Samenvatting Metabolisme en Toxicologie
advertisement
Samenvatting Metabolisme en Toxicologie Esmee Castermans College 1 (23 feb) Je neemt een geneesmiddel in als tablet/pil/drankje. Dan is er: - Absorptie in het bloed - Distributie door het lichaam en opname in de weefsels - Metabole omzetting naar andere stoffen - Excretie via de urine of feces ADME is dus het proces dat een medicijn ondergaat. (Let op! E is niet eliminatie, want dat is metabolisme + excretie) Geneesmiddelen kunnen gewenste en ongewenste effecten hebben. Als de effecten niet gewenst zijn, is het een bijwerking. Het kan zijn dat deze bijwerking een gewenst effect heeft voor andere ziekten (off label use). Een bijwerking kan ook schadelijk zijn. Dit heet een ADR (adverse drug reaction). De CBG, EMA en FDA kijken naar de balans tussen de gewenste en ongewenste effecten. Er zijn namelijk nooit helemaal geen bijwerkingen. 2 typen ongewenste effecten: - On-target effect: Werkt op dezelfde receptoren van het medicijn, maar het effect is overdreven groot. Dit leidt tot een dosis-respons curve die parallel is aan het beoogde farmacologische effect. - Off-target effect: Werkt via een ander mechanisme dan het farmacologische effect en heeft een hele andere dosis-respons curve. Ongewenste effecten: - Verstoring van de fysiologische functies - Orgaanschade - Niet-orgaan gebonden toxiciteit o Genetische toxiciteit o Carcinogeniteit o Reproductie toxiciteit - Allergische reacties - Idiosyncratische reacties (de uitzonderingen die er niet tegen kunnen) Medicijnen zijn per definitie niet veilig. De data over de veiligheid zijn namelijk gelimiteerd wanneer een medicijn op de markt komt. Je kan namelijk niet alle interacties tussen het medicijn en andere medicijnen testen. Lareb: houdt de door de patiënten gemelde bijwerkingen van medicijnen bij. METOX = metabolisme en toxicologie. - Metabolisme: De studie van chemische veranderingen die stoffen in het lichaam ondergaan. Het kijkt naar wat het lichaam met de stof doet. - Toxicologie: De studie van schadelijke effecten van chemische stoffen op organismen. Het kijkt dus naar wat de stof met het lichaam doet. Paracetamol is een (relatief) veilige pijnstiller. Het is veilig, maar dat hangt wel af van de dosis. Vanaf 30 gram is het dodelijk. Jaarlijks sterven er in de UK 200 mensen aan een paracetamol overdosis. Je mag er 3x per dag 2 slikken (= 3 gram in totaal) en onder doktersvoorschrift mag je het 4x per dag. Paracetamol werkt pas naar 30 minuten, omdat het eerst nog opgenomen moet worden. Na 6 uur is het uitgewerkt, omdat de lever het dan afgebouwd heeft tot niet-werkzame stoffen. Een stof kan alleen een membraan passeren als het lipofiel en ongeladen is, zoals paracetamol. Water-oplosbare stoffen zijn dus niet zo geschikt als geneesmiddel, omdat ze snel worden uitgescheiden door de nieren. Vet-oplosbare stoffen blijven heel lang in het lichaam aanwezig, omdat ze gebonden zijn aan eiwitten (die niet door de nieren kunnen worden uitgescheiden) en omdat ze opgeslagen kunnen worden door het vetweefsel. Om uitgescheiden te worden, moeten stoffen dus omgezet worden in wateroplosbare verbindingen. Dit gebeurt in de lever. 5% van de ziekenhuisopnames is door geneesmiddelvergiftiging. De meest voorkomende oorzaak van geneesmiddelvergiftiging in Nederland is een overdosis aan paracetamol, ondanks dat het zo veilig is. De toxiciteit wordt bepaald door: - De stof-eigenschap (is het toxisch?). - De hoeveelheid/dosis/concentratie. Samen bepalen ze hoe veilig of risicovol een stof in een bepaalde dosis is. Paracelsus (1500): “Alles is toxisch. Het is de dosis die bepaalt of iets een gif is.” Dit klopt wel ongeveer, maar eigenlijk had hij ongelijk, want niet de dosering maar de blootstelling is het probleem. Met blootstelling wordt bedoeld de dosis die een targetorgaan bereikt. Dat kan dus systemisch of lokaal zijn. Wanneer je iets op de huid toedient moet je ook rekening houden met systemische toxiciteit en andersom. Gif uitzuigen: je gaat er niet dood van als je het doorslikt, omdat je lichaam het afbreekt in de maag. Dit is een voorbeeld van dat niet de dosering, maar de blootstelling van belang is. LD50: de dosis (in mg/kg) die 50% van de dieren doodt. Alcohol heeft een LD50 van 10.000 mg/kg. Hier kun je dus heel veel van binnen krijgen en het toch overleven. Botuline toxine heeft een LD50 van 10 ng/kg. Dat is dus een hele lage dosis! De LD50 zegt maar heel weinig. Er mist nog veel informatie. Hoe is het toegediend? (intraveneus heeft een hele andere beschikbaarheid dan oraal) Aan wie/wat is dit gegeven? (Wat voor een dier? Dieren kunnen bijvoorbeeld van morfine 900 mg/kg krijgen, maar mensen veel minder) Waarom blijft de helft leven en waaraan gaat de andere helft precies dood? Wat gebeurt er met de mensen die blijven leven? (Zijn ze bijvoorbeeld heel ziek of gezond?) De LD50 is geen handige maat. Je hebt niks aan een dosis die de helft van de mensen doodt. 6 liter water achter elkaar drinken is dodelijk, maar alleen als je het direct achter elkaar drinkt. Dat geldt ook voor alcohol. Je moet het achter elkaar drinken, want anders is het verspreidt en gaat het niet meer op. De blootstelling: Blootstelling = het oppervlak onder de concentratie-tijd curve = AUC. Als een dosering nog niet is afgebroken wanneer de nieuwe dosering gediend wordt, treedt er accumulatie op. De ene stof wordt veel sneller afgebroken dan de ander. Toxiciteit wordt bepaald door: - Chemische een fysische eigenschappen o Maar de structuur-activiteit relatie (SAR) is niet zonder meer voorspelbaar. o Soms zijn er klasse-effecten, maar de meeste stoffen hebben een eigen toxisch profiel. - Biologische effecten (receptor binding, affiniteit voor een actief centrum van een enzym, binding aan DNA, etc.) - Dosis en systemische/lokale blootstelling o De hoeveelheid die is toegediend o De biologische beschikbaarheid. - Blootstelling aan het target orgaan o Toedieningsroute o Metabole activiteit o Transporters in het membraan o Doorbloeding o Tijd (dosering versus dosis) Er is echter grote individuele gevoeligheid! Paracetamol: Eenmalig: >70 mg/kg (±5 gram) leidt tot toxische effecten. >140 mg/kg (±10 gram) leidt tot matige leverschade en >200 mg/kg (±14 gram) leidt tot ernstige leverschade. Wanneer je elke dag 3-4 gram paracetamol neemt, krijg je ook leverschade. Het toxisch effect kan worden versterkt door chronisch alcoholgebruik en door bepaalde geneesmiddelen. Dingen die je eet en drinkt kunnen de werking van medicijnen dus beïnvloeden! Het tegengif voor paracetamol is N-acetylcysteine of methionine. Er is een verband tussen metabolisme en toxiciteit. Soms zijn de metabolieten van geneesmiddelen meer toxisch dan de oorspronkelijke stof. Dit heet toxificatie/bioactivatie. Soms zijn de metabolieten juist minder toxisch. Dit heet detoxificatie. Bij paracetamol: Wanneer paracetamol geoxideerd wordt, wordt het getoxificeerd. Door oxidatie wordt het namelijk elektrofiel. DNA, RNA en eiwitten kunnen hierdoor elektronen doneren en beschadigd raken. Ook kan geoxideerd paracetamol gedetoxificeerd worden. Geoxideerde paracetamol kan bijvoorbeeld onder invloed van GSH-T gedetoxificeerd worden en ongeoxideerde paracetamol kan door ST of GT worden gedetoxificeerd en uitgescheiden worden met de urine. Geneesmiddel onderzoek - Is een geneesmiddel werkzaam? - Is een geneesmiddel schadelijk (toxisch)? - Hoeveel moeten we toedienen? Het testen van de toxiciteit/veiligheid vindt plaats in verschillende fases 1) In vitro 2) Op proefdieren (preklinische fase) 3) Op gezonde mensen (fase 1) 4) Op patiënten (fase 2 en 3) Verschillen in metabolisme tussen mens en dier zijn groot. Er zijn dus ook grote verschillen in toxiciteit. Het kan 12 tot 24 jaar duren om een idee om te zetten in een medicijn. Eerst worden er miljoenen mogelijke compounds gescreend. Van de hits worden er maar een paar (minimaal 12) geschikte kandidaten gevonden. Van deze kandidaten vallen er nog een heleboel af en uiteindelijk blijft er hopelijk 1 over die als geneesmiddel kan dienen. De toxicologietesten vinden plaats van de ontdekking van de drug tot de registratie van het geneesmiddel (± 10 jaar). Een langdurige test is nodig om de carcinogeniteit te bepalen. Research fase: - Screening van de toxiciteit - Screening van het metabolisme - In vitro: HTS (high troughput screening) Dit is heel massaal. Ontwikkelingsfase: - Veiligheidsonderzoek - Toxiciteit en safety pharmacology van ADME - In vitro testen - In vivo testen op 2 soorten proefdieren Testen van de geneesmiddel toxiciteit: 1) Stofeigenschappen. Je neemt een humane cellijn en gaat het geneesmiddel in verschillende concentraties toedienen. a. Heeft het geneesmiddel schadelijke effecten op cellen en organismen? b. Mechanisme van de toxiciteit. 2) Hoeveelheid/dosis a. Blootstelling van het organisme b. Blootstelling van targetcellen in de organen 3) Klinische testen a. Humane farmacokinetiek b. Klinische toxiciteit/veiligheid 4) Postmarketing a. Bijwerkingen (al dan niet voorspeld) b. Pharmacovigilantie = geneesmiddelenbewaking. Het opsporen, evalueren en voorkomen van ongewenste bijwerkingen en interacties. c. Postmarketing surveillance Ondanks alle testen zijn er toch vaak problemen met geneesmiddelen die niet verwacht werden. De medicijnen kunnen bijvoorbeeld tot leverschade of trombose leiden. Diane (anticonceptie) was eigenlijk niet als anticonceptie geregistreerd maar als geneesmiddel tegen acne. Diane heeft een groot risico op trombose. Toch wilden veel mensen deze pil, omdat anti-acne medicijnen vergoed worden en anticonceptie niet. Adverse drug reactions (ADR) zijn een groot klinische probleem. - 10-20% van de mensen in het ziekenhuis hebben hier last van. - 1-5% van de mensen die in het ziekenhuis zijn er gekomen door ADR. - >2 miljoen mensen per jaar in USA - 13% van de medicijnen wordt teruggetrokken of krijgt een black box warning. Geschiedenis van de toxicologie. - 1550 bc. Papyrusrollen met info over gifstoffen - 400 bc. Socrates drinkt de gifbeker - 1500 Paracelsus: “Alles is giftig, maar de dosis maakt het een gif.” - 1800 Orfila: de eerste experimenteel toxicoloog - 1930 Oprichting van de Food and Drug Administration (FDA) - 1950 Wetgeving in Europa over geneesmiddelen - 1963 Oprichting van het College ter Beoordeling van Geneesmiddelen. (CBG-MEB) - 1965 eerste EEC directive - 1995 Oprichting van het EMEA (nu EMA), de European Medicines Agency. Het CBG-MEB is lid van de EMA. De mens wordt blootgesteld aan meer dan 100.000 xenobiotica. Dit zijn voedseladditieven, bestrijdingsmiddelen, milieuverontreinigingen, industriële producten en geneesmiddelen. De veiligheid is van belang bij geneesmiddelen en voedseladditieven. Het gevaar (hazard) is juist van belang bij milieuverontreinigingen en bestrijdingsmiddelen. Bij alles is het risico van belang. REACH: Registratie, Evaluatie en Autorisatie van CHemische stoffen. Dit is een nieuwe regelgeving in de EU voor stoffen waarvan per jaar meer dan een ton wordt geproduceerd of ingevoerd. Er worden gegevens verstrekt voor veilig gebruik. 3 belangrijke activiteiten van de toxicologie: - Mechanistische toxicologie - Regulatory toxicologie - Descriptieve toxicologie. Het grensvlak tussen regulatory toxicologie en descriptieve toxicologie is de risk assessment en is ook van belang. Waarom worden er studies gedaan naar het mechanisme van toxiciteit? - Het geeft inzicht in oorzaak en gevolg o Mogelijkheid tot het vinden van tegengif/maatregelen. o Het vermijden/voorkomen van het toxische effect o De toxiciteit genezen o De species verschillen vinden. - Je kan gevolgen voorspellen o Risico-analyse doen - Nodig voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen Dosis-effect relatie (bij alcohol): ED50: effectieve dosis bij 50% van de mensen (bij alcohol: 0,4 mL in het bloed) TD50: toxische dosis bij 50% van de mensen (bij alcohol: 0,8-1,0 mL in het bloed) LD50: lethale dosis bij 50% van de mensen (bij alcohol: 4,0 mL in het bloed) Een geneesmiddel heeft een drempelwaarde. Bij de een ligt deze drempel bij een hogere dosis dan bij de ander en bij de een zijn de effecten groter dan bij de ander. De steilheid van de dosis-effect curve kan ook per medicijn verschillen. Er wordt een nieuw geneesmiddel gevonden en je wil de effecten meten. Je begint met testen op cellijnen om de LD50 te bepalen. Hierna moet je testen ontwikkelen en op proefdieren moeten deze testen toegepast worden. Je begint met intraveneuze toediening om te zorgen dat de beschikbaarheid 100% is. Daarna ga je het op andere manieren toedienen Je kijkt vervolgens naar parameters als - lichaamsgewicht - voedsel-en waterinname - activiteit/houding - vacht - reflexen/verlamming - speekselproductie - diarree - dood Tot hier zijn de parameters niet-invasief. - hartslag - bloeddruk - orgaangewicht/-schade - parameters in het bloed - kanker - effecten op de embryo - verminderde afweer Het bepalen van deze parameters is wel invasief. Hierdoor vindt identificatie, bepaling van het mechanisme en classificatie van de target plaats. Biomarkers voor toxicologie: Dit zijn uitleesparameters die de fysiologie, pathologie en ernst van de aandoening en de effecten van de (toxische) stoffen (waaronder geneesmiddelen) kunnen weerspiegelen. Je kijkt naar urine, bloed, biopten en scans. Vervolgens gebruik je chemische bepalingen en –omics technologie om deze biomarkers te vinden. Het moment en de plek waarop je meet is ook heel belangrijk. Waar en wanneer zijn stoffen toxisch? - lokaal of systemisch - snel/acuut of vertraagd/chronisch - reversibel of irreversibel - gradueel of alles/niets - direct of indirect? Koolmonooxide: bindt op de plek waar zuurstof moet binden. Je gaat dus dood aan zuurstofgebrek en niet aan de koolmonooxide zelf. Dit is een voorbeeld van een indirect toxisch effect. - MABEL = Minimal Anticipated Biological Effect Level Dit is het niveau waarop er een effect op begint te treden. NOAEL = No Observed Adverse Effect Level Dit is het hoogste niveau waarop er nog geen toxisch effect opgetreden is. LOAEL = Lowest Obeserved Adverse Effect Level Dit is het niveau waarop er net toxische effecten op beginnen te treden. Sommige stoffen kunnen meerdere toxische effecten hebben. Bijvoorbeeld bij chlorpyrifos. Bij een hele kleine dosis begint cholinesterase geïnhibeerd te worden. Bij een hogere dosis wordt naast cholinesterase ook carboxylesterase geïnhibeerd. Dosis-effect vertalen naar dosis-respons De normale range van de activiteit van een bepaald systeem in het lichaam is bekend. Lage dosissen van een medicijn leiden meestal tot activiteit die niet buiten de normale range komt en dus niet significant is. Wanneer de activiteit bij een dosis hoger is dan de normale range, is er een respons op de dosis en is de dosis dus hoog genoeg om een effect te hebben. De hoogst gemeten dosis die binnen de normal range valt is de NOAEL en de laagst