Bachelorproef Methodeontwikkeling en validatie van de bepaling
advertisement
Bachelorproef Methodeontwikkeling en validatie van de bepaling van methylmalonzuur in plasma op UPLC-­‐MS/MS UZ BRUSSEL Laarbeeklaan 101 1090 Jette Dr. Wet. Nik De Brabanter Adjunct – hoofdlaborant Stefaan Vanneyghem Adjunct – hoofdlaborante Gerda Winckelmans Goovaerts Silke Departement GEZ-­‐LA Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie Afstudeerrichting Farmaceutische en Biologische Laboratoriumtechnologie 2014-­‐2015 II Bachelorproef Methodeontwikkeling en validatie van de bepaling van methylmalonzuur in plasma op UPLC-­‐MS/MS UZ BRUSSEL Laarbeeklaan 101 1090 Jette Dr. Wet. Nik De Brabanter Adjunct – hoofdlaborant Stefaan Vanneyghem Adjunct – hoofdlaborante Gerda Winckelmans Goovaerts Silke Departement GEZ-­‐LA Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie Afstudeerrichting Farmaceutische en Biologische Laboratoriumtechnologie 2014-­‐2015 III IV Voorwoord In het kader van het behalen van mijn diploma in de Farmaceutische en Biologische Laboratoriumtechnologie aan Erasmushogeschool Brussel heb ik mijn eindwerk mogen uitvoeren op de dienst Metabole Stoornissen van het laboratorium Klinische Biologie UZ Brussel. Ik wil alvast Nik De Brabanter bedanken om mijn stage op deze dienst te mogen uitvoeren. Ook Gerda Winckelmans, Stefaan Van Neyghem, Jacques De Molder en alle andere laboranten van Metabole Stoornissen en Toxicologie wil ik bedanken voor hun uitleg en hulp tijdens het uitvoeren van mijn stage. Mevrouw Van Beneden wil ik ook bedanken bij het nakijken en verbeteren van mijn eindwerk. Als laatste bedank ik mijn ouders om mij bij te staan tijdens deze stageperiode en bij het nalezen van mijn eindwerk. V Organigram Metabole Stoornissen Prof. Dr. Martens Nik De Brabanter Wetenschappelijk medewerker Gerda Winckelmans Adjunct -­‐ hoofdlaborante Stefaan Vanneyghem Adjunct -­‐ hoofdlaborant VI Inhoudsopgave Voorwoord Organigram Metabole Stoornissen Inhoudsopgave Lijst met afkortingen Samenvatting Abstract V VI VII VIII XI XIII I. Inleiding 1 II. Literatuurstudie 2 1. Methylmalonzuur 2 2. Methylmalonacidemie 4 3. Vitamine B12 6 4. Therapie 9 5. Detectie 10 6. Chromatografie – Massa spectrometrie 13 7. SPE 18 III. Experimenten 19 1. Materiaal en methode 19 1.2 Apparatuur 22 1.3 Methode ontwikkeling 24 1.4 Methodevalidatie 32 2. Resultaten 34 2.1 Methodevalidatie 34 3. Discussie 38 IV. Besluit 41 V. Bibiliografie 42 VI. Bijlagen 45 1. Methodevalidatie 45 VII Lijst met afkortingen 3-­‐OH-­‐prop: Ado-­‐cbl: ACN: C2: CAH: cbl: cblA: cblB: cblC: cblD: cblF: cblH: cbl-­‐IF: CHT: CID: CO2: CoA: CV: D3: Dx: DAU: DC: EC: EDTA: ESI: EV: FA: FBT: GA: GC – MS: H: + H : H2O: Holo TC: HP: HSS: IQC: IEC: IF: Ile: IS: IVA: KS: kV: VIII 3 – Hydroxy – propionzuur Adenosylcobalamine Acetonitrile 2 Koolstoffen Congenitale bijnierschorshyperplasie Cobalamine Cobalamine deficiëntie type A Cobalamine deficiëntie type B Cobalamine deficiëntie type C Cobalamine deficiëntie type D Cobalamine deficiëntie type F Cobalamine deficiëntie type H Cobalamine – intrinsic factor Congenitale hypothyreoïdie Collision-­‐Induces Dissociation Koolstofdioxide Coenzyme A Variatiecoëfficiënt 3 Deuteriums Deuterium Daughter Ion Analysis ‘Direct Current’, gelijkspanning Europese Commissie Ethyleendiaminetetra -­‐ azijnzuur Elektrospray Ionisatie Elektronvolt Formic Acid, Mierenzuur Farmaceutische en Biologische Laboratoriumtechnologie Glutaaracidemie Gaschromatografie – Massa Spectrometrie High, hoog Waterstof Water Holotranscobalamine Humaan Plasma High Strength Silica Intern Quality Control, Interne Kwaliteitscontrole ‘Ion Exchange Chromatography’ Intrinsic Factor Isoleucine Interne Standaard Isovaleriaanzuuracidemie Kalfserum Kilovolt L: LC-­‐MS/MS: LMCD: MADD: MCAD: MCM: MeOH: Met: MF: MMA: MMAd3: MQ: MRM: MS: MSUD: mut0: mut-­‐: m/z: N2: Na+: NBS: NH4+: OH – cbl: PA: Pa: PAR: PKU: PSI: Q: RF: RRT: RSD: RT: SA: SAS: SD: SEP: SF: SIR: SN: SPE: T: tHcy: Thr: TQ: TQD: TV: IX Low, laag Liquid Chromatography – Tandem mass spectrometry Biotinidase deficiëntie Multiple acyl – CoA dehydrogenase deficiency Medium – chain acyl – CoA dehydrogenase deficiency Methylmalonyl – CoA -­‐ mutase Methanol Methionine Mobiele Fase Methylmalonzuur Gedeutereerd methylmalonzuur MilliQ water Multiple Reaction Monitoring Massa Spectrometer Maple syrup urine disease Mutatie type 0 Mutatie type -­‐ Massa/ladingsverhouding Stikstof Natrium ‘Newborn Screening’, neonatale screening Ammonium Hydroxocobalamine Propionzuuracidemie Pascal Parent Ion Scan Fenylketonurie en hyperfenylalaninemie Pound-­‐force per square inch Quadrupool Wisselspanning Relatieve Retentietijd Relatieve Standaarddeviatie Retentietijd Succinic Acid; Succinaat Serum Assay Sample Standaarddeviatie Sample Extraction Products Stationaire fase Selected Ion Recording Supernatans Solid Phase Extraction toeren per minuut Totaal-­‐homocysteïne Threonine Triple Quadrupool Triple Quadrupool Detector Tussenverdunning UPLC: UTAK: UZ(B): V: Val: v/v: X Ultra Performance Liquid Chromatography UTAK Laboratories Universitair Ziekenhuis (Brussel) Volt Valine Volumeverhouding Samenvatting Methodeontwikkeling en validatie van de bepaling van methylmalonzuur in plasma op UPLC-­‐MS/MS Silke Goovaerts (co)promotor: Dhr. N. De Brabanter, dhr. S. Vanneyghem, mevr. G. Winckelmans contactpersoon hogeschool: Mevr. K. Van Beneden Achtergrond Methylmalonzuur is een belangrijk intermediair in het katabolisme van bepaalde aminozuren, cholesterol en vetzuren. Methylmalonzuur wordt verder omgezet in succinaat, dat wordt verwerkt in de Krebscyclus. Methylmalonacidurie kan voorkomen door een deficiëntie van het enzyme methylmalonyl-­‐ CoA Mutase. Dit mutase gaat de omzetting van methylmalonyl – CoA in succinyl – CoA kataliseren. Indien er problemen optreden met methylmalonyl – CoA mutase, zal methylmalonzuur accumuleren. Dit enzyme heeft voor deze omzetting vitamine B12 nodig als cofactor. Tekort aan vitamine B12 zal eveneens een verhoging van de methylmalonzuur concentraties verzoorzaken. Daarom is methylmalonzuur een sensitieve en specifieke vroege biomarker om intracellulair functioneel vitamine B12 deficiëntie te detecteren. De spiegels van methylmalonzuur zijn bij een klinisch (met gezondheidsklachten) vitamine B12 tekort in 95-­‐98% van de gevallen verhoogd. Enkele voorbeelden van pathologieën van vitamine B12 tekort zijn bloedarmoede, alzheimer, osteoporose en nierfalen. Doel Een snelle methode ontwikkelen om methylmalonzuur accumulatie en vitamine B12 deficiëntie op te sporen in een klein volume plasma, via UPLC-­‐MS/MS. Methode Voor de methodeontwikkeling zijn we vertrokken van een artikel van het Wilhelmina ziekenhuis te Nijmegen die een eenvoudige procedure beschrijft voor zowel staalvoorbereiding als chromatografische scheiding en detectie, maar we zijn enkele obstakels tegen gekomen zoals dat enkel proteïneprecipitatie met acetonitrile onvoldoende is. De extracten waren nog te vuil (troebel, wit, …) en dit is niet ideaal voor een LC-­‐MS/MS. Het Wilhelmina ziekenhuis maakt gebruik van mobiele fases met hoge concentraties zuur. We hebben gemerkt dat dit een aanslag/afzetting geeft op de ionisatie bron van de MS. We hebben de auteur gecontacteerd en die bevestigt inderdaad het probleem. Daarom hebben we deze procedure aangepast: XI Om meer onzuiverheden uit de matrix te verwijderen werd gekozen om een solid phase extraction (SPE) uit te voeren. Verder werden mobiele fases met lagere concentraties mierenzuur uitgestest om vervuiling van de bron te vermijden. Voor de methodevalidatie werden verschillende paramaters uitgestest: de stabiliteit/reproduceerbaarheid van de relatieve retentietijd, carry over, ion ratio’s, recovery, precisie en bias, lineariteit en de detectielimiet en kwantificeringslimiet. Er werd voor elk van deze testen nagegaan of dit binnen de vooropgestelde criteria ligt die men kan terugvinden in de literatuur. Resultaten De methodeontwikkeling heeft de meeste tijd in beslag genomen, maar uiteindelijk is de SPE methode een korte en makkelijke extractiemethode. Eer we hiertoe gekomen zijn, hebben we eerst een aantal validatietesten uitgevoerd met de methode die we in de literatuur hadden gevonden. Deze bleek echter geen goede werkwijze, want de resultaten waren niet reproduceerbaar. Hieruit is dan zoals eerder vermeld de SPE methode gerealiseerd. De methodevalidatietesten geven met de SPE methode goede resultaten, maar er zijn nog een aantal zaken die moeten bijgesteld worden. Conclusie We concluderen dat het vooropgestelde volume van 100 µL voldoende is om methymalonzuur (MMA) te detecteren in plasma en dat de staalvoorbereiding nog steeds vrij kort is. SPE hebben we wel moeten introduceren, maar dit is nog te automatiseren. Het is dus mogelijk om MMA op UPLC/MS-­‐MS kwantitatief te bepalen, maar er moeten nog enkele verbeteringen uitgevoerd worden. Dit was echter wel een eerste stap om de bepaling van organische zuren in plasma mogelijk te maken in het labo Metabole Stoornissen te UZ Brussel. XII Abstract Method development and validation of the assay of methylmalonic acid in plasma by UPLC-­‐MS / MS Silke Goovaerts (co)promotor: Dhr. N. De Brabanter, dhr. S. Vanneyghem, mevr. G. Winckelmans Mentor school: Mevr. K. Van Beneden Background Methylmalonic acid is an important intermediary in the catabolism of certain amino acids, cholesterol and fatty acids. Methylmalonic acid is further converted into succinate that is processed in the Krebscycle. Methylmalonic aciduria can occur by a deficiency of the enzyme methylmalonyl – CoA Mutase. This mutase will catalyse the conversion of the methylmalonyl – CoA into succinyl –CoA. If problems occur with methylmalonyl – CoA mutase, methylmalonic acid will accumulate. This enzyme needs vitamin B12 as a cofactor for its conversion. A lack of vitamin B12 will also cause an increase of methylmalonic acid concentrations. That is why methylmalonic acid is a sensitive and specific early biomarker for detecting intracellular functional vitamin B12 deficiency. Within a clinically vitamin B12 deficiency the levels of methylmalonic acid (with health problems) are increased in 95-­‐98% of the cases. Some examples of pathologies of vitamin B12 deficiency include anemia, Alzheimer's disease, osteoporosis and kidney failure. Goal To develop a rapid method in order to detect accumulation of methylmalonic acid and vitamin B12 deficiency in a small amount of plasma using UPLC-­‐MS/MS. Methods For the method development, we started from an article of the Wilhelmina Hospital in Nijmegen which describes a simple procedure for both sample preparation as chromatographic separation and detection, but we have encountered some obstacles such as single protein precipitation with acetonitrile is insufficient. The extracts were still too dirty (cloudy, white,…) and this is not ideal for a LC-­‐MS/MS. The Wilhelmina Hospital uses mobile phases with high concentrations of acid. We have noticed that this gives a deposit on the ionization source of the MS. We contacted the author and he indeed confirmed the issue. Therefore, we have adapted this procedure: In order to remove more matrix and impurities before the injection we have chosen to use a solid phase extraction (SPE). Further, mobile phases with lower concentrations of formic acid XIII were tested to avoid contamination of the source. For the method validation, various parameters were tested: the stability / reproducibility of the relative retention time, carry over, ion ratios, recovery, precision and bias, linearity, and the limit of detection and limit of quantitation. It was established for each of these test whether this is within the criteria that can be found in the