Application Note 5

Application Note 5
Gebruik van gecertificeerde referentiematerialen voor de kwantificering van
GGO's via de DNA-getalsverhouding
Deze application note bevat een leidraad voor een correct gebruik van
Europese referentiematerialen met een gecertificeerde fractie GG-DNA
(GG = genetisch gemodificeerd) voor een bepaalde modificatie.
Onderstaande details hebben vooral betrekking op het gebruik van de
CRM's ERM-BF413d en ERM-AD413 en de CRM's met een
gecertificeerde getalsverhouding waar nog aan wordt gewerkt.
November 2007
Auteur: Philippe Corbisier
Europese Commissie - Gemeenschappelijk
Centrum voor Onderzoek
Instituut voor Referentiematerialen en Metingen
(IRMM)
Retieseweg 111, 2440 Geel, België
Email: [email protected]
www.erm-crm.org
INLEIDING
Het IRMM van het GCO heeft onlangs twee nieuwe
types gecertificeerde referentiematerialen (CRM's) voor
GGO's ontwikkeld, die een correcte toepassing van
Aanbeveling 2004/787/EG [1] via een metrologisch
traceerbaar systeem mogelijk maken. Deze application
note bevat instructies voor de toepassing van de
nieuwe CRM's.
KARAKTERISTIEKEN VAN DE NIEUWE GGOCRM'S
A. Nieuwe matrix-CRM's voor GGO's
De gecertificeerde waarde is gebaseerd op twee
verschillende meeteenheden. Naast een gecertificeerde
waarde voor de massafractie van een specifieke
genetische modificatie (zie application note 4) is het
nieuwe
CRM
gecertificeerd
voor
de
DNAgetalsverhouding. Deze parameter, uitgedrukt in %,
wordt als volgt berekend:
Aantal GG-DNA [cp]
DNA-getalsverhouding [%] =
x 100
Aantal doeltaxon-specifiek
DNA [cp]
De certificering is gebaseerd op metingen via QRTPCR (kwantitatieve real-time PCR). Deze metingen
worden gekalibreerd met behulp van een specifieke
plasmide-DNA-kalibrant waarvan is gecertificeerd dat
deze één kopie van zowel het GG-DNA als het
doeltaxon-specifieke DNA per plasmide bevat (zie deel
B).
Daarom wordt de DNA-getalsverhouding van GG-maïs
direct gekoppeld aan de geanalyseerde modificatie.
Bovendien mag het CRM ERM-BF413d (in onderstaand
voorbeeld) alleen samen met de plasmide-kalibrant
ERM-AD413
en
de
modificatie-specifieke
detectiemethode voor MON 810 worden gebruikt [2].
De gecertificeerde DNA-getalsverhouding voor MON
810 (0,57%) verschilt van de gecertificeerde
massafractie (10,0 g/kg of 1,0%), aangezien de
gecertificeerde getalsverhouding voor MON 810
rekening houdt met de zygositeit, ploïdie en
endoreduplicatie status van de zaden die voor de
productie van dit materiaal zijn gebruikt.
De matrix-CRM is bedoeld voor kwaliteitscontrole van
analyseprocedures, inclusief de extractie en zuivering
van DNA, en de stappen van de PCR-meting voor een
specifieke modificatie.
B. Nieuwe plasmide-CRM's voor GGO's
De
gecertificeerde
kalibranten
bevatten
een
gedefinieerd DNA-fragment dat specifiek is voor een
genetische modificatie en een gedefinieerd DNAfragment dat specifiek is voor het geanalyseerde taxon.
Het plasmide bevat een fragment van de 5'-plant-P35Sjunctie van MON 810 met 170 baseparen (bp) en een
fragment van het endogene "high mobility group"-gen
(hmg) van maïs met 351 bp.
De gecertificeerde waarden zijn respectievelijk het
aantal gekloonde GG-DNA-fragmenten en het aantal
taxon-specifieke DNA-fragmenten per plasmide. De
getalsverhouding tussen deze twee DNA-fragmenten
wordt verstrekt als indicatieve waarde, verkregen door
duplex en simplex real-time PCR.
GEBRUIK VAN
KALIBRANT
DE
GGO-PLASMIDE-
De kalibrant moet worden gebruikt in combinatie met
een gedefinieerde QRT-PCR-methode [2].