gemeten dosis die buiten de normal range valt is de LOAEL. Er kan een figuur gemaakt worden waarbij de responsfrequentie wordt uitgezet tegen de dosis. (respons = het aantal of percentage mensen/dieren dat reageert) Dit geeft een normaal verdeelde curve met dieren die heel gevoelig zijn (links) en dieren die relatief ongevoelig zijn (rechts) en alles daartussenin. De cumulatieve respons die daaruit afgeleid kan worden, is een S-curve; de dosis-respons curve. Er is een manier om de dosis-respons curve recht te maken zodat je kan bepalen wat het effect is van een andere dosis bij een groep mensen/dieren. Deze rechte lijn is een verband tussen het logaritme van de concentratie en de respons. De LD50 is af te lezen uit de dosis-respons curve. Op de y-as (waar de cumulatieve respons in procenten staat) trek je een lijn van 50 naar de lijn van de grafiek. Vanaf dit punt trek je en lijn naar beneden. De dosis die daar staat, is de LD50. Wanneer je de LD50 van 2 stoffen bepaald hebt en het is ongeveer gelijk, betekent dat niet dat ze even gevaarlijk zijn. Dat hangt namelijk ook af van de helling van de lijn. Hoe steiler de helling, hier meer de respons toeneemt bij een verhoging van de dosis. Interactie tussen stoffen: Stof A heeft een bepaalde dosis-respons curve. Als je bij stof A stof B (die zelf ongevaarlijk is) geeft, kan de curve toch naar links schuiven. Dat houdt in dat de drempelwaarde lager is en de stof dus gevaarlijker is. Nadeel aan de NOAEL: de NOAEL is afhankelijk van welke doseringen je gekozen hebt om te testen. Je kan niet oneindig veel doseringen testen, dus de NOAEL geeft niet de exacte grens aan van wel of geen effect. Je kan ook gebruik maken van de benchmark dosis. Benchmark dosis (BMD): Een dosering waarbij je van tevoren afspreekt welke effecten je wil zien. Bijvoorbeeld de dosering die voor 10% verhoging van een bepaalde biomarker zorgt. Je extrapoleert deze dosering aan de hand van de dosis-effect curve (die je maakt door bij een aantal doseringen te meten) Dus bij 10% kijk je in de dosiseffect curve bij 0,1 en lees je af welke dosis daar bij hoort. Je gebruikt de BMD om andere waarden mee te vergelijken. Dit is vooral handig op gebieden waar je niet goed kan meten. De BMD en de NOAEL kunnen best veel van elkaar verschillen. Wanneer je alleen de effectieve dosis en de lethale dosis van een geneesmiddel bepaalt, mis je informatie over de bijwerkingen. De curve van de toxische dosis is dus eigenlijk veel belangrijker. Wanneer de dosis te laag is, kun je de effecten niet meer meten. Dat is omdat de apparatuur niet gevoelig genoeg is. Bij hele lage dosis is er dus een onzekerheid. Bij een stof die schade aan het DNA veroorzaak gaan we er van uit dat er geen veilige dosering is. Zelfs de kleinste dosering heeft dus een klein effect. Bij bijvoorbeeld paracetamol is dat anders, omdat er bij een hele lage dosering genoeg mechanismen zijn om de paracetamol onschadelijk te maken. Dit zijn echter schattingen, want het is dus niet meetbaar. Het heet daarom de black box van de toxicologie. Let op! Bij een dosis van 0 kan er ook een effect op treden! Bijvoorbeeld als je kijkt naar de kans op kanker door een toxische stof. Zonder die toxische stof kan je namelijk ook kanker krijgen. Gebruik dus altijd een controlegroep! Verschillende dosis-respons relaties - Lineaire dosis-respons. Hoe hoger de dosis, hoe groter de respons. Dus zodra er een dosis is, begint er ook meteen een kleine respons. - Hormesis: bij een lage dosis is het effect positief, maar bij hoge dosis worden de effecten negatief. Een voorbeeld hiervan is vitamines. Dit kan ook andersom (dus weinig is negatief en veel is positief). - Dosis-respons met drempelwaarde (NOAEL). Dit is een lineaire dosisrespons, maar er treedt pas een respons op vanaf een bepaalde dosis. Dus: Een toxisch effect is afhankelijk van de concentratie bij de target en is gerelateerd aan de dosis, maar… - Er kan verzadiging van het effect, reparatie of detoxificatie optreden. - Er kan accumulatie optreden - tijd (dosis x tijd) is van belang - interacties (inductie, inhibitie, verdringing) met andere stoffen kunnen de toxiciteit beïnvloeden. Hazard = gevaar: Dit is een biologische eigenschap. Risico: De kans dat gevaar optreedt Veiligheid: De kans dat schade niet optreedt. ADI (acceptable daily intake) De hoeveelheid die je dagelijks mag innemen zonder dat er schade optreedt. ADI (in mg/kg bw/dag) = NOAEL/safety factor De safety factor is er omdat er verschillen op kunnen treden tussen soorten en individuen. Voor beide is een correctie van 10, dus de safety factor is meestal 10 x 10 = 100. Dit is een ruwe schatting en er is helemaal geen bewijs voor. Therapeutische index van geneesmiddelen = TD50/ED50. Afstand tussen de curve van de effectieve dosis en de toxische dosis. Hoe groter deze afstand, hoe veiliger het geneesmiddel. Veiligheids marge (MOS) = TD1/ED99 Dit is een betere, want je wil zo veel mogelijk effect en zo min mogelijk toxiciteit bij een geneesmiddel. Tegenwoordig gebruiken we: MOS = TC1/EC99. Er wordt dus niet gekeken naar de toxische en effectieve dosis, maar naar de toxische en effectieve bloedconcentratie. Dit is de beste maat die we hebben om te bepalen of een geneesmiddel veilig is. Toxicokinetiek ADME is van belang voor de toxiciteit omdat het bepaalt wat de blootstelling van de stof is bij de target. - Absorptie: waar en hoeveel? - Distributie: hoeveel en waarheen? - Metabolisme: welke producten? - Excretie: waar en hoeveel? De link tussen ADME en TOX is dus de blootstelling van de stof bij de target. (!) Als je iets tot je neemt via het maagdarmkanaal, komt het eerst in de darm en gaat het van de darm naar de lever. Dan pas komt het in de circulatie terecht. Wanneer je iets intraveneus toedient, circuleert het eerst door het hele lichaam en komt het dan pas langs de lever. Andere manieren van het binnenkrijgen van stoffen zijn door inhalatie en dermaal. Lokale toxiciteit: Stoffen die schadelijk zijn zonder geabsorbeerd te worden Systemische toxiciteit: Stoffen die schadelijk zijn na absorptie en opname in de algemene circulatie Biologische beschikbaarheid (bioavailabilty): Het deel van de dosis dat niet door de darm en de lever wordt gemetaboliseerd en wat dus in de circulatie komt. Het maakt uit hoe je iets toedient, want bij elke toedieningsplek wordt het door andere cellen opgenomen. Manieren van absorptie: - Absorptie via passieve diffusie o onder invloed van de pH o transcellulair (door een cel heen) o paracellulair (tussen 2 cellen door) - Absorptie via endocytose/pinocytose - Absorptie via carriers Fysisch-chemische eigenschappen van geneesmiddelen die van belang zijn voor de membraanpassage: - grootte/vorm - lipofiel/hydrofiel (logP) - lading/polariteit - affiniteit voor transporters - structurele gelijkenis met endogene substraten Membraanpassage: Passieve diffusie leidt ertoe dat de concentratie aan beide kanten van het membraan gelijk is. Een stof diffundeert dus naar de kant waar zijn concentratie lager is. Er ontstaat een evenwicht. Dit kan zonder carrier bij lipofiele stoffen en met carrier bij relatief hydrofiele stoffen. Een carrier kan er ook voor zorgen dat er tot 1000-voudige concentratie gradiënten gemaakt worden, maar hier is wel ATP voor nodig. Het is dus actief transport en het leidt tot een concentratieverschil tussen intra- en extracellulair. Absorptie: Hoe komen geneesmiddelen het lichaam binnen? - maagdarmkanaal - huid - longen - parenteraal = intermusculair (im), subcutaan (sc), interaperetoniaal (in de buikholte, ip), intraveneus (iv) Het maagdarmkanaal De darm heeft door zijn villi een extreem groot oppervlak (250 m2) waardoor voedingsstoffen opgenomen worden. De absorptie is afhankelijk van: - pH (De pH van de mond, maag, dunne darm en dikke darm verschilt. Er is ook verschil tussen soorten.) - bloodflow - metabolisme in het darmwandepitheel - transporters - voedingstoestand - darmcontracties Ook zijn bacterien betrokken bij de metabolisme, bioactivatie en detoxificatie. Ze zetten stoffen om en ze kunnen stoffen dus ook toxisch maken. Stofeigenschappen die van invloed zijn op de darmopname: - lipofiliteit - pKa - affiniteit voor opnamecarriers - grootte - oplosbaarheid - affiniteit voor metabole enzymen en excretiecarriers (Pgp). In de darm zijn er carriers die zorgen voor de actieve opname, maar er is ook uitscheiding. MDR1 is zo’n uitscheider en heeft invloed op hoe goed er voedingsstoffen opgenomen kunnen worden. Veel MDR1 = weinig opname. Apicale kant: kant van het lumen Basolaterale kant: kan van het bloed Factoren die de darmtoxiciteit beïnvloeden Blootstelling: - Hoge concentraties in het darmlumen na orale inname, afhankelijk van volume van de inhoud van de darm. - Mate van opname in de darmcellen (door transporters) - Mate van excretie uit de darmcellen (door transporters) Metabolisme: - Metabolisme door darmbacteriën - Metabolisme door darmwand epitheelcellen - pH (activerend of inactiverend) Systemische blootstelling: wordt bepaald door de opname en het metabolisme in zowel de darm als de lever! De huid: - Groot oppervlakte (1,5-2 m2) Weinig doorlaatbaar Absorptie is afhankelijk van o Dikte van de huid (absorptie voetzool < hoofdhuid) o Beschadiging (toxische stof induceert zijn eigen absorptie) o Vochtigheid o Temperatuur o Metabolisme in de huid o Oplosmiddel (enzymen) Stoffen die goed worden opgenomen door de huid: - Lipofiel o CCL4 o parathion - klein, hydrofiel o hydrazine NH2-NH2 o nicotine o alcohol Toxiciteit en de huid: Na absorptie door de huid - toxiciteit op de huid zelf - systemische toxiciteit - fotosensitisatie (bioactivatie door UV, alleen in de huid!) - metabolisme in de huid - allergie Na systemische toediening (het komt dan in de huid terecht) - huidtoxiciteit door fotosensitisatie - allergie De longen: - Opname van gassen, dampen, aerosolen en deeltjes. - Zeer groot oppervlakte (50-100 m2). o Beide longen zijn ongeveer 1 kg o 2400 km aan luchtwegen o 990 km aan bloedvaten o 300-500 miljoen alveoli - Dunne scheiding tussen lucht en bloed in de alveoli. (2 dunne cellagen) - Opname van lipofiele stoffen die door de cellagen heen kunnen. In het bloed worden ze vervolgens gebonden aan eiwitten. - Bevatten sulfactant die zorgt dat stofdeeltjes teruggetransporteerd kunnen worden naar de mondholte en dat slik je dan door. Er ontstaat hierdoor dus orale beschikbaarheid! - Snelle doorbloeding. - Deeltjesgrootte is bepalend voor het doordringen van de luchtwegen o > 10 micrometer: bovenste luchtwegen o 2-10 micrometer: bronchiën en bronchiolen o < 2 micrometer: alveoli o < 0,1 micrometer: uitgeademd Deeltjes in de luchtwegen worden - met mucus omhoog getransporteerd - verwijderd door hoesten en komen via doorslikken in het maagdarmkanaal terecht Deeltjes in de alveoli worden - gefagocyteerd door macrofagen (die hier niks mee kunnen) - met mucus omhoog getransporteerd - via de lymfe afgevoerd De absorptie is afhankelijk van - Oplosbaarheid in het bloed - Snelheid van de ventilatie (alleen als de oplosbaarheid groot is) - Perfusiesnelheid (alleen als de oplosbaarheid laag is) Luchtwegtoxiciteit 100% van het bloedvolume komt langs de long. De blootstelling is dus groot! De long heeft 40 verschillende celtypen. De long (Clara cellen en type II pneumonocyten) en de neus zijn metabole organen met een specifieke samenstelling van enzymen (in de long bijv CYP4B1). De longen zijn goed in het ontgiften van o.a. GSH, SOD, GSHperoxidase, catalase, vitamine E en vitamine C. Er zijn transporters aanwezig die voornamelijk voor basische amines zijn. Veiligheid van chemische stoffen: - Toxische eigenschappen van de stof Wat is het effect? - Blootstelling aan de stof en zijn metabolieten Bij welke concentratie? Verdeling: - in het lichaam: plasma - in organen: interstitiële water - in cellen: intracellulair water, cytosol en organellen Eigenschappen van organen bij de verdeling van een stof - doorbloeding - er zitten poriën in de bloedvaten van organen om stoffen door te laten. In de lever zijn die bijvoorbeeld aanwezig en vrij groot (100 nm). Zo kunnen in de lever grote stoffen opgenomen worden. In de nier zijn ze ook vrij groot (3-4,5 nm), maar in de hersenen zijn ze heel erg klein (0,3 nm). Dit laatste is de bloed-hersenbarrière. - Hydrostatische druk - Transporters Eigenschappen van de stof bij de verdeling van die stof - Grootte o Klein? Door de poriën o Groot? Opname door pinocytose/fagocytose - Lading - Lipofiliteit Eiwitbinding (zowel in het plasma als in de weefsels) o Verdringing, verzadiging Substraat voor carriers Stoffen kunnen competeren voor een transporter. Daarom gaan sommige geneesmiddelen interactie aan. Ze vechten om een transporter. ABC transporters: - Transporters steken door het membraan (in het geval van ABC transporters wel 12x). - 2 ATP-binding cassettes die nodig zijn voor transport. - Naam is dus A(TP) B(inding) C(assesttes) transporters. - Zitten in levercellen, in de darm en in de hersenen. Uptake transporters: - OATP (Organic Anion Transporting Protein) Substraat: organic anions, bulky cations. Functie: Na-afhankelijk transport van organische anions, cations en neutrale stoffen. - OAT (Oraganic Anion Transporter). Substraat: porterorganic anions. Functie: Transport van organische anions, vooral in de nieren. - OCT (Organic Cation Transporter). Substraat: relatief kleine cations. Functie: Transport van organische anions, vooral in de nieren en lever. - NTCP (Na-dependent Taurocholate Cotransporter). Substraat: galzouten - Pept (Petide transporter). Substraat: eiwitten. Functie: Transport van dien tripeptides, soms xenobiotics. Efflux transporters: - MDR1 of Pgp (Multi-Drug Resistance protein). Deze zorgt ervoor dat de opname laag wordt. Is ook belangrijk bij kanker. Substraat: grote lipfiele stoffen. Functie: efflux uit hersenen, darm en placenta en galsecretie. - MRP (Multi-Drug resistance-associated Protein MRP1-6). Substraat: drug conjugates. Functie: anion efflux, glucuronide en glutathione conjugates en nucleoside transport. - BCRP (Breast Cancer Resistance Protein). Substraat: drug conjugates. Functie: organische anion efflux, voornamelijk sulfaat conjugates. - BSEP (Bile Salt Export Pump). Substaat: galzouten en drug conjugates. Functie: het transporteren van galzouten. - MATE (Mulidrug And Toxin Extrusion). Substraat: cations. Transporters in de lever: Influx van bloed naar levercellen door OATP, OAT, OCT en NTCP. Efflux van levercellen naar bloed door MRP. Excretie in de galbuizen door MRP, MDR, BCRP, MATE en BSEP. Transporters in de nier: Influx van bloed naar niercel door OATP, OAT en OCT. Efflux van niercel naar bloed door MRP. Excretie in de glomerulus door MRP, MDR en MATE. Reabsorptie vanuit de glomerulus door OAT, Pept, URAT en OCTN. Transporters in de darm: Influx van bloed naar enterocyt door OCT. Efflux van enterocyt naar bloed door MRP. Excretie in het