnieuw milli Q. Vriesdrogen van deze oplossing geeft het geïsoleerde eindproduct. Rendement: ≈100% conversie Karakterisatie: FTIR, NMR, GPC 64 E. Synthese van tritylaminoethylamine Het inbouwen van aminegroepen langs de zijketens van pBG vereist een mono-‐beschermd ethyleendiamine voor de aminolysereactie. Ethyleendiamine kan niet onbeschermd ingezet worden daar dit mogelijk kan lijden tot vernetting van pBG of intramoleculaire lusvorming tussen de zijketens. Figuur 6.1: Synthese en reactiemechanisme van TrAEA. Voor de synthese van TrAEA wordt een oplossing gemaakt van 21,4 ml (0,32 mol) ethyleendiamine in 240 ml DCM in een tweenekkolf van 2 l. Hieraan wordt langzaam een oplossing van 22,3 g (0,08 mol) tritylchloride in 800 ml DCM aan toegedruppeld (figuur 6.1). Na 24h roeren bij kamertemperatuur wordt het reactiemengsel verdund met 800 ml CHCl3. Vervolgens wordt het mengsel drie maal gewassen met respectievelijk een 5% Na2CO3(aq) oplossing, een 5% NaCl(aq) oplossing en ultrazuiver water (milli Q). Hierbij wordt het ongereageerde ethyleendiamine in de waterige fase geëxtraheerd. De organische fase wordt gedroogd op MgSO4 en ingedampt aan de rotavapor. Het bekomen product verder gedroogd wordt aan de oliepomp. Indien het materiaal niet tot een vaste stof kan ingedampt worden, dient de bekomen viskeuze vloeistof verder gezuiverd te worden. Hiervoor wordt er 50 ml diethylether toegevoegd en gedurende enkele minuten in een ultrasoon bad geplaatst tot een melkachtige emulsie bekomen wordt. Deze emulsie wordt bij -‐30 °C uitgekristalliseerd tot witte kristallen. De resterende onzuiverheden blijven in de etherfase achter. Na decanteren van de etherfase dienen de kristallen verder gedroogd te worden aan de oliepomp. Rendement: 61,5 % Karakterisatie: IR, NMR 65 Aromatische H’s + CHCl3
B
A
A
B
2H
2H
H 20
Diethylether
CH2
Diethylether
CH3
1
Figuur 6.2: H-‐NMR spectrum van TrAEA. Analyse via 1H-‐NMR en IR kan bevestigen dat de synthese van TrAEA volgens de gevolgde procedure tot een zuiver eindproduct leidt. Zo kunnen in het 1H-‐NMR spectrum (figuur 6.2) de twee CH2’s onderscheiden worden als een triplet bij 2,1 en 2,8 ppm. De aromatische H’s van de drie fenylgroepen zijn terug te vinden in de regio tussen 7,1 en 7,5 ppm. Deze overlappen met de solventpiek van CHCl3. De brede piek bij 1,5 ppm is afkomstig van resten H2O. Verder zijn er nog enkele onzuiverheden zichtbaar van diethylether zoals een multiplet bij 3,4 ppm en een singlet bij 1,19 ppm. Het primaire en secundaire amine zijn niet terug te vinden in het spectrum aangezien dit uitwisselbare protonen zijn. Karakterisatie via IR analyse gaf extra bevestiging zoals een piek bij 3400 cm-‐1 afkomstig van de N-‐H rekvibratie van het eindstandige primaire amine. De C-‐H rekvibraties van de drie benzeenringen zijn aanwezig rond 3000 cm-‐1 en liggen gedeeltelijk in overlap met de N-‐H rek van het secundaire amine. 66 F. Synthese van p(LA-‐co-‐ε-‐CL) copolymeren De p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) copolymeren werden gesynthetiseerd vertrekkende van de overeenkomstige cyclische monomeren, namelijk D,L-‐lactide (LA) en ε-‐caprolacton (CL). Het gebruikte lactide is een dimeer van D-‐en L-‐melkzuur. Deze microgolf geassisteerde ringopeningspolymerisatie werd uitgevoerd in een 80:20 verhouding (LA:CL) en geïnitieerd met Sn(II)octoaat (figuur 6.3) via het zogenaamde coördinatie-‐insertie mechanisme. [1] Figuur 6.3: Synthese van p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) copolymeer uit een mengsel van D-‐en L-‐lactide en ε-‐caprolacton. Moleculaire gewichten tussen 50 & 100 kDa werden gesynthetiseerd (GPC analyse, tabel 4.1). De gesynthetiseerde copolymeren vertoonden volgens de DSC thermogrammen een gemiddelde glastransitietemperatuur rond 38 ± 2,4 °C (figuur 6.4 + tabel 6.1). Deze kan afgeleid worden uit de verschuiving van de basislijn in het thermogram. Verder kon de thermische stabiliteit van de copolymeren gegarandeerd worden tot ongeveer 241 °C uit gegevens van de TGA analysen (figuur 6.5). Bij een verdere verhoging van de temperatuur treedt er gewichtsverlies op als gevolg van degradatie van de copolymeren. Tabel 6.1: Analyse resultaten van de gebruikte p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) copolymeren. Versie Ratio LA/CL synthese 100 kDa 80:20 50 kDa 80:20 60 kDa 80:20 NMR gemiddeld 84:16 GPC DSC Mw Mn D Tdegradation Tg 97500 57900 1,69 232 38,1 52500 39000 1,38 238 35,6 62200 41600 1,5 244 39,6 67 TGA -‐∆H/∆t exotherm -‐> -‐20 100 kDa 50 kDa 60 kDa Temperatuur 20 40 (°C) 0 60 80 Gewichts % Figuur 6.4: DSC thermogram van de gebruikte p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) copolymeren in functie van het moleculair gewicht. 1.0
100 kDa 50 kDa 60 kDa 50 100 150 200 250 300 Temperatuur (°C) 0.9
350 400 Figuur 6.5: TGA thermogram van p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) copolymeren in functie van het moleculaire gewicht. 0.8
0.7
B + B’
C + C ’
D + D’
0.6
β’
0.5
D
0.4
E
0.3
B
C
C’
E’
D’
A
A’
α
α’
B’
β + β’
β
α + α‘
0.2
0.1
E + E’
A + A’
0.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
1
Figuur 6.6: H-‐NMR spectrum van p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL). De verhouding van de ingebouwd monomeren in de ketens kon dan weer afgeleid worden uit 1H-‐NMR spectra (figuur 6.6 + tabel 6.1). De pieken bij 1,45 en 5,1 ppm komen respectievelijk overeen met de chemische verschuiving van de waterstoffen op de 68 methylgroep (β en β’) en het α en α’-‐waterstof van de lactide-‐eenheden. De pieken bij 4,05 en 4 ppm zijn afkomstig van de CH2’s op positie E en E’ in de ε-‐caprolacton eenheden. Verder zorgen de CH2’s op positie A en A’ voor een chemische verschuiving van 2,35 en 2,5 ppm. Tenslotte kan de intense piek op 1,5 ppm toegewezen worden aan de CH2’s op positie B, B’, C, C’ en D, D’ in de ε-‐caprolacton eenheden. De bepaling van de verhouding van de monomeren in het random copolymeer kan afgeleid worden via integratie. Zo kan bijvoorbeeld de ratio van de oppervlakte onder de α + α’-‐piek van lactide (integreert voor 1 H) op de gehalveerde oppervlakte onder een CH2-‐piek (E + E’ of A + A’) van ε-‐caprolacton bepaald worden. Hieruit kan de procentuele samenstelling van de copolymeren berekend worden. 69 Bijlage 2: Gebruikte technieken voor karakterisatie A. Bepaling van de M/C-‐waarde De benodigde hoeveelheid polymeer bij een bepaalde ladingsverhouding kan berekend worden voor een polyplex uit de M/C-‐waarde of massa per ladingsverhouding (vergelijking 6.4). Deze M/C-‐waarde stelt de massa van een bepaalde polyelektroliet voor die nodig is om één mol lading te bekomen. Voor DNA is deze waarde vastgelegd op het gewogen gemiddelde van de vier basen (Adenine, Guanine, Thymine en Cytosine) of 325 Da/mol. [2] Dit verschilt echter voor elk copolymeer afhankelijk van welke (al dan niet geladen) groepen aanwezig zijn in de (zij)ketens. Bovendien moet de aanwezigheid van een tegenion (HCl) ook in rekening gebracht worden om de neutraliteit te bewaren. Om de M/C-‐waarde van de derivaten te kunnen vergelijken moet de M/C berekend worden bij 100% lading. Hierbij wordt er vanuit gegaan dat guanidine en amine functies volledig geprotoneerd zijn, terwijl een imidazolgroep (pKa ~ 6) slechts in de helft van de gevallen geprotoneerd is. 𝑀
= 𝑀
𝐶 100% = 𝐶 𝑝𝑜𝑙𝑦
% 𝑔𝑒𝑙𝑎𝑑𝑒𝑛 𝑔𝑟𝑜𝑒𝑝𝑒𝑛
% 𝐻𝐸𝐺 ∗ 172 𝑔 𝑚𝑜𝑙 + % 𝐼𝑚𝐸𝐺 ∗ 258,5 𝑔 𝑚𝑜𝑙 + (% 𝐴𝐸𝐺 ∗ 206,5 𝑔 𝑚𝑜𝑙)
% 𝐼𝑚𝐸𝐺
(
+ %𝐴𝐸𝐺)
2
Vergelijking 6.1: M/C 100% na aminolyse. =
% 𝐻𝐸𝐺 ∗ 172 𝑔 𝑚𝑜𝑙 + % 𝐼𝑚𝐸𝐺 ∗ 258,5 𝑔 𝑚𝑜𝑙 + (% 𝐺𝑢𝐸𝐺 ∗ 249,7 𝑔 𝑚𝑜𝑙)
% 𝐼𝑚𝐸𝐺
(
+ %𝐺𝑢𝐸𝐺)
2
Vergelijking 6.2: M/C 100% na guanidinylering. Een ongeladen HEG unit heeft een molaire massa van 172 g/mol. Een geladen aminegroep afkomstig van een AEG unit (170 g/mol) telt mee voor 206,5 g/mol aangezien deze gestabiliseerd is met een HCl unit (36,5 g/mol). Hetzelfde geldt voor de geladen guanidinegroepen (GuAEG = 213,2 g/mol en HCl = 36,5 g/mol), wat neerkomt op een massa in oplossing van 249,7 g/mol. Een imidazolgroep (222 g/mol) geneutraliseerd met een HCl unit zal dan weer een molaire massa geven van 258,5 g/mol. In het geval van onze copolymeren wordt de M/C 100% volgens vorige vergelijkingen bepaald (vergelijking 6.1 en 6.2). 70 B. Dynamische lichtverstrooiing Dynamische lichtverstooiing of dynamic light scattering (DLS) is een techniek die kan aangewend worden om te bepalen of de gesynthetiseerde vectoren al dan niet DNA kunnen complexeren en welke groottedistributie deze polyplexen hebben in oplossing. De basis van de techniek ligt in tijdelijke fluctuaties van de intensiteit van verstrooide lichtstralen veroorzaakt door de Browniaanse beweging van de opgeloste stoffen. De Browniaanse beweging ontstaat doordat deeltjes in oplossing botsen met elkaar en solventmoleculen. Botsingen ontstaan door de continue beweging van moleculen in oplossing als gevolg van thermische energie. Grotere partikels hebben een tragere Browniaanse beweging in oplossing en zullen minder intensiteitsfluctuaties veroorzaken. De fluctuatie van de intensiteit komt voort uit de lichtverstrooiing en is het gevolg van de interactie van de invallende laserstraal met de in oplossing aanwezige, continu bewegende deeltjes. Hierdoor wordt de techniek ook wel foton correlatie spectroscopie genoemd. De techniek is (strikt gezien) enkel toepasbaar voor kleine deeltjes in vergelijking met de invallende lichtbundel (<λ/20) die beantwoorden aan de Rayleigh verstrooiingslimiet. Aangezien het licht in alle richtingen evenredig verstrooid wordt, meet men onder een hoek van 90° of 173° om de interferentie met invallende straling en eventuele backscattering te minimaliseren. De gemeten intensiteitsfluctuaties worden vervolgens omgezet in een elektrisch signaal waarna hieruit een correlatiefunctie berekend wordt (figuur 6.7). De snelheid waarmee deze functie (exponentieel) afneemt kan vervolgens gecorreleerd worden aan de Browniaanse beweging van de deeltjes in oplossing. Dit is dan weer een maat voor de grootte van de deeltjes. Uit de correlatiefunctie kan de diffusiecoëfficiënt D gehaald worden. De hydrodynamische diameter van de partikels in oplossing wordt vervolgens berekend uit de Stokes-‐Einstein vergelijking [3, 4]: 𝑑(𝐻) =