literature. Results The method development took most of the time, but eventually the SPE method is a quick and easy extraction method. Before we have come to this end, we first carried out a number of validation tests with the method that we had found in the literature. This turned out not to be a good method because the results were not reproducible. It is then achieved as previously stated, the SPE method. The method validation tests indicate the SPE method good results, but there are still some issues that need to be adjusted. Conclusion We can conclude that the intended volume of 100 µl is sufficient to detect methylmalonic acid (MMA) in plasma and that the sample preparation is still relatively short. We have had to introduce SPE, but this can be automated. So, it is possible to determine MMA quantitatively on UPLC/ MS-­‐MS, but there are still some improvements to be carried out. However, this was a first step in the determination of organic acids in plasma in the lab Metabolic Disorders at UZ Brussel. XIV I. Inleiding Eiwitten zijn één van de voedingsstoffen die het lichaam nodig heeft, ze zijn terug te vinden in voedingsmiddelen zoals eieren, melk, vis, vlees, en kaas. De eiwitten afkomstig uit vlees of melk worden afgebroken tot twintig afzonderlijke aminozuren, zoals serine. Aminozuren worden getransporteerd in het bloed en afgeleverd aan cellen afgeleverd waar nodig. Meestal eten we veel meer eiwit dan we nodig zouden hebben. Als het lichaam de nodige aminozuren heeft opgenomen, wordt de overschot in de lever afgebroken door enzymen zoals methylmalonyl-­‐CoA Mutase. Zo worden er onschadelijke stoffen gevormd, die uitgescheiden kunnen worden. Indien één van deze enzymen niet goed werkt, worden er organische zuren gevormd die schadelijk kunnen zijn voor het lichaam. (Gick) Methylmalonzuur behoort tot deze voorgenoemde organische zuren, welke meestal zwakke zuren zijn. Afhankelijk van de omgevingszuurtegraad gaat een deel van het zure molecule een waterstofatoom afsplitsen, en dissociëren. Enkele voorbeelden van organische zuren zijn mierenzuur, citroenzuur, azijnzuur. (DAAVISION) Osteoporose, progressief nierfalen, intellectuele onbekwaamheid (mentale retardatie), verstoorde coördinatie van bewegingen door een aandoening aan de motorische zenuwbanen vatten het ziektebeeld van methylmalonylacidemie samen. Ook metabole acidose, d.w.z. een te lage pH (< 7,35) veroorzaakt door een overschot aan zure (in dit geval methylmalonzuur en metabolieten) of een tekort aan basische componenten in het bloed, kan een gevolg zijn van methylmalonacidemie. (Hoffmann & Zschocke, 2014) Methylmalonzuur is een belangrijke biomarker om vitamine B12 deficiëntie te detecteren. Vitamine B12 deficiëntie heeft geen opmerkende symptomen en is moeilijk te detecteren. Het is ook belangrijk om de plasmaconcentraties van methylmalonzuur te bepalen bij diagnose en opvolging van patiënten met methylmalonacidurie. In deze thesis wordt onderzocht of het mogelijk is een LC-­‐MS/MS methode te ontwikkelen en te valideren voor de bepaling van methylmalonzuur met minimale staalvoorbereiding in een kleine hoeveelheid plasma. Methylmalonzuur zal een verhoogde concentratie geven in 95 – 99% van de gevallen bij een tekort aan vitamine B12, vandaar is dit een belangrijke biomarker. 1 II. Literatuurstudie 1. Methylmalonzuur Methylmalonzuur of 2-­‐methyldipropaanzuur, C4H6O4, is een belangrijk intermediair in het katabolisme van bepaalde aminozuren, cholesterol en vetzuren. Figuur 1: MMA is een dicarbonzuur met 4 koolstofatomen In geval van een overschot aan aminozuren in het lichaam, of een periode van vasten worden in de mitochondriën aminozuren geoxideerd om de energiebehoefte van de cel te dekken (Metabolisme, Schuit). Bij de afbraak van threonine, methionine en de vertakte aminozuren valine en isoleucine wordt daarbij propionzuur gevormd. In mindere mate zijn ook vetzuren met oneven aantal koolstofatomen en cholesterol precursoren van propionzuur. Dit propionzuur wordt via methylmalonzuur omgezet in succinaat om zo de citroenzuurcyclus (Krebs-­‐cyclys) binnen te gaan (anaplerose, zie figuur 2). Succinaat is een isomeer van methylmalonzuur. In deze Krebs-­‐cyclus wordt via 9 enzymatische stappen telkens een C2-­‐eenheid verbrand tot CO2 en H2O, waarbij energierijke verbindingen voor de cel gevormd worden. 2 Leucine Isoleucine Valine ... ... … 3-­‐OH-­‐3-­‐methyl-­‐ glutaryl-­‐CoA 2-­‐methyl-­‐ acetoaceytl-­‐CoA Methylmalonic semialdehyde 3-­‐hydroxy-­‐propionzuur Methyocitraat Acetoacetaat Acetyl-­‐CoA Propionyl-­‐ CoA Succinyl -­‐ CoA Methylmalonyl-­‐ CoA Ado-­‐cbl cblB cbl (I) Krebs Cyclus cblA cbl (III) OH-­‐cbl Figuur 2: Metabole wegen van valine-isoleucine metabolisme tot Krebscyclus 3 Methionine Homocysteïne 2. Methylmalonacidemie Aangeboren metabole ziekten maken deel uit van een grote groep zeldzame ziekten en worden veroorzaakt door een mutatie in een enzymcoderend gen. Deze mutatie wordt geërfd van de ouders en zorgt voor een tekort van het enzyme in kwestie. Hierdoor wordt de normale metabole flux onderbroken en/of gewijzigd. Zulke blokkades in metabole paden zorgen typisch voor opstapeling van de metabolieten stroomopwaarts en een tekort aan producten stroomafwaarts van het defect. Zowel de opstapeling van producten in de cel als het tekort ervan kunnen aanleiding geven tot diverse lichamelijke problemen. Dit is te zien in figuur 3. Deficiëntie van een bepaald enzym, in dit voorbeeld nummer 3 in figuur 3, is het gevolg van een aangeboren metabole ziekte. Hierbij ontstaat er een opstapeling van metabolieten (A, B en C), een alternatieve uitweg voor de metabolieten stroomopwaarts van het defect en een tekort aan metabolieten stroomafwaarts (vanaf D). De zwarte staafdiagrammen stellen metabolietenconcentraties voor in het betrokken weefsel bij normale gezondheid. De rode staafdiagrammen geven de concentraties bij een aangeboren metabole ziekte weer. Metaboliet C vindt een andere uitweg. (Schuit, 2010) A B 1 C 2 D 3 E 4 F 5 G 6 H 7 Alternatieve weg Figuur 3: Principe van een metabole ziekte: onderbreking en wijziging van metabole paden Een klassieke methylmalonacidurie wordt veroorzaakt door een deficiëntie van het enzyme methylmalonyl-­‐CoA Mutase (MCM), dat de omzetting van methylmalonyl-­‐CoA in succinyl-­‐ CoA kataliseert, zie figuur 4. 4 Mitochondrion Methylcitraat Propionyl-­‐CoA Biotine Methylmalonzuur D-­‐methylmalonyl-­‐CoA Methylmalonyl-­‐CoA-­‐mutase Cytoplasma L-­‐methylmalonyl-­‐CoA Succinyl-­‐CoA Ado-­‐cbl cblA Figuur 4: Vorming van methylmalonzuur. In het geval van problemen met MCM zal vooral methylmalonzuur (MMA) accumuleren, men spreekt dan van een methylmalonacidemie (bloed) en/of een methylmalonacidurie (urine). Naast methylmalonzuur kunnen ook andere intermediairen stroomopwaarts beginnen opstapelen en/of andere uitwegen zoeken (zie figuur 3). In geval van een MCM deficiëntie vindt de cel een uitweg via 3-­‐hydroxypropionzuur en methylcitraat om de stijgende concentraties propionzuur weg te werken zoals te zien is in figuur 4. Men maakt onderscheid tussen mut0, een volledige deficiëntie van methylmalonyl CoA mutase en mut-­‐, een partiële deficiëntie van methylmalonyl CoA mutase.De incidentie van methylmalonacidemie ligt tussen 1 op 25.000 voor een volledige deficiëntie en 1 op 48.000 voor een partiële deficiëntie. (Orphanet; Helgeson, Magera, Matern, & Rinaldo, 2000; Beukema) 5 3. Vitamine B12 Naast het gendefect kunnen ook problemen met de cofactor zorgen voor een minder goede werking van een enzyme. Methylmalonyl-­‐Coa mutase is een van de twee enzymen in het menselijk lichaam die cobalamine (Cbl, vitamine B12) nodig hebben voor hun activiteit. Dit vitamine B12 is aanwezig in voeding van dierlijke oorsprong en wordt geabsorbeerd in verschillende stappen. cblA, cblB en cblH zijn geassocieerd met abnormaliteiten van de adenosylcobalamine syntheseweg zie figuur 4. Na vrijstelling uit de voeding in de maag wordt cobalamine gebonden aan intrinsic factor(IF), een glycoproteïne dat gesecreteerd wordt door de maag. Het Cbl-­‐IF complex wordt dan door receptoren opgenomen in het ileum. Cobalamine wordt hier losgekoppeld van IF en afgegeven gebonden aan transcobalamine II voor transport door de bloedbaan. Na opname door de cel via endocytose zal het Cbl terug vrijgesteld worden en omgezet worden in adenosylcobalamine, de cofactor van MCM, zie figuur 5. Figuur 5: Afgelegde weg van cobalamine Naast MCM wordt cobalamine ook gebruikt als cofactor voor de synthese van methionine uit homocysteïne. Bijgevolg zullen problemen met Cbl gevolgen hebben voor zowel de omzetting van methylmalonzuur als homocysteïne, zie figuur 2. Een kleine fractie (6-­‐20%) van de totale hoeveelheid circulerend vitamine B12 is aan transcobalamine II, een transporteiwit, gebonden. Dit is het actieve B12 en deze is beschikbaar voor synthesereacties op celniveau. In de lysosomen wordt het vitamine B12 losgemaakt van transcobalamine II en indien nodig omgezet naar methyl-­‐ of adenosylcobalamine. Het inactieve B12, het overige deel, 80%, is aan haptocorrine, transcobalamine I, gebonden en wordt gebruikt voor transport en opslag. Hierdoor mist de meting van totaal vitamine B12 (referentie-­‐interval 150-­‐700 pmol/l vanuit het artikel van het Wilhelmina Ziekenhuis te Nijmegen) de nodige sensitiviteit, het correcte gemeten actieve B12, en specificiteit, de geschiktheid om een onderscheid te maken tussen het actieve B12 en inactieve B12. Het is mogelijk dat de totale vitamine B12 concentratie normaal is (> 150 pmol/l) terwijl het actief B12 te laag is. Totaal vitamine B12 kan ook te laag blijken door 6 verzadiging aan het haptocorrine zonder een functioneel tekort. Methylmalonzuur is dus de meest gevoelige en specifieke marker voor de vitamine B12 status op cellulair niveau en indien methylmalonzuur in bloed verhoogd is, duidt dit op een vitamine B12 deficiëntie. (Beijers, van Daal, & van den Ouweland, 2011; Allen, Keyes, Pedersen, Shahab-Ferdows, & Newman, 2011; Stichting Orthokennis, 2014) Bij DNA-­‐synthese, cellulaire herstelprocessen, bloedaanmaak en hersenfunctie speelt vitamine B12, een essentiële voedingsstof, een belangrijke rol. Verscheidene gezondheidsklachten kunnen ontstaan indien men een verlaagde actieve vitamine B12 status heeft. Het is dus belangrijk om vitamine B12-­‐tekort te voorkomen, vroeg op te sporen en juist te behandelen. Indien dit niet gebeurt is er kans op irreversibele neurologische schade en beenmergfalen en dit wil men voorkomen. Vitamine B12 is een wateroplosbare molecule met in het centrum een kobaltatoom. Afhankelijk van de restgroep die gekoppeld is aan het centrale kobaltatoom, komt vitamine B12 in verschillende vormen voor. De restgroepen kunnen: methyl-­‐, adenosyl-­‐, hydroxy-­‐ en cyanocobalamine zijn. Indien cobalamine zonder restgroep voorkomt, is dit op zichzelf geen stabiele molecule. Figuur 6: Structuurformule vitamine B12 (Co+ = Kobaltatoom; R = Restgroep) Vitamine B12 komt in het lichaam voornamelijk voor onder de vorm van actieve co-­‐ enzymvormen methylcobalamine (in het bloedplasma, celcytoplasma en cerebrospinale vloeistof)en adenosylcobalamine (in de weefsels en celmitochondriën). Ca. 2 tot 5 mg vitamine B12 heeft het lichaam in voorraad. Het grootste deel hiervan wordt in de lever opgeslagen. Via urine en gal verdwijnt er dagelijks 0,1 – 0,2 % van de totale lichaamsreserve. Doordat de voorraad onvoldoende aangevuld wordt, door onvoldoende inname of absorptie, of het verlies toegenomen is, door oxidatieve stress of verstoorde heropname van vitamine B12 uit gal (enterohepatische recirculatie), kan zich langzaam een vitamine B12-­‐tekort ontwikkelen over een periode van jaren. Vitamine B12 uit voedingssupplementen is