lumen door MRP, MDR en BCRP. Absorptie vanuit het lumen door OATP, Pept, OCTN, ISBT, MCT en HPT. Toxicologische aspecten van transport: - De opname in en uitscheiding uit cellen is bepalend voor de blootstelling. - Ophoping via endogene transporters. o Paraquat in de long via de polyamine transporter. o Lood in de darm via de calcium transporter. - Remming van transporters voor endogene stoffen. - Geneesmiddel-interacties (DDI = drug-drug interactie): competitie tussen twee geneesmiddelen voor dezelfde transporter. College 2 (24 feb) Verdeling naar de hersenen: - Vooral lipofiele stoffen penetreren - Bloed-hersenbarrière (BBB) o Lage permeabiliteit van het capillair (want weinig/kleine poriën en gliacellen bedekken het basaalmembraan) o Transporters voor excretie (Pgp) (Let op, normaal zorgt Pgp voor absorptie!) Transporters in de hersenen: Influx van capillair endotheel naar het bloed door MDR, BCRP, MRP en OATP. Efflux van het bloed naar het capillair endotheel door OATP. Afgifte van het capillair endotheel aan de hersenen door OATP. Opname vanuit de hersenen naar het capillair endotheel door OAT en OCTN. Orgaan-specifieke ophoping door verschillen in: - vetgehalte - transporters - bindingseiwitten In de lever is bijvoorbeeld veel ophoping. De plaats van ophoping is niet altijd gelijk aan de plaats van de toxiciteit! DDT (bestrijdingsmiddel) hoopt zich bijvoorbeeld heel erg op in het vetweefsel. Hierdoor is de vrije concentratie in het plasma vrij laag en DDT wordt maar heel langzaam afgegeven. DDT is een neurotox, dus het is in de hersenen pas toxisch en dus niet op de plek waar het opgeslagen wordt. Verdeling naar de foetus - Het bloed van de foetus en de moeder is slechts door 2 dunnen cellagen gescheiden. - Er zijn veel transporters voor endogene stoffen - Er is ophoping door metabolisme in de uterus extra hoge blootstelling De foetus wordt dus ook blootgesteld aan de toxische stoffen die de moeder binnen krijgt. Transporters in de placenta: Van foetaal bloed naar de cytotrophoblast door OAT. Van cytotrophoblast naar foetaal bloed door MRP. Van foetaal bloed naar syncytiotrophoblast door MRP, OAT, OCT en OATP. Van syncytiotrophoblast naar maternaal bloed door BCRP, MDR en MRP. Van maternaal bloed naar syncytiotrophoblast door OCTN en OATP. Uitscheiding: - Nier (urine) - Lever (via gal naar de feces) - Long (uitademingslucht) - Darm (feces) o Incomplete absorptie o Gal- en speekselexcretie o Excretie door de darm vanuit het bloed Door uitscheiding is er een verminderde blootstelling en dus verminderde toxiciteit, maar… - concentrering in gal toxiciteit in de galwegen - galuitscheiding Opnieuw blootstelling van de darm, dus darmtoxiciteit - metabolisme in de darm darmschade - neerslag in de urine nierschade Door leeftijd/ziekte/verzadiging kan er een verandering plaatsvinden in de excretie. Oudere mensen hebben bijvoorbeeld een slechtere excretie! Verminderde excretie ophoping in het plasma toxiciteit. Nieruitscheiding - filtratie in de glomerulus - actieve secretie in de proximale tubulus Terugwinning van stoffen door - actieve reabsorptie in de proximale tubulus - passieve reabsorptie in de hele tubulus excretie = filtratie + secretie – reabsorptie Leveruitscheiding: 1) Aanvoer van het geneesmiddel met het bloed. 2) Opname in de hepatocyten. 3) Metabolisme van het geneesmiddel. 4) Secretie van de metaboliet in de gal. 5) Afgifte van de metaboliet aan het bloed. 6) Eliminatie van de metaboliet door de nier. 7) (of) Eliminatie van de metaboliet door de lever (het komt dan dus weer terug naar de lever!). 8) Opname van de metaboliet door de hepatocyten. 9) Secretie van de metaboliet in de gal. Enterohepatische kringloop: Stoffen worden met de gal uitgescheiden in de darm en vanuit de darm kunnen ze weer opgenomen worden in de lever. Hierdoor kan een stof heel lang rondcirculeren voordat het uitgescheiden wordt. Toxicologie en leveruitscheiding: - Verzadiging van excretie-transporters. Dit kan leiden tot ophoping en toxiciteit in de hepatocyten (bijv. door galzouten). - Down-regulatie/remming van excretie-transporters. Dit kan leiden tot ophoping en toxiciteit in hepatocyten (bijv. door troglitazone). - Down-regulatie/remming van opname transporters. Dit kan leiden tot meer toxiciteit elders in het lichaam (bijv. door symvastatine) - Enterohepatische circulatie. Dit vergroot de blootstelling van het organisme (bijv. door diclofenac). - Galuitscheiding. Dit kan leiden tot toxiciteit in de darm (o.a. door bacteriële omzetting) (bijv. door diclofenac) Longuitscheiding: Secretie naar het bloed en excretie naar de uitademingslucht is afhankelijk van - Oplosbaarheid van een stof in het bloed - Vluchtigheid van die stof - Snelheid van de ventilatie - Perfusiesnelheid Overige uitscheiding: Deze vormen zijn kwantitatief niet erg belangrijk, maar toxicologisch wel! - Moedermelk De moeder wordt iets minder blootgesteld aan het toxine, maar dit toxine krijgt de baby vervolgens binnen en dat kan heel schadelijk zijn. - Zweet Heel weinig uitscheiding, maar het kan wel huidtoxiciteit veroorzaken. - Haren, nagels Vrijwel geen blootstelling, maar het kan een indicatie geven van of iemand wel of niet aan een stof is blootgesteld. Voorspelling van de toxicokinetiek: - Compartimenten modellen: Op basis van de analyse van de farmacokinetische gegevens van een bepaalde stof in vivo een model opstellen dat het gedrag van een farmacon beschrijft. - Mechanism-based PBTK modellen: Op basis van in vitro en in vivo gegevens over metabole enzymen, transporters en doorbloeding de kinetiek voorspellen. Hiervoor zijn dus geen in vivo gegevens bij mensen van het farmacon nodig. Toxiciteit: Het is een balans tussen de toxificatie en de detoxificatie en het is een balans tussen het effect (bijv. DNA schade) en de reparatie. (!) Targets die stoffen in ons lichaam kunnen hebben: - Receptoren - Proteïnen, enzymen, transporters - Membraanlipiden - DNA/RNA - Ca2+ homeostase - Ionenkanalen - Mitochondriën Schadelijke effecten: - Celdood - Farmacologische/fysiologische effecten - Genotoxiciteit (door DNA schade) - Carcinogeniteit - Reproductieve schade - Teratogeniteit - Neurotoxiciteit - Immunotoxiciteit, sensitisatie - Irritatie (huid en oog) Neurotoxiciteit: - Schadelijk effect op het hele zenuwstelsel. - In de neuronen treden veranderingen op in de morfologie, fysiologie en functie. - Je kan het vrij moeilijk testen. Er zijn altijd verschillende testen nodig. o Gedragstesten bij dieren: bijv. reflexen, verandering in spontaan gedrag, verandering in de reactie op prikkels (pijn, zwemmen, etc.), geheugentest, leergedrag, etc. Immunotoxiciteit: 1) Toxische effecten door het immuunsysteem: een immunologische reactie op schade ergens in het lichaam, bijv. sensitisatie en hapteenvorming. Het lichaam gaat zijn eigen eiwitten aanvallen. 2) Toxische effecten op het immuunsysteem zelf: toxisch effect op B of T lymfocyten, bijv. door immunosuppressiva en immunostimulantia. Toxiciteitsstudies: Het is belangrijk om bij toxische stoffen de blootstelling in te schatten en te weten wat de maximale mogelijke blootstelling is. Bij geneesmiddelen werkt dit iets anders, want je wil een zo groot mogelijk effect en zoekt hier de blootstelling bij. Veder kijk je bij welke blootstelling de bijwerkingen niet te groot zijn. Er bestaan verschillende soorten testen om toxiciteit te bepalen. Er is een acute test (24 uur), een short-term repeated/subacute test (1 maand), een sub-chronische test (10% van de levensduur) en een long-term/chronische test (6-12-24 maanden tot 2 generaties) beschikbaar. Deze testen kunnen uitgevoerd worden door toediening via verschillende routes. Het kan door po (tablet, drinkwater), inhalatie, subcutaan, dermaal en (bij proefdieren) intraperitoneaal. Per land verschillen de eisen die gesteld worden aan de toxiciteitsstudies. Het ene land gebruikt bijvoorbeeld meer soorten en meer toedieningsmethoden. LD50 wordt tegenwoorden niet meer verplicht gesteld. Er wordt nu geprobeerd om de voorschriften wereldwijd te harmoniseren. Wat nu gedaan wordt: - Kijken naar gedrag. - Kijken naar voedselinname en gewicht. - Bloed en urine afnemen en analyseren op biomarkers. - Weefsel (na doden), macroscopisch en microscopisch bekijken. Voor het bepalen van de toxiciteit van bepaalde medicijnen worden apen gebruikt. Dit is vooral voor geneesmiddelen voor de afweer, want apen en mensen komen heel veel overeen qua eiwitten in het immuunsysteem. Risk assessment: - Risico communicatie (Hoe communiceer je in bijsluiters en de media over de risico’s van een geneesmiddel?) - Risico perceptie (Hoe ervaar je het risico?) - Risico acceptatie (Is het effect het risico waard?) Dierproeven Op dit moment is het nog geen optie om geen dierproeven te doen. Er wordt gezocht naar alternatieven voor dieren, manieren om het leed te verkleinen bij dieren en manieren om minder dieren nodig te hebben. Een alternatief is om testen in vitro te doen. Hiervoor worden dieren gedood en worden de weefsels gebruikt. Nieuw geneesmiddel tegen MS (dodelijke spierziekte): Het is zeer goed werkzaam, want 50% van de patiënten verbetert door het geneesmiddel. Er zijn echter ook toxische effecten, waardoor 2% zal overleiden. Moet zo’n geneesmiddel op de markt komen? Moeten er meer dierproeven gedaan worden? Dit is dus een dilemma. Volgens de wet zijn dierproeven verboden als de proef ook op een andere manier gedaan kan worden, met minder dieren kan of met minder ongerief kan. Je moet dus streven naar de 3 V’s; Vermindering, Vervanging en Verfijning. Motieven om alternatieven te ontwikkelen: - Ethiek - Wetgeving - Economisch (twijfelachtig alternatief) Wetenschappelijk (bij in vitro wordt de invloed van andere organen uitgesloten. Ook is het handig omdat je humane cellijnen kan gebruiken.) - Maatschappelijke druk Vervanging en vermindering: - Gebruik van humaan weefsel - In silico modellen (met gebruik van computermodellen) - In vitro technieken (weefsels, cellen, cellijnen, stamcellen) Voordelen van in vitro systemen - Vermindering van proefdieren - Betere beheersing van de condities - Grotere experimentele flexibiliteit - Grotere gevoeligheid - Duidelijkere interpretatie van het mechanisme - Geen interacties met andere organen Nadelen van in vitro systemen - Geen interactie met andere organen (op het gebied van kinetiek en biotransformatie) - Mogelijke wijziging van eigenschappen - Extrapolatie naar in vivo is onzeker Problemen bij het voorspellen van het effect van een geneesmiddel: - Species verschillen - interindividuele verschillen - Overdosis - Gebruik bij andere ziekten (off-label use) wat kan leiden tot bijwerkingen die niet voorspeld waren. - Chronische doseringen - Tolerantie - Interacties Metabolisme van de farmaca Waarom is er metabolisme? Het is betrokken bij de afweer. De afweer heeft namelijk 3 mechanismen: 1) Anatomisch (huid en slijmvliezen) 2) Immunologisch (eiwitten en cellen) 3) Metabolisch en/of uitscheiding (via urine, gal, feces, uitademingslucht, zweet of moedermelk) Metabolisme = biotransformatie Xenobiotica = lichaamsvreemde stoffen die niet de normale metabole economie van de cel worden opgenomen. Doel van metabolisme is om stoffen geschikt te maken voor de uitscheiding. Ze worden meer polair gemaakt. Metabolisme is zeer belangrijk om xenobiotica uit het lichaam te verwijderen. Meestal zorgt het voor de beëindiging van de farmacologische werking, maar het kan soms ook farmacologisch actieve metabolieten vormen die zelf ook weer een werking hebben (soms toxisch). Wat doet het lichaam met xenobiotica? 1) Onveranderd uitscheiden a. Zeer polaire stoffen (worden amper opgenomen door de cellen en lossen goed op in de urine). b. Zeer apolaire vluchtige stoffen (worden snel weer uitgeademd). 2) Spontaan metaboliseren en uitscheiden a. Afhankelijk van fysiologische condities, bijv. pH. b. De spontane reactie wordt eventueel versneld door een enzym. 3) Metabolisme met behulp van enzymen a. Vooral apolaire stoffen, want die hebben een hoge eiwitbinding en hebben een sterke tubulaire terugresorptie (dus slechte uitscheiding door de nier). Er zijn enzymen betrokken bij het metabolisme van xenobiotica. 1) Omzetting naar endogene substraten. a. Hoge affiniteit voor endogene verbindingen b. Lage affiniteit voor xenobiotica c. Beperkte substraatspecificiteit 2) Enzymen waar geen endogeen substraat van bekend is. (grootste deel). Er zijn altijd al xenobiotica geweest zoals voeding en kruiden en hierdoor zijn deze enzymsystemen ontstaan. a. Vaak lage affiniteit b. Brede substraatspecificiteit. (dit houdt dus wel in dat je veel interacties kan verwachten tussen het xenobiotica metabolisme en het endogene metabolisme) Een hogere omzettingssnelheid kan alleen als er veel enzym is. Als je de stoffen binnenkrijgt ga je dus meer van het enzym maken. Dit heet inductie. Hoe vindt het metabolisme plaats? De meeste xenobiotica zijn lipofiel. Er worden in fase I functionele groepen aangebracht door oxidatie- reductie- en hydrolysereacties en een primair product wordt gevormd. Het primaire product is dan iets hydrofieler. In fase II vindt er bio-synthetische conjugatie plaats en wordt er een secundair product gevormd. Door efflux transporters kunnen deze secundaire producten worden uitgescheiden in fase III. Het geconjugeerde secundaire product kan ook gedeconjugeerd worden en weer een primair product worden en zo uitgescheiden worden. Ook kan het geconjugeerde secundaire product gedeconjugeerd worden en dan geacetyleerd, gemethyleerd of geoxideerd en worden uitgescheiden. Enzymen: Voor alle fasen (I, II en III) zijn er vele verschillende enzymen en iso-enzymen. Deze zijn familie van elkaar, maar ze hebben een andere affiniteit en een andere snelheid van omzetting. Consequenties: - Kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in vorming van metabolieten o tussen soorten o tussen individuen o tussen weefsels Dit berust dus op het feit dan er verschillende enzymen zijn. - Interacties van geneesmiddelen onderling als ze beide substraat zijn voor hetzelfde iso-enzym. - Interacties van geneesmiddelen met endogeen-metabolisme - Verzadiging van het betrokken enzym (dosis-afhankelijk metabolisme) Fase I: - Invoering van een functionele groep (-OH, =O, -NH2, -COOH, -S=O) door middel van een oxidatie, reductie of hydrolysereactie. - De metaboliet is substraat voor fase II en/of wordt uitgescheiden. - Beperkte verandering in fysisch-chemische eigenschappen. - Enzymen: o Oxidatie door o.a Cyt P450. o Reductie door o.a. Cyt P450. o Hydrolyse door o.a. esterase en bepaalde typen hydrolases. - De metaboliet is soms werkzaam maar meestal onwerkzaam en meestal minder toxisch, maar soms meer toxisch. - Fase I reacties kosten energie (NADPH of NADH) Fase I reactie bij paracetamol: Er wordt een OH-groep toegevoegd (linksboven) waar eerste een H zat. Dit heet een hydrolyse reactie. Het is bij andere