d(H) = hydrodynamische diameter T = absolute temperatuur (in K) η = viscositeit solvent D = diffusiecoëfficiënt 𝑘𝑇
6𝜋𝜂𝐷
Vergelijking 6.3: Stokes-‐Einstein vergelijking. 71 Figuur 6.7: Correlatiefunctie voor een DLS meting met typische omgekeerde S-‐vorm. Bij de DLS metingen wordt de grootte van de DNA/polymeer complexen of polyplexen bij drie verschillende ladingsverhoudingen gemeten. Er worden polymeer/DNA ratios met een LV van 1/1, 2/1 en 4/1 gemeten. Voor de bereiding van de stalen wordt er 16 µl (of 40 µg) van een 2,5 mg/ml kalfsthymus DNA oplossing gebruikt. De benodigde hoeveelheid polymeer die hieraan toegevoegd dient te worden hangt af van de M/C-‐waarde van het DNA (325 g/mol) en polymeer, maar wordt ook bepaald door de gewenste LV. Alle fysicochemische testen worden uitgevoerd in een oplossing die aangelengd is tot 2 ml met ultrazuiver water. De kuvetten worden vervolgens gedurende 5 s gevortext voor aanvang van de meting. Onderstaande formule (vergelijking 6.4) bepaald de benodigde hoeveelheid polymeer: µμ𝑔 𝑝𝑜𝑙𝑦𝑚𝑒𝑒𝑟 =
40 µμ𝑔 𝐷𝑁𝐴
∗ 𝑀 𝐶 𝑝𝑜𝑙𝑦𝑚𝑒𝑒𝑟 ∗ 𝐿𝑉 𝑀 𝐶 𝐷𝑁𝐴
Vergelijking 6.4: Bepaling benodigde hoeveelheid polymeer bij bepaalde ladingsverhoudingen. De uiteindelijke grootte van de polyplexen in oplossing wordt gemeten door een lichtstraal van een 10 mW laser bij een golflengte van 488 nm te laten invallen op een kuvet. De intensiteit van de verstrooide lichtstralen wordt gemeten onder een hoek van 90° bij 72 kamertemperatuur. Elke kuvet wordt drie maal gemeten, met een interval van tien subruns per meting. C. Fluorescentie testen SYBRGold is een kationische kleurstof die sterk interageert met de dubbele helix van DNA. Ook de aanwezigheid van enkelstrengige RNA moleculen en kortere oligonucleotiden kan hiermee gevisualiseerd worden. De fluorescentie test bepaalt naast de LV waarbij complexvorming optreedt (condensatiepunt) ook de mate waarin dit gebeurt. SYBRGold is een asymmetrische cyanide kleurstof die (net als ethidiumbromide) kan intercaleren tussen twee basenparen via een Van der Waals interactie in de kleine (minor) groef van de DNA helix. [5] Deze intercalatie wordt geheel of gedeeltelijk verhinderd wanneer er DNA/polymeer complexen ontstaan. De elektrostatische interactie tussen het polymeer en DNA is sterker dan de DNA/SYBRGold interactie. Hierdoor daalt de fluorescentie. Binding van SYBRGold aan de ‘minor’ groef zorgt voor een selectieve excitatie van gebonden SYBRGold bij een golflengte van 495 nm aangezien ongebonden SYBRGold nauwelijks geëxciteerd wordt. Het geëxciteerde SYBRGold geeft aanleiding tot een maximale fotonemissie (fluorescentie) bij 537 nm en is omgekeerd evenredig met de mate waarin polyplexen gevormd worden. [6, 7] Bij te hoge concentraties SYBRGold wordt DNA zo sterk gestabiliseerd dat de vorming van polyplexen met de polyelektrolieten volledig verhinderd wordt. De optimale concentratie voor de fluorescentiemetingen is 0,1 µg/ml en werd ook gebruikt voor de fluorescentietesten. Deze concentratie is voldoende hoog om een detecteerbare fluorescentie waar te nemen en laag genoeg om geen te sterke stabilisatie van DNA te veroorzaken. [7, 8] Voor de fluorescentiemetingen wordt er 16 µl (40 µg) van een 2,5 mg/ml DNA oplossing in een kuvet gebracht en opgelost in een 0,1 µg/ml SYBRGold oplossing. Het volume SYBRGold oplossing dat toegevoegd wordt dient het totale volume op 2 ml te brengen bij LV 2/1. Wanneer vb. 100 µg polymeer nodig is, dient een volume van 10 µl uit een stockoplossing van 10 mg/ml gepipetteerd te worden. Hieraan dient 1984 µl (2000 µl -‐ 16 µl DNA -‐ 10 µl polymeeropl.) SYBRGold-‐oplossing toegevoegd worden. Voor de meting wordt de oplossing in de kuvet 5 seconden gevortext. De kalibratie van de apparatuur gebeurt door een SYBRGold/DNA oplossing te meten in 73 afwezigheid van polymeer en de relatieve fluorescentie gelijk te stellen aan 100%. Tussen de metingen wordt er telkens een hoeveelheid polymeer toegevoegd zodanig dat er een stijging in de LV van 0,2 eenheden optreedt. Deze procedure wordt herhaald tot een finale LV van 2/1 bekomen wordt. De geëmitteerde fluorescentie wordt bij elk staal in drievoud opgemeten. [9] D. Agarose gel-‐elektroforese Voor de bereiding van de gel wordt 1 g agarose opgelost in 100 ml ultrazuiver water en ingekookt voor 15 minuten au bain marie. Nadien wordt de gel in een mal gegoten en gedurende 1h gehard en ondergedompeld in een TBE buffer (0,1 M trisbase, 0,09 M boorzuur en 1 mM Na2EDTA*2H20). Per gel worden elf verschillende polymeer/DNA verhoudingen in zogenaamde “wells” ingebracht. Hierbij wordt een oplopende LV volgorde van 0/1 (puur DNA) tot 2/1 in stappen van 0,2/1 gerespecteerd. Per polymeer wordt 16 µl (40 µg) van een 2,5 mg/ml DNA oplossing toegevoegd en aangelengd met ultrazuiver water tot een totaalvolume van 2 ml. De benodigde hoeveelheid polymeer hangt af van de M/C-‐waarde en de gewenste LV. Van elke oplossing wordt 20 µl genomen en 2 µl ladingsbuffer (50% v/v glycerol, 100 mM Na2EDTA*2H20, 0,1% w/v bromofenol blauw en ultrazuiver water) toegevoegd. Toevoegen van deze ladingsbuffer zorgt zowel voor een verhoging van de densiteit van de polyplexen waardoor deze op de bodem van de “wells” blijven als een visualisatie van het migratiepatroon van het DNA tijdens de elektroforese. Vervolgens wordt er 20 µl van deze oplossingen in de “wells” gepipetteerd. De scheiding door elektroforese gebeurt onder een spanning van 90 V gedurende 1h, waarna de gel gekleurd wordt door 2h incubatie in een 0,1 µg/ml SYBRGold oplossing. Vervolgens worden de aanwezige componenten op de gel gevisualiseerd met een UV-‐
transilluminator (λex = 312 nm) en onder een digitale camera gefotografeerd. E. Polyacrylamide gel-‐elektroforese Polyacrylamide gel-‐elektroforese (PAGE) dient verticaal in plaats van horizontaal gelopen te worden. PAGE is beter geschikt voor de scheiding van korte DNA fragmenten zoals oligonucleotiden dan agarose. Voor de scheiding van het 21-‐mer enkelstrengig oligonucleotide is een 8% acrylamide gel nodig. De bereiding van de gel gebeurt door aan 74 een 2 ml TBE (10x) bufferoplossing 200 µl ammoniumpersulfaat (APS) toe te voegen als oxidant om de polymerisatie te katalyseren. Hieraan wordt 4 ml acrylamide (29:1 acrylamide:bisacrylamide) aan toegevoegd. Deze oplossing wordt verder aangelengd tot 20 ml met ultrazuiver water (milli Q). Vervolgens worden eventuele luchtbellen verwijderd in een ultrasoon bad en dient de oplossing gekoeld te worden in een ijsbad. Hierna wordt er 20 µl N,N,N',N'-‐tetramethylethyleendiamine (TEMED) toegevoegd om de polymerisatie (en crosslinking) te initiëren. De gel wordt uitgegoten tussen twee glasplaten (spacing 1 mm) en gedurende 45 minuten uitgehard. Vervolgens wordt de gel in het elektroforese apparaat bevestigd en onder TBE buffer geplaatst. Eventuele luchtbellen in de wells worden met behulp van een injectienaald verwijderd. De gel wordt verder geconditioneerd door een prerun bij 150 V gedurende 25 minuten. In een volgende stap wordt de gel beladen met elf verschillende polymeer/DNA verhoudingen in oplopende LV van 0/1 (puur DNA) tot 2/1 in stappen van 0,2/1. Na een run van 17 min wordt de gel voor 10 à 15 minuten gestaind in SYBRGold om de bandjes te visualiseren. Per LV wordt 4 µl (0,4 µg) van een 0,1 mg/ml DNA oplossing samen met de vector toegevoegd en aangelengd met ultrazuiver water tot een totaalvolume van 20 µl. De benodigde hoeveelheid polymeer hangt af van de M/C-‐waarde en de gewenste LV. Hieraan wordt 2 µl ladingsbuffer (50% v/v glycerol, 100 mM Na2EDTA*2H20, 0,1% w/v bromofenol blauw en ultrazuiver water) toegevoegd. Van elke oplossing wordt 5 µl op een well gebracht. F. Gel permeatie chromatografie Gel permeatie chromatografie (GPC) is een chromatografische methode die de scheiding van polymeren toelaat op basis van hun hydrodynamisch volume. Polymeren in oplossing worden gescheiden door hun onderling verschil in grootte, wat gecorreleerd is aan het moleculair gewicht. De scheiding verloopt op een stationaire fase die bestaat uit een gecrosslinkte, poreuze gel met een zekere poriegrootte en distributie. Het scheidingsgebied van de kolom situeert zich tussen volledige exclusie en volledige permeatie van het polymeer in de poriën in de gel. Grotere moleculen elueren eerst aangezien deze slechts gedeeltelijk in de poriën kunnen doordringen of zelfs volledige exclusie ondergaan. Kleinere moleculen zullen daarentegen wel de poriën binnendringen waardoor deze een langere verblijftijd op de kolom hebben en later elueren (figuur 6.8). De detectie gebeurt door het meten van verschillen in de 75 brekingsindex aan de uitgang van de kolom d.m.v. een differentiële refractie index detector. Het moleculair gewicht en de gewichtsspreiding kunnen bepaald worden door middel van een kalibratie. De kalibratiecurve wordt bepaald door het meten van een reeks standaarden. GPC is geen absolute methode. Naast het hydrodynamisch volume is het bekomen Mn of Mw ook afhankelijk van de polymeer-‐solvent interacties. Op deze manier kan het numeriek moleculair gewicht Mn, het gewichtsgemiddeld moleculair gewicht Mw en de polydispersiteit D van een gegeven staal bepaald worden. [10] Figuur 6.8: Principe van de scheiding van polymeren via GPC op basis van hydrodynamisch volume. De moleculaire gewichten van de gederivatiseerde polymeren worden na aminolyse en guanidine conversie bepaald door middel van GPC in een waterige oplossing. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een fosfaatbuffer met een zoutconcentratie tussen 0,2 en 0,5 M en pH 4 op basis van NaH2PO4 (5%), acetonitrille (CH3CN) (3%) en ultrazuiver water. Eventuele onzuiverheden in het eluens worden afgefilterd door een 0,45 µm filter en aanwezige luchtbellen worden bij de injectie verwijderd. De injectie gebeurt manueel met een hamiltonspuit en hierbij wordt een loop van 20 µl beladen. Als standaarden voor het bepalen van de kalibratiecurve wordt gebruik gemaakt van dextraan. Alle polymeerstalen worden in een 10 mg/ml bufferoplossing op de kolom gebracht en gescheiden over twee in serie geschakelde kolommen. De kolommen zijn in serie geschakeld om een hoger plaatnummer te bekomen en scheiden de polymeren in een range van 500 tot 2 000 000 Da. Het Mw, Mn en D van het geïnjecteerde polymeer worden na 40 minuten bepaalt aan de hand van de bekomen kalibratiecurve. 76 G. Differentiële scanning calorimetrie & thermogravimetrische analyse Differentiële scanning calorimetrie of DSC is een techniek die gebruikt wordt om thermische transities in een polymeer te meten. Het apparaat bestaat uit twee thermisch geïsoleerde pannen (sample en referentie materiaal) in een oven die met een constante snelheid worden opgewarmd of afgekoeld. Tijdens het opwarmen/afkoelen ondergaat het polymeer staal fysische transformaties die endo-‐ of exotherm kunnen zijn of gepaard gaan met een verandering in warmtecapaciteit (bv. glastransitie). Hierdoor moet er meer of minder warmte naar het referentie materiaal vloeien om de temperatuur van het staal en referentie op hetzelfde niveau te houden. Op deze manier wordt een thermogram bekomen waarbij de temperatuur op de x-‐as geplot is en de tijdsafhankelijke warmteoverdracht (∆H/∆t) op de y-‐
as. Endo-‐ en exotherme processen geven aanleiding tot een piek, de glastransitie wordt gezien als een sprong in de basislijn. De curve wordt in drie opeenvolgende stappen bekomen. Doorgaans wordt in een eerste opwarmcyclus de thermische historiek uitgeschakeld en wordt na smelten een goed thermisch contact gegarandeerd tussen sample en pannetje. Vervolgens wordt het sample gecontroleerd afgekoeld en wordt het sample in een tweede cyclus opnieuw opgewarmd. In geval van smelten van een polymeer, vertoont de scan een brede endotherme piek waarbij de onset-‐temperatuur als smelttemperatuur kan bepaald worden. Uit de oppervlakte onder de piek kan de graad van kristallisatie berekend worden. De Tg van het materiaal kan bepaald worden door een verschuiving van de basislijn op de y-‐as. Dit kan samengaan met een hysteresis piek als gevolg van de fysische relaxatie van de polymeerketens. De y-‐waarde is tevens een maat voor de warmtecapaciteit van het materiaal. [11, 12] Thermogravimetrisch analyse of TGA is een techniek die kan gebruikt worden om de thermische stabiliteit, degradatie-‐ en oxidatietemperaturen van een materiaal te bepalen in een bepaald temperatuursbereik. De methode onderzoekt gewichtsveranderingen van het materiaal in functie van de temperatuur. In geval van thermische stabiliteit wordt het gewicht in functie van de tijd gevolgd bij een bepaalde temperatuur. Bij degradatie of verbranding wordt het gewicht gevolgd in functie van de toenemende temperatuur. Bij pyrolyse (onder inerte flow) worden degradaties gemeten, bij verbranding (onder zuurstof of lucht flow) worden oxidaties gevolgd. Vanaf een bepaalde temperatuur zal er 77 gewichtsverlies optreden doordat het materiaal begint te degraderen. Op deze manier kan de gebruikslimiet van een polymeer vastgesteld worden. [11] H. Scanning elektronen microscopie Scanning elektronen microscopie of SEM is een elektronen microscoop die beelden maakt van een sample door dit af te scannen met een gefocuste elektronen straal (figuur 6.9). Zo kan er visuele informatie bekomen worden over de oppervlakte topografie van het staal. De visualisatie kan sterk verbeterd worden wanneer het staal eerst gecoat is met een heel dun laagje goudpartikels. Dit is noodzakelijk aangezien het te visualiseren oppervlak elektrisch geleidend moet zijn. Zo kan een resolutie kleiner dan een nanometer bekomen worden onder zeer sterke vergrotingen. Figuur 6.9: Schematische werking van een scanning elektronen microscoop. Bovenaan de microscoop wordt een elektronenstraal geproduceerd door een elektronen pistool. Deze volgen een verticaal pad in de apparatuur onder een hoog vacuüm. Deze straal wordt versneld door een anode en verder gefocust door magnetische lenzen. Wanneer de elektronenstraal het staal bereikt worden er X-‐stralen, teruggekaatste primaire, secundaire en Auger elektronen gevormd. Deze worden opgevangen door een detector en geconverteerd in een visueel beeld. [13] Voor de analyse van een staal is het belangrijk dat dit volledig vrij is van elk spoor solvent om de apparatuur niet te beschadigen. Hiervoor wordt het staal gedurende 48h gedroogd in een 78 vacuümoven. Wanneer gewerkt wordt met micropartikels kan hiervan een staal genomen worden door de partikels af te zetten op een klevend grafietoppervlak. Vervolgens wordt het staal via sputtering gecoat met een dunne laag goudpartikels om een betere scherpstelling en een geleidend oppervlak te verkrijgen. I. Atoomkracht microscopie Atoomkracht microscopie (AFM) is een techniek die kan gebruikt worden voor de visualisatie van de oppervlakte morfologie van een materiaal. Het principe van de techniek bestaat uit de meting van de beweging van een tip of probe die aan een flexibele cantilever is vastgehecht door middel van een laser (figuur 6.10). Deze tip scant het oppervlakte van het materiaal af en geeft zo informatie over de morfologie van het oppervlak op atomische schaal. De aanwezigheid van oneffenheden op het oppervlak zullen zorgen voor een verandering van de positie van de cantilever waardoor de laser niet meer perfect de detector raakt. Op deze manier wordt er een soort van topografische map van het oppervlakte gecreëerd waaruit de ruwheid van het materiaal kan afgeleid worden. [14] Figuur 6.10: Principe van AFM visualisatie van de oppervlakte topologie. J. Statische contacthoek metingen Statische contacthoek metingen (SCA) kunnen gebruikt worden als maat voor de hydrofobiciteit/hydrofiliciteit van een materiaal (figuur 6.11). Hierbij wordt een druppel water (5 µl) op het oppervlak van het materiaal aangebracht door middel van een fijne 79 Hamilton naald. Vervolgens wordt de relaxatie van de druppel gedurende 30 s opgenomen. Deze data wordt verder geanalyseerd en hieruit wordt een gemiddelde contacthoek met het oppervlakte berekent. Per staal worden er minstens 3 druppels afgezet om een reproduceerbare meting te bekomen. [15] Figuur 6.11: Principe van SCA als maat voor de hydrofobiciteit/hydrofiliciteit van een materiaal. K. Dynamische damp sorptie Dynamische damp sorptie (DVS) kan gebruikt worden voor de bepaling van het absorptie/desorptie profiel van waterdamp in een staal. Er wordt bepaald hoeveel en hoe snel een droog sample water kan opnemen. Dit wordt gedaan door de relatieve vochtigheid te variëren bij een constante temperatuur van 37°C (onder fysiologische omstandigheden). De toename of afname in massa als het gevolg van opname of afgifte van water in het staal wordt opgemeten met een microbalans. Tijdens de metingen wordt de relatieve vochtigheid stapsgewijs verhoogd (in stappen van 10%). Tussen elke stap wordt gewacht tot een nieuwe evenwichtsmassa van het staal bereikt is. De output van de metingen zijn waterdamp isothermen. [16] Aangezien dat er steeds amorfe partikels zouden moeten bekomen worden na sproeidrogen, werd dit getest door middel van dynamische damp sorptie. Semi-‐kristallijne materialen zullen weinig of geen water absorberen terwijl amorfe materialen meer absorptie zullen vertonen. Uit de isotherm plot (figuur 6.12 boven) kan gezien worden dat er een relatief massa verschil van 13,6 % optreedt na een cyclus bij een relatieve luchtvochtigheid van 100 % en een verschil van 6,6 % na twee, respectievelijk drie cycli van absorptie en desorptie. Dit is een aanzienlijke wateropname en wijst op het feit dat de via sproeidrogen geproduceerde micropartikels zich inderdaad in de amorfe toestand bevinden. Het verschil tussen absorptie en desorptie bij de verschillende cycli geeft info over het hysteresis fenomeen (figuur 6.12 onder). Deze piek kan toegeschreven worden aan een structurele verandering veroorzaakt 80 door de distributie van watermolecule tussen de polymerketens. [12] Het indringen van de watermoleculen verstoort de interacties tussen de ketens. Isotherm plot 15 Cycle 1 Sorp Cycle 1 Desorp Cycle 2 Sorp Cycle 2 Desorp Cycle 3 