Toepassing van Next Generation Sequencing (NGS) in de routine

Toepassing van Next Generation Sequencing
(NGS) in de routine Pathologie diagnostiek
Winand N.M. Dinjens
Laboratorium voor Moleculaire Diagnostiek
Afdeling Pathologie
Erasmus MC Kanker Instituut, Rotterdam
[email protected]
Voordracht NVvO Basiscursus Oncologie
Ellecom, 2 maart 2015
Belangen Disclosure
(potentiële) belangenverstrengeling: Lid adviesraad GI Cancer Amgen B.V.
Moleculaire biologie dogma
GEN
(DNA)

mRNA

Eiwit
DNA in de Cel
Chromosoom
Celkern
Dubbelstrengs
DNA molecuul
A
T
C
G
Individuele nucleotiden
In elke celkern is tweemaal het volledige DNA aanwezig
2 x 6 x 109 DNA bouwstenen = 12 miljard basen (A, T, C, G)
3 x 106 dubbelzijdige A4 (pts 12) = 150 meter
Kankerbiologie dogma
Kanker is een ziekte van het DNA
Oorzaak:
Afwijkingen (mutaties) in het DNA die leiden
tot afwijkingen (activatie, overexpressie,
inactivatie, afwezigheid) in eiwitten
gemuteerd
gen (DNA)
*
*

gemuteerd
mRNA

gemuteerd
*
Eiwit
Bepaling van DNA afwijkingen heeft klinische toepassingen:
*
Maligniteit ja/nee:
lymfomen
*
Primaire/metastase:
multipele tumoren
*
Tumortype:
lymfomen, sarcomen
*
Welke behandeling:
“targeted therapy”
tumoren long, borst,
dikke darm, melanoom
GIST, etc
*
weefselidentificatie, virus, bacterie
Het is dus van belang de DNA bouwsteen (base) volgorde
(sequentie) te bepalen van specifieke delen (targeted)
van het DNA om afwijkingen te detecteren:
DNA sequencing
--GTG GGC GCC GGC GGT GTG GGC--
-- Val
Gly Ala
Gly Gly Val
Gly--
--GTG GGC GCC GTC GGT GTG GGC--- Val
Gly Ala Val
Gly Val
Gly--
Bepaling volgorde DNA bouwstenen
PCR apparaat
Weefselfragmenten

DNA isolatie

DNA vermenigvuldiging
(1 cel  2 kopieën  34 miljard)

DNA volgorde bepalen
DNA analyzer
ABI 3730
Analyseren van DNA:
Conventionele (Sanger) sequencing:
Per sequentie reactie kan slechts één PCR product
geanalyseerd worden: arbeidsintensief
Sequentie wordt bepaald van een mix van moleculen
(van één PCR product): geringe gevoeligheid
Normale cel DNA
Tumor cel DNA
DNA

isolatie
 amplificatie (PCR)
DNA
tumorcellen : normale cellen = 1 : 1
Mutant DNA 2x (25%)
Wildtype DNA 6x (75%)

Van mix (MUT / WT) van moleculen
wordt sequentie bepaald
Capillaire electroforese
ABI:
* Scheiding grootte
* Label terminale ddNTP
* Detectie laser
GCTGGTGG
GCTGGTGG
GCTGGTGG
GCTGGTGA
Detectie 3xG, 1xA
100 cellen
=
200 allelen
100 WT
100 MUT
1:1
125 WT
75 MUT
1,6:1
150 WT
50 MUT
3:1
175 WT
25 MUT
7:1
187,5 WT
12,5 MUT
15:1
Conventionele Sequencing (CS)
versus
Next Generation Sequencing (NGS)
CS
mix van moleculen
NGS
“single molecule”
NGS: Single Molecule
“Massive Parallel”
Conventionele sequencing:
50% neoplastische cellen
25% mutant DNA
Next Generation Sequencing (NGS):
Clonering PCR product
Sequencing gecloneerde moleculen
NEXT GENERATION SEQUENCING
ION TORRENT Personal Genome Machine
(PGM)
Normale cel DNA
Tumor cel DNA
DNA

isolatie
 amplificatie (PCR)
DNA
tumorcellen : normale cellen = 1 : 1
Mutant DNA 2x (25%)
Wildtype DNA 6x (75%)