stoffen ook mogelijk dat een O-R groep wordt vervangen door OH of dat een OCOCH3 groep een OH groep wordt zoals bij aspirine. Fase II: - Conjugatie met een (polaire, geladen) functionele groep. Er kan conjugatie met een glucuronzuur, sulfaat, acetyl, glutathion, methyl of glycine plaatsvinden. - De metaboliet wordt uitgescheiden (fase III) of gedeconjungeerd. - Metaboliet is meer polair en dus water oplosbaar - Het substraat is een xenobioticum of een fase I metaboliet daarvan. - De metaboliet is meestal onwerkzaam en meestal minder toxisch maar soms meer toxisch. - Fase II reacties kosten ook energie (energierijk co-substraat). Fase II reactie bij paracetamol: de OH-groep aan de onderkant van de benzeenring wordt gesulfeerd (het wordt een OS groep) of geglucuroneerd (het wordt een OG groep). Een benzeenring wordt meestal gesulfeerd (maar het kan dus ook geglucuroneerd worden). Deconjungatie van fase II metabolieten: - Deconjungatie kan plaatsvinden bij de conjugaten glucuronide, sulfaat en glutathion. Deconjungatie vindt plaats in de lever en de darmen: De oorspronkelijke stof kan weer worden gevormd en kan weer worden opgenomen door de darm (dit is de enterohepatische cyclus) De metaboliet kan ook anders zijn dan het oorspronkelijke fase II substraat. Bij deconjugatie van glutathion-conjugaat in de lever en de nier zal deze metaboliet geacetyleerd worden en het gevormde mercaptuurzuur zal dan uitgescheiden worden. Fase III: - Een fase III reactie is de transport door een membraan via een carrier. - Het geneesmiddel bindt aan de carrier en de carrier zorgt voor transport over het membraan. - De carriers/transporters in membranen zijn eerder al besproken. Waar vindt het metabolisme plaats? Het metabolisme heeft een strategische anatomie. De meeste enzymen zitten in het glad endoplasmatisch reticulum (SER), waar veel lipofiele stoffen terecht komen. Een aantal enzymen zitten in de mitochondriën en het kenmembraan. Ook is er een deel van de enzymen opgelost in het cytosol. De stoffen kunnen dus op verschillende plaatsten in de cel omgezet worden. De metabolisme vindt onder andere plaats in de darm en lever in de enterohepatische circulatie. Een medicijn (bijv. diclofenac) wordt in de darm omgezet in een primair product. Daarna wordt het opgenomen uit de darm en komt het via de portaalader in de lever. Hier zorgt glucuronyltransferase ervoor dat het wordt omgezet in een metaboliet. Vervolgens wordt het in het gal afgevoerd naar de darm. In de darm zorgt bèta-glucuronidase er vervolgens voor dat de metaboliet weer het primaire product wordt. Deze wordt weer opgenomen, etc. De organen die betrokken zijn bij het metabolisme van xenobiotica zijn dus vooral de lever, dan de darm, dan de longen en nieren en als minst belangrijkste groep de huid, gonaden, blaas, bloed en neusmucosa (de neusmucosa draag niet bij aan de lichaamsklaring, het werkt alleen lokaal). Weefselspecifieke transcriptiefactoren bepalen de expressie van metaboliserende enzymen en transporters en zorgen zo voor specificiteit van de weefsels in het metabolisme van xenobiotica. Fase I reacties MFO = mixed function oxidase CYP P450 = Cytochroom P450 Oxidatiereacties worden gedaan door MFO’s, bijvoorbeeld CYT P450. Er vindt voornamelijk oxidatie aan een C-atoom plaats. De algemene reactievergelijking is: RH + NADPH + H+ + O2 ROH + H2O + NADP+ Het substraat (RH) wordt dus geoxideerd en O2 wordt gereduceerd. Dit is een aliphatische hydroxylatie reactie. Ook kan een benzeenring een OH groep krijgen (= aromtische hydroxylatie), kan er een O aan een CH3 groep komen, wat samen vervolgens loslaat als H2CO en een H achterlaat (= epoxidatie) en kan een NH2 groep als NH3 plaats maken voor een =O (= deaminatie). Ook kan er een O binden aan een CH3 die naast een N, O of S zit. Aan deze N, O of S bindt vervolgens de derde H die eerst aan de C zat (= N- O- of S-dealkylatie). Verder kan er een O binden aan een NH en een NOH vormen (= N-hydroxylatie), kan er een halogeengroep vervangen worden door een dubbel gebonden O en hierbij verliest de C 1 Htje (= oxidatieve dehalogenatie), kunnen 2 N’s die dubbel gebonden zijn elkaar loslaten en H’s binden (= azo reductie), kan een NO2 aan een benzeenring vervangen worden door een NH2 (= aromatische nitro reductie) en kan een halogeen aan een C die in totaal 3 halogenen gebonden heeft vervangen worden door een H (= reductieve dehalogenatie). Cytochroom P-450 heeft een heamgroep. CYT P450 bevindt zich in het SER. Zuurstof dat aan de heamgroep zit krijgt een elektron van een elektronendoneerder en bindt zo aan het geneesmiddel. Er vindt zo dus oxidatie van het geneesmiddel plaats. CYP heeft dus altijd een andere stof nodig die een electron doneert! Er komt een zuurstofradicaal bij dit proces vrij. Er zijn vele iso-enzymen (±200) van CYT P450 binnen en tussen allerlei soorten. Ze worden gegroepeerd naar de homologie van de aminozuren. - Eerste nummer: familie (>40% homologie) - Tweede nummer (letter): subfamilie (>70% homologie) - Laatste nummer: genummerd volgens volgorde van de ontdekking. Bijvoorbeeld CYP3A4. Deze komt alleen voor bij de mens! Het is bij de mens ongeveer 31% van de totale hoeveelheid CYP iso-enzym. Ook is dit het enzym dat betrokken is bij het metabolisme van de meeste geneesmiddelen. CYP2D6 komt heel weinig voor, maar is ook bij heel veel metabole omzettingen van geneesmiddelen betrokken. Er zijn meerdere iso-enzymen van CYT P450 betrokken bij dehydroxylering. De belangrijkste zijn CYP2C9, CYP4A en CYP3A4. Andere oxidatie reacties: Naast MFO zijn er nog een aantal andere soorten oxidases. - FAD-monooxygenase (FMO), aanwezig in het SER. Het is vooral van belang bij stikstof- en zwaveloxidase! o RH + O2 + NAD(P)H + H+ ROH + H2O + NAD(P)+ o Het zorgt er dus voor dat een H groep wordt vervangen door een OH groep. - Monoamine oxidase (MAO), aanwezig in de mitochondria. Het is vooral voor de oxidatie van endogene amines. o NADH + H+ + R-NH2 + O2 R=NH + H2O2 + NAD+ (+ H2O) R=O + NH3 + H2O2 + NAD+. o Het zorgt er dus voor dat een NH2 groep wordt vervangen door een =O. Dit is dus een deaminatie reactie. - Peroxidase-afhankelijke co-oxidase. Prostaglandine H synthase (PHS) zorgt voor activatie van cyclo-oxygenase (COX1 en COX2), die arachidoic acid kan oxideren. Ook maakt PHS peroxidase dat deze geoxideerde arachioic acid om kan zetten in een reactieve prostaglandines. Reductie reacties: - Azo reductie 2 dubbel gebonden N-en laten elkaar los en binden H’s. - Nitro reductie een NO2 groep wordt een NH2 groep. Hydrolyse reacties: - Epoxide hydrolase: o Detoxificatie van epoxides o Bij alkene epoxide wordt een C C O driehoekje verbroken en bindt er een H aan de O. Aan de achterste C bindt een OH groep. o Bij arene epoxide wordt de C C O driehoek die aan de buitenkant van een benzeenring hangt verbroken. Er bindt een H aan de O en aan de andere C bindt een OH groep. - Carboxylesterases o Dit enzym zet esters om. o Gevaar voor interactie met acetylcholine-esterase activiteit. o Activering van een prodrug, wat de ester van een actieve drug is. Fase II reacties: UGTs zijn de grootste groep van enzymen bij fase II. Ook de sulfotransferases (STs) zijn een grote groep. Glucuronidering reacties: - Deze fase II reactie is kwantitatief de belangrijkste. - Er vindt conjugatie met glucuronzuur plaats. o O-glucuroniden: R-OH (etherglucuronide) en R-COOH (esterglucuronide). R2 o N-glucuroniden: R-NH2 (vooral aromatische aminen) en R1-N-R3 (quaternair glucuronide). o S-glucuroniden: R-SH - De cofactor is UDPGA, oftewel UDP-glucuronzuur. Dit is energierijk en in grote hoeveelheden aanwezig. - Basisreactie: R-OH + UDPGA ROG + UDP - Enzym: glucuronyltransferases. (UDPGT) Ze hebben een lage affiniteit, maar een hoge capaciteit. - Localisatie: in het SER. - Deconjugatie: in de darm door β-glucuronidase dat afkomstig is van micro-organismen. Het glucuronzuur wordt er hierdoor weer afgehaald en het is dus weer zoals het was. Dan is er weer opname in de lever etc. het zit dus in de enterohepatische circulatie. Er zijn heel veel verschillen tussen de enzymen. Sommige enzymen kunnen van alles, terwijl anderen maar heel weinig kunnen. UGT’s komen voor in de lever, galbuizen, dikke en dunne darm, maag en esophagus. Acyl-glucuronides kunnen ook gevormd worden door glucuronidering. Het product is toxisch! Sulfatering reacties: - Er vindt conjugatie met sulfaat plaats - Substraten: R-OH, R-NH2, R-SO2NH2 en R-SH. - Cofactor: PAPS. Het is energierijk, maar we hebben veel minder PAPS dan UDPGA, dus deze reactie is heel snel uitgewerkt. - Basisreactie: R-OH + PAPS R-OS + PAP. - Enzym: Sulfotransferase (SULT1, SULT2 en SULT4) Ze hebben een hoge affiniteit, maar een lage capaciteit. Er zijn grote verschillen tussen soorten. - Lokalisatie: in het cytosol van de lever, darm en nier. Er is een balans tussen sulfatering en glucuronidering. Deze balans is afhankelijk van 2 factoren, namelijk: - De dosis o Lage dosis meer sulfaat conjugaat o Hoge dosis meer glucuronide conjugaat - De lipofiliteit van het substraat o Lipofieler glucuronidering in het SER o Hydrofieler sulfatering in het cytosol Methylering reacties: - Er vindt conjugatie met een methylgroep plaats. Dit is raar, want methylering maakt een stof niet meer water oplosbaar zoals alle andere reacties! - Substraten: R-SH, R-NH2 en R-OH. De substraten zijn vooral endogeen. - Cofactor: SAM (S-adenosyl-methionine). Deze is heel energierijk. - Basisreactie: R-SH + SAM R-S-CH3 + S-adenosyl-homocysteine. - Enzym: N- S- of O- methyltransferase. - Localisatie: in de long en de lever in het SER. - Conjugaten: zijn minder polair en dus minder goed uit te scheiden dan het substraat. Acetylering reacties: - Er vindt conjugatie met acetaat plaats (-COCH3) - Substraten: R-NH2 en R-NH-NH2. Vooral aromatische aminen. - Cofator: Acetyl-CoA. Dit is heel energierijk. - Basisreactie: R-NH2 + acetyl-CoA R-NH-CO-CH3 + CoA. - Enzym: N-acetyltransferase (NAT1 en NAT2) - Localisatie: NAT1 in de meeste weefsels en NAT2 voornamelijk in de lever en de darm. - Conjugaten: zijn minder wateroplosbaar dan het substraat, dus percipitatie in de nier. Isoniazide (INH) kan door NAT worden omgezet in acetyl-INH. Als acetyl-INH door CYP wordt omgezet in een reactieve metaboliet, kan er leverschade optreden. Aminozuur conjungatie: - Er vindt conjungatie plaats met glycine, taurine, glutamine of serine. - Substraten: o Carboxyl groepen o Aromatische hydroxylamine - Cofactoren: o Acetyl CoA en aminozuur o Geactiveerd aminozuur - Enzymen: o Acyl CoA synthetase en acyl CoA-aminoacid N-acyltransferase o Seryl-tRNA synthetase. Glutathion conjugatie: (!) - Dit is de belangrijkste manier van detoxificatie! - Er vindt conjugatie plaats met glutathion (= glycine-cysteine-glutamaat) (GSH) - Substraten: elektrofielen zoals alkyl-X, aromatische halides, alkyl-NO2, aromatische NO2, alkenen, epoxides en H2O2. - Cofactor: GSH. Hier hebben we heel erg veel van. - Enzym: glutation-S-transferase (omdat hij koppelt aan de S van cysteine.) Er bestaan verschillende isoenzymen van. De reactie verloopt vaak ook spontaan. - Localisatie: Voornamelijk in het cytosol van de lever, nier en darm. - Conjugatie: Soms wordt het onveranderd uitgescheiden (als glutation conjugaat) in de gal en urine, maar vaker wordt het gedeconjugeerd tot mercaptuurzuur (ge- N-acetyleerde cysteine) en dan uitgescheiden. Ook kan er methylation glucuronidation gevormd worden (reactieve metaboliet). Wat je niet vindt in de uitscheiding van deze stof is de reactieve metaboliet! Het verschijnt niet in de urine omdat het voor die tijd met iets anders gereageerd heeft. Als het goed is heeft het met glutation gereageerd, maar als het niet goed is, heeft het met iets anders gereageerd en is het dus toxisch. Fase III: Als het geneesmiddel kan oplossen in de lipide bilaag, is er passieve diffusie door het membraan. Zo niet, dan moet het met een transporter als MDR1 (Pgp), MRP of BCRP. College 3 (25 feb) Activatie van stoffen door het metabolisme Activatie: Een stof die niet actief is, wordt door een metaboliet geactiveerd. Toxificatie: De productie van toxische metabolieten. Het metabolisme van xenobiotica zorgt meestal voor detoxificatie, maar ook soms voor toxificatie. Meestal maakt het het xenobioticum farmacologisch inactief, maar soms wordt het juist actiever. Toxificatie: Omzetting die leidt tot het ontstaan van reactieve metabolieten of reactieve intermediairs die een covalente binding aangaan met weefselmacromoleculen zoals DNA, RNA, eiwitten en lipiden, of het cellulaire milieu veranderen (bijv. redox-actieve stoffen) Door metabolisme ontstaan er hele andere verbindingen die ook hele andere eigenschappen hebben. Valium demethylering naar nordizepam hydroxylering naar oxazepam. Asperine deacetylering naar salicylzuur. Bij paracetamol: CYTP450 zorgt in een fase I reactie voor toxificatie. De OH verandert in een dubbel gebonden O en rechts onderin ontstaat een lading. Hiermee kan het molecuul binden aan cellen of macromoleculen en deze beschadigen of doden. GST kan vervolgens door conjugatie voor detoxificatie zorgen in een fase II reactie waarbij SG gekoppeld wordt aan de benzeenring. Al voordat de toxische metaboliet gevormd wordt door CYT P450, kan het ook gedetoxificeerd worden. SULT zorgt voor conjugatie van een sulfaatgroep op de plek van de OH groep in een fase II reactie. Ook kan UGT zorgen voor detoxificatie door conjugatie van OG op de plek van de OH in een fase II reactie. Een stof kan alleen toxisch zijn als er meer toxificatie is dan detoxificatie. (!) Bij paracetamol is heel veel detoxificatie, dus je moet super veel nemen voordat de detoxificatiemechanismen verzadigd zijn en de toxificatie de overhand kan nemen. 