University of Groningen Cell entry mechanisms of dengue virus

University of Groningen
Cell entry mechanisms of dengue virus
Schaar, Hilde Margot van der
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2009
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Schaar, H. M. V. D. (2009). Cell entry mechanisms of dengue virus s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
Nederlandse samenvatting
Chapter 7
Inleiding
Het dengue virus (DENV) is de laatste decennia sterk in opmars. Tegenwoordig
vinden er wereldwijd naar schatting 50 tot 100 miljoen infecties per jaar plaats,
waarvan ongeveer 500.000 resulteren in ziekenhuisopname en 20.000 een
fataal beloop kennen. Het virus wordt overgedragen door de Aedes Aegypti
mug, ook wel tijgermug genoemd, die in bijna alle (sub)tropische delen van
de wereld voorkomt. Ongeveer 2,5 miljard mensen wonen in deze regio’s en
lopen daardoor het risico om geïnfecteerd te worden. Ondanks de grote impact
die dengue wereldwijd heeft, zijn er nog geen antivirale middelen of vaccins
beschikbaar om DENV infecties te bestrijden of te voorkomen.
Er circuleren vier serotypen van DENV. Elk serotype kan bij mensen
dengue koorts veroorzaken, waarvan de symptomen te vergelijken zijn met een
ernstige griep. Dengue koorts is ook bekend onder de naam knokkelkoorts,
omdat er tevens pijn in de gewrichten kan optrreden. Infectie met een van
Figuur 1. Levenscyclus van het dengue virus. Zie tekst voor details.
142
Nederlandse samenvatting
de serotypen biedt levenslange bescherming tegen herinfectie met hetzelfde
serotype. Opmerkelijk is dat in het geval van een heterotypische herinfectie,
dat wil zeggen herinfectie met een ander serotype, de patiënt zeer ernstige, soms
zelfs levensbedreigende dengue hemorragische koorts kan ontwikkelen. Dit
ernstige ziektebeeld wordt gekarakteriseerd door hevige, inwendige bloedingen,
die een dusdanige omvang kunnen hebben dat de patiënt in shock raakt
(dengue shock syndroom). Het is opvallend dat babies, waarvan de moeder een
of meerdere dengue episodes heeft gehad, het risico lopen om tijdens een eerste
DENV infectie dengue hemorragische koorts te ontwikkelen. Deze obvervaties
hebben geleid tot de algemeen geaccepteerde hypothese dat antilichamen het
ziektebeeld kunnen versterken, maar de achterliggende mechanismen zijn niet
geheel bekend.
DENV behoort samen met andere ziekteverwekkers zoals het gele koorts
virus en het West-Nijl virus tot de familie van de Flaviviridae, vernoemd naar
het gele koorts virus omdat flavus Latijn is voor geel. Mature flavivirussen
zijn sferische deeltjes met een diameter van 0,05 µm. In de kern bevindt
zich het nucleocapside, dat is opgebouwd uit een veelvoud aan C (capside)
eiwitten die het virale genoom, een enkelstrengs RNA molecuul, inpakken.
Het nucleocapside wordt omgeven door een membraan van lipidemoleculen,
waarin 180 kopieën van een tweetal zogenoemde spike eiwitten verankerd
zitten, te weten E (envelop) en M (membraan). Het grootste eiwit is het E
eiwit, dat verschillende belangrijke stappen tijdens het infectieproces medieert.
Het M eiwit is een proteolytisch fragment van het precursor eiwit prM. In een
geïnfecteerde cel zijn de nieuwe virusdeeltjes die worden gevormd in eerste
instantie immatuur. Immature virusdeeltjes dragen het precursor eiwit prM, dat
over het E eiwit heen ligt. Vlak voordat de virusdeeltjes worden uitgescheiden
door de cel, wordt het prM eiwit geknipt door het enzym furine tot het M
eiwit, waardoor de virusdeeltjes matuur en infectieus worden, zie Figuur 1. In
mature deeltjes ligt het kleine M eiwit verscholen onder het E eiwit, waardoor
het E eiwit in staat is om infectie van de volgende gastheercel te realiseren.