makkelijker op te nemen dan vitamine B12 uit voeding, want het loskoppelen van voedingsgebonden vitamine B12 kan gebrekkig verlopen. (Stichting Orthokennis, 2014) 7 De meest voorkomende reden voor een tekort aan cobalamine is onvoldoende opname via de voeding, bijvoorbeeld bij vegetariërs en veganisten. Ook bij kinderen die lange tijd uitsluitend borstvoeding krijgen van een vegetarische moeder kunnen tekorten optreden. Daarnaast kunnen ook (genetische) problemen met opname/transport aanleiding geven tot een te lage beschikbaarheid van cobalamine als cofactor voor het MCM enzyme, zoals bv een defect in de secretie van IF. (Chan, Fu, Pattengale, & Xu, 2013) Markers voor Vit B12 deficiëntie: Methylmalonzuur en/of homocysteïne? Het mutase heeft ook adenosylcobalamine nodig welke een essentiële rol speelt in deze omzetting. Bij vitamine B12 deficiëntie stijgt de concentratie methylmalonzuur, maar niet in dezelfde mate als bij een volledige deficiëntie van het methylmalonyl-­‐Coa mutase (The Monitor, 2008). Methylmalonzuur en totaal-­‐homocysteïne (tHcy) zijn aanvullende bepalingen in serum bij een lage vitamine B12 spiegel (<350 pmol/l volgens het artikel van het Wilhelmina Ziekenhuis te Nijmegen). Vanaf waarden hoger dan 350 pmol/l is de patiënt positief voor vitamine B12 deficiëntie volgens het artikel. Dit is een richtwaarde voor het Wilhelmina Ziekenhuis, want het UZ Brussel gaat een eigen referentiewaarde opstellen naar de toekomst toe. Dit is noodzakelijk omdat in de literatuur sommige bronnen een hogere waarde of een lagere waarde gebruiken. Methylmalonzuur en tHcy zijn essentieel bij het vaststellen van het functioneel (intracellulair) vitamine B12 tekort. De spiegels van methylmalonzuur en tHcy zijn bij een klinisch (met gezondheidsklachten) vitamine B12 tekort in 95-­‐98% van de gevallen verhoogd. De meest specifieke merker om vitamine B12 na te gaan is methylmalonzuur in bloed, maar deze kan bij een tekort normaal zijn bij antibioticagebruik (vals negatief) en bij een normale vitamine B12 status verhoogd zijn door nierinsufficiëntie of uitdroging (vals positief). Indien dit het geval, patiënten met nierinsufficiëntie, kan de bepaling van methylmalonzuur uitgevoerd worden in urine. (Beijers, van Daal, & van den Ouweland, Diagnostische opbrengst van standaard reflexmeting op serum methylmalonzuur voor het vaststellen van een functioneel vitamine B12 tekort, 2011) Naast nierinsufficiëntie kunnen ook hypovolemie, laag circulerend bloedvolume en bacteriële overgroei van de dunne darm oorzaken zijn van een te hoge waarde van methylmalonzuur in plasma en/of urine. (Helgeson, Magera, Matern, & Rinaldo, 2000) (Allen, Keyes, Pedersen, Shahab-Ferdows, & Newman, 2011) Naast vitamine B12-­‐tekort kan ook bij familiaire hyperhomocysteïnemie, foliumzuurtekort, roken, hypothyroidie, gebruik van levodopa en nierinsufficiëntie de homocysteïnespiegel verhoogd zijn, daarom is deze parameter minder specifiek. (Stichting Orthokennis, 2014) Een voordeel van methylmalonzuur t.o.v. homocysteïne is, naast de hogere specificiteit voor het aantonen van vitamine B12 deficiëntie, dat dezelfde serumbuis kan gebruikt worden om vitamine B12 te bepalen als methylmalonzuur. Voor homocysteïne dient een nieuwe bloedafname plaats te vinden onder specifieke afnamecondities, afname op ijs e.d. (Beijers, van Daal, & van den Ouweland, Diagnostische opbrengst van standaard reflexmeting op serum methylmalonzuur voor het vaststellen van een functioneel vitamine B12 tekort, 2011) In geval van een chromatografische bepaling van methylmalonzuur is de volledige scheiding van het isomeer succinaat (SA) zeer belangrijk, co-­‐elutie kan aanleiding geven tot vals verhoogde methylmalonzuur spiegels. (RECIPE, 2010; El-Khoury, Gabler, Spatholt, Wang, & Yuan, 2012) 8 4. Therapie Als therapie voor MMA kan een dieet met het beperken van inname van de aminozuren isoleucine, valine, methionine en threonine of het toevoegen van carnitines (om de excretie te stimuleren: MMA kan binden aan carnitine om zo het systeem te verlaten) opgestart worden. (Hoffmann & Zschocke, 2014) Vitamine B12 deficiëntie heeft voornamelijk een hematologisch (megaloblastaire anemie) en neurologisch ziektebeeld (demyeliniserende ziekte: veranderende mentale toestand). Vitamine B12 geeft ook energie, want in de apotheek zijn verschillende energiestimulerende producten beschikbaar, zoals gelullen met foliumzuur, Neo Genyl® Action. (Stichting Orthokennis) Oudere patiënten kunnen te maken hebben met onomkeerbare neurologische schade, anemie, osteoporose en cerebrovasculaire en cardiovasculaire aandoeningen. (El-Khoury, Gabler, Spatholt, Wang, & Yuan, 2012) 9 5. Detectie Neonatale screening Het belang van neonatale screening is dat ze vroegtijdig aandoeningen kunnen opsporen. Vroeger was er nog geen neonatale screening met als gevolg dat de aandoening veel te laat ontdekt werd om nog te behandelen. In tabel 1 staan alle aangeboren aandoeningen die kunnen opgespoord worden via de hielprik. Tabel 1: Lijst van aangeboren aandoeningen opgespoord in de neonatale screening (via hielprik) Lijst van aangeboren aandoeningen in hielprik-­‐screening Fenylketonurie en hyperfenylalaninemie (PKU) Congenitale hypothyreoïdie (CHT) Congenitale bijnierschorshyperplasie (CAH) Biotinidase deficiëntie (LMCD) Medium-­‐chain acyl-­‐CoA dehydrogenase deficiëntie (MCAD) Multiple acyl-­‐CoA dehydrogenase deficiëntie (MADD) Isovaleriaanzuuracidemie (IVA) Propionzuuracidemie (PA) Methylmalonzuuracidemie Maple syrup urine disease (MSUD) Glutaaracidemie (GA) -­‐ Guthrie kaartje Figuur 7: Guthrie kaartjes 10 Een Guthriekaartje, zie figuur 7, bestaat uit een aantal delen: een gedeelte met cirkels waarin het bloed wordt verzameld, een gedeelte waarin de essentiële gegevens worden opgeschreven en een strookje als bewijs voor de moeder dat er een neonatale screening is uitgevoerd. De hielprik moet worden uitgevoerd bij een voldragen baby minstens 72 uur na de geboorte, maar liefst niet langer dan na dag vijf. (Wouters, 2014) Confirmatie: Confirmatie van positieve, te hoge, resultaten van de neonatale screening kan onder andere gebeuren via de bepaling van organische zuren in urine met gebruik van GC-­‐MS/MS. Een andere methode is om in plasma of op guthriekaartjes acylcarnitines te bepalen met UPLC_MS/MS. Hierbij gaat men kijken of de waarden van bepaalde carnitines per aandoening verhoogd zijn. In het geval van methylmalonacidemie kan men ook volgende organische zuren bepalen via het guthriekaartje: methylmalonzuur, 3-­‐OH-­‐propionzuur en methylcitraat. In UZ Brussel worden momenteel 4 patiënten met methylmalonacidemie gevolgd. De confirmatie kan ook gebeuren via aminozuren in plasma, waarbij glycine en alanine concentraties gaan gestegen zijn. Ook via acylcarnitines kan men positieve resultaten confirmeren voor de verschillende aandoeningen. Voor methylmalonzuuracidurie wordt de C3-­‐carnitine concentratie gemeten. Acylcarnitines zijn essentiële componenten in het metabolisme van vetzuren. Deze gaat men meten bij een NBS, diagnose van organische aciduriën of vetzuur oxidatiestoornissen, hypoglycemie en bij controle van de behandeling. De gebruikte methode om deze elf aandoeningen op te sporen is Electrospray tandem MS of ‘fast atom bombardment tandem MS’. Het monster dat men hiervoor kan gebruiken zijn dried blood spot (Guthrie kaartje), plasma/serum en urine. Hieruit kan men a.d.h.v. tandem MS dan bepalen welke acylcarnitine verhoogd is en is dit C3-­‐carnitine, dat duidt dit op methylmalonzuur. (Hoffmann & Zschocke, 2014) Vitamine B12 Vitamine B12 werd vroeger gedetecteerd door een serum vitamine B12 bepaling uit te voeren of een Schilling test. Met de Schillingtest kan er nagegaan worden of er malabsorptie is van vitamine B12 in het distale deel van het ileum. Er wordt intramusculair een overmaat aan vitamine B12 toegediend die de bindingsplaatsen in de lever verzadigen. Daarna neemt de patiënt radioactief gelabelde vitamine B12 in. De hoeveelheid radioactieve vitamine B12 uitgescheiden in de urine wordt gemeten. Het percentage van de in de urine uitgescheiden vitamine B12 zal verlaagd zijn t.o.v. de orale dosis bij een malabsorptie, normaal bedraagt die 10%. Bij deze test kwamen te veel foutieve testresultaten voor door bijvoorbeeld een onvolledige verzameling van urine. (de Rooij, Huijmans, Hoekstra, Fischer, & Wiersinga, 2005) Bepaling van methylmalonzuur kan gebeuren in zowel serum als in plasma als in urine. De bepaling zal meestal in bloed gebeuren, omdat de methylmalonzuur niveaus minder beïnvloed zijn door te diëten e.d. dan als men de bepaling gaat uitvoeren in urine. Deze zijn in urine meer geconcentreerd dan in plasma. (Hoffmann & Zschocke, 2014) 11 De detectie en bepaling van methylmalonzuur wordt uitgevoerd op een LC-­‐MS/MS toestel van Waters. Er wordt bij de kwantitatieve methode gebruik gemaakt van gedeutereerd methylmalonzuur (d3) als interne standaard voor elk monster, deze laat toe te corrigeren voor variabiliteit tijdens zowel de staalvoorbereiding al de analyse op het toestel. (RECIPE, 2010) GC-­‐MS werd gebruikt als gouden standaard voor de methylmalonzuur bepaling in urine voor vele jaren. Correcte resultaten werden bekomen, maar het vergde veel handelingen voor analytische extracties en derivatisatie. GC-­‐MS vergt ook veel tijd op vlak van chromatografische scheidingen. Daarom heeft LC-­‐MS/MS de GC-­‐MS vervangen omwille van zijn relatieve methodologische eenvoud en hogere gevoeligheid (Carvalho & Kok, 2008) 12 6. Chromatografie – Massa spectrometrie Chromatografie is een scheidingstechniek. Deze is gebaseerd op de distributie tussen twee fasen, die t.o.v. elkaar in tegenstroombeweging zijn. De stationaire fase, SF, is een stilstaande laag die ofwel gecoat is op de kolom (capillaire GC) ofwel op zeer fijne partikels waarmee de kolom gevuld is (LC) en de mobiele fase, MF, wordt continu voortgestuwd doorheen de SF. De MF dient als transportmiddel tijdens de analyse. Chromatografie is een techniek die zowel voor kwalitatieve als kwantitatieve bepalingen kan gebruikt worden. Afhankelijk van de MF kan dit ingedeeld worden in twee hoofdgroepen. Indien de MF een gas is, spreekt men van gaschromatografie. Is de MF een vloeistof, dan spreekt men van vloeistofchromatografie, waarop we ons concentreren in deze thesis. UPLC of Ultra Performance Liquid Chromatography maakt snellere en meer efficiënte chromatografische analyses mogelijk door kolommen te gebruiken met kleine partikels (bv. 1,7 µm) bij zeer hoge druk (15.000 psi). Door de kleine partikels gaat de scheiding efficiënter verlopen, ook bij hogere snelheden van de mobiele fase. Er moet dan wel meer druk gestoken worden op die mobiele fase om die aan een bepaalde snelheid door de dichtgepakte kolom te laten lopen. Hierdoor moeten de kolommen de hogere drukken kunnen verdragen. T.o.v. een HPLC kolom is een kolom bij UPLC-­‐MS/MS gevuld met kleinere partikels om de hogere snelheden te kunnen gebruiken zonder enig verlies van de resolutie. (Lanckmans, Procedure: Toestellen algemeen UPLC-MS/MS, 2009) (www.chromacademy.com) Een interne standaard, IS, wordt gebruikt voor de kwantificatie. Een gepaste IS gaat fouten in de staalvoorbereiding, de chromatografie en de ionisatie in de MS opvangen en minimaliseren. Het is dus belangrijk een geschikte IS te kiezen, meestal wordt er één gekozen die analoog is aan de structuur van het component. Hier werd gebruik gemaakt van een gedeutereerde IS, Dx, waarbij x staat voor het aantal deuteriums. Deuterium is een stabiele isotoop van waterstof en heeft naast een proton ook een neutron in de atoomkern. Aangezien de massa van het gelabelde molecule verschilt met de massa van de niet gelabelde molecule, kan met massaspectrometrie