Single molecule clonering
en sequencing
Letterlijk één molecuul per agarose bead
Letterlijk één
agarose bead
per micel
Emulsie
PCR
(clonering)
Emulsie
PCR
(clonering)
Chip sequencing
Letterlijk één agarose bead per well
Per well wordt DNA sequentie bepaald
60 wells wildtype signaal
20 wells mutatie
PGM chip
PGM chip
Bij koppeling van nucleotide komt proton (H+ ion) vrij: pH verandering in well
NGS
ANALYSE
EGFR
Tumor: 70%
p.T790M
Resistentie
mutatie 7%
3 verschillende chips mogelijk
314: 1 miljoen wells: 50 Mb output
316: 6 miljoen wells: 500 Mb output
318: 11 miljoen wells: 1Gb output
Welk type gebruikt wordt hangt af van:
gewenste coverage
aantal amplicons
aantal patiënten
Cancer hotspot panel V2: 207 primer paren, amplicon grootte 111-187 bp
Sample 1
Sample 2
Sample 3
Sample 4
Amplicon 1
Amplicon 2
Amplicon 3
Amplicon 4
Conventionele Sequencing (CS)
versus
Next Generation Sequencing (NGS)
CS
NGS
mix van moleculen
“single molecule”
1 fragment / analyse
honderden fragmenten / analyse
output 104 basen
output 50 – 1000 x 106 basen
veel DNA nodig (>50 ng)
weinig DNA nodig (<10 ng)
geringe gevoeligheid (>50%)
hoge gevoeligheid (>10%)
1 sample
poolen van samples
bio-informatica ondersteuning
Diagnostiek casus: vrouw 78 jaar:
Endometrioid endometrium carcinoom van de
uterus (T1)
Adenocarcinoom in het rechter ovarium (T2)
Vraag:
twee onafhankelijke primaire tumoren
of gemetastaseerde ziekte?
NGS analyse: Ion Torrent PGM.
DNA isolatie van tumor en normaal weefsel:
*
Routine formaline gefixeerd en paraffine ingesloten
(FFPE) weefsel
*
Manuele microdissectie van tumor en normaal
weefsel van FFPE coupes
cytology preps, gekleurd of ongekleurd
routine H&E gekleurde coupes
routine IHC gekleurde coupes
DNA isolatie uit routine verkregen preparaten
 Paraffine blokje
Immuno gekleurde coupe
 Paraffine coupe
(gekleurd) cytologiepreparaat)
 H&E gekleurde coupe
Hoog % tumorcellen voor DNA isolatie:
manuele of laser capture microdissectie
T1 Endometrium: 80%T
H&E voor dissectie
H&E
Na dissectie
T2 Ovarium: 80%T
H&E voor dissectie
H&E
na dissectie
DNA isolatie:
weefselfragmenten in Tris/HCl, pH 8.0 + Prot K + Chelex 100 resin
(met of zonder deparaffinering)

O.N. 560C

10 min 950C en centrifugatie

Gebruik supernatant voor kort-amplicon PCR
NEXT GENERATION SEQUENCING
ION TORRENT Personal Genome Machine
(PGM)
Cancer hotspot panel V2: 207 primer paren, amplicon grootte 111-187 bp
T1: Endometrium
Ref_Cov
Var_Cov
Coverage
1691
792
2483
Ref_Freq
Var_Freq
68.10%
31.90%
T2: Ovarium
Ref_Cov
Var_Cov
Coverage
1174
1031
2205
Ref_Freq
Var_Freq
53.24%
46.76%
KRAS p.G13D
KRAS p.G13D
T1: Endometrium
Ref_Cov
Var_Cov
Coverage
1035
2186
3222
Ref_Freq
Var_Freq
32.15%
67.85%
T2: Ovarium
Ref_Cov
Var_Cov
Coverage
206
1827
2034
Ref_Freq
Var_Freq
10.18%
89.82%
PTEN p.R130G
PTEN p.R130G
T1: Uterus
CDH1 p.V365I
Ref_Cov
Var_Cov
Coverage
1680
781
2461
Ref_Freq
Var_Freq
68.26%
31.74%
T2: Ovarium
Ref_Cov
Var_Cov
Coverage
985
723
1708
Ref_Freq
Var_Freq
57.67%
42.33%
CDH1 p.V365I
Resultaten
Identieke moleculaire afwijkingen in
endometrium en ovarium tumor:
KRAS
PTEN:
CDH1:
FBXW7:
c.G38A:p.G13D
c.C388G:p.R103G
c.G1093A:p.V365I
c.G1436T:p.R479L
Resultaat
Beide tumoren hebben meerdere identieke
moleculaire afwijkingen
Conclusie:
Endometrioid endometrium tumor
en ovarium tumor zeer
waarschijnlijk één entiteit:
primaire tumor en metasase
Conclusies:
 Detectie van moleculaire afwijkingen in tumoren
is mogelijk in routine pathologie preparaten
(FFPE, gekleurde coupes, cytologie, etc)
 Resultaten leveren waardevolle informatie op
betreffende de relatie tussen meerdere tumoren
bij één patiënt
 Resultaten bepalen (mede) de klinische
behandeling
Dank voor uw aandacht