Sorp Cycle 3 Desorp ∆m (%) 10 5 0 0 20 40 60 80 Relageve vochggheid (%) -‐5 100 Isotherm Hysteresis (%) Hysteresis plot 0,4 0,2 0 -‐0,2 0 50 Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 -‐0,4 -‐0,6 -‐0,8 -‐1 100 Relageve vochggheid (%) Figuur 6.12: DVS isothermen van p(D,L-‐LA-‐co-‐CL) met een moleculair gewicht van 100 kDa en LA/CL ratio van 84:16. Boven: isotherm plot met relatief massaverschil. Onder: hysteresis plot. 81 Bijlage 3: Productie en modificatie van micropartikels A. Invloed van de deeltjes grootte De deeltjes grootte van micropartikels zal bepalen via welke weg de deeltjes in de cel zullen opgenomen worden. In de literatuur bestaat er geen eenduidige consensus, maar algemeen wordt aangenomen dat deeltjes kleiner dan 200 nm via endocytose opgenomen worden, terwijl grotere deeltjes (tot 1 à 5 µm en groter) via fagocytose in de cel worden geïnternaliseerd. [17] Er wordt aangenomen dat partikels met een diameter van 100 à 200 nm de beste eigenschappen bezitten om efficiënt geïnternaliseerd te worden. [18] De deeltjesgrootte zal afhangen van de toegepaste productietechniek en tal van parameters zoals polymeerconcentratie, roersnelheid (bij emulsies), viscositeit van de oplossing, enzovoort. De reden waarom microsferen zo aantrekkelijk zijn voor biomedische toepassingen is dat ze kunnen opgenomen worden in cellen en ingezet als gecontroleerde afgiftesystemen. Dit maakt micropartikels uitermate interessant als dragers voor geneesmiddelen of therapeutisch DNA. [17, 19, 20] Het is ook mogelijk om cellen in te kapselen met grotere micropartikels. B. Productie van micropartikels via emulsie technieken De meest populaire technieken voor de productie van micro-‐ of nanopartikels zijn gebaseerd op emulsies. Hierbij worden deeltjes opgelost of gedispergeerd in een oplossing om vanuit de emulsie microdruppels te vormen. Deze moeten na het verwijderen van het solvent nog verder gedroogd worden (figuur 6.13). [21] Dit maakt emulsietechnieken vrij omslachtig aangezien meerdere stappen moeten doorlopen worden. Emulsie technieken maken veelal gebruik van organische solventen. Dit is niet zo interessant voor biomedische applicaties aangezien het solvent volledig dient verwijderd te worden om te voorkomen dat eventuele resten zorgen voor toxische effecten. Bovendien is het meestal noodzakelijk gebruik te maken van een surfactant om coagulatie van de gesuspendeerde polymeer partikels te vermijden. Het gebruikte solvent en surfactant hebben ook invloed op de deeltjes grootte. Dit wordt mede bepaald door de roersnelheid, wat resulteert in vrij 82 polydisperse micropartikels. [20, 21] Er zijn verschillende benaderingswijzen mogelijk: een emulsiepolymerisatie van opgeloste monomeren in micellen, een suspensie (of dispersie) polymerisatie van monomeren in een non-‐solvent of gedispergeerde polymeerpartikels in een emulsie. Via een emulsiepolymerisatie kunnen kleinere partikels bekomen worden (in de range van 10 nm tot 10 µm) dan bij een suspensiepolymerisatie (tussen 0,5 en 10 µm) aangezien de suspensiepolymerisatie in de grotere monomeerdruppeltjes plaatsvindt. [20] Figuur 6.13: Vorming van microsferen door dispersie van een polymeeroplossing in een emulsie en de daaropvolgende verdamping van het solvent. [20] De dispersie van een polymeeroplossing in een emulsie is noodzakelijk voor de productie van micropartikels (zoals PLA) die niet via een emulsiepolymerisatie kunnen gesynthetiseerd worden. Hierbij wordt een polymeer oplossing langzaam toegevoegd aan een continue fase waarbij vaste micropartikels gevormd worden door de verdamping van het solvent. [20-‐23] C. Productie van micropartikels via sproeidrogen Xedev (alias Procept) is een technologie bedrijf te Zelzate gespecialiseerd in sproeidrogen (figuur 6.15). Dit is een techniek die toelaat om allerhande materialen (van polymeren tot geneesmiddelen) tot micropartikels te verwerken op grotere schaal. De productietechniek laat samples met een volume van 1 ml tot 4 l toe. Concreet betekent dit een reikwijdte van mg-‐schaal tot enkele kilo’s product. [24] Dit is zeer interessant aangezien de meeste productie technieken voor micropartikels niet geschikt zijn om grotere batchen te produceren. De basis van de techniek is vrij simpel en berust op de verneveling van een 83 polymeeroplossing in een warme luchtstroom (figuur 6.14). Dit gaat gepaard met de vorming van polymeerdeeltjes met een deeltjesgrootte van 1 tot 150 µm en de onmiddellijke verdamping van het solvent. De micropartikels worden in poedervorm afgescheiden en opgevangen door middel van centrifugatie in een cycloon. [25, 26] Figuur 6.14: Schematische uiteenzetting van het principe van sproeidrogen. Figuur 6.15: Set-‐up van de sproeidroog apparatuur bij Xedev [25] Ondanks de eenvoud van deze techniek, worden er steeds micropartikels bekomen met een zekere spreiding in deeltjesgrootte. Door optimalisatie van alle parameters kan deze dispersiteit echter tot een minimum beperkt worden. [27] De Tg van de polymeren dient boven 35 °C te liggen om te vermijden dat de polymeren week worden en in de proceskolom of fanbox blijven kleven. Hierdoor kan het verlies aan materiaal geminimaliseerd worden. Deze beperking kan voor een stuk overkomen worden 84 door te werken met een koelgas dat zorgt voor een snellere afkoeling. Bovendien is er de mogelijkheid om te werken in een gesloten systeem (onder N2) voor de behandeling van vocht en lucht gevoelige materialen. Er zal wel steeds een minimale fractie van het product verloren gaan door het achterblijven van materiaal op de wanden van het sproeidroog systeem. [26] De verwerking van warmtegevoelige materialen vormt geen probleem aangezien de verblijftijd van het materiaal in de apparatuur slechts enkele milliseconden bedraagt. De geproduceerde micropartikels bevinden zich steeds in amorfe toestand na sproeidrogen. Snelle verdamping van solvent en koeling van de gevormde micropartikels zorgt dat deze in de amorfe toestand ingevroren worden voordat kristallisatie kan optreden. De vorm van de partikels wordt bepaald door de verhouding van de verdampingsnelheid van het solvent en de diffusiesnelheid van de aanwezige componenten. Deze verhouding wordt ook wel het Pecklet nummer genoemd. [25] Wanneer dit kleiner is dan 1, worden er vaste sferische deeltjes gevormd. Terwijl bij een verhouding kleiner dan 1 eerder geïmplodeerde deeltjes met een onregelmatig, gerimpeld oppervlak geconstrueerd worden. Dit laatste is ook meestal het geval bij polymeer micropartikels, tenzij er in sterk verdunde condities gewerkt wordt. [21, 24-‐29] Voor de experimenten werd gewerkt met een ‘small size’ cycloon, een bi-‐fluid nozzle met diameter van 0,2 mm en een airflow op 35 °C met snelheden tussen 1,5 en 7 l/min. De flow rate van de p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) oplossing werd constant gehouden op 3 ml/min. De totale airflow doorheen de droogkamer werd eveneens constant gehouden op 0,3 m³/min. De gebruikte koellucht heeft een debiet tussen 100 en 200 l/min zodat een uitgangstemperatuur tussen 25 en 28 °C werd bereikt. Deze uitgangstemperatuur dient hoog genoeg te zijn om al het solvent te verdampen, maar moet ook onder de Tg van het gebruikte polymeer liggen om te voorkomen dat dit aan de wanden van de apparatuur blijft kleven. Dit is een limiterende factor aangezien de Tg van het p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) slechts rond 38 °C ligt. Het gebruik van een aangepast septum op de polymeeroplossing kon blokkage van de nozzle door concentratieverschillen als gevolg van verdamping van het solvent verhinderen. 85 D. Productie van micropartikels via electrosprayen Via electrosprayen is het mogelijk om reproduceerbare micropartikels te bekomen met een nauwe dipersiteit, een gecontroleerde morfologie en hoge opbrengsten. Het principe van de techniek bestaat uit de atomizatie van een vloeistof met behulp van een sterk elektrisch veld (figuur 6.16). [30] Figuur 6.16: De verschillende stappen in de productie van nano-‐ of micropartikels via electrospraying. [30] De polymeer oplossing gaat door een capillaire naald/nozzle met een elektrische potentiaal die kan gaan van -‐ tot + 30 kV. De vloeistof wordt als gevolg van de sterke elektrostatische krachten uitgetrokken tot een jet, die opbreekt in druppels. Hierdoor verkrijgt men een fijne nevel. Deze wordt opgevangen met een collector scherm dat tussen 7 en 30 cm afstand van het capillair geplaatst is. Uiteindelijk wordt een fijn poeder bekomen. [22] Een alternatieve methode (dripping mode) bestaat erin om de flow rate zo in te stellen dat er druppels gevormd worden aan de naald en naar het opvangscherm vallen onder invloed van de zwaartekracht. Door de overmaat aan positieve ladingen op de gevormde druppels worden de afstotende (elektrostatische) Coulomb krachten groter dan de oppervlaktespanning (samenhoudende cohesie krachten). Dit zorgt voor een Coulomb expansie waardoor de druppels exploderen in kleinere druppeltjes tot enkel nog vaste polymeerdeeltjes overblijven. Deze mode wordt ook wel het “jet break-‐up process” genoemd. [30] De electrospray techniek laat de productie van monodisperse microsferen toe met een afmeting van 1 à 20 nm tot ongeveer 1000 µm. Evenals sproeidrogen gaat het hier om een éénstaps proces waarbij geen extra droogstap vereist is. De grootte van de microsferen kan gecontroleerd worden door “key parameters” als