deze van elkaar onderscheiden worden op vlak van hun massa. Deze doet chemisch hetzelfde. Bij een gedeutereerde IS worden een aantal waterstoffen (De Brabanter, 2014) vervangen door deuterium atomen, waardoor de IS een grotere m/z heeft dan zijn overeenkomstige niet gedeutereerde vorm. Teveel deuteriums kunnen echter een verandering in de fysico – chemische eigenschappen van de component veroorzaken. (Lanckmans, Procedure: Toestellen algemeen UPLC-MS/MS, 2009) Particles: 1-5 µM Figuur 8: Principe UPLC-MS/MS 13 1. Massaspectrometrie: principe Een massaspectrometer is een detector die in staat is ionen te filteren en vervolgens te detecteren volgens hun massa over lading verhouding (m/z). De detector werkt onder hoog vacuüm, 10-­‐3 tot 10-­‐6 Pa zodat de ionen niet kunnen interfereren met nog aanwezige luchtmoleculen. Ze kunnen botsen met het te detecteren ion en fragmentatie veroorzaken en/of het traject wijzigen. Hierdoor kan het ion zijn lading verliezen door te botsen met de wanden van de MS. Een massaspectrometer bestaat typisch uit een ionisatiebron, waarin het monster wordt geïntroduceerd, een massa – analysator en een detector zoals te zien is in figuur 9. (Lanckmans, Procedure: Toestellen algemeen UPLC-MS/MS, 2009) Detector 162 m/z Mass Analyze r 198 m/z Liquid from LC Ion Source 228 m/z Data Sample Introduction 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 Minutes Figuur 9: Schematisch overzicht van Massaspectrometrie 1.1 Ionisatiebron Bij vloeistofchromatografie vormt de ionisatiebron de interface tussen de LC (op atmosferische druk) en de MS (onder vacuüm). In de bron zullen de moleculen die de LC-­‐ kolom verlaten, geïoniseerd worden bij atmosferische druk. In deze oppuntstelling wordt vertrokken vanuit een vloeistoffase en maakt men gebruikt van elektrospray ionisatie, ESI. Het ionisatieproces kan ingedeeld worden in drie stappen: aërosolvorming, druppelverkleining en ionenvorming. Het eluens wordt door een smalle stainless steel capillair gestuurd waar de ionisatie gebeurt door het aanleggen van een sterk elektrisch veld (2 tot 6 kV) op het capillair. Hierdoor ontstaat een aerosol van geladen druppels die kleiner worden als de oplossing evaporeert van de oppervlakte. Dit desolvatatieproces wordt versneld door een temperatuursverhoging en door desolvatatiegas (N2). Hierdoor stijgt de ladingsdichtheid, waardoor de afstotingskrachten (repulsiekrachten) van deze ladingen toenemen. Indien de repulsiekrachten op een bepaald moment groter worden dan de oppervlaktespanning van de druppels, vallen de druppels uiteen in netto positief of netto negatief geladen deeltjes. Afhankelijk van de polariteit en de aangelegde potentiaal worden positieve of negatieve ionen in de massa analyzer getrokken. (De Brabanter, 2014) 14 + + + + - + - + -+ - - - - --+ - + - More Negative Ions than Positive Ions + +- ++- + + - + +- + +- +- -+ + + + -+ + -++ + + + ++ + + + Liquid + + - + + + + +-+ + + --+ +--+---+ +-- - - - Positively Charged Droplets + + + + Taylor Cone More Positive Ions than Negative Ions High Voltage Figuur 10: Uitvergrote weergave van het capillair en druppelvorming bij positieve elektronspray ionisatie Positive Electrospray Ions H H N N O Ibuprofen + H+ N + O C H3 CH3 Negative Electrospray Ions C H3 C H3 OH CH3 H 3C N C H3 CH 3 Lidocaine H O H O CH3 H 3C + H+ O Figuur 11: Vorming van ionen in positieve en negatieve ionisatiemode Een positief electrospray ion wordt geproduceerd op het moment dat een positief ion of een adduct, een component gevormd door een additiereactie, wordt toegevoegd aan een molecule, bijvoorbeeld: H+, NH4+, Na+. Dit komt vooral voor bij basische componenten. Een negatief electrospray ion wordt geproduceerd wanneer een proton (waterstof ion) van een molecule wordt verwijderd, deprotonatie. Dit komt vooral voor bij zure substanties. 15 Hoe groter de molecule, hoe groter de kans dat er meerdere plaatsen beschikbaar zijn voor (de)protonatie doordat er meerdere basische en/of zure functionele groepen op staan. Het vormen van meervoudig geladen moleculen is een belangrijke en unieke eigenschap van ESI. Het grootste nadeel aan ESI is de gevoeligheid aan matrixeffecten die de ionisatie tegenwerken of juist versterken. De matrixeffecten zijn effecten van co – eluerende componenten op de ionisatie van targetmoleculen. Deze kunnen veroorzaakt worden door de monstervoorbereiding, additieven in de MF en matrixcomponenten zoals lipiden, zouten en anticoagulantia zoals lithiumheparine en natrium – EDTA. (De Brabanter, 2014) 1.2 Massa – analysator : In de massa – analysator worden de gevormde ionen gescheiden volgens hun m/z waarde. D.m.v. een elektrisch of magnetisch veld worden de gevormde ionen naar de massa – analysator toegetrokken. Er bestaan verschillende types zoals een triple quadrupool, een ion trap of een time of flight. In deze thesis werd gebruik gemaakt van de triple quadrupool, TQ. Één quadrupool bestaat uit vier, onderverdeeld in twee paar, evenwijdige staven met cirkelvormige doorsnede. De staven die tegenover elkaar staan, zijn elektrisch verbonden en hebben dus dezelfde potentiaal, maar de ene is positief en de andere is negatief. Er wordt een paar positief ingesteld en een ander paar negatief ingesteld. Er wordt een combinatie van gelijkspanning (DC) en wisselspanning (RF) op elk paar aangebracht. Deze combinatie zorgt voor de ionenscheiding met een grote selectiviteit, enkel de ionen met een specifieke m/z verhouding worden doorgelaten en bereiken de detector. De andere ionen gaan door botsing met de staven verloren. (De Brabanter, 2014) 1.3 Triple Quadrupool (TQ) De combinatie van twee of meer massa – analysatoren is typisch voor een tandem massaspectrometer. De meest gebruikte analysator voor kwantitatieve analyses is de TQ. Deze is opgebouwd uit twee quadrupolen die verbonden zijn via een botsingscel. Deze botsingscel kan gevuld zijn met botsingsgas (argon). De precursor ionen worden in de eerste quadrupool selectief doorgelaten waarna ze in de botsingscel gefragmenteerd worden door botsing met een inert gas. De tweede quadrupool selecteert dan de gewenste fragmenten die nadien tenslotte gedetecteerd worden door impact op een fotonvermenigvuldiger. (De Brabanter, 2014) De TQ MS kan in verschillende scan modi opereren: product ion scan, parent ion scan, multiple reaction monitoring (MRM) modus en neutral loss scan. Alle fragment ionen van een welbepaald precursor ion worden gemeten in de product ion scan mode. Alle precursor ionen, die een specifiek fragment produceren, worden gemeten in de parent ion scan mode. Bij MRM wordt de transitie gevolgd van één precursor ion naar één karakteristiek fragment ion. De MRM modus is de aangewezen methode voor kwantitatieve en/of gevoelige analyses. Om een groep componenten te analyseren die allemaal een specifiek neutraal fragment verliezen, wordt er in de neutral loss scan gemeten. (De Brabanter, 2014) 16 Figuur 12: Schematische weergave principes verschillende MS/MS modes 17 7. SPE ‘Solid Phase Extraction’, SPE, is een monstervoorbereiding waarbij vaste partikels worden gebruikt. SPE wordt gebruikt voor opzuivering, het selectief verwijderen van interferenties en opconcentratie, aanreiken, van het monster. (Lanckmans, Procedure: Rapidtrace, 2014) Voor een ‘Ion Exchange Chromatography’, IEC, moeten het analiet en sorbent tegenovergesteld geladen zijn. ‘Anion exchange’ wordt gebruikt om negatief geladen ionen tegen te houden op een positief oppervlak. (Arsenault, 2012) Een typisch SPE protocol bestaat uit 4 stappen (zie figuur 13): -­‐ ‘Conditioning the packaging’: Methanol of acetonitrile wordt doorheen de cartridge gestuurd. Het verwijdert elke onzuiverheid afkomstig van het productieproces of toevallige vervuiling uit de omgeving. Het laat ook toe het sorbent te solvateren indien nodig. -­‐ ‘Sample application’ (‘loading’): Het monster wordt indien nodig opgelost in een zwak solvent en op de kolom gebracht. Voor ion exchange is het zwakke solvent water of buffer waaraan bv. 10% organisch zuur is aan toegevoegd. -­‐ ‘Washing the packing’ (‘rinsing’): verwijderen van zoveel mogelijk interferenties door de cartridge te wassen met een solvent van gemiddelde sterkte. De wasstap wordt stop gezet net voordat het analiet loskomt van de cartridge zodat geen verlies van het analiet optreedt. -­‐ ‘Elution and recovery of the analyte’: in deze stap wordt het analiet geëlueerd en de fractie van het analiet wordt gecollecteerd. Figuur 13: Schematisch overzicht van Ion-exchange chromatografie 18 III. Experimenten 1. Materiaal en methode 1.1 Materiaal Tabel 2: Gebruikte commerciële controles Commerciële controles Kalibratoren QC UTAK SAS 19 ClinCal® -­‐ Calibrator (Serum Calibrator Set lyophilised) Methylmalonic Acid RECIPE Level 0: < 21.0 nmol/L Level I: 223 nmol/L Level II: 803 nmol/L Level III: 1468 nmol/L ClinChek® -­‐ Control (Serum Control lyophilised) Methylmalonic Acid RECIPE Level I: 208 – 312 nmol/L Level II: 467 – 700 nmol/L BI – Level Methylmalonic Acid – Serum Toxicology Control van UTAK Laboratories Inc. Level I: Target value: 200 nmol/L Verified value: 202 nmol/L Expected range: 170 – 230 nmol/L Level II: Target value: 1000 nmol/L Verified value:1020 nmol/L Expected range: 870 – 1170 nmol/L Special Assays Serum – ErndimQA Sample 127: Mean: 244 nmol/L Median: 230 nmol/L Sample 131: Mean: 243 nmol/L Median: 240 nmol/L ClinCal® -­‐ Calibrator (Serum Calibrator Set lyophilised) Methylmalonic Acid RECIPE Level 0: < 25.4 nmol/L Level I: 220 nmol/L Level II: 770 nmol/L Level III: 1431 nmol/L Methylmalonzuur, met pKa van 3,07, en de gedeutereerde standaard MMA-­‐d3 werden aangekocht bij de firma ISOTEC Sigma Aldrich. Er werden stockoplossingen bereid van 10 mmol/l voor methylmalonzuur en de gedeutereerde standaard MMA-­‐d3 en een werkoplossing van 0,01 mmol/L door 100 µl van de MMA stockoplossing op te lossen in 100 ml milliQ water. Voor de oppuntstelling werd kalfsserum gebruikt (leverancier Bovogen Biologicals), met een concentratie van ongeveer 2000 nmol/L methylmalonzuur, drie keer gemeten op UPLC-­‐ MS/MS. Hiervan hebben we volgende verdunningen gemaakt: vier keer verdund tot een MMA concentratie van om en bij 500 nmol/L en tien keer verdund tot een concentratie van ongeveer 200 nmol/L. De patiëntenmonsters werden afgenomen van vrijwilligers in lithium heparine SARSTEDT® oranje buizen van 9 ml. Deze tubes bevatten een gel die toelaat om de cellen makkelijker te scheiden van het plasma. Deze monsters worden gecentrifugeerd en het plasma wordt afgepipetteerd en bewaard bij -­‐20°C. SPE staalvoorbereiding werd uitgevoerd op Sep-­‐Pak® Accell™ Plus QMA Cartridges kolommen van Waters. Dit type kolom is een gebaseerd op silica, hydrofiel, sterke anionenuitwisselaar met grote poriën die gebruikt wordt om anionische analieten in waterige en niet-­‐waterige oplossingen te extraheren. Volgende buffers werden gebruikt voor: -­‐ Conditioneren en wassen: o Methanol (CH4O )ULC/MS van de firma Biosolve BV met een zuiverheid van 99,98% o MQ water van de MQ waterkraan -­‐ Monster laden: o Fosfaatbuffer, 0,05 mol/l met een pH van 6,5 door 31,5 ml Na2HPO4 op te lossen met 68,5 ml NaH2PO4 -­‐ Elueren o Formic Acid (CH2O2, mierenzuur) van de firma Emsure® met een concentratie van 98-­‐100%, maar hiervan werd een werkoplossing van 5% FA in methanol gemaakt om te gebruiken als eluens. Voor analyse van de monsters werd een Waters UPLC-­‐MS/MS toestel gebruikt met een Waters Acquity™ UPLC® type HSS=T3 als kolom (1,8 µm; 2,1 mm x 100 mm). HSS staat voor High Strength silica. De silica deeltjes zijn ontworpen voor een hoge mechanische stabiliteit en hebben een passende morfologie voor een lange levensduur van de kolom en genoeg efficiëntie bij hoge druk. De mobiele fases die gebruikt worden: -­‐ Methode 1, 2 & 3 o A2: 1% v/v FA in 1L MQ (10 ml FA in 1 L MQ) o B2: 0,3% FA in 1L MeOH (3 ml FA in 1 L methanol) -­‐ Methode 4: o A1: 0,1% FA in MQ ULC/MS van Biosolve BV (1 ml FA in 1 L MQ ULC/MS) o B2: 0,3% FA in 1l MeOH (3 ml FA in 1 l methanol) 20 Mobiele fases werden maximaal 1 maand gebruikt. Als weak needle wash werd 50 ml acetonitrile ULC/MS (C2H3N, concentratie 99,97%) van Biosolve BV met 950 ml MQ gemengd. Voor de onteiwitting van monsters in alle methodes werd een mengsel gemaakt van 80 ml ACN en 20 ml methanol (Biosolve BV). Na staalvoorbereiding werden monsters opgelost in oplossingssolvens, gemaakt door 3 ml FA op te lossen in 100 ml MQ ULC/MS van Biosolve. 