4-ipomeanol (komt voor in schimmels van zoete aardappels): Mensen hebben CYP1A2 en CYP3A4 (in de lever) die hier gevoelig voor zijn. Bij de mens leidt het dus tot levertoxiciteit. Dieren hebben CYP4B1 (in de long) en krijgen dus longtoxiciteit. Er zijn dus species verschillen! Reactieve metabolieten Fase 1 - Hydroxylamines (C-N-C met aan de N een OH groep) - Epoxiden (C-C-O driehoekje) - Radicalen (radicaal (C) atoom) - carbonylhalide (C=O met aan die C ook een halogeen (Cl, Br of I) Al deze stoffen zijn heel actief omdat ze heel elektrofiel zijn. Ze geven een off-target toxisch effect, omdat ze zo reactief zijn, dat ze met van alles en nog wat in de cel gaan reageren (on- en off target moeten we kennen!) Fase 2 Niet altijd detoxificatie! Er kan een instabiele stof gevormd wordt die uiteenvalt in actieve componenten. Hierbij kan een carbonium ion (C+) of nitrenium ion (N+) gevormd worden. Ook kan een fase 2 reactie tot deconjungatie leiden en weer de toxische fase 1 stof worden. Een voorbeeld van fase 2 toxificatie is 1,2-dibroomethaan. Glutathion (GSH) bindt aan een van de CH2-en als GS en hierdoor wordt 1 bromide eraf gegooid. De GS groep bindt vervolgens ook met de tweede CH2 (dus ook de tweede bromide wordt eraf gegooid) en wordt een CH2-GS+-CH2 driehoekje gevormd. Dit heet een thilranium ion, dat erg elektrofiel en dus reactief is. Er kan ook toxificatie plaatsvinden door deconjungatie, bijvoorbeeld bij anilineglucuronide. In de lever wordt er een OH groep en (onder invloed van UDPGA) een glucuronide groep aan gekoppeld. Vervolgens gaat het naar de nieren. Het glucuronzuur valt er hier door de pH af. De stof die overblijft is reactief en leidt tot blaasschade. Een derde is N-acetylatie. NAT2 haalt een acetylgroep eraf en er ontstaat een reactieve metaboliet, namelijk een nitrenium ion. Ook hierbij is de lage pH van de blaas de trigger en kan het leiden tot blaasschade. (nitrenium ion onthouden) N-acetylatie kan leiden tot de vorming van een toxisch nitrenium ion. Aan een NH2 groep bindt met behulp van CYP1A4 een OH groep (een H gaat eraf). Onder invloed van NAT2 kan deze OH groep veranderen in een –O–C=O groep, die vervolgens eraf valt. Wat overblijft is een N+, die heel CH3 Reactief is en een carcinogene werking op het DNA kan hebben. Toxificatie door glucuronidering (fase II): 2-naphtylamine heeft 2 benzeenringen en een NH2 groep. Deze groep kan omgezet worden in een –NHOH groep. Onder invloed van UGT kan 1 van de H’s een glucuronide groep worden. Dit wordt weer naar de nier verplaatst, waar de pH laag is en het glucuronzuur eraf valt. Het resultaat is een NH+ groep. Dit is een nitrenium ion en het kan covalent binden aan DNA. Toxificatie door sulfatering (fase II) Tamoxifen wordt door CYP omgezet (er komt een OH groep aan). Mensen zetten dat om in een stabiele stof door de H van de OH te vervangen in een glucuronide groep, maar ratten voeren een sulfatering reactie uit. Ze vervangen de H van de OH door een SO2H groep. Dit is instabiel en valt uit elkaar. Het resultaat is een carbonium ion dat reactief is en covalent aan DNA kan binden. Toxische effecten: 1) Additie aan DNA en RNA kan leiden tot carcinogenese 2) Additie aan eiwitten, DNA en RNA kan leiden tot celbeschadiging en celdood. 3) Additie aan vetten = lipideperoxidatie kan leiden tot celbeschadiging en celdood. Variatie in metabolisme: Variatie = species verschillen en individuele verschillen tussen mensen. Speciesverschil bij oxyphenbutazone Mens: hele lange halfwaardetijd Hond: hele korte halfwaardetijd. (hebben meer enzymen die het omzetten) Verklaring voor interindividuele metabole variatie: - Genetische aanleg - Leeftijd - Ziekte - Geslacht - Voeding - Andere xenobiotica en endogene stoffen (bijv. hormonen) dit gebeurt via inductie en inhibitie (o.a. competitie) Genetische verschillen in metabolisme: door polymorfismen. Isoniazide (een TB toxine) wordt geacetyleerd door een enzym (isoniazid Nacetyltransferase, NAT) om een anti-tuberculose werking te hebben. Isoniazid Nacetyltransferase heeft verschillende polymorfismen voor zowel NAT2 in de lever en darm als voor NAT1 in meerdere weefsels. Vooral polymorfismen in NAT2 maken een verschil. Bij sommige mensen gaat de acetylering dus veel sneller dan bij de ander, afhankelijk van het polymorfisme. Je bent dus een poor- of een extensivemetablolizer. Poor metabolisers worden langer blootgesteld aan isoniazine en hebben dus meer toxiciteit. Ook CYP2D6 heeft polymorfismen. De populatie is, net als bij isoniazid Nacetyltransferase, opgedeeld in extensive metabolizers (EM) en poor metabolisers (PM). Dit komt door een (punt)mutatie of deletie in het CYP2D6gen. 7% van de bevolking is PM. De mutatie is meestal een SNP (Single Nucleotide Polymorphism) (!). Als je de mutatie hebt, heb je minder CYP450 in de lever en wordt de stof die CYP om moet zetten (paracetamol) veel langzamer gemetaboliseerd. Daarom wordt de concentratie hoger en duurt het langer voordat de paracetamol is uitgewerkt. EM-ers hebben een veel hogere dosis van nortripyline (zet een toxine om) nodig dan IM-ers en PM-ers. Ze ervaren geen effect en stoppen met het medicijn. CYP2D6 zet ook codeïne om in morfine. Dit gebeurt door een demethyleringsreactie. Als je een PM-er bent zet je niet genoeg tot morfine om en vervaar je dus geen pijnstilling. CYP2C19 heeft ook polymorfismen. 20% van de Aziaten en 2-5% van de Europeanen missen het actieve enzym. CYP2C19 zet benzodiazepines om. Iso-enzymen: - Verklaring voor kwalitatieve en kwantitatieve verschillen in de vorming van metabolieten. Hieruit kun je dus een metabool patroon bepalen. o Tussen species o Tussen individuen o Tussen weefsels - Interacties van geneesmiddelen onderling - Interacties van geneesmiddelen met endogeen metabolisme De leeftijd is van belang bij het fase II metabolisme. De expressie van bepaalde enzymen verschilt door het leven en op hele jonge leeftijd zijn bepaalde enzymen nog niet tot expressie gekomen! Ook zijn er individuele patronen van ontwikkeling van enzymsystemen en zijn er verschillen tussen enzymsystemen. Wanneer je een leverziekte hebt, gaat de hoeveelheid enzymen omlaag. Hoe erger de ziekte, hoe minder je ervan hebt. Bepaalde enzymen nemen heel snel af bij de ziekte (CYP2C19 en CYP3A4), maar anderen doen er veel langer over (CYP2D6 en glucuronidation) De omzettingscapaciteit van de enzymen wordt dus ook lager naarmate de ziekte vordert. De paradox van moderne drug development 1) Clinical trials bewijzen de effectiviteit van een drug in grote populaties met de normale dosissen. 2) De medicijnen worden echter gebruikt om een individu te behandelen die grote variatie kan tonen in zijn respons op de drug. Geneesmiddelinteracties: Inductie: aanmaak van extra enzym. Inhibitie: competitie om een enzym of destructie van een enzym. De Milosevic case: Milosevic slikte rifampicine en beta-blockers. Rifampicne werkt beta-blockers tegen. Als je de dosis beta-blockers dan verhoogt, is het weer werkzaam, maar als je dan stopt met rifampicine, krijg je een overdosis. Rifampicine is een inducer van CYP450. Een ander voorbeeld van een inducer is fenobarbital. Toediening van fenobarbital leidt tot kortere slaap bij konijnen. Een inducer heeft meestal effect op de eiwitsynthese. De eiwitsynthese heeft 3 belangrijke fasen: transscriptie, translatie en afbraak. Een lichaamsvreemde stof activeert een transscriptiefactor. Deze transscriptiefactor kan vervolgens naar de kern gaan en daar met een bepaald deel van het DNA binden (response of element). Dit leidt tot meer of minder transscriptie en dus meer enzymafgifte (bijv. CYP). Dit enzym gaat dan zijn werk doen. Inductie van de Aryl Hydrocarbon Receptor (AHR): Polycyclische koolwaterstoffen stimuleren de CYP1A1productie via de AHR : Een polycyclische koolwaterstof bindt aan een systolische receptor, de Aryl Hydrocarbon Receptor (AHR). In de nucleus vindt vervolgens binding met ARNT plaats en dit complex bindt met het XRE gen (xenobiotic responsive element). Er is activatie van de mRNA productie, en er is meer productie van CYP1A1 Inductie van de Constitutive Androstane Receptor (CAR): Phenobarbital stimuleert de Cyp2B productie via CAR:. Gefosforyleerde CAR in het cytosol wordt door phenobarbital gedefosforyleerd. Het gaat de kern in en bindt met RXR. Hier zorgt phenobarbital er ook voor dat weer gefosforyleerd wordt door de transscriptiefactor SRC-1. Het complex bindt aan het DNA op het PBREM gen en CYP2B6 wordt afgeschreven. Effecten van CAR stimulatie: - Stijging van specifieke iso-enzym activiteit - Toename in SER eiwitten en lipiden - Toename in het levergewicht - Toename in de doorbloeding - Toename van andere enzymactiviteit zoals glucuronyl-transferase, GSHtransferase en epoxide hydrolase. Dit zijn allemaal detoxificatiemechanismen. CAR zorgt dus voor detoxificatie! Let op! CAR heeft dus niet alleen invloed op CYP2B, maar op heel veel verschillende celtypen. Inductie van de Pregnane X Receptor (PXR): Rifampicine stimuleert de CYP3A4 productie via de PXR. Het bindt in het cytosol aan de PXR en het complex migreert de celkern in. Hier bindt het aan RXR en samen binden ze aan het ER6 gen voor de transcriptie van CYP3A4. PXR speelt een centrale rol bij de klaring van drugs en steroiden. Ook PXR beïnvloed veel meer enzymen dan alleen CYP3A4. Een belangrijke andere is MDR1. Inductie door alcohol: Alcohol leidt tot meer CYP2E1, maar niet door stimulatie van de transscriptie, maar door stimulatie van de translatie. Het stabiliseert CYP2E1, dat onder andere betrokken is bij de afbraak van paracetamol. Sint Jans kruid induceert allerlei medicijnen en vermindert zo de werking ervan. CsA wordt in de lever wordt omgezet tot metaboliet door CYP3A4. Rifamficine zorgt voor meer productie van CYP en er wordt dus meer metaboliet gevormd. De CsA concentratie in het plasma neemt dus af. De inductie van het metabolisme kan dus een groot effect hebben op de plasmaconcentraties van geneesmiddelen en dus ook op de werkzaamheid. Inductie van het metabolisme kan zowel voor detoxificatie als voor toxificatie zorgen. Inhibitie: 1. Competitie met een ander substraat. 2. Vernietigen CYP door suïcide substraten (deze reactieve substraten, geproduceerd door CYP, reageren met CYP en remmen zo hun eigen aanmaak. De toxische metabolieten binden irreversibel aan C=C bindingen, bijvoorbeeld intestine in grapefruitsap. 3. Na metabolisme is er reversibele binding aan CYP, o.a. bij cimitidine, methadon en SKF525A. 4. Verlaging van de enzymconcentratie door beïnvloeding van de synthese en/of degradatie, bijv. metaalionen zoals kobalt en cadmium. 5. Uitputting van de cofactoren. 6. CO (in vitro) competeert met O2 voor heem in CYP. CsA en ketoconazole (KTZ) competeren om een plek op CYP3A4. Als KTZ wint, wordt CsA minder omgezet. De CYP3A4 productie neemt af en de concentratie CsA in het plasma gaat dus omhoog, omdat er minder metaboliet gevormd wordt. Grapefruitsap zorgt ervoor dat diazepam, een geneesmiddel, langzamer uit het lichaam verdwijnt. Dit vergroot de kans op bijwerkingen. Wanneer het famacon intraveneus gegeven wordt, treedt dit effect niet op. Het effect varieert met de dosis sap. Het sap inhibeert dus CYP3A4 in de darm. Het is hierbij een suïcide substraat. De plasmaconcentratie van felodipine, de actieve stof in diazepam, is door grapfruitsap dus verhoogd (want het wordt minder omgezet in de actieve metaboliet). Belangrijk drug-interacties die tot CYP3A4 inhibitie leiden: - Cyclosporine en FK506 leiden door CYP3A4 inhibitie tot neuro- en niertoxiciteit. - Terfenadine leidt tot cardiotoxiciteit - Midazolam/triazolam leidt tot overmatige sedation. Er zijn meerdere interacties tegelijkertijd mogelijk. - Plasma clozapine is verhoogd in patiënten behandeld met fluvoxamine (potente inhibitor van CYP1A2). - De halfwaardetijd van clozapine is verlaagd in rokers (want roken induceert CYP1A2, hogere metabole klaring van clozapine. Dus fluvozamine gaat het effect van roken op clozapine tegen (en andersom). De ethanol en paracetamol paradox: 1) Ethanol zorgt ervoor dat je beschermd bent bij en overdosis paracetamol. Ze competeren namelijk om de CYP2E1 receptor. Het verlaagt dus de kans op toxiciteit bij paracetamol. Er is sprake van inhibitie. 2) Wanneer je chronisch alcohol gebruikt, is de gevoeligheid van CYP2E1 verhoogd, omdat je er extra van hebt aangemaakt (want alcohol zorgt daarvoor) en heb je juist een grotere kans op toxische effecten bij een overdosis paracetamol. Er is sprake van inductie. Door de enzyminhibitie wordt de biobeschikbaarheid van het substraat verhoogd. Dit leidt tot een grotere kans op on-target effecten, want je hebt meer van de stof in je lichaam en dus meer binding aan de receptor. Methoden om metabolisme te meten: - in vivo (proefdieren, mens, plasma, urine, feces) - precies gesneden plakjes weefsel (slices) - celkweken (vers geïsoleerd of cellijn) - microsomen (vesicles van SER) - cytosol - S9 fractie (cytosol + microsomen) - Enzymen die tot expressie worden gebracht in cellijnen (kunstmatig) Kun je inhibitie meten met microsomen? Ja, want sommige van de enzymen die geïnhibeerd worden zitten in het membraan van het smooth ER. Als het enzym er niet zit, kan het dus niet. Kun je inductie meten met microsomen? Nee, want in de microsomen zitten geen ribosomen, RNA, etc, dus je kan alleen inductie meten als je van tevoren de stofjes maakt en toedient. Kun je in weefselplakjes inductie meten? Ja, dat zijn complete levende cellen. Kun je een voorspelling doen van de metabole klaring in de mens aan de hand van een cellijn? Nee, want cellijnen zijn gede-differentieerd, dus de enzymen zijn heel anders geworden. Microsomen worden gemaakt door het homogenaat eerst langzaam 30 min te centrifugeren. Het pellet bevat dan kernen en microsomen. Dan wordt het supernatant 60 minuten gecentrifugeerd op hoge snelheid. Het supernatant is dan het cytosol. Dan wordt het pellet gewassen en opnieuw 60 minuten snel gecentrifugeerd. Je houdt dan de microsomen over. Cellulaire en moleculaire mechanismen van toxiciteit Toxicant delivery a) interactie met target molecuul of b) verandering van de biologische omgeving van een cel cellulaire dysfunctie of schade (leidt tot toxiciteit) slechte reparatie en adaptatie (leidt tot toxiciteit). De toxiciteit is de balans tussen schade en (goede) reparatie. 3 dingen hebben invloed op het proces dat plaatsvindt als een ultimate toxicant (ultimate, want het is de stof die uiteindelijk bindt en dat hoeft niet perse hetzelfde te zijn als de toxische stof die je binnenkrijgt) aan een target bindt. 