aangelegde voltage op de naald en flow rate van de polymeeroplossing. Maar ook andere parameters als de afstand tot de collector, de elektrische conductiviteit van de oplossing, het gebruikte solvent, het type polymeer, de 86 polymeerconcentratie, … oefenen hierop een invloed uit. [30] Het verschil tussen electrospinnen en electrosprayen ligt in de densiteit van de ketenverstrengelingen van de polymeer oplossing. Electrosprayen gaat door bij een lage polymeer concentratie en dus ook een lage densiteit aan ketenverstrengelingen. Hierdoor wordt de vloeistof jet verbroken wat leidt tot een poeder in plaats van een vezelstructuur. [22, 30] Voor de optimalisatie van de parameters bij electrosprayen werd uitgegaan van een 10 w/v% p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) oplossing met een moleculair gewicht van ongeveer 60 kDa (tabel 6.2) in DCM. Telkens wanneer een parameter aangepast werd, volgde er een stabilisatietijd van 5 minuten. Vervolgens werden er gedurende 5 minuten micropartikels opgevangen op een glasplaatje voor analyse. De oplossing werd in een 20 ml spuit gebracht, verbonden met een Teflon buisje waaraan een fijne injectienaald met een inwendige diameter van 200 µm (gauge 27) bevestigd werd. De continue aanvoer van polymeeroplossing werd gegarandeerd door een automatische injector. Flow rates tussen 0,2 en 2 ml/h werden experimenteel getest (tabel 6.2). Verder werd een potentiaalverschil tussen 10 & 20 kV aangelegd ter optimalisatie van het systeem. Er werd een afstand van 20 of 25 cm gehanteerd tussen het collectorscherm en de naaldtip. Dit geeft aanleiding tot voldoende droge partikels en handelbare grootte van de sproeikegel zodat de deeltjes in voldoende densiteit konden gecollecteerd worden. Tabel 6.2: Overzicht van de toegepaste parameters, deeltjesgrootte en standaardafwijking van 16 testen voor de parameter optimalisatie van electrosprayen. test A B C D E F G H I J K L M N O P flow rate (ml/h) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,7 0,7 0,7 0,7 1 1 1 1 voltage (kV) 10 12 14 16 10 12 14 16 10 12 14 16 10 12 14 16 afstand (cm) 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 Diameter (µm) 2,94 2,57 2,84 2,66 5,08 6,02 4,05 1,59 7,77 8,39 5,08 5,76 8,05 7,71 5,32 5,84 stdev 1,61 1,08 0,65 0,93 2,16 3,43 1,22 0,55 3,83 2,40 1,00 0,70 5,75 4,30 2,19 0,70 E. Plasma oppervlak modificatie van micropartikels Een plasma kan aanzien worden als de vierde fasetoestand van materialen. Het plasma wordt gevormd door een gas (vb. Argon, O2 of N2) in contact te brengen met een sterk elektrisch veld waardoor dit geëxciteerde atomen, elektronen, ionen, UV-‐straling en vrije radicalen zal vormen. [31] Deze ontstaan doordat geïoniseerde moleculen uit elkaar vallen. 87 Hier wordt gebruik gemaakt van een plasma bij niet-‐evenwichts condities en kamertemperaturen (25 °C). Tijdens de plasma behandeling wordt het materiaal blootgesteld aan een zeer reactieve omgeving. Het oppervlak wordt gebombardeerd met hoog energetische gasmoleculen en UV-‐straling. Hierdoor worden er vrije radicalen (en andere actieve verbindingen) gecreëerd aan het oppervlak van het biopolymeer. Dit zorgt voor de activatie van het oppervlak. Oppervlakte activatie laat de recombinatie met andere functionele groepen toe via covalente aanhechting. [32] Voor de plasmabehandeling worden de p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) beads in droge toestand in de cilindrische plasmareactor gebracht en onder vacuüm geplaatst. De kamer wordt gevuld met stikstofgas tot een constante druk van 0,7-‐0,8 mbar bereikt wordt. Vervolgens wordt hierop een diëlektrische ontlading van 100 V gedurende 5 min op losgelaten. De beads worden beoordeeld door 4 verschillende oplossingen in een fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS) te maken die elk zowel na een dag als een week geëvalueerd worden. Er worden twee PBS oplossingen (5 ml) aangemaakt waaraan niet-‐
geactiveerde beads (10 mg) zijn toegevoegd. Een van deze oplossingen bevat enkel beads in PBS en aan de andere oplossing is ook 10 mg p(HEG15%-‐co-‐GuAEG78%-‐co-‐ImEG7%) toegevoegd. Er worden ook twee PBS oplossingen aangemaakt met geactiveerde beads volgens hetzelfde protocol. Na incubatie van deze oplossingen bij 37°C in een schudbak dienen de oplossingen gevriesdroogd te worden alvorens verdere analyse op de partikels kan uitgevoerd worden. Zo kan er gekeken worden of er aggregatie optreedt of spontane aanhechting van de vectoren aan de niet-‐geactiveerde beads. Verder kan beoordeeld worden of de vectoren zich aan het oppervlakte van de geactiveerde beads kunnen bevestigen. Een alternatieve strategie voor het coaten van de micropartikels met de vectoren bestaat erin om de beads in een eerste stap te coaten met pBG via plasma modificatie en pas nadien verder te modificeren. Hierbij zou gebruik gemaakt kunnen worden van vaste fase chemie. Dit zou de opzuivering na de verschillende derivatisaties vergemakkelijken aangezien steeds met een overmaat aan reagentia gewerkt wordt. Tegelijkertijd zou de analyse en karakterisatie een stuk ingewikkelder worden (vb. NMR, DLS, fluorescentie, gel-‐
elektroforese). 88 F. Spincoating van p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) Voor evaluatie van het p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) via contacthoekenmetingen en AFM was het eenvoudiger om testen uit te voeren op gespincoate samples dan beads. Hiervoor werd tussen de 50 en 70 µl van een 4% p(D,L-‐LA-‐co-‐ε-‐CL) oplossing in droge THF op een cirkelvormig dekglas gebracht. Vervolgens werd dit gedurende 1 min gespincoat bij een toerental van 3000 rpm in een custom-‐made spincoater. Voor verdere analyse en modificatie werden deze stalen overnacht gedroogd in een vacuümoven bij 35°C. Vervolgens werd het oppervlak van de gespincoate stalen geactiveerd via plasma modificatie. Na activatie werden de stalen gedurende 1h geïncubeerd in een 10 mg/ml p(HEG15%-‐co-‐GuAEG78%-‐co-‐ImEG7%) oplossing en gedroogd in een vacuümoven. Hierna kon verdere evaluatie van de oppervlakte modificatie plaatsvinden. 89 Bijlage 4: Cytotoxiciteit en haemotoxiciteit A. Haemotoxiciteit Haemotoxiciteit of hematoxiciteit staat voor de schade die stoffen kunnen toebrengen aan rode bloedcellen en de mate waarin ze het bloed kunnen verstoren. De bloedcompatibiliteit hangt samen met de inductie van bloedstolling als gevolg van een complexe cascade reactie na oppervlakte adsorptie aan lichaamsvreemde stoffen. Door aggregatie of agglutinatie van rode bloedcellen kunnen bloedklonters gevormd worden, wat gevaarlijk is voor de patiënt. Aangezien serum albumine voor 50 g/l aanwezig is in het bloed, wordt dit meestal gebruikt om de bloed (in)compatibiliteit van biomedische toepassingen te testen. Opsonizatie is een bijkomende barrière voor gen-‐afgiftesystemen waarop DNA gecondenseerd is, aangezien hydrofobe deeltjes gemakkelijk uit de bloedstroom verwijderd worden. Tijdens dit opzuiveringsproces worden de lichaamsvreemde partikels gecoat met specifieke plasma proteïnen. Deze interageren met het oppervlak van de partikels en zorgen voor verwijdering uit de bloedcirculatie door macrofagen. Binnen enkele minuten na intraveneuze toediening is al een groot deel van de hydrofobe deeltjes afgevoerd via dit proces. [33] De biocompatibiliteit van gen-‐afgiftesystemen kan verbeterd worden met behulp van een oppervlakte modificatie die de interactie met biologische componenten voorkomt. Hiervoor kan een modificatie van de zijketens met PEG/PEO uitgevoerd worden. Polyethyleenglycol zorgt voor een keten extensie, wat de interactie en adsorptie van proteïnen aan het oppervlak van de vector vermijd. De werking van PEG berust op het hydrofiele karakter van de ketens. Hier spelen twee fenomenen een belangrijke rol in, namelijk osmotische repulsie en het sterische repulsie effect (figuur 6.17). Osmotische repulsie steunt op de sterke hydratatie van de PEO ketens in water, waardoor eveneens sterkt gehydrateerde proteïnen zich niet kunnen vasthechten aan het oppervlak. Bovendien zijn de PEO ketens zeer mobiel en wordt proteïne adsorptie aan het oppervlak vermeden door de snel bewegende ketens. Het sterische repulsie effect, ook wel entropische repulsie genoemd, schermt het oppervlak van de vector af door de vorming van kluwens in de zijketens waardoor een zeker volume niet bereikbaar is voor interagerende bestandsdelen. Gegrafte PEG ketens vormen zo een 90 soort van borstel op het oppervlak van de vector die de thrombogeniciteit sterk kunnen verminderen. [34, 35] Figuur 6.17: Mechanismen betrokken in de proteïne resistentie van PEO oppervlakken. A) sterisch (entropische) repulsie effect B) osmotische repulsie [34] B. Cytotoxiciteit De cytotoxiciteit is de mate waarin stoffen lichaamscellen kunnen beschadigen of zelfs doden. Om een succesvolle transfectie van het therapeutisch gen te bekomen, moet het plasmamembraan voor een stuk beschadigd worden zodat het DNA zich toegang tot het cytoplasma kan verschaffen. Daarom moet er een balans zijn tussen internalisatie en cytotoxiciteit. Zo kan vermeden worden dat een groot deel van de cellen afsterft na transfectie met DNA. Bij kationische polymeren wordt DNA beter gecomplexeerd naarmate het aantal primaire amines op de toeneemt, maar de cytotoxiciteit stijgt evenredig. Door het inbouwen van imidazolgroepen of het omzetten van primaire amines in guanidines, waarbij de positieve lading beter gedelokaliseerd wordt, kan de cytotoxiciteit opnieuw verlaagd worden. [8] Daarboven kan het gebruik van biodegradeerbare vectoren de cytotoxiciteit aanzienlijk verlagen, aangezien er veel minder sprake is van accumulatie in de getransfecteerde cellen of doelweefsel. Hier werd vooral gefocust op polymeer gebaseerde genafgifte systemen, maar zoals figuur 6.18 laat blijken, hangt de cytotoxiciteit ook sterk af 91 van de gebruikte methode en is afhankelijk van de hoeveelheid schade die er aan de celmembranen dient toegebracht te worden. [33] Figuur 6.18: Vergelijking van de genafgifte efficiëntie versus toxiciteit tussen verschillende non-‐virale gen-‐afgifte systemen. [36] 92 Referenties bijlagen 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. Wannes, L., Application of the bioplotter technology for the production of porous scaffolds to support cellular growth, in Polymer Chemistry and Biomaterials Research Group 2011-‐2012, University of Ghent. p. 83. Chargaff, E., R. Lipshitz, and C. Green, Composition of the desoxypentose nucleic acids of four genera of sea-‐urchin. J Biol Chem, 1952. 