21 1.2 Apparatuur De analyses van deze oppuntstelling gebeuren op een Acquity™ Ultra Performance Liquid Chromatography systeem. Deze bestaat uit drie componenten: een Binary Solvent Manager , een Sample Manager en Column Manager. Een Waters TQ Detector wordt gebruikt om de componenten te detecteren. C B D A Figuur 14: UPLC met Binary Solvent Manager (A), de Sample Manager (B), de Column Manager (C) en de TQ detector (D) De Binary Solvent Manager bestaat uit een binaire pomp en een vacuümontgasser voor de vier solventleidingen. Twee solventen worden gemengd met een constante (isocratische) of variabele (gradiënt) samenstelling door de binaire pomp onder hoge druk. In deze thesis wordt gebruik gemaakt van een gradiënt. De gradiënt gaat zorgen voor een versnelde elutie van componenten die sterk binden aan de stationaire fase met een lagere retentietijd en smallere pieken. Hier wordt gebruik gemaakt van twee oplossingen in de mobiele fase, waarbij milliQ water wordt gebruikt als zwakke oplossing en een sterke oplossing, het organisch component methanol. De zwakke oplossing gaat ervoor zorgen dat de opgezuiverde componenten langzaam gaan elueren, de sterke oplossing gaat er dan weer voor zorgen dat het monster sneller door de kolom loopt. Er wordt gebruik gemaakt van een C18, silica, kolom. MMA is polair en gaat weinig interactie met de vaste fase vertonen en met een waterige mobiele fase van de kolom lopen, dit duidt op weinig retentie. Apolaire stoffen gaan een veel grotere interactie met de kolom vertonen en in dat geval is een meer organische mobiele fase nodig om die interacties te verbreken. De begincondities van de gradiënt bestaan uit een grotere verhouding van solvent A en een kleinere verhouding van solvent B. Naarmate de analyse gaat vorderen, gaat er een grotere verhouding van solvent B gevormd worden en een kleinere verhouding van solvent A. Boven de binaire pomp bevindt zich de Sample Manager waarin twee compartimenten te vinden zijn. Het monstercompartiment bevindt zich aan de linkerkant. Hierin zitten twee uitschuifbare monsterhouders, een automatische injector en de injectienaald. Het monstercompartiment kan gethermostatiseerd worden tussen 4°C en 40°C. Het injectievolume kan ingesteld worden tussen 0,1 en 50 µl, hier maken we gebruik van 10 µl injectievolume in full loop modus, wat ook de maximale hoeveelheid is van de sample loop. Het needle wash compartiment bevindt zich aan de rechterkant. 22 In de Column Manager bevindt zicht de kolomoven waarin de analytische kolom wordt verwarmd, want lagere temperaturen leiden tot een hogere viscositeit met hogere drukken tot gevolg. De temperatuur kan gaan van minstens 5°C boven de omgevingstemperatuur tot 65°C, in dit geval 30°C. Aan de kolom is een microchip bevestigd die het serienummer van de kolom opslaat en het toestel kan hieraan de gegevens dan linken. Ik heb gebruik gemaakt van de Waters Acquity™ UPLC® van het type HSS-­‐T3 kolom (1,8 µm; 2,1 x 100 mm). De kolom is een C18-­‐kolom (18 koolstofatomen), silicakolom. Door deze vele koolstofatomen is deze soort kolom zeer apolair. Vandaar dat de mobiele fases polair zijn en vaak bestaan uit een waterige en een organische oplossing. Indien de component zeer apolair is, gaat deze een goede interactie met de kolom ondervinden t.o.v. polaire stoffen die een moeilijke interactie met de apolaire kolom gaan ondervinden. Deze laatste zullen dan ook snel van de kolom elueren. Hoe meer apolair de stof is, hoe hoger de retentietijd gaat zijn. De componenten worden gedetecteerd door een TQ detector na elutie van de analytische kolom. Deze detector is uitgerust met een elektrospray ionisatiebron, een tripel quadrupool als analysator en een fotonvermenigvuldiger als detector. Op het chromatogram wordt de absorptie i.f.v. de tijd weergegeven. Het softwareprogramme MassLynx® (Waters) is het besturingssysteem voor de UPLC. In TargetLynx® kunnen de resultaten verwerkt worden zoals de integratie, opstellen van de ijklijnen en het berekenen van de concentraties. (Lanckmans, Procedure: Toestellen algemeen UPLC-MS/MS, 2009) De Rapidtrace, zie figuur 15, is een toestel dat gebruikt om SPE analyses mee uit te voeren.. Het toestel te UZ Brussel heeft drie modules, waarbij elke module geladen kan worden met 10 buisjes van 3 ml en 10 buisjes van 6 ml. De Rapidtrace is zeer makkelijk te besturen via een softwareprogramma. Het toestel is ontworpen om de staalvoorbereiding te automatiseren en om de te bepalen componenten op te zuiveren. (Rapid Trace SPE Workstation, 2012) Figuur 15: Rapidtrace toestel met 3 modules 23 1.3 Methode ontwikkeling Eerst hebben we de UPLC-­‐MS/MS getuned, (zie tabel 3), dit houdt in dat de juiste ion mode wordt geselecteerd, in dit geval de negatieve electrospray. Deze wordt gebruikt om vanaf basische of neutrale oplossingen de vorming van negatieve ionen te vergroten. De optimale collisie energie wordt bepaald voor elk dochterion. De parameters worden allemaal zo optimaal mogelijk ingesteld voor de target molecule, in dit geval methylmalonzuur. In tabel 4 zijn de geoptimaliseerde parameters beschreven. Bij het tunen van de UPLC-­‐MS/MS tracht men een zo hoog mogelijke detectorrespons te bekomen voor het precursorion en de dochterionen. Tabel 3: Stappen tuning UPLC-MS/MS -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ -­‐ API gas inschakelen en collision gas uitschakelen Ion mode kiezen: Electrospray – Fluidics infusion: 10 µl/min (eerste prime) Analyser in MS mode zetten Optimum voor parent ion bepalen door: cone voltage te variëren tot maximum 40V Function = MS Scan Grafiek instellen, door ‘span’ en ‘gain’ aan te passen Nadien daughter ions optimaliseren Collision gas inschakelen Analyser in MS/MS mode zetten Voor elk dochterion de optimale collision energie bepalen Function = Daughter scan De component wordt rechtstreeks in de MS geïnjecteerd in een verdunning in 0,1% mierenzuur/ACN (50/50). Tabel 4: Parameters ESI-MS/MS METHYLMALONZUUR 100 µMOL/L: 100 KEER VERDUND UIT STOCK 10 MMOL Parent ion m/z Cone V Daugther ion m/z Collision Energy EV 116.98 23V 73.00 10V 55.30 20V INTERNE STANDAARD METHYLMALONZUUR d3: STOCK METHYLMALONZUUR d3 = 1 MG/L = 8.3 MM 120 µL STOCK IN 100 ML 0,1% FA ACN = 100 µM MMA D3 Parent ion m/z Cone V Daugther ion m/z Collision Energy EV 120.0 20V 76.00 10V 24 1) Instellen methode volgens protocol Wilhelmina Nijmegen METHODE 1: Wilhelmina Nijmegen In tabel 4 is de procedure beschreven gebaseerd op het artikel van het ziekenhuis Wilhelmina Nijmegen. Er wordt 50 µl interne standaard gemengd met 100 µl monster (plasma). Dit wordt dan even geschud op de vortex. Dan wordt er 1000 µl acetonitrile/methanol (80/20 v/v) toegevoegd aan het mengsel om de proteïnen neer te slaan. Dit wordt opnieuw krachtig gevortext. Het mengsel wordt 5 minuten gecentrifugeerd aan 4000 rpm op 4°C en het supernatans wordt overgebracht in een nieuwe eppendorf en dit wordt drooggedampt onder stikstof bij 50°C. Na droogdampen lost men het residu op in 100 µl 3% mierenzuur in milliQ water, een protisch oplosmiddel, om methylmalonzuur opnieuw in oplossing te brengen. Aangezien methylmalonzuur een zwak zuur is, betekent wanneer deze in oplossing is altijd een fractie geprotoneerd en een fractie gedeprotoneerd is. In deze thesis wordt er opgelost in een zuur oplosmiddel, 3% mierenzuur in milliQ water, waarmee MMA geprotoneerd wordt. Dit wordt bepaald door de pKa van MMA en van de pH waarin het opgelost wordt. Nadat het opnieuw gevortext en gecentrifugeerd is wordt het in een vial met insert overgebracht, nogmaals gecentrifugeerd en op het toestel geplaatst. De details van de procedure zijn terug te vinden in tabel 5. Enkele voordelen van deze methode zijn dat er kleine hoeveelheden gebruikt worden, 100 µl monster voornamelijk van het plasma. Dit zou positief voor de patiënt zijn dat men niet veel monster nodig heeft zodat het geen intensieve afname is voor de patiënt. Het is ook een zeer snelle en simpele methode om uit te voeren. Met deze methode zijn heel wat bepalingen uitgevoerd. In het begin hebben we voornamelijk humaan plasma gespiked zodat we aan een concentratie komen van 5000 nmol/L. Enkele reeksen van kalibratoren en commerciële controles zijn ook uitgevoerd, om na te gaan of we de concentratie meten die deze zouden moeten hebben. Nadien zijn de validatietesten uitgevoerd met deze methode. Voornamelijk bij lineariteit waren er altijd veel outliers. Hierdoor hebben we de standaardadditiemethode geïntroduceerd en dit gaf betere resultaten. Van dezelfde monsters die gebruikt werden bij de standaardadditiemethode werd ook een guthriekaartje naar een ander ziekenhuis gestuurd, om na te gaan of onze concentraties methylmalonzuur die we bekwamen hetzelfde waren als deze van het guthriekaartje. Dit was echter niet het geval, dus moest er nagedacht worden over een andere methode. Dit was niet de enige reden om van methode te veranderen, maar ook dat de bron van de UPLC-­‐MS/MS zeer vervuild geraakte door deze monsters. Deze waren niet altijd helder en eerder troebel, dit kwam doordat er enkel met acetonitrile geprecipiteerd werd. 25 Tabel 5: Overzicht van de procedure voor bepaling van MMA volgens het artikel van Wilhelmina Nijmegen (Beijers, van Daal, & van den Ouweland, Methylmalonzuurmeting in serum en urine met behulp van LC-tandem massaspectrometrie, 2011) MONSTERVOORBEREIDING IN EPPENDORF 50 µl 100 µl Vortex 1000 µl 16500 nM methylmalonzuur d3 Monster ACN/MeOH 80/20 v/v met socorexpipet + pasteurpipet Rotina centrifuge 4000 t 5 min 4°C Met pasteurpipet 3% FA in MQ Rotina centrifuge 4000 t 5 min 4°C Rotina centrifuge 4000 t 5 min 4°C Methode: Wilhelmina Nijmegem.w2200 Vortex krachtig Centrifugeren SN in nieuw eppendorf overbrengen Droogdampen onder N2 bij 50°C Oplossen in: 100 µl Vortex Centrifugeren Overbrengen in vial met insert Vial met insert afdraaien 10 µl injectievolume 2) Aanpassen staalvoorbereiding richting SPE + optimalisatie SPE Omwille van de obstakels die we hadden met de methode van het Wilhelmina ziekenhuis, zijn we SPE gaan introduceren. Hier zijn we eerst het monstervolume gaan nagaan, namelijk of dat 100 µl nog steeds optimaal is of dat er overgeschakeld moet worden op 200 µl, om na te gaan of 100 µl voldoende is om een LOD te halen die gelijk is aan de ondergrens van het referentie interval. Dit zijn we nagegaan door de procedure van tabel 5 te volgen en gebruik te maken van 100 µl monster en eens 200 µl monster. We konden besluiten dan 100 µl nog steeds voldoende is, omdat de resultaten van 200 µl en 100 µl vergelijkbaar waren. De bekomen concentraties bij beide hoeveelheden waren beiden aanvaard, omdat ze binnen de grenzen lagen van de theoretische concentratie van de kalibratoren. Nadien zijn we nagegaan of de monsters met een wasstap met methanol betere resultaten gaven, dan de monsters die zonder de methanol wasstap werden voorbereid op de Rapidtrace, zie tabel 6. Hieruit konden we besluiten dat die zonder methanol redelijk troebel waren door het aanwezige MQ. MMA is een zwak zuur en gaat niet volledig ioniseren in water. Deze monsters waren dus niet te injecteren want hierdoor werd de bron weer vervuild. 