Elke kalibrant wordt op droog ijs in een gesloten
kunststof buis geleverd en moet tot gebruik op -20°C
worden gehouden. De inhoud moet eerst worden
ontdooid, vervolgens gemengd en ten slotte onder een
laminaire stroming worden geopend en verdund om het
contaminatierisico te beperken. Elke buis bevat
6
ongeveer 2x10 kopieën (cp) plasmide per µl en het
aanbevolen startvolume voor de verdunningsreeks is
50
µl.
Het
op
het
certificaat
vermelde
verdunningsprotocol dient te worden gevolgd. De
verdunningsbuffer wordt niet meegeleverd.
De verdunningsreeks moet altijd vers worden bereid en
restanten moeten in gesloten buizen worden afgevoerd.
De verdunningsreeks wordt gebruikt om twee
kalibratiecurves te maken (één voor het transgen en
één voor het taxon-specifieke gen) met elk vijf punten.
Elk punt wordt bij de PCR-reactie in triplo gemeten (zie
het voorbeeld). Eén buis bevat genoeg kalibrant om
10 kalibratiecurves voor beide targets te maken en dat
betekent dat er met één buis in totaal 100 tot 250
monsters kunnen worden gekwantificeerd. De
aanbevolen monstergrootte voor QRT-PCR is 5 µl
template-DNA per PCR-putje.
Als de gemeten fluorescentie-drempelwaarden (Ctwaarden) worden uitgezet tegen het theoretische aantal
kopieën van beide fragmenten, levert dit twee
kalibratiecurves op. Deze worden gebruikt voor de
kwantificering van het GG-target ten opzichte van het
© Europese Gemeenschappen, 2007. Reproductie met bronvermelding is toegestaan.
De Europese Commissie en personen die namens de Commissie optreden, zijn niet verantwoordelijk voor het gebruik dat eventueel
Pagina 1 van 2
van de informatie in deze application note wordt gemaakt.
taxon-specifieke target in een onbekend monster. De
resultaten kunnen vervolgens worden berekend als
quotiënt van beide targets en overeenkomstig
Aanbeveling 2004/787/EG in percentages worden
uitgedrukt. Er kan een interne kwaliteitscontrole- PCR
(QC) worden gedaan door het gemiddelde quotiënt van
de gemeten Ct-waarden voor het taxon-specifieke en
het transgene target te berekenen voor de
kalibratiepunten die overeenkomen met 2000 cp/µl. Dat
quotiënt
moet
overeenkomen
met
1,04%
(geëxpandeerde onzekerheid 0,06%) voor een simplexPCR, zoals vermeld in het certificatieverslag (zie ook
Application Note 1 voor ERM).
VOORBEELD
Genoom-DNA, geëxtraheerd uit een onbekend monster en uit ERMTotaal aantal cp van het
Gemeten Ct-waarden
Gemiddelde
MON 810-fragment
triplo 1
triplo 2
triplo 3
Ct
BF413d (gebruikt als QC-materiaal) wordt geanalyseerd met QRT50000
25,30
25,19
25,15
25,21
PCR met ERM-AD413 als kalibrant. De Ct-waarden worden na
10000
27,57
27,62
27,66
27,62
amplificatie van het hmg- en het MON 810-fragment voor de kalibrant
1000
31,19
30,89
31,14
31,07
100
33,99
35,12
34,80
34,64
ERM-AD413 verkregen (tabel 1). Voor het onbekende monster levert
25
35,79
35,67
36,37
35,95
de amplificatie van het MON 810- en het hmg-fragment als
NTC
45,00
45,00
45,00
45,00
gemiddelde Ct-waarden respectievelijk 32,76 en 25,44 op. Voor het
Totaal aantal cp van het
QC-materiaal zijn de gemiddelde Ct-waarden 31,22 en 22,20 voor
hmg-fragment
500000
20,76
20,67
20,63
20,69
respectievelijk het MON 810- en het hmg-fragment.