1) Attributen van de target a. Reactiviteit b. Bereikbaarheid c. Kritieke functie 2) Reactie types a. Noncovalente binding (bijv. CO vergiftiging) b. Covalente binding c. Hydrogen abstraction d. Elektronen transfer e. Enzymatische reactie 3) Uitkomsten a. Dysfunctie b. Vernietiging c. Neoantigeen formatie. (een lichaamseigen eiwit wordt veranderd doordat er een toxine aan bindt. Het lichaam herkent het eiwit niet meer en gaat er antigenen tegen maken.) Stap 1: blootstelling van de target Tijdens de delivery van de toxine naar de target vindt er absorptie, distributie naar de target, reabsorptie en toxificatie plaats. Hun tegenhangers zijn respectievelijk pre-systemische eliminatie, distributie weg van het target, excretie en detoxificatie. Dit bepaalt hoe veel van de toxine het uiteindelijke target orgaan bereikt. In het targetorgaan bindt de ultimate toxicant aan zijn targetmolecuul. Ultimate toxicant: reactieve stof > Radicalen (hebben een ongepaard elektron): - metabolieten van xenobiotica - metabolieten van O2 > Elektrofielen (willen een elektron binden): - epoxiden - isocyanaten - ketonen - acylhaliden - aromatische aminen - ester-glucuroniden (zuur-glucuroniden) Stap 2; Reactie types: - Non-covalente binding: reversibel. Invloed op de activiteit van receptoren, enzymen, transporters etc. - Covalente binding: irreversibel. Door reactieve elektrofiele metabolieten - Waterstof abstractie: o.a. van lipiden. Door radicalen. - Elektronen overdacht: oxidatie/reductie. Quinonen, ROS vorming. Irreversibele binding aan een eiwit betekent dat het nooit meer los laat, maar op een gegeven moment worden die eiwitten afgebroken. Het effect is dus niet voor eeuwig. Het effect is wel blijvend als de binding aan zo’n eiwit ervoor zorgt dat de hele cel doodgaat. LMW (low molecular weigth) compounds: - Niet-covalente binding (reversibel, geeft bijeffecten) - Covalante binding (reactieve metaboliet) - Lipideperoxidatie - Oxidatie/reductie/ROS vorming - Incorporatie in het DNA/RNA Dit geldt voor een groot deel van de geneesmiddelen, maar tegenwoordig worden er steeds meer biologicals gebruikt als geneesmiddelen. Dit zijn bijv. eiwitten, DNA gen therapie en siRNA. Een voorbeeld is een monoclonaal antilichaam. Dit is een antilichaam die heel specifiek tegen 1 eiwit gericht is. Deze biologicals hebben hele andere eigenschappen. - Immunlogische reactie (hier worden dus antilichamen tegen gemaakt!) - Bijeffecten door receptorbinding - Zeer soort-specifiek. Stap 3: Effecten van toxische stoffen op de targets - dysfunctioneren van de target o Activatie o Remming o Verandering tertiaire structuur o Verstoring van de homeostase van de cel - Vernietiging van de target o Eiwit: afbraak door chaperones en ubiquitinilering o Lipiden: lipidperoxidatie o DNA: breuken - Neoantigen vorming = hapteen o Immunologische reactie Binding van een toxine aan een targetmolecuul kan, wanneer deze target betrokken is bij cell maintenance, leiden tot slechte maintenance en dus bloeding in het lichaam. In dit geval heeft lokale binding effect op verschillende plekken. Binding aan macromoleculen: de gevolgen - Eiwitten (vaak aan de –SH of –NH2 groepen) o Verstoorde functie verstoorde homeostase vele effecten, direct of indirect o Celdood o Hapteen vorming antilichaam vorming o Alleen het feit dat er veranderde eiwitten gevormd worden, betekent niet per definitie dat het eiwit ook schadelijk is. - Lipiden o Verstoorde membraanfunctie - RNA o Remming van de eiwitexpressie - DNA o Mutaties kanker o Crosslinking celdood Verstoring van de cel functies: - Genexpressie Vaak binding aan transcriptiefactoren, verhoogde of verlaagde functie. - Signaal transductie. Activatie van signalling pathways, celdeling, celdood en apoptose. - Neuronale activiteit. Via binding aan een receptor of via beïnvloeding van neurotransmitter concentraties. - Mitochondriële schade Verstoring van de ATP voorziening - Verhoging van de Ca2+ concentratie in het cytoplasma Al deze mechanismen beïnvloeden elkaar en kunnen elkaar versterken. De calciumconcentratie in de cel is heel laag. Er zijn allerlei processen die hier voor zorgen (ten kosten van ATP). Dit is nodig omdat Ca2+ een heel aantal enzymen activeert die zorgen voor necrose en apoptose van de cel. Een reactieve metaboliet kan er via verschillende mechanismen voor zorgen dat het Ca2+ niveau stijgt in de cel. Voorbeelden van deze mechanismen zijn ATP gebrek, membraanschade, mitochondriele schade, GSH depletie en oxidatieve stress. Necrose: Er is ATP gebrek, ROS en LPO. De cel ploft uit elkaar, maar de afbraakstukjes blijven in vesicles. De kern wordt heel klein (piknose). De cellen om de necroserende cel ontvangen door de necrose vaak ook schade. Er treedt karyolyse op (oplossing van de cel), de cel is eosinofiel (kleurt extra oranje van eosine kleurstof), de mitochondriën en het ER zwellen en er komen enzymen vrij in het bloed. Dit leidt uiteindelijk tot een ontstekingsreactie (!) Apoptose: er is receptor-gemedieerde signaaltransductie. ATP blijft lang hoog. Er zijn mitochondriële toxines en DNA toxines. De cel plopt helemaal uit elkaar in kleine stukjes, ook de kern (blebvorming). DNA wordt in willekeurige stukjes gebroken en geeft in een gel een ladder. De chromatiden condenseren, de caspase-activiteit wordt verhoogd, de cel krimpt en er zijn apoptotic bodies. De 3 fasen van apoptose: 1) Initiation: de toxische stof richt schade aan De apoptose machinerie wordt geactiveerd. 2) Dicision: balans tussen pro- en anti-apoptotische factoren 3) Execution: caspases breken eiwitten en DNA af. Dit hele proces is dus heel erg gereguleerd. MOMP: Mitochondrial outer membrane permeability MPTP: Mitochondrial permeability transition pore De MPTP’s zijn poriën in het mitochondrionmembraan die open gaan staan bij schade. (mitchondriale schade, DNA schade of stimulatie dan de death receptor) Hierdoor komt cytochroom C de mitochondriën uit en gaat het procaspase 9 activeren tot caspase 9. Caspase 9 zet vervolgens procaspase 3 om in caspase 3. Wanneer dit in een paar mitochondria gebeurt, overleeft de cel. Wanneer het bij wat meer mitochondria gebeurt, vindt er de gecontroleerde apoptose plaats. Wanneer het bij alle mitochondria gebeurt, is er geen ATP meer en gaat de cel in de ongecontroleerde necrose. De death receptor induceert caspase 8 en die induceert caspase 3. Ook kan activatie van de death receptor leiden tot afgifte van cytochroom C uit de mitochondria. Liganden voor de death receptor zijn TNFalfa, FAS en TRAIL. Hogere concentraties hiervan activeren meer mitochondria van een cel en hoe meer er geactiveerd worden, hoe meer de dood gaat naar de kant van necrose. Stap 4: reparatie, adaptatie en schade: Reparatie kan plaatsvinden op moleculair (eiwitten, vetten en DNA), cellulair (autofagie van kapotte organellen en regeneratie van beschadigde axonen) of weefsel niveau (apoptose, cel reproductie en ECM reproductie. Dit geeft fibrose = littekenweefsel). Reparatie van moleculen - Reparatie van eiwitten o Reduceren van geoxideerde S-S bruggen o Chaperone en heat shock eiwitten repareren beschadigde cellen o Ubiquitinilering: afbraak van eiwitten in het proteasoom - Reparatie van lipiden o Reductie van geoxideerde lipiden dmv GSH reductase. - Reparatie van DNA Reparatie van cellen en weefsel: - Opruimen: beschadigde organellen (dmv. autofagie) - Apoptose: gecontroleerde cel-verwijdering - Regeneratie: Door proliferatie. Celdeling van naburige cellen als reactie op de uitscheiding van bepaalde signalen (o.a. cytokines) door de beschadigde cellen. - Celmigratie: bijv. in de darm. De overgebleven cellen dekken snel de gaten die ontstaan zijn af. - Ontstekingsreactie: Aantrekking van opruimcellen - Bescherming: acute fase eiwitten. Tegen het ontstaan van verdere schade. Adaptatie: - Opregulatie van de bescherming (GST, Nrf/Keap) en reparatie van enzymen - Opregulatie van de excretie transporters (Pgp) - Compensatie voor functieverlies door opregulatie van de functie in de overgebleven cellen. Als de adaptatie en reparatie falen, vindt er necrose (+ontsteking), bindweefselvorming (fibrose) of kanker plaats. Het herkennen van toxiciteit kan met biomarkers. Met –omics meet je het profiel van verschillende biomarkers. Voorbeelden van – omics zijn phospho-proteomics, kinomics, transscriptomics, proteomics en metabonomics. Ze werken allemaal samen, want meer DNA transscriptie betekent niet automatisch dat er ook meer eiwit gevormd wordt. Microarray analysis: Je neemt cellen uit een gezonde en vergifigde lever. Hier haal je RNA uit. Vervolgens pas je reverse transscription toe en voeg je labels in kleuren toe. Daarna doe je hybridisatie en ga je kijken hoeveel kleur elk vakje heeft. De ruwe data werk je uit en normaliseer je en uiteindelijk kun je zo kijken welke genen up- of downgereguleerd zijn ten opzicht van de controle. Hier kun je allemaal data uit halen, waaronder de toxische pathways. Proteomics: De voorbereidingsstappen zijn hetzelfde. Vervolgens doe je het RNA in een gel en scheidt je alle eiwitten. Met een spectrometer identificeer je dan de eiwitten. Kinomics: Je haalt lysate uit een weefsel en doet er kinases bij. Met chips markeer je de kinases die wel of niet geactiveerd worden. Idiosyncratische toxiciteit: - treedt niet op bij de eerste blootstelling - er is geen duidelijke dosis-effect relatie - het is slecht reproduceerbaar in dierproeven - het komt maar weinig voor De hypothese is dat de reactieve metaboliet koppelt aan een eiwit (hapteen). Er wordt een co-stimulerende factor geproduceerd die de cellen extra gevoelig maakt. Hierdoor vindt er een immunologische reactie plaats. Dit komt bijvoorbeeld voor bij halothaan. College 4 (26 feb) Oxidatieve stress = Disbalans tussen de vorming van reactieve zuurstof intermediairen (reactive oxigen species, ROS) en de werking/aanwezigheid van antioxidanten. Normaal gesproken ligt de balans aan de kant van antioxidanten en hebben we geen last van ROS, maar geneesmiddelen kunnen die balans een beetje verschuiven en zo kan je wel last krijgen van ROS. Diclofenac is een voorbeeld van zo’n geneesmiddel. Gevolgen: - Sub-cellulair: Schade aan eiwitten, DNA en lipiden en verstoring van signaaltransductie en genregulatie. - Cellulair/weefsel niveau: Celdood (door apoptose of necrose) / functieverlies / mutaties. - Organisme niveau: Tumoren (kanker) of degeneratieve ziekten. ROS: chemisch reactieve moleculen die zuurstof bevatten. Zuurstof zelf (O2) en water (H2O) zijn zelf niet reactief, maar alles ertussenin wel. ROS hebben een verschillende halfwaardetijd. Hoe korter de halfwaardetijd, hoe reactiever. Van reactief naar minder reactief: ONOO- (peroxynitrite) NO• (nitric oxide radical) 1O2 (singlet oxygen) O2-• (superoxide anion) H2O2 (hydrogen peroxide) ROO• (peroxyl radical) RO• (alkoxyl radical) HO• (hydroxyl radical) ROS productie: Endogeen - Het ontsnapt uit elektronen transportketen. - Bijproduct van de enzymactiviteit: chytochroom P450, xantine oxidase, etc. - Geactiveerde macrofagen, lymfocyten, etc. - Laatste 2 puntjes: gewone endogene processen, maar door beïnvloeding van lichaamsvreemde stoffen kunnen deze processen versterkt worden. Exogeen - Redox-cycling (metabolieten van) xenobiotica: quinonen, radicalen - Interferentie met de elektronen transportketen van xenobiotica - UV Endogene productie van ROS. In het celmembraan zitten lipoxygenase en NADPH oxygenase complex. Dit zorgt voor productie van peroxide, superoxide anion en hydoxyl radicalen. Semiubiquinone als endogene ROS producent: Semiubiquinone heeft een reactieve O. Deze kan zijn elektron afgeven aan O2 in de elektronen transport keten en zo wordt er een reactieve zuurstof gevormd. CYT-P450 als endogene ROS producent: P450-Fe2+---O2 P450-Fe3+ + O2-• + S S Als dit gebeurt, is de O niet gekoppeld aan de je substraat en is de reactie dus eigenlijk mislukt. Hierbij ontstaat ook een reactieve zuurstof. De superoxide anion radicalen laten los uit een elektron gereduceerd peroxy-CYP complex. Ook kan er waterstof peroxide loslaten uit twee elektron gerecuceerde peroxy-CYP complexen na protonering. Er zijn dus 2 plekken in deze cyclus waarbij een ROS vrijkomt! Het ene type CYP isoenzym laat makkelijker ROS los dan het andere type. Exogene ROS vorming door metabolisme van een quinone. -quinone als uitgang: reactief en redox-actief Elektronen van NADPH worden overgezet op de zuurstof van een quinone. Uiteindelijk lekken alle elektronen door redox-cycling naar de zuurstof van de quinone. De O van quinone is dan reactief en dit geeft zijn elektronen af aan O2, waardoor deze reactief wordt. Dit is schadelijk. Ook maakt deze cyclus alle NADPH op, die voor andere celprocessen nodig is en maakt het de antioxidanten op. Het is dus op 3 manieren schadelijk. ROS vorming door interferentie met de elektronen transport keten: Bijv. doxorubicine. Ook hierbij doneert NADPH elektronen en worden O’s reactief gemaakt. Zuurstof wordt hierdoor geactiveerd. Hoe kan een xenobioticum ROS productie stimuleren? - Door inductie van CYPs (vooral 2E1) ROS productie door ontkoppeling. - Door in de mitochondriën elektronen uit de elektronentransport keten op te vangen en door te geven aan zuurstof (bijv. doxorubicine) - Door redoxcycling elders met behulp van CYTP450 reductase dat steeds weer elektronen aanlevert. (bijv. benzoquinone) - Door op een andere manier cellen te beschadigen, waardoor het immuunsysteem geactiveerd wordt. Detoxificatie van ROS: antioxidanten Superoxide dismutase (SOD) katalyseert de detoxificatie reactie van ROS. Hij voegt twee superoxides samen met 2 H+ en vormt zo H2O2. Dit is ook een ROS, maar deze is al een stuk minder gevaarlijk. Het tweede deel van de reactie wordt uitgevoerd door glutathion peroxidase of catalase. Glutathion peroxidase zet H2O2 met 2 GSH om in 2 H2O en een O2. Catalase zet H2O2 om met een tweede H2O2 in 2 H2O en een O2. Fenton reactie: toxificatie Wanneer de H2O2 niet snel genoeg wordt weggevangen, gebeurt dit. Er worden een HO• En een OH- gevormd. Ook kan de O2-• binden met NO• voordat SOD het omzet. Er wordt dan •NO2 en CO3-• gevormd. Detoxificatie met behulp van vitamine E: Vitamine E is een vetoplosbaar vitamine. Het detoxificeert ROS dus in de membranen. Het zorgt voor detoxificatie van lipid-radicalen. Vit E wordt hier zelf radicaal van. GSH zorgt ervoor dat dit vit E radicaal wordt omgezet in glutathion disulfide. De rol van glutathion (GSH) bij de bescherming tegen celschade. (kennen!) - Detoxificatie van radicalen - Detoxificatie van H2O2 (met behulp van glutathion-S-peroxidase) - Reductie van protein-S-S-X - Conjugatie van reactieve metabolieten met behulp van glutathion-Stransferase (GST). Dit zijn 4 hele belangrijke eigenschappen van glutathion! Ook zorgt het voor een gereduceerd milieu en heeft het een hoge intracellulaire concentratie. Detoxificatie van chlopromazine radicaal door GSH: H2O2 wordt door POD en GR omgezet. Hierbij wordt uiteindelijk NADP+ gevormd. Thioltransferase is samen met GSH belangrijk bij de detoxificatie van radicale eiwitten. Bij radicale eiwitten is er een S-S brug gevormd tussen 2 SH groepen. Thioltransferase en GSH samen kunnen S-S bruggen verbreken en het eiwit zo weer herstellen naar zijn oorspronkelijke vorm. Glutathion is een vrij stabiele stof en wordt niet snel in het lichaam afgebroken. Daar zijn namelijk speciale enzymen voor nodig en die bevinden zich niet in de darm. Schade door ROS: - lipide peroxidatie o membraanschade o vorming van reactieve aldehydes - DNA schade o Mutaties o Strengbreuk - Schade aan eiwitten: oa oxidatie –SH o Verlies van functie o Afbraak gestimuleerd door HSP’s o Cytotoxiciteit van eiwitaggregaten - Interferentie met signaaltransductie en genregulatie o Ontstekingsreactie o Apoptose o Adaptatie! Behalve bij detoxificatie leidt ROS altijd tot apoptose van de cel. Cyto-protectie wordt geïnduceerd door ROS (adaptatie). Dit is om een kleine verhoging in ROS aan te kunnen. Op Nrf2 zit Keap1 die Nrf2 remt. Wanneer Keap1 ROS opmerkt, laat het los van Nrf2 en valt te rem op Nrf2 weg. Nrf2 gaan vervolgens allerlei genen opwaarderen. Deze genen coderen voor antioxidanten en enzymen die betrokken zijn bij detoxificatie. Het ontstaan van membraanschade (lipide peroxidatie): Meervoudig onverzadigde vetzuren: de radicalen kunnen protonen uit de dubbele bindingen halen. De vetzuren worden dan lipide radicalen en binden een zuurstof, die dus ook radicaal wordt. om dit op te lossen pakt hij een proton van een ander membraanlipide en oxideert hij zichzelf. (oxidatie is minder erg dan een radicaal zijn, maar het is nog steeds niet goed voor het lipide). Na een tijdje is het hele membraan geoxideerd omdat de lipiden het radicaal steeds doorgeven. Ook worden er toxische monodialdehydes (TBAR’s) gevormd. Carcinogenese: Kanker is een ongeremde (relatief autonome) proliferatie (neoplasme) van een somatische cel, resulterend in een tumor die benigne (adenoom) of maligne (carcinoom, sarcoom) is. Het wordt gekarakteriseerd door een verlies van groeicontrole. Een carcinogeen veroorzaakt: - Toename van het aantal tumoren - Ongebruikelijke tumoren - Versnelde tumorvorming - Toename van het aantal verschillende tumoren. Een stof is carcinogeen (IARV definitie) als hij kwaadaardige tumoren induceert. Carcinogenen kunnen verschillende dingen zijn die structureel heel veel van elkaar kunnen verschillen: - natuurlijke stoffen - xenobiotica, incl. geneesmiddelen - virussen - straling genetische predispositie: - deficiëntie in de reparatie - deficiëntie in de (de)toxificatie - deficiëntie in de apoptose Geneesmiddelen kunnen carcinogeen zijn. Er is een classificatie van geneesmiddelen op het gebied van carcinogeniteit. 