26 Tabel 6: Procedure op Rapidtrace toestel Procedure Rapidtrace CONDITIONEREN 3,75 ml MeOH 3,75 ml MQ MONSTER LADEN 1,5 ml monster WASSEN 2 ml MQ 2 ml MeOH ELUEREN 2 ml 5% FA in MeOH Dit was ook een snelle methode, maar aangezien er maar plaats is voor 10 monsters op het Rapidtrace toestel, waaronder 4 kalibratoren en 2 controles en 4 monsters, is dit niet optimaal als er veel monsters moeten behandeld worden, aangezien we maar één module ter onze beschikking bezitten van de Rapidtrace. De methode van het toestel, wordt dan manueel uitgevoerd en vergeleken. In tabel 7 wordt de volledige procedure getoond met gebruik van de Rapidtrace. Met deze methode dient enkel de staalvoorbereiding manueel uitgevoerd te worden, het conditioneren, het monster laden, het wassen en het elueren worden uitgevoerd door de Rapidtrace. Tabel 7: Volledige procedure met Rapidtracetoestel MONSTERVOORBEREIDING IN LANGE GLAZEN SPE BUIZEN 50 µl 16500 nM methylmalonzuur d3 100 µl Monster Vortex 900 µl Fosfaatbuffer pH 6,5 Vortex krachtig Op RAPIDTRACE plaatsen SPE Sep Pak Vac 3cc (500 mg) Eulaat droogdampen onder N2 bij 50°C Oplossen in: 100 µl 3% FA in MQ Vortex Centrifugeren Rotina centrifuge 4000 t 5 min 4°C Overbrengen in vial met insert Vial met insert afdraaien Rotina centrifuge 4000 t 5 min 4°C 10 µl injectievolume Methode: Wilhelmina Nijmegem.w2200 27 METHODE 3: Manuele SPE Methode De methode met het toestel gaf als nadeel dat er maar 4 monsters, naast de controles en kalibratoren, konden geëxtraheerd worden, dus zijn we overgeschakeld naar een manuele versie van de procedure van de Rapidtrace. Een aantal keren wordt wel nog de manuele methode vergeleken met de methode via de Rapidtrace. Deze manuele methode gaf betrouwbare resultaten en was ook snel, met als voordeel dat er meer monsters kunnen behandeld worden. De centrifugestap leek ons beter om op een lagere rpm af te draaien, langer te laten centrifugeren en op een hogere temperatuur aangezien deze op de Rapidtrace niet gecentrifugeerd worden en daar staan de monsters op kamertemperatuur en zo gaat het monster door de packing van de SPE buis. Op de Rapidtrace wordt het monster door de packing geduwd d.m.v. een soort arm. Het eluaat wordt gecentrifugeerd om het zo helder mogelijk op het UPLC-­‐MS/MS toestel te plaatsen. 28 Tabel 8: Procedure met manuele SPE methode MONSTERVOORBEREIDING MONSTER IN LANGE GLAZEN SPE BUIZEN 50 µl 16500 nM methylmalonzuur d3 100 µl Monster Vortex 900 µl Fosfaatbuffer pH 6,5 Vortex krachtig Werkwijze IN LANGE PLASTIC TUBES + SEP PAK VAC 3CC (500 MG) CONDITIONEREN 2 ml MeOH Centrifugeren Rotina centrifuge 4000 t 30 seconden 4°C Waste 2 ml MQ Centrifugeren Rotina centrifuge 4000 t 30 seconden 4°C Waste MONSTER LADEN Monster Centrifugeren Rotina centrifuge 4000 t 30 seconden 4°C Waste WASSEN 2 ml MQ Centrifugeren Rotina centrifuge 4000 t 30 seconden 4°C Waste 2 ml MeOH Centrifugeren Rotina centrifuge 4000 t 30 seconden 4°C Waste Nieuwe tube nemen ELUEREN 2 ml 5% FA in MeOH Centrifugeren Rotina centrifuge 4000 t 30 seconden 4°C Overbrengen in lange glazen tubes Eulaat droogdampen onder N2 bij 50°C Oplossen in: 100 µl 3% FA in MQ Vortex Centrifugeren Rotina centrifuge 4000 t 5 min 4°C Overbrengen in vial met insert Vial met insert afdraaien Rotina centrifuge 4000 t 5 min 4°C 10 µl injectievolume Methode: Wilhelmina Nijmegem.w2200 29 METHODE 4: Manuele SPE Methode bijgewerkt De centrifugatiestap is bijgewerkt, omdat ook op de rapidtrace de monsters bij kamertemperatuur staan en omdat de vloeistof niet vanzelf door de kolommen gaan lopen. Dit komt omdat de packing te dicht is. Door gebruik te maken van de centrifuge gaat de vloeistof sneller door de packing lopen. Op de Rapidtrace gebeurt dit door een soort arm die het monster door de packing duwt. Via deze methode hebben we ook een nieuwe kolom voor UPLC-­‐MS/MS geïntroduceerd, want de kolom was vervuild en de stationaire fase was niet meer optimaal op een goede piekvorm en retentietijd te garanderen. De pieken werden asymmetrisch. Dit merkten we aan de resultaten dat de bekomen concentraties van de kalibratoren en commerciële controles niet meer binnen de grenzen vielen van de theoretische controle. De resultaten waren niet meer betrouwbaar. Met deze nieuwe kolom zijn we nagegaan of mobiele fase met 0,1% FA in MQ water even goede resultaten geeft als 1% FA in MQ water. Hieruit bleek dat 0,1% FA in MQ water ook goede resultaten als 1% FA in MQ water, dus zijn we zelf bereidde 0,1% FA gaan gebruiken als mobiele fase. Dit geeft de mobiele fase een pH van ongeveer 2,6. Hierbij gaat methylmalonzuur niet ioniseren, omdat de mobiele fase meer polair is. Met deze methode zijn de validatietesten dan uitgevoerd. 30 Tabel 9: Bijgewerkte procedure met manuele SPE methode MONSTERVOORBEREIDING MONSTER IN LANGE GLAZEN SPE BUIZEN 50 µl 16500 nM methylmalonzuur d3 100 µl Monster Vortex 900 µl Fosfaatbuffer pH 6,5 Vortex krachtig Werkwijze IN LANGE PLASTIC TUBES + SEP PAK VAC 3CC (500 MG) CONDITIONEREN 2 ml MeOH Centrifugeren Rotina centrifuge 1000 t 1 minuut 15°C Waste 2 ml MQ Centrifugeren Rotina centrifuge 1000 t 1 minuut 15°C Waste MOSTER LADEN Monster Centrifugeren Rotina centrifuge 1000 t 1 minuut 15°C Waste WASSEN 2 ml MQ Centrifugeren Rotina centrifuge 1000 t 1 minuut 15°C Waste 2 ml MeOH Centrifugeren Rotina centrifuge 1000 t 1 minuut 15°C Waste Nieuwe tube nemen ELUEREN 2 ml 5% FA in MeOH Centrifugeren Rotina centrifuge 1000 t 1 minuut 15°C Overbrengen in lange glazen tubes Eulaat droogdampen onder N2 bij 50°C Oplossen in: 100 µl 3% FA in MQ Vortex Centrifugeren Rotina centrifuge 4000 t 5 min 4°C Overbrengen in vial met insert Vial met insert afdraaien Rotina centrifuge 4000 t 5 min 4°C 10 µl injectievolume Methode: MMA150102.w2200 31 1.4 Methodevalidatie i. Retentietijd Er wordt nagegaan of de retentietijden in echte monsters voldoen aan de opgelegde criteria van de Europese commissie: van 10 patiëntenmonsters wordt de relatieve retentietijden vergeleken met de relatieve retentietijden van de standaard/controle. De relatieve retentietijd van het monster mag voor LC maximaal 2,5% afwijken van de relatieve retentietijd van de calibratieoplossing. De relatieve retentietijd is de verhouding van de retentietijd van de standaard op de retentietijd van het monster. Tijdens het meten van de retentietijd zijn we ook nagegaan of bij alle resultaten succinaat gescheiden was van methylmalonzuur. ii. Carry over Twee patiëntenmonster of gespiked plasma met hoge en lage concentratie worden geanalyseerd in een bepaalde volgorde om overdracht tussen de verschillende injecties uit te sluiten. Er wordt hierbij nagegaan of een signaal van een analiet verschijnt in een monster met lage concentratie na een aantal monsters te analyseren met hogere concentratie. Tabel 10: Volgorde carry over Volgorde 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 32 Laag/Hoog L1 L2 L3 H1 H2 L4 H3 H4 L5 L6 L7 L8 H5 H6 L9 H7 H8 L10 H9 H10 L11 iii. Ion ratio’s Ion ratio’s zijn de verhouding van de piekoppervlakten voor beide transities (moederion ! dochterion). Deze verhouding moet voor een juiste identificatie van methylmalonzuur telkens dezelfde zijn, binnen opgelegde grenzen. Het betrouwbaarheidsinterval voor de ion ratio’s wordt bepaald door 10 analyses van een standaard uit te voeren. iv. Analytische gevoeligheid De detectielimiet en kwantificeringslimiet worden in het labo traditioneel bepaald door van eenzelfde blanco monster herhaalde metingen uit te voeren. De detectielimiet is de laagste concentratie van het analiet dat kan gemeten worden door het toestel. De kwantificeringslimiet is de laagste concentratie die niet alleen kan worden gedetecteerd, maar ook kwantitatief juist is. Na enkele metingen uit te voeren van blanco humaan plasma, hebben we vastgesteld dat elk menselijk monster methylmalonzuur bevat, want dit is een component van het menselijk metabolisme. Deze validatietest wordt dan uitgevoerd d.m.v. kalibratiecurves en resultaten van lineariteit. v. Recovery Om de recovery te bepalen worden zes monsters telkens blanco en gespiked met een gekende concentratie MMA gemeten. De recovery wordt berekend via de formule: (!!!!!) Recovery (%) = !! 𝑥 100, waarbij C1 de concentratie is van het verrijkte monster, C2 de concentratie van het monster dat niet verrijkt is en C3 de concentratie van de verrijking. vi. Lineariteit Het lineair gebied wordt bepaald door een verdunningsreeks van kalibratoren in duplo te analyseren met concentraties van 25 nmol/L tot 1431 nmol/L. vii. Precisie en bias Uit de driemaal herhaalde analyse van vier controles door drie personen, worden de precisie en bias berekend. Precisie, of CV, wordt berekend door per controle de standaarddeviatie van de herhaalde metingen te delen door het gemiddelde van de herhaalde metingen. De bias wordt per herhaling berekend door van de gegeven concentratie van de controle, de bekomen concentratie per meting af te trekken en dit delen door de bekomen concentratie. 33 2. Resultaten 2.1 Methodevalidatie i. Retentietijd De retentietijd van methylmalonzuur is gemiddeld 2,60 minuten en die van de interne standaard methylmalonzuur-­‐d3 bedraagt 2,59 minuten. Dit kan men onderscheiden van elkaar omdat deze elk een andere massa hebben. Het criterium van de Europese Commissie is dat de maximale tolerantie op de relatieve retentietijd 2,5% is voor LC tussen de RRT van het monster en die van de standaard. Over twintig controles hebben wij een maximale afwijking van 0,38, met een maximum van 0,39, dit is te zien in tabel 12 in bijlage. Dit is ongeveer gelijk voor beide, methylmalonzuur als de IS. De scheiding van succinaat (barnsteenzuur) met methylmalonzuur zijn we nagegaan tijdens het experiment van de retentietijd. Op figuur 16 is te zien dat voor beide transities succinaat (witte piek) volledig gescheiden is van methylmalonzuur (grijze piek). Figuur 16: Scheiding van succinaat ii. Carry over Volgens de bepaalde volgorde zoals te zien is in tabel 13 in bijlage werd dit uitgevoerd en zijn de resultaten aanvaardbaar, want er is geen overdracht tussen de levels, van de lage levels naar de hoge levels en omgekeerd. In de low-­‐low kolom is te zien dat er geen overdracht is tussen de lage levels, in de high-­‐low kolom is dan weer te zien dat er geen overdracht is van de hoge levels naar lage levels. De error limiet is de toegestane hoeveelheid overdracht en is drie maal de standaarddeviatie van de bekomen concentraties in de low-­‐low kolom. De carry over bedraagt 4 nmol/L, dit is het verschil van het gemiddelde van de concentraties uit de high-­‐low kolom en het gemiddelde van de concentraties uit de low-­‐low kolom. Van carry over spreekt men wanneer de carry over waarde groter is dan de error limiet. 34 iii. Ion ratio’s Op figuur 17 is het resultaat van beide transities te zien, namelijk 117!73 en 117!55. De ruwe date van de ion ratio’s staat in tabel 14 in bijlage. De gemiddelde ion ratio bedraagt 0,0195 en is te zien op figuur 20 in bijlage als het rode coördinaat. We bekomen 0,016l als ondergrens en 0,023 als bovengrens voor het betrouwbaarheidsinterval berekend a.d.h.v. de standaarddeviatie en de coverage factor k die 3 bedraagt. Dit duidt op dat het betrouwbaarheidsinterval 99,7% moet bedragen. Figuur 17: Piekoppervlakten beide transities iv. Recovery Voor deze validatietest hebben we de methylmalonzuurconcentratie in eigen plasma bepaald d.m.v. de standaardadditiemethode. Uit de formule, y = ax + b, kunnen we x, de concentratie van het eigen humaan plasma, berekenen, wat 319 nmol/L bedraagt, zie figuur 18. Het plasma werd gespiked met gekende concentraties van methylmalonzuur en de range van het spiken lag van 50 tot 3000 nmol/L, zie tabel 15 in bijlage. In deze validatietest wordt nagegaan of het toestel effectief deze concentraties ook gaat bekomen alsook de opbrengst van de staalvoorbereidingsprocedure. Uit de resultaten van deze metingen werd per meting de recovery (formule: Recovery (%) (!!!!!) = !! 