100000
22,92
23,00
23,04
22,99
Om het gehalte aan MON 810 in beide monsters te berekenen moeten
10000
26,39
26,36
26,33
26,36
de helling en het Y-intercept van de twee kalibratiecurves worden
5000
27,31
27,29
27,37
27,32
1000
29,38
29,19
29,57
29,38
bepaald, uitgaande van een rechte lijn als best passende
NTC
45,00
45,00
45,00
45,00
modelfunctie. Voor de berekening van de helling en het Y-intercept
Tabel 1: Voorbeeld van experimentele Ct-waarden
kunnen de ingebouwde modules van MicrosoftExcel of andere
met ERM-AD413 als kalibrant. NTC1 = no template
beschikbare software voor kalibratie/bepaling worden gebruikt.
control.
De helling (b) van de lineaire regressielijnen kan met de vergelijking
∑ log( x) − log( x) ( y − y worden berekend, waarbij x het aantal kopieën van het geamplificeerde fragment is en y de bijbehorende
b=
2
∑ log( x) − log( x)
Ct-waarde. De helling van de kalibratiecurves van het hmg- en het MON 810-fragment in tabel 1 is respectievelijk -3,25 en -3,32. Het
Y-intercept (a) van de regressielijnen wordt berekend met de vergelijking a = y − b x bij log(x) = 0. In ons voorbeeld is de waarde van
(
)
(
)
)
a voor de regressielijnen van hmg en MON 810 respectievelijk 39,26 en 40,93. Dit zijn de theoretische Ct-waarden bij 1 cp van beide
fragmenten. Met behulp van de helling kan de PCR-efficiëntie (ε) worden berekend met de vergelijking ε = (10-1/b -1)*100. In ons
voorbeeld was de PCR-efficiëntie voor de amplificatie van het MON 810- en het hmg-fragment respectievelijk 99,7% en 103,1%. Het
 Ct MON 810 − a MON 810 


bMON 810
,
aantal kopieën (cp) van MON 810 in het onbekende monster wordt berekend met de vergelijking cpMON810 = 10
waarin
CtMON810, aMON810 en bMON810 respectievelijk de Ct-waarde, het Y-intercept en de helling bij de amplificatie van MON 810 zijn. Evenzo
wordt het aantal kopieën van het hmg-fragment berekend met de vergelijking
cphmg = 10
 Ct hmg − a hmg


bhmg





. In ons voorbeeld is het bepaalde
gemiddelde aantal kopieën van het MON 810- en het hmg-fragment in het onbekende monster respectievelijk 289 cp en 17878 cp.
Het gehalte aan MON 810 van het onbekende monster, uitgedrukt als percentage, is derhalve gelijk aan 289 cp
.
MON 810
* 100 = 1,62%
17878 cphmg
Met dezelfde berekening bevat het QC-materiaal 841 cpMON 810
* 100 = 0,47%
MON 810. Rekening houdend met de aan ERM-BF413d
177513 cphmg
verbonden onzekerheid en de meetonzekerheid (zie Application Note 1 voor ERM) kan worden geverifieerd of de gemeten waarde
overeenkomt met de gecertificeerde waarden van ERM-BF413d. In bovenstaand voorbeeld is bij 10000 cp (5 µl ERM-AD413 bij
2000 cp/µl) het quotiënt van de gemiddelde Ct-waarden (1,05) in overeenstemming met de op het certificaat van ERM-AD413
gerapporteerde indicatieve waarde (1,04 ± 0,06), hetgeen betekent dat deze GG-kwantificering aan de eisen voldoet.
[1] Aanbeveling 2004/787/EG van de Europese Commissie van 4 oktober 2004 betreffende technische richtsnoeren inzake
bemonstering en opsporing van genetisch gemodificeerde organismen en materiaal geproduceerd met genetisch gemodificeerde
organismen, als of in producten aangeboden, in het kader van Verordening (EG) nr. 1830/2003, Publicatieblad van de Europese Unie
L 348 van 24.11.2004, blz. 18-26.
[2] ISO 21570:2005: Voedingsmiddelen – Analysemethoden voor de detectie van genetisch gemodificeerde organismen en afgeleide
producten – Kwantitatieve methoden op basis van nucleïnezuur. Bijlage D2: Event-specifieke methode voor de relatieve kwantificering
van DNA van maïslijn MON 810 met behulp van real-time PCR. 93-99.
___________
1
Als de Ct-waarde voor NTC van het aantal uitgevoerde PCR-cycli verschilt, is er waarschijnlijk sprake van kruisverontreiniging of
aspecifieke amplificatie.
Pagina 2 van 3