195(1): p. 155-‐60. Reschel, T., et al., Physical properties and in vitro transfection efficiency of gene delivery vectors based on complexes of DNA with synthetic polycations. Journal of Controlled Release, 2002. 81(1–2): p. 201-‐217. Malvern, I. Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes. Olmsted, J. and D.R. Kearns, Mechanism of ethidium bromide fluorescence enhancement on binding to nucleic acids. Biochemistry, 1977. 16(16): p. 3647-‐54. Tsuboi, M., J.M. Benevides, and G.J. Thomas, Jr., The complex of ethidium bromide with genomic DNA: structure analysis by polarized Raman spectroscopy. Biophys J, 2007. 92(3): p. 928-‐34. Invitrogen, SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain. Molecular Probes invitrogen detection techniques: p. 5. Goes, A., Synthese en evaluatie van poly-‐L-‐glutamine derivaten als niet-‐virale gen-‐
afgiftesystemen, in Onderzoeksgroep Polymer Chemistry & Biomaterials Group 2010, UGent: Vakgroep Organische Chemie. p. 121. Dubruel, P., L. Dekie, and E. Schacht, Poly-‐L-‐glutamic acid derivatives as multifunctional vectors for gene delivery. Part A. Synthesis and physicochemical evaluation. Biomacromolecules, 2003. 4(5): p. 1168-‐1176. Trathnigg, B., Size-‐Exclusion Chromatography of Polymers, in Encyclopedia of Analytical Chemistry2006, John Wiley & Sons, Ltd. Stodghill, S.P. Thermal Analysis – A Review of Techniques and Applications in the Pharmaceutical Sciences. 2010. Du Prez, F., Polymer materials, Polymer Chemistry Research Group. Schweitzer, J. Scanning electron microscope. 2010; Available from: http://www.purdue.edu/rem/rs/sem.htm. Jalili, N. and K. Laxminarayana, A review of atomic force microscopy imaging systems: application to molecular metrology and biological sciences. Mechatronics, 2004. 14(8): p. 907-‐945. Kwok, D.Y. and A.W. Neumann, Contact angle measurement and contact angle interpretation. Advances in Colloid and Interface Science, 1999. 81(3): p. 167-‐249. Bravo-‐Osuna, I., C. Ferrero, and M.R. Jimenez-‐Castellanos, Water sorption-‐desorption behaviour of methyl methacrylate-‐starch copolymers: effect of hydrophobic graft and drying method. Eur J Pharm Biopharm, 2005. 59(3): p. 537-‐48. Jeong Soon, J., et al., Poly(ethylene glycol)/poly(ε-‐caprolactone) diblock copolymeric nanoparticles for non-‐viral gene delivery: The role of charge group and molecular weight in particle formation, cytotoxicity and transfection. Journal of Controlled Release, 2006. 113(2): p. 173-‐182. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. Nguyen, K.T., et al., Studies of the cellular uptake of hydrogel nanospheres and microspheres by phagocytes, vascular endothelial cells, and smooth muscle cells. J Biomed Mater Res A, 2009. 88(4): p. 1022-‐30. Tamjid, E., et al., Effect of particle size on the in vitro bioactivity, hydrophilicity and mechanical properties of bioactive glass-‐reinforced polycaprolactone composites. Materials Science and Engineering: C, 2011. 31(7): p. 1526-‐1533. Freiberg, S. and X.X. Zhu, Polymer microspheres for controlled drug release. International Journal of Pharmaceutics, 2004. 282(1–2): p. 1-‐18. Lassalle, V. and M.L. Ferreira, PLA nano-‐ and microparticles for drug delivery: An overview of the methods of preparation. Macromolecular Bioscience, 2007. 7(6): p. 767-‐783. Bock, N., et al., Electrospraying, a Reproducible Method for Production of Polymeric Microspheres for Biomedical Applications. Polymers, 2011. 3(1): p. 131-‐149149. Reverchon, E., et al., Spherical microparticles production by supercritical antisolvent precipitation. J. of Supercritical Fluids, 2008. 47: p. 70-‐84. Vanwesenbeeck, J., F. Van der Gucht, and M. Gil, Spray Drying Scale-‐Up from mg to kg Scale, Lessius, Editor 2011. Van der Gucht, F., R&D Spray Drying, 2012, Procept. p. 54. Van der Gucht, F., The ProCepT 4M8 Spray Dryer for R&D, 2011. p. 6. Serneels, G., F. Van der Gucht, and G. Van den Mooter, Optimization of Process Conditions for Spray Drying drug-‐loaded Poly lactic-‐co-‐glycolic acid (PLGA) microspheres, L.P.U. Leuven, Editor 2011. Tran, V.-‐T., J.-‐P. Benoît, and M.-‐C. Venier-‐Julienne, Why and how to prepare biodegradable, monodispersed, polymeric microparticles in the field of pharmacy? International Journal of Pharmaceutics, 2011. 407(1–2): p. 1-‐11. Van der Gucht, F. and I. De Ridder, Particle engineering with a lab scale spraydryer, D.N. Institute, Editor 2011. Jaworek, A. and A.T. Sobczyk, Electrospraying route to nanotechnology: An overview. Journal of Electrostatics, 2008. 66(3–4): p. 197-‐219. Loh, I.-‐H., Plasma Surface Modification In Biomedical Applications. AST Technical Journal, 2000: p. 6. Bazaka, K., et al., Plasma-‐assisted surface modification of organic biopolymers to prevent bacterial attachment. Acta Biomaterialia, 2011. 7(5): p. 2015-‐2028. Pouton, C.W. and L.W. Seymour, Key issues in non-‐viral gene delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 1998. 34(1): p. 3-‐19. Lee, H.B., J.H. Lee, and J.D. Andrade, Blood compatibility of polyethylene oxide surfaces. Progress in Polymer Science, 1995. 20(6): p. 1043-‐1079. Dubruel, P. and E. Schacht, Polymers for biomedical applications 2011. Luo, D. and W.M. Saltzman, Synthetic DNA delivery systems. Nat Biotechnol, 2000. 18(1): p. 33-‐7. Bijlage 5: English report 93 Development and Evaluation of Surface Modified Microparticles with DNA Interacting
Properties
B. Martensa*, A. Goesa, S. Van Vlierberghea, P. Dubruela
a
Department of Organic Chemistry - Polymer Chemistry and Biomaterials research Group,
Ghent University, Ghent B9000, Belgium
First cationic polymers with DNA complexing properties are designed
to come up with a non-viral vector for gene therapy. Starting from
poly(γ-benzyl-L-glutamate)
side
group
functionalities
like
hydroxyethyl, imidazole and guanidine are incorporated via a postpolymerization modification to come up with p(HEGx-co-GuAEGy-coImEGz). The formed polyelectrolytes are water-soluble and presumably
possess a low cytotoxicity and high transfection efficiency. Since the
vectors have a low Mw they proved to be more fitting to condensate
small ssDNA than larger dsDNA fragments. In the second part
biodegradable p(D,L-LA-co-ε-CL) microparticles with a controlled
size (1 to 5 µm) and spherical morphology are produced via
electrospraying and spraydrying techniques. Both techniques are
compared and optimized to achieve the desired particle diameters and a
narrow dispersity. Finally, a successful coating of the microparticles
was performed with the synthesized polycations via surface plasma
modification. This transfers the DNA interacting properties to the
beads. The modified microparticles can be used as substrate to cultivate
cells and allow for the ex vivo transfection of DNA.
*Corresponding author: [email protected]
Keywords: gene therapy, non-viral vectors, cationic polymers, polyplexes, microparticles, electrospraying, spraydrying
Introduction
Gene therapy is seen as the ultimate solution to cure diseases with a genetic component. In
contrast to traditional therapies, gene therapy focuses on the treatment of the underlying
genetic cause of the disease instead of the symptoms. Diseases like AIDS (1), cancer (2),
cystic fibrosis (3) and other genetic diseases (4) can be cured by the introduction of a
therapeutic gene. This gene replaces a defective or missing gene in the target cells and
substitutes its function. Although gene therapy is a very promising approach it is not
straightforward due to a series of defense systems inherent to the human body to protect itself
from foreign DNA. In the blood vessels nucleases are present to degrade foreign DNA and
cellular barriers prevent the introduction of DNA in cells. (5) To allow a therapeutic gene to
reach its target cell there is a need for a carrier or vector. This vector protects and transports
the DNA to the desired tissue, aids in penetrating the cell membrane and release into the
cytoplasm. (6) Viral vectors, derived from modified viruses reach the highest transfection
efficiencies but have some inherent limitations due to immunogenicity and limited size of the
therapeutic gene. (7) Designing non-viral vectors can solve these problems. Reaching high
transfection efficiencies can be done by mimicking mechanisms viruses use to penetrate cells.