𝑥 100) berekend, het gemiddelde van de alle bekomen waarden voor de recovery, 100,33% en de range van de recovery berekend, 76,1% -­‐ 122,57%. De ruwe data hiervan staan in tabel 16 in bijlage. Uiteindelijk wordt er bijna altijd de concentratie die toegevoegd is teruggevonden, vandaar de 100,33% recovery wat een goed resultaat is. 35 Standaardaddititie 0,3 y = 0,0001x + 0,0319 R² = 0,99992 Signaal 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 500 1000 1500 2000 2500 Conc toegevoegd (nmol/l) Figuur 18: Grafiek standaardadditie v. Lineariteit en analytische gevoeligheid De standaardreeks werd verkregen uit het mengen van kalibratoren. We kunnen uit figuur 19 besluiten dat de methode lineair is, omdat de correlatiecoëfficiënt 0,99961 bedraagt. Het laagste punt dat getest werd is 25 nmol/L. Aangezien een concentratie van 25 nmol/L moeilijk detecteerbaar is, wordt de ondergrens van het meetbereik verlegd naar 50 nmol/L. De bovengrens, verhoogde MMA waarden, wordt vastgelegd op 400 nmol/L, omdat dit ook in de literatuur terug te vinden is. (Stichting Orthokennis) Een blanco monster wordt normaal gemeten om na te gaan of er enige ruis, onnodige pieken aanwezig zijn die de kwantificatie en de identificatie kunnen bemoeilijken. Voor de analytische gevoeligheid wordt de ijklijn gebruikt van lineariteit, omdat ieder persoon wel methylmalonzuur bezit. Hierdoor kunnen dus geen blanco monsters kunnen gemeten worden en worden de detectielimiet en kwantificeringslimiet via deze validatietest bepaald. De detectielimiet, LOD, is de laagste concentratie die gedetecteerd kan worden. Aangezien er vanaf 50 nmol/L duidelijk gedetecteerd kan worden, wordt de LOD hierop vastgelegd. Deze waarde hebben we ook kunnen bevestigen door tijdens andere testen na te gaan of dit effectief zo was. De kwantificeringslimiet, LOQ, is de laagste concentratie die nog kwantitatief correct is. De LOQ wordt vastgelegd op de waarde van de laagste UTAK controle, namelijk 200 nmol/L. Deze kan gemeten worden met een aanvaardbare CV van 9,6%. 36 1600,00 y = 1x - 0,111 R² = 0,99961 Experimentele concentratie (nmol/L) 1400,00 1200,00 1000,00 800,00 600,00 400,00 200,00 0,00 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Theoretische concentratie (nmol/L) Figuur 19: Standaardreeks MMA verkregen uit mengen van commerciële controles vi. Precisie en bias Zoals men kan zien in tabel 11, zijn de resultaten hierbij goed, want er is een lage CV en een lage bias voor de vier controles. Hoe lager de bias, hoe juister er gemeten is. Enig nadeel is dat er in de praktijk verschillende outliers waren met afwijkende resultaten voor de controles. In tabel 18 en 19 in bijlage worden de ruwe data weergegeven. Tabel 11: Resultaten precisie en bias 4 controles door 3 personen nmol/L CV (%) Gemiddelde bias (%) L1 202 5,9 -­‐1,9 L2 260 7,5 -­‐4,6 L3 583 5,2 -­‐4,3 L4 1020 5,8 -­‐5,6 37 3. Discussie Voor de methodeontwikkeling zijn we gestart met het implementeren van deze van het ziekenhuis Wilhelmina Nijmegen, beschreven in tabel 4. Met deze snelle en gebruikvriendelijke methode kan een kleine hoeveelheid plasma gebruikt worden, namelijk 100 µL. Zoals eerder vermeld is dit positief voor de patiënt, omdat er slechts een klein volume bloedstaal nodig is. We hebben dit protocol geruime tijd getest en de methode leek voldoende geschikt om de validatietesten uit te voeren. Dit gaf uiteindelijk toch problemen, zoals bij het uitvoeren van de lineariteit dat er te veel outliers waren. Lineariteit werd ook in duplo uitgevoerd en ook deze resultaten stemden niet overeen. Er waren echter nog enkele problemen zoals dat enkel de proteïneprecipitatie met acetonitrile onvoldoende is. De extracten waren nog te vuil, ze waren troebel en wit en dit is niet ideaal voor een LC-­‐MS/MS. Ook maken ze gebruik van mobiele fases met hoge concentraties zuur. Dit gaf een vervuiling op de ionisatie bron van de LC-­‐MS/MS. De auteur van het artikel hebben we gecontacteerd en bevestigde inderdaad het probleem. Door deze verschillende nadelen hebben we besloten om de staalvoorbereiding met SPE uit te voeren. De werkwijze hiervan staat beschreven in tabel 5. Ook hier kan er nog steeds een minimum aan volume gebruikt worden, namelijk 100 µL. Dit is bevestigd door de methode met zowel 200 µL als met 100 µL uit te voeren en te vergelijken. We zijn bij de SPE procedure ook nagegaan of het introduceren van een extra wasstap met methanol betere resultaten gaf, dan deze die zonder de methanol wasstap worden voorbereid. Deze laatste monsters gaven echter ook troebele extracten en uit ervaring met de eerste methode, hebben we deze niet geïnjecteerd, zodat de bron niet weer vervuild wordt. Er is dus besloten om de SPE kolommen toch te wassen met methanol. Deze methode met de Rapidtrace, is echter wel ook een snelle en simpele methode. Aangezien MMA een zwak zuur is, met een pKa van 3,12, is strong anion exchange in theorie de beste keuze. Anion exchange kolommen hebben een positieve lading om anionen aan te trekken. In het labo is een Rapidtrace toestel beschikbaar die de volledige SPE procedure automatisch kan uitvoeren. Alvorens het plasma op de kolom wordt aangebracht, wordt er eerst 50 µL interne standaard toegevoegd. Er wordt gekozen voor een fosfaatbuffer met pH 6,5, zodat het monster verdunt wordt dat zorgt voor een betere verdeling over de kolom. Ook gaat het de pH regelen, want rond pH 7 is MMA negatief geladen, zodat het aan de positieve partikels zal blijven plakken. (Pubchem) Met zure methanol wordt er geëlueerd, want door de lage pH zal MMA terug een proton opnemen en zijn lading verliezen. Daardoor komt het los van de kolom en kan het opgevangen worden. De staalvoorbereiding gaat meer matrix en onzuiverheden verwijderen voor de injectie en er wordt met normalere mobiele fases gewerkt, namelijk met lage concentraties zuur welke de pH van de mobiele fase gaat verlagen. Hierbij gaan de polaire componenten vertraagd worden en gaat de kolom langer mee. Ook de piekvorm gaat symmetrischer zijn. Het nadeel van de Rapidtrace was dat op het toestel slechts plaats is voor tien monsters. Er moeten telkens vier kalibratoren en twee controles mee, dus was er maar plaats voor vier monsters. Dit is niet optimaal als er een routinetest van gemaakt wordt en meer monsters moeten bepaald worden dan er op het toestel konden. 38 Daarom hebben we de methode via de Rapidtrace vergeleken met een manuele methode gelijkaardig aan de Rapidtrace, die weergegeven is in tabel 6. Deze methode is snel, ook kunnen we meer monsters behandelen dan met de Rapidtrace. In tabel 7 is te zien dat deze methode nog verder geoptimaliseerd is door één minuut te centrifugeren op 1000 rpm en bij 15°C i.p.v. een halve minuut te centrifugeren op 4000 rpm bij 4°C. Dit omwille van dat op de Rapidtrace de monsters op kamertemperatuur staan en niet worden afgedraaid. Er werd ook gebruik gemaakt van een nieuwe kolom, omdat de oude kolom al heel wat injecties had gekregen en de retentietijden verschoven. Op deze nieuwe kolom zijn we de zuurconcentraties in de mobiele fases gaan vergelijken: of er een verschil was tussen 1% FA in MQ water en 0,1% FA in MQ water. De resultaten met 0,1% FA in MQ water waren even goed als deze met 1% FA in MQ water, dus zijn we overgeschakeld naar het laagste zuurniveau, puur ook om de bron minder te vervuilen. Met deze geoptimaliseerde manuele SPE methode zijn dan de validatietesten uiteindelijke uitgevoerd. De retentietijd van methylmalonzuur bedroeg gemiddeld 2,60 minuten en deze van de interne standaard, methylmalonzuur-­‐d3, bedroeg 2,59 minuten, dit is te zien in tabel 12 in bijlage. Deze twee zijn van elkaar te onderscheiden, omdat ze elk een andere massa bezitten. Het criterium voor de relatieve retentietijd van het monster mag voor LC een maximale afwijking hebben van 2,5 % op de relatieve retentietijd van de kalibratieoplossing. Over 20 controles bedraagt de maximale afwijking bij ons 0,38, met een maximum van 0,39 zoals terug te vinden is in tabel 12 in bijlage. De methode heeft voldaan aan het criterium. In figuur 16 is de scheiding van succinaat met methylmalonzuur duidelijk te zien is op het chromatogram dus is dit voldaan. De carry over is volgens de bepaalde volgorde zoals te zien is in tabel 13 in bijlage uitgevoerd. De resultaten zijn aanvaardbaar, want er is geen overdracht tussen elk monster, dus ook geen overdracht tussen een laag en een hoog level en omgekeerd. Aangezien de carry over 4 nmol/L bedraagt en deze lager is dan de error limiet welke 16,757 nmol/L bedraagt, kan men niet spreken van carry over. Deze validatietest heeft uiteraard voldaan aan de eisen. Ion ratio’s zijn de verhouding van de piekoppervlakten voor beide transitites. Voor een correcte identificatie van methylmalonzuur moet deze dus telkens dezelfde zijn en binnen opgelegde grenzen liggen. Daarom stellen we een interval op waarbinnen met 99% zekerheid de verhouding moet liggen. Het resultaat is te zien op figuur 20, met 0,016 als ondergrens en 0,023 als bovengrens waarbinnen het interval moet liggen. Op figuur 16 is het resultaat van beide transities te zien, namelijk 117!73 en 117!55. De ruwe date van de ion ratio’s staat in tabel 14 in bijlage. De gemiddelde ion ratio bedraagt 0,0195 en is te zien op figuur 19 in bijlage als het rode coördinaat. We bekomen 0,016 – 0,023 als betrouwbaarheidsinterval berekend a.d.h.v. de standaarddeviatie en de coverage factor k die 3 bedraagt. Dit duidt op dat het betrouwbaarheidsinterval 99,7% moet bedragen. 39 Voor de bepaling van de recovery werd er van zes monsters telkens een blanco en een gespiked met gekende concentratie methylmalonzuur gemeten. Dit hebben we uitgevoerd door een standaardadditiemethode uit te voeren en zo de methylmalonzuurconcentratie te bepalen in eigen plasma. Hieruit is 319 nmol/L gekomen als concentratie methylmalonzuur in eigen plasma. Hierna werd het plasma gespiked met gekende concentraties tussen 50 en 3000 nmol/L van methylmalonzuur. Hieruit kwam dan een recovery van 100,33% als gemiddelde van alle metingen en de range van de recovery bedroeg 76,1% -­‐ 122,57%. Deze resultaten kunnen we ook beschouwen als goed en is deze ook gevalideerd. De methode is lineair, aangezien de correlatiecoëfficiënt 0,99961 bedraagt. 25 nmol/L is het laagste punt dat we gemeten hebben op deze manier, maar dit is moeilijk detecteerbaar. Dit komt door grote afwijkingen en lage piekoppervlakten. Hierdoor werd dus de ondergrens verlegd naar 50 nmol/L. Op klinisch vlak zijn enkel de verhoogde waarden belangrijk. In de literatuur zijn waarden normaal tot 350 à 400 nmol/L, boven 400 nmol/L wordt er gesproken van verhoogde MMA waarden. De bovengrens werd dus gelegd op 400 nmol/L, wat vanaf die waarde dus positief wordt beschouwd voor methylmalonzuuracidurie of vitamine B12 deficiëntie. Omwille er geen blanco monsters van methylmalonzuur bestaan, omdat humaan plasma dit sowieso bezit, hebben we de analytische gevoeligheid niet kunnen uitvoeren op de manier om op eenzelfde blanco monster herhaalde metingen uit te voeren. De detectielimiet werd a.d.h.v. ijklijnen en de experimenten van lineariteit bepaald, namelijk 50 nmol/L. Vanaf deze waarde kan er duidelijk methylmalonzuur gedetecteerd worden. De kwantificeringslimiet wordt dan weer bepaald via de laagste UTAK controle, deze van 200 nmol/L. Deze hebben we genomen, omdat na verschillende metingen deze een aanvaardbare CV, niet meer dan 10%, heeft van 9,6% wat dus lager is dan 10%. Precisie en bias: bij dit experiment hebben we de 4 controles laten analyseren door 3 personen. Algemeen gesproken zijn de resultaten hiervan heel goed. In tabel 19 worden de gemeten waardes weergegeven door de verschillende personen waarvan deze altijd in de buurt van de theoretische concentratie die het monster heeft. Dit zijn de uiteindelijke resultaten, maar in de praktijk met gewone metingen zitten er in de verschillende reeksen verschillende outliers met aberrante resultaten voor de controles. Dit zijn dus nog geen definitieve resultaten, de methode zal eerst verder geoptimaliseerd moeten worden, om het probleem van de outliers aan te pakken. Nadien dient de bepaling van precisie en bias opnieuw te gebeuren. Alle validatietesten zijn dus gevalideerd, op precisie en bias na, maar men kan concluderen dat we op de goede weg zitten om methylmalonzuur te introduceren op de UPLC-­‐MS/MS met SPE als staalvoorbereiding. 