Het onderzoek beschreven in dit proefschrift was gericht op het ophelderen
van de mechanismen die DENV gebruikt om zijn gastheercel binnen te gaan
en te infecteren. Met dit doel is het exacte opnameproces van DENV in de cel
in kaart gebracht. Daarnaast is vastgesteld hoe antilichamen het opnameproces
van immature virusdeeltjes beïnvloeden. Deze verbeterde inzichten in het
infectieproces van DENV zouden uiteindelijk bij kunnen dragen aan de
ontwikkeling van vaccins en antivirale middelen.
143
Chapter 7
Opnameproces van dengue virusdeeltjes in cellen
Flavivirussen infecteren hun gastheercellen via receptor-gemedieerde endocytose (zie Figuur 1). In de eerste stap van dit opnameproces bindt het virusdeeltje
via zijn E eiwitten aan een receptor op het celoppervlak. Vervolgens wordt
het virusdeeltje geïnternaliseerd door de cel en komt terecht in een blaasje
genaamd endosoom. Het zure milieu in het endosoom brengt conformationele
veranderingen in de E eiwitten teweeg, die leiden tot versmelting van het virale
membraan met het endosomale membraan. Door deze membraanfusie komt
het nucleocapside van het virus vrij in het cytoplasma van de cel.
Een eerste hint over de efficiëntie van het opnameproces wordt gereflecteerd
door de ratio tussen infectieuze virusdeeltjes en fysieke virusdeeltjes. In
Hoofdstuk 3 is vastgesteld dat deze ratio voor DENV type 2 stam PR159
S1 ongeveer 1000 tot 10,000 is, wat wil zeggen dat maar 1 op de 1000 tot
10,000 DENV deeltjes infectieus zou zijn. Deze ogenschijnlijk lage infectiviteit
kan worden veroorzaakt door het feit dat een of meerdere stappen tijdens
het opnameproces niet efficiënt verlopen. Voor het ontrafelen van dit proces
is gebruik gemaakt van een techniek, gebaseerd op real-time fluorescentie
microscopie, waarmee individuele DENV deeltjes ‘live’ gevolgd kunnen
worden tijdens het infectieproces. Hiervoor worden de virusdeeltjes gemerkt
met de fluorescerende stof DiD, die wordt ingebouwd in het virale membraan.
Tijdens membraanfusie verdunnen de DiD moleculen zich vanuit het virale
membraan in het endosomale membraan uit, wat kan worden waargenomen als
een toename in de fluorescentie intensiteit van DiD. Met deze techniek kan dus
niet alleen de opnameroute van het virusdeeltje in de cel worden vastgesteld,
maar tevens de plaats en het tijdstip van membraanfusie.
Als eerste zijn de bindingseigenschappen van DENV aan de cel bepaald.
De binding van DENV aan het celoppervlak blijkt niet erg efficiënt te zijn.
Ongebonden virusdeeltjes blijken in een nieuwe ronde normaal aan cellen
te kunnen binden, wat aantoont dat de lage bindingsefficiëntie niet wordt
veroorzaakt door een defect in het virus. De virusdeeltjes die aan de cel binden
en worden opgenomen, bewegen zich op twee verschillende wijzen voort in de
cel. Ongeveer een derde van de deeltjes blijft relatief stil zitten in de periferie
van de cel, terwijl de rest zich met hoge snelheid over microtubili verplaatst naar
de perinucleaire regio van de cel. Membraanfusie treedt vervolgens gemiddeld
12 minuten na binding van het virus aan het celoppervlak op. Van alle deeltjes
die aan het celoppervlak zijn gebonden, fuseert een substantiële hoeveelheid
(~20%), wat suggereert dat voornamelijk de inefficiënte binding de oorzaak is
van de ogenschijnlijk lage infectiviteit van DENV.
144
Nederlandse samenvatting
Er zijn verschillende internalisatieroutes in de cel waardoor virusdeeltjes in
endosomen terecht kunnen komen; deze worden beschreven in Hoofdstuk 2.
In Hoofdstuk 4 is de exacte opnameroute van DENV in de cel opgehelderd.