(8)
Cationic polymers like pLL, pEI, pDMAEMA have been extensively investigated. (9) The
main drawback of these non-viral vectors is the lack of efficiency combined with a significant
cytotoxicity. In addition most of these vectors are not biodegradable which causes problems
after repeated administration due to accumulation in the body. The aim of this research project
is the synthesis of biodegradable poly-L-glutamic acid derivatives with a low cytotoxicity, an
improved transfection efficiency and excellent water solubility. Also DNA condensation to
protect the therapeutic DNA against degradation by nucleases and aid in the transport to
overcome different cellular barriers are mandated to come up with an effective vector. The
incorporation of imidazole, hydroxyethyl and guanidine functionalities in the side chains via a
post-polymerization modification provides the desired characteristics to obtain a suitable
vector. (10)
A second important feature is the controlled release of the DNA to assure a constant delivery
of the therapeutic gene. The use of surface modified microparticles with DNA complexing
abilities can help to assure a sustained transfection during a longer period. (11) Coated
microparticles can be employed as substrate to cultivate cells with ex vivo transfection of
therapeutic DNA. The size and surface topology of the microparticles play a crucial role in
this process. Polymeric particles with an average diameter smaller than 5 µm can be taken up
via fagocytosis (12) while endocytosis is limited to 500 nm and larger particles can only
transfect cells during mitosis. (11) Rough or porous particles with a good surface wettability
will show better adhesion of cells. In addition, the use of biodegradable microparticles is
beneficial to avoid an extra separation step after harvesting the transfected cells before the
tissue is implanted in the body. This also avoids accumulation of the microparticles in tissues
and reduces the chance for cytotoxic effects. (13)
Scheme 1: Synthesis route of poly(-L-glutamate) derivatives as non-viral vectors for gene
therapy. Cyclisation of γ-benzyl-L-glutamate to γ-benzyl-L-glutamate N-carboxy-anhydride
(BG-NCA), followed by the polymerization to poly(-γ-benzyl-L-glutamate) (pBG) and further
modification
by
aminolysis
and
amine
conversion
into
guanidines.
R group = Hydroxyl, Guanidine, Imidazole
Experimental: vector synthesis
Overall strategy. The synthesized non-viral vectors are derived from poly-γ-benzyl-Lglutamate (pBG) via a post-polymerization aminolysis (scheme 1). The starting product for
the synthesis is γ-benzyl-L-glutamate. This is changed in a suitable monomer by
transformation in a cyclic N-carboxyanhydride (NCA). The BG-NCA is polymerized in a
controlled way to pBG. This has to be further modified to obtain a polyelectrolyte with the
desired characteristics. Functionalization of the side chain via aminolysis and further amine
conversion into guanidines allows the incorporation of imidazole, hydroxyethyl and guanidine
moieties in the side chain. The presence of imidazole groups is responsible for an increased
transfection efficiency due to the improved proton sponge effect which facilitates the release
from the endosome after cellular uptake. (9, 14) The hydroxyethyl groups act as a spacer to
increase the water solubility, avoid non-specific adsorption of proteins and provide charge
separation. (15) The amine functionalities are positively charged at physiological pH and
complexate DNA strands via an electrostatic interaction with the negatively charged
phosphates in the backbone. (16, 17) So, the guanidine groups are responsible for DNA
complexation and also cause a reduction of the cytotoxicity due to a delocalization of the
positive charge.
Synthesis of γ-benzyl-L-glutamate-N-carboxyanhydride. The conversion of γ-benzylL-glutamate into its corresponding NCA with diphosgene is the most benign way to
polymerize the corresponding polyamide. For the cyclization, a solution of diphosgene (15
w/v%) in ethylacetate (EtOAc) is dropwise added in small portions (10 ml) to a suspension of
γ-benzyl-L-glutamate in dry EtOAc at 60°C. After 20 minutes of reaction, the formed
hydrochloric acid (HCl) is removed from the reaction mixture by flushing with argon. This
cycle is repeated until the suspension becomes transparent and all the γ-benzyl-L-glutamate is
converted. In the next step the reaction is further flushed (1h, Ar, 60°C), cooled and flushed
again (1h, Ar) before precipitation in cold pentane. The isolated precipitate is purified by
repeated recystallization in EtOAc. The purity of the final product is tested with a chloride
test to assure a chloride concentration below 0,02%.
Synthesis of poly(-γ-benzyl-L-glutamate). The controlled ring-opening polymerization
(ROP) of BG-NCA is initiated by nucleophilic attack of n-butylamine. The initiation with a
primary amine is only suitable for low Mw’s (<35 kDa) (18, 19). The polymerization is
carried out for 48h in CH2Cl2/EtOAc (6/1) at room temperature under inert atmosphere. The
chain growth is terminated by adding a 10-fold excess of triethylamine and acetic anhydride
(3h) prior to precipitation in diethylether/methanol (4/1). The obtained molecular weight is
determined by the ratio of monomer to initiator and can be determined by integration of the αhydrogen in the 1H-NMR spectrum.
Post-polymerization modification of poly(-γ-benzyl-L-glutamate). To introduce DNA
complexing and cell penetrating properties, a side chain modification with imidazole-,
guanidine- and hydroxylgroups by aminolysis and further guanidine conversion is performed.
The aminolysis of the ester functions is carried out at 50 °C in DMF with an excess of
reagentia (aminoethanol, histamine and tritylaminoethylamine) in presence of a 5-fold excess
of 2-hydroxypyrridine as bifunctional catalyst to increase the selectivity. (20) The final
composition of the derivatives is determined by the used excess, reaction time and reactivity
of the reagentia. A full conversion of all esters is ensured by adding an extra excess of
aminoethanol after 48h reaction. This product is precipitated in diethyl ether and purified by
dialysis. In the next step a guanidinylation of the primary amines is performed. This reaction
is carried out in a 16-fold excess of 3,5-dimethyl-1-guanylpyrazole for 24h in ultrapure water
at pH 9,5 and 6M of KI. After purification by dialysis (4 steps: ultra pure water, 0,1M NaCl,
0,05M HCl, ultra pure water), the final poly(hydroxyethyl-L-glutamine-co-guanidylethyl-Lglutamine-co-imidazolethyl-L-glutamine) derivates or p(HEGx-co-GuAEGy-co-ImEGz)
copolymers are obtained by lyophilization.
The composition and Mw of all synthesized polymers can be found in table I.
TABLE I. p(HEGx%-‐co-‐GuAEGy%-‐co-‐ImEGz%) copolymers Mn % HEG % GuAEG %ImEG 9600 60 30 10 17934 41 27 32 9600 53 16 31 5000 21 12 67 5000 22 19 59 18600 8 88 4 18600 15 78 7 18600 45 43 12 10600 22 60 18 5700 55 32 17 5900 66 14 20 5800 61 26 13 Results: physicochemical evaluation
Dynamic Light Scattering. DLS measurements can be used to determine whether the
synthesized vectors are able to condensate DNA. The particle size is evaluated at different
charge ratios (CR) of 1/1, 2/1 and 4/1. Almost all polymers were able to condensate large
DNA fragments (≤ 2000 bp) to polyplexes between 20 and 50 nm in diameter. However, only
partial condensation takes place. During the measurements also large particle distributions (>
200 nm) were observed. The presence of a bimodal distribution can be explained by
remaining partial complexed DNA which is seen as large spheres by the DLS instrument. (2123) The particle size seems independent of the amount of charges present on the vectors and
decreases with increasing CR. The minimal radius of the polyplexes is reached at the
condensation point. Adding extra polyelectrolyte doesn’t lead to stronger complexation but
slightly increases the particle size due to polymer association to the polyplex.
The most likely reason for the partial complexation may be due to the low molecular weight
of the vectors (5-10-20 kDa) in comparison to the large DNA fragments (± 1300 kDa). The
large difference in molecular weight results in a poor availability of the DNA fragments for
interaction with the cationic polymers. This incompatibility is addressed by using smaller
single stranded oligonucleotides (21-mer). In this case, very small particle diameters (<10 nm)
are observed what points to a strong complexation and a better complementary in Mw
between the vector and the DNA. Most vectors already show a fraction of tightly complexed
ssDNA at low CRs. Again, also large fragments (200 à 300 nm) compared to free ssDNA (70
nm) are detected. This points to a different interaction between the vectors and the ssDNA
and the formation of aggregated condensates. These results open possibilities to use the
vectors as antisense delivery systems.
Gel-electrophoresis. A second technique to determine at which CR and how strong the
formation of polyplexes takes place is agarose gel-electrophoresis (AGE). AGE shows a
reduction in the mobility of DNA on the gel after complexation. Stabilisation of DNA is
already sufficient to prevent migration even if the polyplex is not yet formed. Most vectors
only showed condensation at CR higher than 2/1.
The complexation of small oligonucleotides couldn’t be evaluated via AGE because the pores
of the gel are too large to obtain an effective separation. Therefore polyacrylamide gels
(PAGE) were used. The condensation strength was measured by a gradual reduction in
intensity with increasing CR because complexed DNA is unable to seep through the pores.
The results showed a clear trend of complex formation at lower CRs (1/1) with small ssDNA
fragments compared to large dsDNA. These results confirm previous conclusions out of the
DLS measurements.
Fluorescence tests. SYBRGold® Fluorescence was also used to evaluate the
DNA/vector interactions with different CRs. The amount of complexation is determined by
the reduction in fluorescence due to competitive binding of SYBRGold® and the vector to
DNA. Results clearly support previous conclusions. For large dsDNA fragments a slow
decrease in fluorescence is visible with increasing CR. Small ssDNA fragments show a
steeper decrease in fluorescence at low CRs (starting from 0,2/1) (figure 1). This indicates
once more that the low molecular weight vectors are more suitable to form complexes with
small oligonucleotides than larger fragments.
Figure 1: Condensation profiles of 2 synthesized vectors compared for small ssDNA and
large dsDNA fragments.
Discussion: p(HEGx-co-GuAEGy-co-ImEGz) vectors
The synthesis of low molecular weight vectors based on p(HEGx-co-GuAEGy-co-ImEGz)
proved to be difficult. This was mainly due to the limited stability and storage capacity of the
BG-NCA monomer. Further modification of pBG and purification by dialysis possibly caused
partial oxidation of amine side group functionalities. This explains the yellow color of some
derivatives. In the past, similar vectors with higher Mw’s were successfully synthesized what
might indicate that the stability of the biodegradable vectors is influenced by their molecular
weight. (10) Nevertheless, the majority of the synthesized vectors showed DNA complexing
properties. Fysicochemical evaluation of the vectors via DLS, fluorescence and gelelectrophoresis show no clear trend between the amount of charges and the DNA
complexation. However, the results pointed out that the low Mw vectors weren’t suited to
condensate large DNA fragments. This resulted in partial complexation and required large
amounts of polyelectrolyte. Experiments with small single stranded oligonucleotides already
showed formation of polyplexes at low CRs. This opens opportunities to use the p(HEGx-coGuAEGy-co-ImEGz) vectors as antisense delivery systems for small oligonucleotides.