1: bewezen carcinogeen in de mens. Dit zijn er niet heel veel. 2A: waarschijnlijk carcinogeen. Bij het dier wel, bij de mens waarschijnlijk ook. 2B: mogelijk carcinogeen. Bij het dier wel, maar bij de mens is er onvoldoende data. 3: onbekend = niet geclassificeerd. Er is onvoldoende data. 4: bewezen niet-carcinogeen (hoewel dit natuurlijk bijna onmogelijk te bewijzen is.) De classificatie wordt gedaan door middel van epidemiologisch onderzoek en blootstelling van grote groepen mensen. Voorbeelden van carcinogene stoffen: - Beta-propiolactone - 1,2-dimethylhydrazine - Vinyl chloride - Benzoapyrene er komen OH groepen aan of er wordt een epoxide gevormd. Dit is te voorspellen omdat er zo veel benzeenringen aan zitten. - Thioacetamide - Safrole Deze stoffen hebben hele verschillende structuren. IARC klasse 1 voorbeelden - Geneesmiddelen: o Tamoxifen tegen borstkanker. Kans op genezing is groter dan de kans dat je later weer kanker krijgt hierdoor. o Diethylstilboestrol o Chiclosporine immuun afweer tegengaan bij orgaantransplantatie. o Chlorambucil Bij al deze geneesmiddelen geldt dat hun voordelen opwegen tegen de kans op carcinogeniteit. - Overig o Alcohol o Asbest o Roken Genotoxische carcinogenen (mutageen): gaan interactie aan met DNA met als gevolg schade aan of verandering in de structuur. Men neemt aan dat er van genotoxische carcinogenen geen NOAEL is, omdat 1 enkel molecuul al kanker kan veroorzaken. Je mag er dus helemaal niet aan blootgesteld worden. Nicotine is zo’n mutageen. De tumorigeniciteit is afhankelijk van de dosis. Non-genotoxische carcinogenen (non-mutageen): Stoffen die op andere wijze carcinogeen zijn. Er is verandering van DNA expressie, maar zonder DNA structuur verandering. Er is een treshold en het proces is reversibel. De tumorgeniciteit is dus dosis afhankelijk. Ze kunnen zorgen voor promotie van tumorgroei, maar ze leiden niet tot directe DNA schade. Deze stoffen zijn soort-, cellijn- een weefselspecifiek. Er zijn species verschillen. Een stof zal bij de ene soort wel en bij de andere soort niet omgezet worden. Goedaardige tumoren (benign) - omkapseld - niet invasief - niet metastaserend Kwaadaardige tumoren (malignant) - niet omkapseld - invasief - metastaserend 3 stadia van carcinogenese: 1) Nadat er DNA schade is ontstaan wordt een cel een initiated cell, dus fase 1 is de initiatie. Initiatie is irreversibel. Er is vaak DNA schade door genotoxische carcinogenen. Vaak zijn er meerdere mutaties in de genen nodig die van belang zijn voor de regulatie van de celdeling. 2) Deze cel gaat zich proliferen (tenzij er apoptose plaatsvindt) en wordt een focale lesie. Fase 2 is dus de promotion. Het gebeurt door nongenotoxische (epigenetische) carcinogenen. 3) De cellen gaan verder prolifereren (ongeremd) en er ontstaat kanker. Fase 3 is de progression. Dit leidt tot verandering van het fenotype, snelle groei, verlies van groeicontrole, invasie, metastase, angiogenese en remming van de apoptose. Eerst moet de initiator aanwezig zijn en daarna moet de promotor komen. Er mag niet te veel tijd tussen de promotors zitten. Binding van een stof aan het DNA leidt tot kanker. Hoe kan dat? 2 Hypotheses voor het ontstaan van kanker: Initiatie in de normale somatische, gedifferentieerde cel. o Gereprogrammeerd tot minder gedifferentieerde cel o Immortalisatie: capaciteit tot deling Initiatie in een multipotente stamcel. o Verlies van asymmetrische deling o Behoud van de geïmmortaliseerde staat o Blokkade van differentiatie Wanneer een cel Oct 4 tot expressie brengt, is het een stamcel. Wanneer de Oct 4 positieve cel wordt blootgesteld aan een factor die hem kan initiëren, blijft hij Oct 4 tot expressie brengen en blijft hij zich dus delen. Er vindt promotie plaats. Op een gegeven moment komt er een tweede mutatie bij en wordt het een kankercel. Genetisch toxiciteit: Genetische toxicologie = genotoxicology. Genotoxische angentia = Alle chemische, fysische en biologische factoren die permanente of reversibele veranderingen in het genetisch materiaal veroorzaken. In het DNA: C-G bindingen hebben 3 H bruggen. A-T bindingen hebben 2 H bruggen. Zo herkennen ze elkaar. Verder bevat het DNA fosfolipiden en suikergroepen. Mutagenese = DNA-schade Er ontstaan mutaties door deletie, additie of transformatie Clastogenese = chromosoomschade DNA ketens breken en de delen worden verkeerd aan elkaar gezet of gaan verloren. Aneugonese = verandering in het aantal chromosomen Chromosomen worden ongelijk verdeeld over de dochtercellen tijdens de replicatie. Oorzaken van mutaties: - Elektrofielen o Direct o Na bioactivatie - Radicalen o Bioactivatie - o Straling Straling Ze regeren met N of O van de base (want deze plekken zijn nucleofiel) of de O van de fosfaatgroep. Ook kan er cross-linking van DNA ketens en DNA breuk ontstaan. Dit leidt ertoe dat er een verkeerde base in het DNA komt of dat er intercalatie ontstaat. Elektrofiele reactieve metabolieten: covalente binding van benzo-a-pyreen aan guanine. 4 OH groepen komen aan een van de beenzeenringen van benzo-a-pyreen te zitten door oxidatie en epoxide hydrolisatie. Er ontstaat hierdoor een reactieve metaboliet. Deze bindt met de G (guanine) van het DNA. Dit aanhangsel heet een adduct. Alkylering van guanine: Het adduct komt aan de =O van guanine. Hier komt een reactieve alkygroep aan vast. Deze O wordt normaal gebruikt voor de 3e waterstofbrug, dus deze derde brug kan niet gevormd worden. In plaats van met C bindt het met 2 waterstofbruggen een T. Het DNA wordt dus anders en er heeft een mutatie plaatsgevonden. DNA adducten: - Sommigen leiden tot mutatie, anderen niet. - Ze zijn aantoonbaar, dus het is een biomarker voor blootstelling. - Sommigen ondergaan snelle reparatie. - Het is een premutagene lesie, want er ontstaat pas een verandering in het DNA als het DNA zich gaat delen. - Detectie vindt plaats d.m.v. radioactiviteit, GC-MS, HPLC, immunoassays of fluorescentie technieken. UV geïnduceerde ROS productie resulteert in dimeer vorming van thymidine (T). 2 T’s die naast elkaar zitten plakken aan elkaar en worden gelezen als 1 T. Er wordt dus een base overgeslagen bij de transscriptie. Waar in het DNA dit gebeurt, bepaalt wat het effect is. Oxidatieve schade aan het DNA gebeurt dus door ROS, maar het kan ook door geneesmiddelmetabolisme, endogene processen in de mitochondriën of UV straling (H2O OH. + H.) Het gevolg is het ontstaan van oxidatie producten of DNA-strengbreuk. Mutaties door base analoga, broomuracil: Base analoga = stoffen die lijken op DNA basen. Broomuracil kan worden ingebouwd in het DNA alsof het een normale C of T base is. Het wordt dus ook als een van die twee basen gezien. Na een aantal bindingen krijg je hierdoor dat er een hele andere code gemaakt wordt. Puntmutaties: - Frame shift: base toevoegen (additie) over verwijderen (deletie). - o Intercalerende stoffen (stoffen die tussen de DNA strengen gaan zitten) als acridine, ethidiumbromide en doxorubicine o Gevolg: totaal andere genetische code, want als er 1 basepaar weg is of erbij komt, schuiven alle codons een stukje door en is bijna elk gevormd aminozuur anders. Transformatie: vervanging van een base door een andere base. o Transitie: Een base wordt vervangen in dezelfde base of een base die niet tot een ander aminozuur leidt. o Transversie: Er ontstaat een ander aminozuur chemische modificatie van een base (NO2, alkyl, nitrosaminen en vinyl chloride) incorporatie van base-analogen (5Br-uracil) o Gevolg: bij replicatie wordt een verkeerde base ingebouwd Na de replicatie worden de mutaties permanent. Dan is het ook niet meer herkenbaar als een fout. De mutatie wordt beperkt door reparatie voorafgaand aan de replicatie. Cellen die veel delen hebben dus meer kans op mutaties, omdat er minder tijd is om te repareren. Mutaties in het dominante allel hebben meer effect dan mutaties in een recessieve allel. Gevolgen van een puntmutatie voor de expressie van een eiwit - Geen o Als het veranderde codon voor hetzelfde aminozuur codeert o Bij tijdige reparatie. (dit gebeurt heel veel) o Bij mutatie in een niet coderend of regulerende deel van het DNA - Gering o Verandering niet in een functioneel belangrijk deel van het eiwit. - Ernstig o Nonsense eiwit o Geen eiwit o Eiwit met veranderde functie Leidt tot apoptose, maar het kan ook tot een permanent veranderde cel, kanker en teratogenese leiden. Clastogenese (chromosoombreuk): Door alkylerende stoffen: - Breuk van de DNA ketens - Crosslinking van DNA ketens Door fouten tijdens de reparaties van transformaties. Aneugenese (verstoring van de metafase): Er is een verstoring van de segregatie van chromosomen tijdens de meiose of mitose. Dit leidt tot veranderingen in chromosomen of het aantal chromosomen. Colchicine en vinblastine zijn hier bijvoorbeeld bij betrokken. Bijv. het syndroom van Down, waarbij je 47 in plaats van 46 chromosomen hebt. Heel veel mutagenen zijn carcinogeen (maar niet allemaal). Niet alle carcinogenen zijn mutageen. Dit is dan meestal iets epigenetisch, bijvoorbeeld beïnvloeding van de reparatie, immunosuppressiva of promotoren). Voor carcinogenese zijn er vaak meerdere mutaties nodig. Ras gen: proto-oncogen. Wanneer Ras geactiveerd wordt door carcinogenen, worden er groeifactoren, groeifactor receptoren, transscriptiefactoren en kinases upgereguleerd en gaat de cel versneld delen. P53: tumorsuppressorgen. Wanneer P53 wordt geremd door een carcinogeen, worden de intercellulaire communicatie, de remming op de celgroei en op de apoptose verminderd. De cel gaat dan ongeremd delen. Non-genotoxische carcinogenen Promotoren: stimuleren de groei van een geïnitieerde cel. - Immunosuppressiva remmen het herkennen en verwijderen van preneoplastische cellen. - Hormonen: bevorderen de celgroei. - Remmers van DNA reparatie: Voorkomen het verwijderen van gemuteerd of beschadigd DNA. - Proliferatoren: versnelde celdeling, meer kans op fouten, minder tijd voor reparatie van het DNA. - Cytotoxische stoffen: chronische schade. - Remmers van gap junctions (cel-cel communicatie). Non-genotoxische stoffen zijn veel moeilijker op te sporen. Bij genotoxische stoffen kun je gewoon kijken of er DNA veranderingen zijn, maar bij nongenotoxische cellen moet je naar alle bovenstaande processen kijken. Reparatie van mutaties: - Reparatie vóór de celdeling voorkomt kanker - Reparatie van modificaties zoals O6-methylguanine door repair-enzymen - Reparatie van transformaties door een set van enzymen, endonucleasen en DNA polymerases - Remming van de reparatie leidt tot een verhoogde frequentie van kanker (bijv. xeroderma pigmentosum) Reparatiecapaciteit van verschillende organen: - hersenen: heel weinig - nier: redelijk veel - lever: heel veel Geneesmiddelen testen op carcinogene eigenschappen: - bij chronisch of frequent gebruik - verdachte structuur - verdachte werking/klasse - verdacht/positief in de mutatie-test (als een stof mutageen is, wordt hij meestal niet verder ontwikkeld) - verdacht voor ophoping Maar: toelating op de markt is afhankelijk van indicatie: in principe wordt een genotoxisch carcinogeen niet verder ontwikkeld, maar vele chemotherapeutica zijn carcinogeen want ze veroorzaken celdood en DNA schade. Omdat ze tegen levensbedreigende ziekten gericht zijn, worden ze toch verder uitontwikkeld. Alkylerende stoffen zijn carcinogeen Genotoxiciteitstesten: - Covalante binding aan DNA - DNA schade. DNA reparatietest: als er veel reparatie plaatsgevonden heeft, is er blijkbaar veel schade geweest. - Mutaties. Bijv. de AMES test - Aneuploidie - Schade aan chromosoom structuur AMES test: Een gemuteerde salmonella groeit alleen in een histidine medium. Je stopt ze in een histidine-vrij medium en je voegt je stof toe. Vervolgens kijk je of er een terugmutatie plaatsvindt. Dit gebeurt ook spontaan, maar als jouw stof voor meer terugmutaties zorgt, is de stof dus van zichzelf mutageen. Ook worden er een leverhomogenaat en cofactoren toegevoegd aan je stof zodat de metabolieten gevormd worden. Als je dan meer groei van de salmonella ziet, zijn er dus reactieve metabolieten gevormd van je stof. Muis lymfoma TK-locus test. - In thymedine kinase (TK) wordt een mutatie aangebracht. Dit enzym is nodig voor de omzetting van thymidine monoP in thymidine triP. - Het kan ook BrdU (niet- toxisch) omzetten in BrdtriP (toxisch). Dit wordt namelijk ingebouwd in het DNA. - Een mutatie van TK+/- naar TK-/- maakt enzym onwerkzaam en er treedt dan geen toxiciteit op. - Je kijkt dus of je stof voor mutatie van TK zorgt. Comet assay: Cellen worden in een agarose gel geplaats op een microscopisch plaatje. Met alkaline lysis worden de cellulaire eiwitten verwijderd. Het DNA zal zich openen en er vindt elektroforese plaats. Intact DNA beweegt langzaam, maar kapot DNA gaat heel snel. Je staint het DNA en kijkt of een 1 grote stip is of dat er een staart van kapot DNA is. Hoe groter de staart, hoe meer DNA schade. Het wordt opgedeeld in 5 categorieën, namelijk van 0 (onbeschadigd DNA) tot 5 (zwaar beschadigd DNA) Micronucleus-test: Deze test vindt in vivo plaats. Tijdens de celdeling kunnen de chromosomen beschadigen. Bij het verdelen van chromosomen over de twee dochtercellen blijft dit stukje chromosoom (= een microcnucleus) achter. De micronucleus kan worden aangekleurd en zo kun je kijken naar hoe veel micronuclei er zijn. Dit is het best zichtbaar in de erythrocyten, omdat deze geen kern hebben. In vitro genotoxiciteitstesten - Er is een hele batterij van testen nodig om een volledig beeld te krijgen. - Er moeten altijd 1 of meer positieve controles en negatieve controles meegenomen worden. - Metabole activatie is belangrijk (enzymen + cofactoren) - Voorspelling van carcinogeniteit uit de genotoxiciteitstesten is nog onzeker. Genotoxiciteitstesten voor geneesmiddelen: 1) Mutaties. Bij bacterien: AMES test. Bij zoogdieren: TK locus test 2) Chromosomale schade: in vitro test met zoogdiercellen, bijv. muis lymfoma TK-locus of de comet assay. 