40 IV. Besluit Het monstervolume dat we voorop gesteld hebben om zo klein mogelijk te houden is gelukt. Namelijk 100 µL is voldoende om methylmalonzuur te detecteren in plasma. De staalvoorbereiding is nog steeds vrij kort, maar we hebben wel SPE moeten introduceren om een zuiver monster te verkrijgen, maar dit is te automatiseren naargelang er meer modules van de Rapidtrace kunnen gebruikt worden. Het is dus mogelijk om methylmalonzuur op het UPLC-­‐MS/MS toestel van UZ Brussel te bepalen, mits nog enkele verbeteringen. Dit was de eerste stap om de bepaling van organische zuren in plasma mogelijk te maken in het labo Metabole Stoornissen. Er zijn nog enkele zaken die moeten uitgevoerd worden, zoals het verbeteren van de reproduceerbaarheid van kwantificatie. Ook voor de klinische validatie moeten er nog referentiewaarden opgesteld worden en het toetsen van patiënten met methylmalonacidurie en vitamine B12 deficiëntie. De opgegeven waarde van 350 pmol/L is een richtwaarde voor het Wilhelmina Ziekenhuis te Nijmegen. In de literatuur zijn er namelijk sommige bronnen die een hogere referentiewaarde gebruiken en anderen een lagere. Uiteindelijk is het de bedoeling dat de referentiewaarden voor het UZ Brussel in de toekomst zelf bepaald worden in een representatieve populatie (per geslacht, per leeftijd, e.d.). Het doel is wel bereikt door een UPLC-­‐MS/MS methode te ontwikkelen met minimale staalvoorbereiding en met weinig staalvolume. 41 V. Bibiliografie Agilent Technologies. (2013). In Sample Preparation Fundamentals for Chromatography. Agilent Technologies. Allen, L. H., Keyes, W. R., Pedersen, T. L., Shahab-Ferdows, S., & Newman, J. W. (2011). Methylmalonic acid quantification in low serum volumes by UPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B (879), 1502-1506. Arsenault, J. C. (2012). Beginner's guide to SPE solid phase extraction. In J. C. Arsenault, Beginner's guide to SPE solid phase extraction. USA: Waters Corporation. Beijers, A., van Daal, H., & van den Ouweland, J. (2011). Diagnostische opbrengst van standaard reflexmeting op serum methylmalonzuur voor het vaststellen van een functioneel vitamine B12 tekort. Nederlands Tijdschrift Klinische Chemie Labgeneeskunde , 263-264. Beijers, A., van Daal, H., & van den Ouweland, J. (2011). Methylmalonzuurmeting in serum en urine met behulp van LC-tandem massaspectrometrie. Nederlands Tijdschrift Klinische Chemie Labgeneeskunde (36), 260-262. Beukema. (n.d.). Methylmalonzuuracidemie. Retrieved december 19, 2014, from Ziggo: http://members.ziggo.nl/b.beukema/mma.html Carvalho, V., & Kok, F. (2008). Determination of serum methylmalonic acid by alkylative extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry (381), 67-73. Chan, P., Fu, X., Pattengale, P., & Xu, Y.-K. (2013). Simple, Fast and Simultaneous Detection of Plasma Total Homocysteine, Methylmalonic Acid, Methionine and 2Methylcitric Acid Using Liquid Chromatography and Mass Spectrometry (LC/MS/MS). Journal of Inherited Metabolic Disease , 69-78. Cuthbert, C., Gavrilov, D., Loken, P., Magera, M., Matern, D., Oglesbee, D., et al. (2010). Determination of Total Homocysteine, Methylmalonic Acid, and 2-Methylcitric Acid in Dried Blood Spots by Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry , 11 (56), 1686-1695. DAAVISION. (n.d.). Zuren = Antibiotica? Is dat zo? Retrieved juli 15, 2015, from DAAVISION: www.scwd.nl/sendfile.php?cat=Powerpoint&name=Buis%20Ebbinge De Brabanter, N. (2014). LC-MS/MS Principes en data interpretatie. Seminarie TM Groep. Jette: UZ Brussel. de Rooij, S., Huijmans, J., Hoekstra, J., Fischer, J., & Wiersinga, W. (2005). De diagnostiek van vitamine-B12-deficiëntie herzien. Nederlands Tijdschrift voor Geneeskunde , 1-8. El-Khoury, J., Gabler, J., Spatholt, R., Wang, S., & Yuan, C. (2012). Highly sensitive and selective measurement of underivatized methylmalonic acid in serum and plasma by liquid chromatography-tandem mass spectroscopy. Analytical and Bioanalytical Chemistry (404), 133-140. 42 Gick, J. (n.d.). Organische zuren syndromen. Een gids voor patiënten, ouders en families. Retrieved juli 15, 2015, from European registry and network for Intoxication type Metabolic Diseases: http://www.e-imd.org/rc/e-imd/htm/Article/2011/e-imd-20110729-235456354/src/htm_fullText/nl/aciduries_org_NL.pdf Griffiths, W. J., & Wang, Y. (2009). Mass spectrometry: from proteomics to metabolomics and lipidomics. Chemical Society Reviews , 38, 1882-1896. Helgeson, J. K., Magera, M. J., Matern, D., & Rinaldo, P. (2000). Methylmalonic Acid Measured in Plasma and Urine by Stable-Isotope Dilution and Electrospray Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry , 1804-1810. Hoffmann, G. F., & Zschocke, J. (2014). In G. F. Hoffmann, & J. Zschocke, Vademecum Metabolicum Diagnosis and Treatment of Inborn Errors of Metabolism 3rd Revised Edition 2011 (p. 174). Milupa Metabolics and Schattauer. Lanckmans, K. (2014). Procedure: Rapidtrace. UZ Brussel, Toxicologie - Metabole Stoornissen. Jette: UZ Brussel. Lanckmans, K. (2009). Procedure: Toestellen algemeen UPLC-MS/MS. UZ Brussel, Toxicologie - Metabole Stoornissen. Jette: UZ Brussel. Lawrence, B. M. (2006). Natural and Synthetic Menthol. In B. M. Lawrence, Mint. The Genius Mentha (p. 576). Londen: CRC Press. Magera, M., Helgeson, J., Matern, D., & Rinaldo, P. (2000). Methylmalonic Acid Measured in Plasma and Urine by Stable-Isotope Dilution and Electrospray Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry , 11 (46), 1804-1810. Orphanet. (n.d.). Zeldzame ziekten. Retrieved december 12, 2014, from Orphanet: http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/OC_Exp.php?lng=NL&Expert=289916 Pedersen, T., Keyes, W., Shabab-Ferdows, S., Allen, L., & Newman, J. (2011). Methylmalonic acid quantification in low serum volumes by UPLC-MS/MS. Journal of Chromatography B (879), 1502-1506. Pubchem. (n.d.). Methylmalonic Acid. Retrieved Augustus 17, 2015, from Pubchem Open Chemistry Database: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Methylmalonic_acid#section=ExperimentalProperties Rapid Trace SPE Workstation. (2012). Retrieved juli 25, 2015, from Crescent Scientific: http://www.cspl.in/products/extraction/Rapid_Trace_SPE_Workstation.aspx RECIPE. (2010, 11 08). ClinMass . Instruction Manual for the Determination of Methylmalonic Acid in Serum, Plasma and Urine by LC-MS/MS . Munchen, Duitsland: RECIPE. Schuit, F. (2010). Metabolisme. In F. Schuit, Metabolisme (p. 470). Bohn Stafleu von Loghum. 43 Sigma Aldrich. (1998). Guide to Solid Phase Extraction. Retrieved augustus 17, 2015, from Supelco: http://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4600/4538.pdf Stichting Orthokennis. (n.d.). Vitamine B12 werking en toepassing. Retrieved december 19, 2014, from Stichting Orthokennis: http://www.orthokennis.nl/artikelen/vitamine-b12werking-en-toepassing The Monitor. (2008, juni). New Feature: Interview with an organic acid. The Monitor . Wouters, M. Neonatale screening. (p. 36). Brussel: VCBMA. www.chromacademy.com. (n.d.). The Theory of HPLC Band Broadening. Retrieved augustus 25, 2015, from Chromacademy: http://www.chromacademy.com/lms/sco3/Theory_Of_HPLC_Band_Broadening.pdf 44 VI. Bijlagen 1. Methodevalidatie 1.1 Retentietijd Tabel 12: Resultaten retentietijd en relatieve retentietijd Eenheid RT MMA (min) RT MMA-­‐d3 (min) % Afwijking Controle Clinchek L1 2.6 2.59 Controle Clinchek L2 2.6 2.59 Monster 1 3000A 2.6 2.59 0.00 Monster 2 3000B 2.6 2.59 0.00 Monster 3 2000A 2.6 2.59 0.00 Monster 4 2000B 2.6 2.58 -­‐0.39 Monster 5 1000A 2.6 2.59 0.00 Monster 6 1000B 2.6 2.58 -­‐0.39 Monster 7 500A 2.59 2.58 0.00 Monster 8 500B 2.59 2.58 0.00 Monster 9 250A 2.59 2.58 0.00 Monster 10 250B 2.6 2.58 -­‐0.39 Monster 11 100A 2.6 2.59 0.00 Monster 12 100B 2.59 2.59 0.38 Monster 13 75A 2.6 2.58 -­‐0.39 Monster 14 75B 2.59 2.59 0.38 Monster 15 50A 2.6 2.58 -­‐0.39 Monster 16 50B 2.6 2.58 -­‐0.39 Monster 17 25A 2.6 2.59 0.00 Monster 18 25B 2.6 2.58 -­‐0.39 45 1.2 Carry over Tabel 13: Resultaten carry over MMA Level L1 L2 L3 H1 H2 L4 H3 H4 L5 L6 L7 L8 H5 H6 L9 H7 H8 L10 H9 H10 L11 Concentratie (nmol/L) 415 429 417 4688 4624 425 4558 4560 436 415 417 421 4563 4580 409 4584 4641 430 4626 4664 419 SD 5.586 419.8 10.378 423.8 3SD Carry over 16.757 4 Aanvaard? OK Mean Error limit 46 Low -­‐ Low High -­‐ Low 429 417 415 417 421 425 436 409 430 419 1.3 Ion ratio’s Tabel 14: Resultaten ion ratio’s Conc spike MMA (nmol/L) Standaard 1 415 Standaard 2 429 Standaard 3 417 Standaard 4 425 Standaard 5 436 Standaard 6 415 Standaard 7 417 Standaard 8 421 Standaard 9 409 Standaard 10 430 Gemiddelde ion ratio Standaarddeviatie ion ratio Coverage factor k Betrouwbaarheidsinterval RI 0.02 0.018 0.019 0.021 0.021 0.019 0.018 0.019 0.02 0.02 0.0195 0.00 3 voor 99,7% confidence level. [X -k.SD ; X + k.SD] k * SD 0.00 Ondergrens 0.016 X - k x SD Bovengrens 0.023 X + k x SD Figuur 20: Resultaten ion ratio’s 47 1.4 Recovery Tabel 15: Gegevens monsters Gegevens Monster 1 Monster 2 Monster 3 Monster 4 Monster 5 Monster 6 Identificatie Monster 2 Monster 2 Monster plasma Silke Monster plasma Silke Monster plasma Silke Monster plasma Silke Spike (nmol/L) 1000 100 2000 500 3000 50 Tabel 16: Resultaten LC-­‐MS/MS Monster 1 Monster 2 Monster 3 Monster 4 Monster 5 Monster 6 Conc (blanco) 37.5 37.5 101.2 101.2 101.2 101.2 Conc (spike) 1039.2 113.6 2208.7 511 3778.3 159.1 100.33 % 76.1 Gemiddelde Recovery Range recovery 48 Recovery (%) 100.17 76.1 105.375 81.96 122.57 115.8 - 122.57 % 1.5 Lineariteit en analytische gevoeligheid Tabel 17: Resultaten lineariteit Concentratie (nmol/L) Meting 1 (nmol/L) 25 42,00 49,725 51,00 74,05 67,00 122,8 112,00 171,35 165,00 220 224,00 357,5 358,00 495 489,00 632,5 630,00 770 784,00 935,25 911,00 1100,5 1079,00 1431 1460,00 Conclusies: Ondergrens van het meetbereik: Bovengrens van het meetbereik: Meting 2 (nmol/L) 45,00 46,00 72,00 129,00 158,00 219,00 360,00 485,00 637,00 778,00 929,00 1118,00 1418,00 Gemiddelde (nmol/L) 43,50 48,50 69,50 120,50 161,50 221,50 359,00 487,00 633,50 781,00 920,00 1098,50 1439,00 50 >5000 nmol/L nmol/L 49 1.6 Precisie en bias Tabel 18: Gegevens controles Gegevens Clinchek L1 Clinchek L2 UTAK L1 UTAK L2 Criterium Levels L1 L2 L3 L4 Concentratie (nmol/LL 260 583 202 1020 Precisie Bias RSD < 2/3 RSDmax <15% Tabel 19: Resultaten in nmol/L Levels L1 L2 L3 L4 Herhaling 1 279,6 655,3 217,6 1126,6 CV 6,95 6,15 4,13 4,56 Clinchek 50 Herhaling 2 287,8 617,7 218 1145,7 Herhaling 3 280,5 629,6 219,3 1616,3 Herhaling 4 284,8 604,7 205,9 1124,6 Gemiddelde Gemiddelde bias (%) 274,76 -­‐5,68 612,2 -­‐5,01 212,12 -­‐5,01 1107,525 -­‐8,58 Level I Level II mean 260 nmol/L mean 583 nmol/L range 208 – 312 nmol/L range 467 – 700 nmol/L Herhaling 5 241,1 553,7 199,8 1033,2 51