Microparticles production
For the production of microparticles, biodegradable polyesters were chosen because they can
be broken down into non-toxic, low molecular products. (24) So problems due to
accumulation in the target cells are avoided. This allows to use the microparticles as substrate
for cells without the need to remove them afterwards. (25) A p(D,L-LA-co-ε-CL) copolymer
was used with a ratio PLA/PCL of 84:16. This copolymer was selected because its Tg (38 ±
2,4 °C) is situated above the lower limit for the spraydrying process (≈ 25 °C). The same
copolymer can be used to compare electrospraying and spraydrying.
The
produced
beads need to have a diameter below 10 µm to be taken up in the cells via fagocytosis while
they need to be large enough to carry a substantial amount of DNA. (26) In the scope of this
thesis particle diameters ranging from 1 to 5 µm were targeted.
Electrospraying. The electrospraying technique is based on the atomization of a liquid
in a strong electric field via a positively charged nozzle. (27) A 10 w/v% p(D,L-LA-co-ε-CL)
solution in CH2Cl2 with Mw 60 kDa proved ideal to obtain spherical microparticles. Lower
concentrations lead to uncontrolled morphologies and poor reproducibility because the
solvent is not evaporated when the particles hit the collection screen. There is also an upper
concentration limit caused by an increasing amount of chain entanglements which leads to
fiber formation. This indicates the transition of electrospraying to - spinning.
A parametric optimization was performed by varying the flow rate between 0,2 and 1 ml/h
and the applied voltage between 10 and 16 kV. The 3D surface plot (figure 2) clearly shows
that that particle diameter and standard deviation decrease with increasing voltage and
decreasing flow rate.
Figure 2: 3D plot of the parametric optimization with particles diameters (left) and standard
deviations (right) in function of the flow rate and applied voltage during electrospraying.
Spraydrying. The basis of the spraydrying process relies on the atomization and
instantly drying of a polymer solution in a hot air inlet through a small nozzle. The created
microparticles are collected in a cyclone. Spraydrying is a widely used manufacturing process
which uses the aerosol phase to dry the product into microparticles. (28)
The influence of parameters such as nozzle air and cooling air were investigated on the
obtained yield and particle diameter. (table II + figure 3) The results show a decrease in size
with increasing nozzle air and an optimal cooling air of 150 l/min. At higher nozzle airs (7
l/min) a limit was reached due to the loss of small particles. All tests were performed with a
nozzle diameter of 0,2 mm and particles were collected with a small size cyclone. Lower
polymer concentrations were used in contrast to electrospraying to avoid blocking of the
nozzle.
TABLE II. Overview of the parameters used for the optimization tests during spraydying.
test 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 w/v % 5 5 5 5 5 2 2 2 2 5 2 5 Mw 50 50 50 50 100 100 100 100 100 50 100 50 cooling air (L/min) 150 150 150 150 150 150 150 200 100 200 200 200 nozzle air (L/min) 7 3 1,5 4,4 3 6 2,8 2,8 2,8 5 2,8 4,5 µm / 2,45 3,40 2,86 3,06 2,20 2,20 3,28 2,83 2,37 3,09 2,18 stddev / 0,86 1,39 1,05 1,35 0,69 0,69 0,97 0,93 1,01 1,09 0,73 % efficiency 27 53 >100 / 8 79 43 60 42 8 23 32 Figure 3: Boxplot of the particle size for microparticels produced via spraydrying.
Comparison electrospraying vs spraydrying. Scanning electron microscopy (SEM)
images (figure 4) reveal that producing microparticles via electrospraying leads to the
formation of smooth surfaces, while spraydrying generates microparticles with a porous
surface. Both techniques give spherical microparticles with a certain Gaussian size
distribution depending on the parameter settings. Fine tuning of these parameters allowed the
production of microparticles with a diameter between 1 and 5 µm for both techniques. The
main difference between spraydrying and electrospraying is the scalability. Where
spraydrying can be used on large scale (from mg to kg of product), electrospraying is limited
to small scale applications due to low flow rates (< ml/h).
-‐ Rough microparticles
-‐ 5 w/v % in DCM
-‐ Spherical
-‐ Fast, large scale (ml/min)
Electrospraying
Spraydrying
-‐ Smooth microparticles
-‐ 10 w/v % in DCM
-‐ Spherical
-‐ Slow, small scale (ml/h)
Figure 4: SEM images for spraydrying (left) and electrospraying (right). Above each picture
the main differences of producing microparticles via spraydrying and electrospraying are
explained.
Surface modification. The produced p(D,L-LA-co-ε-CL) microparticles can be used as
non-viral gene delivery systems for ex vivo transfection of growing cells. The necessary
DNA-interacting properties are added to the particles via a surface plasma activation in a
nitrogen plasma during 5 minutes and subsequent coating by incubation in a p(HEGx%-coGuAEGy%-co-ImEGz%) solution (10 mg/ml) during one hour. This causes a covalent
immobilization of the vectors on the surface of the beads. In addition, the surface becomes
less hydrophobic which might result in an improved cell adhesion. (29)
The surface modification was evaluated on spincoated samples via atomic force microscopy
(AFM) and surface contact angle (SCA) measurements. Results from both techniques indicate
that the beads are successfully coated with the vectors. (figure 5) SEM images proved that the
beads showed no aggregation after incubation. More tests are mandatory to give exclusion
about the successful coating of the beads.
Figure 5: AFM images of the p(D,L-LA-co-ε-CL) surface after spincoating (SCA 77,4°, left),
after plasma activation (SCA 14,3°, middle) and after surface modification (SCA 30,5°,
right).
Conclusions
The derivatization of poly-γ-benzyl-L-glutamate via an intelligent design proved to be
possible, but also gave some difficulties due to the limited stability of the low Mw vectors.
The incorporation of specific functionalities like hydroxyl-, imidazole- and guanidine groups
in the side chain lead to an improved water solubility, low cytotoxicity and DNA complexing
properties. Fysicochemical evaluation via DLS, fluorescence and gel-electrophoresis revealed
that the vectors weren’t suitable to form polyplexes with large DNA fragments. On the
contrary, small single stranded oligonucleotides showed a good DNA complexation at low
concentrations of polyelectrolyte. This opens opportunities to use the p(HEGx-co-GuAEGyco-ImEGz) vectors as antisense delivery systems for small oligonucleotides.
Processing p(D,L-LA-co-ε-CL) via spraydrying and electrospraying showed that both
techniques were suitable for the production of microparticles with a controlled size and
morphology. Optimization of the parameters resulted in beads with a particle diameter
between 1 and 5 µm and a small size distribution. The main difference between both
techniques is the scalability. Spraydrying gives large yields at flow rates of several ml/min,
while electrospraying uses flow rates below 1 ml/h. Both techniques also result in a difference
in surface roughness of the produced microparticles. Electrospraying leads to the formation of
smooth surfaces, while spraydrying generates microparticles with a porous surface.
The surface modification of the microparticles with p(HEGx-co-GuAEGy-co-ImEGz) via
plasma modification was very promising. Preliminary tests (AFM, SCA) on spincoated
samples indicated that the beads were successfully coated with the synthesized cationic
polymers. This allows the use of the surface modified beads as non-viral gene delivery
systems. DNA loaded beads can be used as a substrate to cultivate and ex vivo transfect cells
or tissue.
Acknowledgments
The author thanks Filip Van der Gucht and Ben De Schepper for their cooperation with the
spraydrying technique at Xedef. Ana Dos Santos for her advice with electrospraying. Thomas
Billiet for providing suitable copolymers for the microparticle production. Veerle Boterberg
for GPC measurements of the synthesized polymers. Prof. Annemieke Madder, Lieselot
Carrette and Ellen Gyssels for their help with the oligonucleotides.
References
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
R. Wolkowicz and G. P. Nolan, Gene Ther, 2005, 12, 467-476.
S. Goverdhana, M. Puntel, et al., Mol Ther, 2005, 12, 189-211.
U. Griesenbach and A. C. Boyd, Journal of Cystic Fibrosis, 2005, 4, 89-100.
D. T. Curiel, J. M. Pilewski, et al., American journal of respiratory cell and molecular
biology, 1996, 14, 1-18.
C. W. Pouton and L. W. Seymour, Advanced Drug Delivery Reviews, 1998, 34, 3-19.
D. Luo and W. M. Saltzman, Nature biotechnology, 2000, 18, 33-37.
V. F. I. Van Tendeloo, C. Van Broeckhoven, et al., Leukemia, 2001, 15, 523-544.
S. Y. Wong, J. M. Pelet, et al., Progress in Polymer Science, 2007, 32, 799-837.
J. H. Jeong, S. W. Kim, et al., Progress in Polymer Science, 2007, 32, 1239-1274.
A. Goes, UGent, 2010.
K. Yin Win and S.-S. Feng, Biomaterials, 2005, 26, 2713-2722.
J. A. Champion, A. Walker, et al., Pharm Res, 2008, 25, 1815-1821.
D. R. Chen, J. Z. Bei, et al., Polymer Degradation and Stability, 2000, 67, 455-459.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
T. Merdan, J. Kopec̆ek, et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54, 715-758.
H. B. Lee, J. H. Lee, et al., Progress in Polymer Science, 1995, 20, 1043-1079.
J. B. Rothbard, T. C. Jessop, et al., Adv Drug Deliv Rev, 2005, 57, 495-504.
Y. Lee, M. Y. Cho, et al., Bull. Korean Chem. Soc., 2008, 29, 666-668.
L. v. Kralingen, Stellenbosch University, 2008.
T. J. Deming, Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 2000, 38, 30113018.
A. De Marre, H. Soyez, et al., Polymer, 1994, 35, 2443-2446.
R. W. Wilson, D. C. Rau, et al., Biophysical journal, 1980, 30, 317-325.
V. A. Bloomfield, R. W. Wilson, et al., Biophysical Chemistry, 1980, 11, 339-343.
V. A. Bloomfield, S. He, et al., Biochemical Society transactions, 1991, 19, 496.
L. Averous, Biodegradable polyesters, http://www.biodeg.net/bioplastic.html.
V.-T. Tran, J.-P. Benoît, et al., International Journal of Pharmaceutics, 2011, 407, 1-11.
K. T. Nguyen, K. P. Shukla, et al., Journal of biomedical materials research. Part A,
2009, 88, 1022-1030.
N. Bock, M. A. Woodruff, et al., Polymers, 2011, 3, 131-149149.
F. Van der Gucht and I. De Ridder, ed. D. N. Institute, 2011.
T. Desmet, T. Billiet, et al., Macromol. Biosci., 2010, 10, 1484-1494.

Ontwikkeling en evaluatie van oppervlakte gemodificeerde

Related documents

Products

Support

Ontwikkeling en evaluatie van oppervlakte gemodificeerde

Related documents

Add this document to collection(s)

Add this document to saved

Suggest us how to improve StudyLib