Hiervoor zijn DiD-gelabelde DENV deeltjes in levende cellen gevolgd, waarin
verschillende compartimenten zijn verlicht met behulp van fluorescerende
merker-eiwitten. Onze resultaten laten zien dat DENV na landing op het
celoppervlak door middel van diffusie migreert naar een pre-existerende
‘clathrin-coated pit’, een instulping in het plasmamembraan die aan de cytoplasmatische kant clathrine moleculen bevat. Nadat het virusdeeltje gevangen is in
de pit, wordt een langzame toename van het aantal clathrine moleculen rond
het virusdeeltje waargenomen. Dit impliceert dat de pit groeit en daardoor
het virusdeeltje insluit. Na insluiting van het virusdeeltje snoert de pit zich af
van het plasmamembraan, waardoor een intracellullair ‘clathrin-coated vesicle’
wordt gevormd, dat vervolgens zijn clathrine moleculen weer verliest.
Na clathrine-gemedieerde opname, wordt het DENV deeltje afgeleverd aan
een vroeg endosoom, dat het merker-eiwit Rab5 bevat. Het vroege endosoom,
dat het virusdeeltje omsluit, matureert vervolgens tot een laat endosoom. Deze
maturatie begint met de accumulatie van het merker-eiwit Rab7 op het vroege
endosoom, dat veelal geleidelijk gebeurt en soms door het samengaan van het
vroege endosoom met een al bestaand laat endosoom. Het maturatieproces
wordt voltooid wanneer het intermediaire endosoom, dat zowel Rab5 als Rab7
bevat, zijn Rab5 eiwitten verliest. De afgifte van Rab5 vindt voornamelijk
geleidelijk plaats, maar af en toe doordat het intermediaire endosoom splitst
in een vroeg en een laat endosoom. Membraanfusie vindt uiteindelijk meestal
plaats in late endosomen. Bovendien blijkt functioneel Rab7 vereist te zijn voor
DENV infectie van cellen. Samengevat heeft deze studie aangetoond dat DENV
zijn gastheercel exclusief binnentreedt via clathrine-gemedieerde endocytose
en fuseert vanuit late endosomen, waarbij tevens de exacte mechanismen en
kinetiek in dit opnameproces zijn opgehelderd.
Antilichaam-gemedieerde opname van immature deeltjes
De ontwikkeling van dengue hemorragische koorts en dengue shock syndroom
lijkt sterk geassocieerd te zijn met heterotypische herinfecties en kan worden
uitgelegd door de hypothese genaamd ‘antibody-dependent enhancement’
(ADE) van infectie. Deze hypothese is mede tot stand gekomen door de
observatie dat babies, waarvan de moeder dengue-immuun is, het risico
lopen om tijdens een eerste DENV infectie dengue hemorragische koorts te
145
Chapter 7
ontwikkelen. De verhoogde kans op het ernstige ziektebeeld in deze babies
lijkt te worden veroorzaakt door de aanwezigheid van maternale dengueantilichamen. De algemene gedachte is dat de pre-existerende antilichamen de
virusdeeltjes naar de cellen van het immuunsysteem sturen en efficiënte opname
van het virus via de Fc receptoren mediëren. Deze Fc receptor-dragende cellen
zijn de natuurlijke gastheercellen van DENV. Het virus zou vervolgens infectie
kunnen bewerkstelligen doordat antilichamen met een lage affiniteit in de zure
endosomen het virusdeeltje loslaten, waardoor het virus fusie-actief wordt. Een
andere mogelijkheid is dat tijdens ADE, dat over het algemeen plaatsvindt
bij subneutraliserende antilichaamconcentraties, niet alle E eiwitten van het
virusdeeltje bezet worden door antilichamen, waardoor de vrije E eiwitten de
conformationele veranderingen voor membraanfusie kunnen ondergaan.
Tot nu toe zijn voornamelijk antilichamen gericht tegen het E eiwit
uitvoerig bestudeerd in ADE studies, terwijl antilichamen tegen het prM eiwit
enigszins onderbelicht zijn gebleven. Antilichamen tegen prM worden echter
vaak aangetroffen in sera van patiënten. Dit komt overeen met de observatie
dat cellen geïnfecteerd met DENV in vitro een groot aantal (~30%) immature
deeltjes produceren. Bovendien blijken de concentraties van antilichamen tegen
prM sterk te zijn verhoogd in patiënten met dengue hemorragische koorts. Dit
gegeven impliceert dat immature DENV deeltjes, ondanks dat ze op zichzelf niet
infectieus zijn, wellicht een rol zouden kunnen spelen in dengue pathogenese.
In Hoofdstuk 5 wordt de infectiviteit van immature DENV deeltjes
bestudeerd in aanwezigheid van het antilichaam mAb 70-21, dat gericht is tegen
prM. Op zichzelf zijn immature deeltjes niet infectieus, omdat de prM eiwitten
de E eiwitten bedekken en zo membraanfusie belemmeren. Uit onze resultaten
blijkt dat immature deeltjes zeer infectieus zijn in Fc receptor-dragende cellen,
wanneer ze geopsoniseerd zijn met mAb 70-21. Na toevoeging van mAb 7021 is de infectiviteit van de immature deeltjes zelfs bijna net zo hoog als die
van wild-type DENV. Deze ADE van infectie vindt plaats bij uiteenlopende
antilichaamconcentraties, zelfs wanneer er een overvloed aan antilichamen is.
Het lijkt er dus op dat immature deeltjes niet kunnen worden geneutraliseerd
door antilichamen gericht tegen prM, ook al zijn de virusdeeltjes volledig
bedekt met antilichamen.
Om te achterhalen hoe de anti-prM antilichamen ervoor zorgen dat
immature virusdeeltjes infectie kunnen bewerkstelligen, zijn de verschillende
stappen van het opnameproces bestudeerd. Na opsonisatie met mAb 70-21
is de binding van de immature deeltjes aan Fc receptor-dragende cellen 30
maal hoger dan wanneer er geen antilichamen aanwezig zijn, waarschijnlijk
146
Nederlandse samenvatting
doordat de geopsoniseerde virusdeeltjes nu een interactie aangaan met de Fc
receptoren. Wanneer de Fc receptoren geblokkeerd worden met een anti-CD32
antilichaam, vindt er inderdaad geen ADE van infectie plaats. Dit resultaat
toont aan dat de geopsoniseerde virusdeeltjes de cel binnengaan via Fc receptorgemedieerde fagocytose. Vervolgens is de rol van het enzym furine tijdens het
infectieproces bestudeerd. In cellen waarin de activiteit van furine wordt geremd
met een furine-blokker, kunnen geopsoniseerde immature virusdeeltjes geen
infectie veroorzaken. Deze observatie geeft aan dat maturatie van virusdeeltjes
een verplichte stap is in het infectieproces. Samenvattend toont deze studie aan
dat immature virusdeeltjes zeer infectieus zijn in aanwezigheid van anti-prM
antilichamen en daardoor wellicht een belangrijke rol zouden kunnen spelen in
de pathogenese van dengue hemorragische koorts.
Slotopmerkingen
In dit proefschrift zijn de mechanismen opgehelderd die DENV gebruikt om
zijn gastheercel binnen te gaan en te infecteren. DENV bewerkstelligt infectie
van een cel middels clathrine-gemedieerde endocytose en fusie vanuit late
endosomen. Vervolgstudies zullen moeten uitwijzen welke route DENV, dat
geopsoniseerd is met antilichamen, gebruikt in humane gastheercellen. Tezamen
zouden deze gegevens potentiële targets voor antivirale middelen aan het licht
kunnen brengen, die een cruciale rol spelen in zowel receptor-gemedieerde
endocytose als antilichaam-gemedieerde opname van DENV.
Daarnaast schetst dit proefschrift een nieuw perspectief op de pathogenese
van dengue hemorragische koorts. In aanwezigheid van anti-prM antilichamen
blijken immature DENV deeltjes zeer infectieus te zijn. De antilichamen
faciliteren Fc receptor-gemedieerde fagocytose van de immature deeltjes,
waarna deze een maturatieproces met behulp van furine ondergaan om
vervolgens de cel te infecteren. Dit gegeven zou wellicht belangrijke implicaties
voor vaccinontwikkeling kunnen hebben. Inductie van antilichaamresponsen
tegen het prM eiwit leidt tot activatie van de infectieuze eigenschappen van
de substantiële populatie van immature deeltjes. Een vaccin dat antilichamen
tegen prM opwekt, bijvoorbeeld door aanwezigheid van immature deeltjes
in het vaccin, zou daardoor mogelijk kunnen bijdragen aan het ontstaan van
dengue hemorragische koorts. Verder onderzoek zal moeten uitwijzen wat de
precieze relatie is tussen de aanwezigheid van antilichamen gericht tegen prM
en bescherming tegen ziekte, hetgeen essentieel is voor de ontwikkeling van een
veilig dengue vaccin.
147