3) In vivo chromosoomschade in knaagdier haematopoëtische cellen met de micronucleus test. In vivo carcinogeniteitstesten: - Muizen en ratten - Ze worden hun hele leven (2 jaar) blootgesteld aan de stof - Er worden grote aantallen dieren gebruikt, mannen en vrouwen. (mannetjes en vrouwtjes hebben een andere hormoonhuishouding) - Er worden 3 doses gedaan. De hoogste dosis is net een beetje toxisch = maximaal getolereerde dosis = MTD. De middelste is 50% van de MTD en de laatste dosis is 10-25% van de MTD. - De toedieningsroute moet gelijk zijn aan de therapeutische toedieningsroute - Er is een extra groep voor de kinetiek. De blootstelling moet vergeleken worden met de blootstelling in de mens bij de therapeutische dosis. (en dus niet bij die hele hoge dosis) Uitleesparameters bij de carcinogeniciteitstest in vivo: - Pathologie, classificatie - Wanneer er tumoren gevonden worden: o Genotoxisch: meestal niet op de markt o Epigenetisch: alleen op de markt toegelaten als het aannemelijk is dat het een speciesverschil is en het dus niet relevant is voor de mens of als de veiligheidsmarge (MOS) heel groot is. Problemen bij carcinogeniteitstesten: - Carcinogeniteit van therapeutische eiwitten is moeilijk te testen in dieren wegens immunogeniteit. Ze zijn waarschijnlijk niet mutageen, maar ze kunnen wel evt. promotoren zijn. - Humaan: moeilijk aan te tonen, alleen mogelijk bij zeldzame kankers. - Sommige chemotherapeutica zijn zelf carcinogeen. Het therapeutisch effect is lastig te meten. - De muizen hebben vaak een hoge spontane tumor-incidentie. - Verschillen tussen muizenstammen. - Speciesverschillen zijn groot, dus wat is de voorspellende waarde? Nieuwe ontwikkelingen: - Transgene muizen die eerder kanker krijgen (kortere proeven) - Muizen die extra gevoelig zijn pasgeboren ratten In vitro non-genotoxische carcinogeniteitstesten dmv. transcriptomics. College 5 (27 feb) Ongeveer 50% van de medicijnen die afgekeurd worden wordt afgekeurd wegens levertoxiciteit. Menselijke lever: 2 lobes. In het midden komen de poortader en de leverarterie uit. Dit bloed komt samen in de holle ader, die bovenop de lever ligt. Bij de poortader en de leverarterie ontspringt ook de galbuis. Deze komt uit in de galblaas, die onder de lever hangt. Leverlobje: hexogene (6-hoekige) structuur. Om elke hoek liggen aderen van de poortader heen en deze hebben allemaal uitlopers naar het midden van het lobje, waar een uitloper van de holle ader is. Het bloed stroomt van buiten naar het midden van het leverlobje. Ook zuurstofrijk bloed uit de leverarterie wordt van buiten naar binnen getransporteerd. Ook wordt er gal gemaakt. Die wordt juist in het midden gemaakt en gaat naar de buitenkant, waar het afgevoerd wordt. In de bloedvaten van de leverlobjes bevinden zich Kupffercellen. Venestrae: poriën in de sinusoïden (bloedvaten) zodat stoffen uit de bloedbaan kunnen treden en de hepatocyten kunnen bereiken. Ze komen dan in de D-laag terecht De hepatic artery, portal vein en bile duct liggen altijd als een drie-eenheid bij elkaar tussen de hepatocyten. De portale ader is het grootst. De lobuli zijn opgedeeld in zones. Er zijn in totaal 3 zones die samen de acinus (functionele eenheid) vormen. De acinus ligt half in het ene lobje en half in het andere lobje. De binnenkant van de acinus is zone 1 en ligt het dichtst bij de portale triade. Zone 2 ligt hiernaast en zone 3 (centrilobilaire zone) ligt het dichtst bij de centrale vene aan de buitenkant van de acinus. Er is heterogeniteit tussen de leverzones. Dit is zowel door de ligging (dingen die door zone 1 al gedaan zijn, kan zone 3 niet meer doen omdat het al gedaan is) en door verschillende eigenschappen (de zones zijn functioneel verschillend) Functies van de verschillende zones Zone 1: sulfotransferase, alcohol dehydrogenase en GSH Zone 2: overgangszone, dus die heeft van alles een beetje Zone 3: cytochrome P450 (!) en vet-synthese De lever bevat meerdere celtypes. - Kupffercellen (macrofagen van de lever, tussen de endotheelcellen): cytokines, ontsteking, antigen presentatie en ROS productie - Hepatocyten: bioactivatie en metabolisme van vet, glucose, albumine, etc. - Endotheelcellen van de bloedvaten: ontsteking - Stellate cellen (tussen de endotheelcellen en de hepatocyten): fibrose (extracellulaire matrix synthese) en vitamine A opslag. In het geval van chemische of ischemische stress kan een hepatocyt beschadigd raken en Kupffercellen activeren. Deze heeft NADPH oxidase en zorgt daarmee voor ROS productie. Ook worden er neutrofielen geactiveerd, die op dezelfde manier ROS maken en ook proteases maken. Deze versterken dus het effect. De Kupffercellen trekken de neutrofielen aan met TNF-alfa. TNF-alfa speelt een centrale rol bij deze immuunrespons. Functies van de lever: - Intermediair metabolisme – koolhydraten, aminozuren, cholesterol, vet en eiwitten - Biotransformatie (metabolisme) van xenobiotica - Secretie – gal, galzuren, galzouten - Excretie – bilirubine, drugs, toxines - Synthese – albumine, bloedstollingsfactoren - Opslag – vitamines, koolhydraten, etc. Levertoxiciteit Waarom is de lever een belangrijk doelorgaan voor toxiciteit? (!) - Hoge metabole capaciteit (toxificatie en detoxificatie) - Grote blootstelling, vooral na po (=oraal, hoge concentratie in het poortaderbloed) - Hoge doorbloeding - Transporters (dus toxines komen makkelijk de lever in) - Veel essentiële functies - Gal secretie (hoge concentraties in de gal, dus cellen rond de gal hebben een extreem hoge blootstelling) Er is een zeer groot aantal oorzaken voor levertoxiciteit, maar er is slechts een beperkt aantal reacties: - degeneratie o Steatose en andere ophopingen o Ballooning o Celdood (necrose en apoptose) - fibrose/cirrhose - ontsteking (hepatitis) - tumoren - cholestetase - vaatbeschadiging De schade is vaak selectief in 1 van de zones. (!) Celdood: - Zonaal o Vaak periveneus (zone 3), want daar zit CYT P450! CCl4, paracetamol o Soms periportaal (zone 1) N-OH-AAF, cocaïne - Grote reservecapaciteit: acuut leverfalen ontstaat pas bij uitval van meer dan 80% van de hepatocyten. Groot regeneratievermogen. Als je er wat afhaalt, groeit het weer aan. Paracetamol: - Metabolisme (CYP 1A1, 1A2, 2E1, 3A4) o Inductie door alcohol o Species verschillen o Inhibitie (cimetidine, ethanol) - Covalente binding van een reactieve metaboliet (NAPQI) aan specifiek eiwit van 58kDA. - Afhankelijk van de GSH status in de lever, omdat dat de stof conjugeert. (antidote = N-acetylcysteine) - Ca2+ concentratie verhoging necrose. Te veel paracetamol maakt je lever dus kapot. Zonering van de levertoxiciteit (globaal kennen): - Zone 1 hepatocyten toxicanten = (teveel) Fe en Allyl alcohol - Zone 3 hepatocyten toxicanten = CCl4, acetaminophen en ethanol - Galbuiscellen toxicanten = Methylenedianiline en sporidesmin - Sinusoidal epitheel toxicanten = Cyclophosphamine en monocrotaline - Kupffer cellen toxicanten = Endotoxine (!) en GdCl3 - Stellate cellen toxicanten = Vitamine A en ethanol (chronisch) Fibrose/cirrose: - Oorzaken o Chronische ontsteking o Chronische cel schade (alcohol, geneesmiddelen) o Virale infectie (HBV, HCV) o Obesitas en NAFLD (vette lever) o cholestase - mechanisme : activering van de stellate cellen tot myofibroblasten (onder invloed van o.a. TGF-beta) en rekrutering van immuuncellen uit de rest van het lichaam, met als gevolg overproductie van bindweefsel (collageen). Er ontstaat dus fibrose. Dit vordert tot cirrose, primaire levercelcarcinoom. Wanneer dit gebeurt, wordt er dus extracellulaire matrix gevormd en wordt de lever heel erg stijf. De leverfunctie gaat hierdoor snel achteruit. Vervolgens ontstaat er bridging fibrose, waarbij het bindweefsel zich over de lever uit gaat spreiden. De Kupffercellen zijn geactiveerd en de poriën tussen de endotheelcellen sluiten zich. Steatose (vette lever): - remming van de uitscheiding van vetten o remming van de synthese van eiwitten die de vetten de lever uit moeten transporteren. (VLDL) o ATP gebrek minder beta-peroxidatie (wat nodig is voor vetafbraak) - toename van de synthese van vetten - toename van de aanvoer van vetten - afname van de afbraak van vetten Vet in de lever is zichtbaar te maken met oil red O. Vet zit vooral in zone 1. Een vette lever is op zichzelf niet erg, maar het is vaak wel een teken dat er iets aan de hand is in de lever. Alcohol is vaak verantwoordelijk voor en vette lever. Het zorgt namelijk voor minder FFA beta-oxidatie in de lever en meer FFA synthese in de lever. Wanneer je een lever coupe maakt, komen er gaten op de plekken waar vet zat. Het vet wordt dus weggewassen. Cholestase: - Verminderde galproductie - Verhoogde galzoutconcentratie in de lever en het bloed. Het komt dus niet in het gal terecht, maar het blijft rondcirculeren. Naast galzouten blijven ook bilirubine, metalen en medicijnen/xenobiotica/hormonen in het bloed en de lever. Gal-synthese; de betrokken transporters (!) - MDR1,3 transporteert organische cations, drugs en phospholipiden de gal in. - MRP2 transporteert conjugaten van glutatathion, glutathion zelf, glucuronide, sulfaat en bilirubine de gal in. - BSEP transporteert galzouten de gal in - Metalen gaan zonder transporter de gal in. Er zijn er nog veel meer, maar deze 3 zijn het belangrijkst. Oorzaken en van cholestase: - Remming van de excretie van galzouten (BSEP) - Remming van de excretie via MRP2 (anionen, GSH en bilirubine) - Beschadiging van het galgang-epitheel - Neerslag en blokkade in de galgang - Beschadiging van de hepatocyten. Door de ophoping van bilirubine kleurt de lever een beetje groen. Bilirubine wordt door UGT geconjugeerd en bilirubine wordt bilirubine gluc. Dit wordt door de MRP2 transporters de gal in getransporteerd. Ethinylestradiol (EE) is een component van de pil. Door UGT wordt het omgezet in EE17G. Dit blokkeert BSEP en voorkomt zo dat galzouten uitgescheiden kunnen worden in de gal. Hepatitis: - Door een geneesmiddel o Intrinsiek = voorspelbaar o Idiosyncratisch = komt zelden voor en is dus niet voorspelbaar. Ook hangt het weinig samen met de dosis. Het lijkt dus meer met - kenmerken van de patiënt dan met kenmerken van de drug te maken te hebben. Door alcohol Door virussen Auto-immuun Halotaan kan hepatitis veroorzaken door een immuunrespons: Het wordt door CYP omgezet en wordt reactief. Dit bindt vervolgens aan de N van een eiwit. Dit eiwit ziet er dan een beetje anders uit en dat wordt herkend door het immuunsysteem. Er treedt een immuunrespons op. Ook kan diclofenac immunologische levertoxiciteit veroorzaken. Detectie van leverschade in vivo - - Levergewicht/grootte (niet erg specifiek) Bloed o Bilirubine o Galzouten o Enzymen als LDH, ALAT (GPT), AST (GOT). Deze zitten normaal gesproken in het cytosol van hepatocyten. Als de hepatocyten kapot zijn, komt dit dus in het bloed. o Albumine. Dit wordt gemaakt door de lever, dus als er minder is dan normaal, kan de lever beschadigd zijn. o Bloedstollingsfactoren. Dit wordt ook gemaakt door de lever, dus als er minder is dan normaal, kan de lever beschadigd zijn. Biopt (LM en EM) Klaring van BSP en ICG. Deze stoffen worden specifiek door de lever geklaard, dus het zegt wat over de leverfunctie. Het maken van lichtmicroscopische preparaten 1) Blokje weefsel invriezen. Je maakt een coupe (4-10 micrometer). Met cryostaat fixeren (bijv. formaline, aceton of alcohol) 2) Blokje weefsel fixeren (formaline, alcohol) water wordt vervangen door xyleen. Inbedden in paraffine. Coupes maken (4-10 micrometer) met microtoom. Oil red O kleuring kun je alleen bij de eerste methode gebruiken, want de tweede methode spoelt alle vet weg met xyleen. Kleuringen van microscopische preparaten: - Haematoxiline en eosine (HE kleuring) - Vetkleuring: Oil red O - Glycogeen: PAS - Apoptose: TUNEL - Specifieke eiwitten: gelabelde antilichamen (= immunohistochemische kleuring) Bij de metabolisatie van N-OH-AAF: HE kleuring kleurt zone 1 rood. Glycogeenkleuring kleurt glycogeen. Bij leverschade is het preparaat witter. Oil red O kleurt vet in zone 1. Wanneer carbon tetracholoride (CCl4) wordt gemetaboliseerd, ontstaat er een radicaal die vervolgens covalent kan binden aan een eiwit of lipide. Ook kan het chloroform of phosgenen vormen en kan het leiden tot lipide peroxidatie. Dit gebeurt allemaal vooral in zone 3 bij zowel HE kleuring als oil red O. Bij hepatitis C zijn er lymfoïde follikels en random verdeelde vetdruppeltjes in de lever. Detectie van leverschade in vitro Methoden voor MET en TOX testen: - In vivo (een nadeel van in vivo is dat proefdieren niet hetzelfde zijn als mensen). - Precies gesneden plakjes (slices). Met slices kun je de immuunrespons meten. Je kan bijvoorbeeld TNF-alfa meten en kijken wat de Kupffercellen doen. Je kan echter geen invloed van neutrofielen meten, want die moeten uit het bloed komen. Bij een hepatocyt kun je geen immuunrespons meten. Fibrose kun je heel goed meten in een slice door hem te beschadigen. Het maken van de slice leidt tot de eerste collageenvorming. - Geïsoleerde levercellen. - Microsomen (alleen voor bepaling van het metabolisme van SERgebonden enzymen). Met microsomen kun heel beperkt toxiciteit bepalen. Alleen uitschakeling van een CYP kan je ermee bepalen. De liver slice techniek: Je haalt een lever uit een rat en haalt daar met een hole boor een core uit. Deze core gaat door een soort worstsnijder die er hele dunne plakjes van snijdt. (100 tot 300 micrometer dik). De slices moeten klaargemaakt en geïncubeerd worden om te kunnen worden gebruikt. Slices zijn eigenlijk een soort mini-organen, omdat ze alle cellen van de lever bevatten. Slicing is makkelijk en snel te doen en sommige slices kunnen wel 5 dagen in leven blijven. De weefselstructuur en eigenschappen van het orgaan blijven behouden en er is interactie tussen verschillende cellen mogelijk. Met slices kun je goed species verschillen meten. Dit kan bijvoorbeeld bij paracetamol (mensen zijn gevoeliger), gliotoxine (mensen zijn gevoeliger) en iproniazide (ratten zijn gevoeliger) Nier toxiciteit: De nier is gevoelig voor toxiciteit omdat er hier veel metabolisme plaatsvindt en omdat er een hoge doorbloeding is. De nieren zitten achter in de buikholte. De buitenkant van de nier is de cortex. De binnenkant is de medulla. Het bloed komt door de glomerulus en wordt hier gefiltreerd. Het deel dat niet gefiltreerd wordt, gaat door en voorziet de nier van doorbloeding en zuurstof. In de nieren kunnen er dingen opgenomen worden richting dit bloed. Uiteindelijk verlaat zuurstofarm bloed de nieren. In de glomerulus zitten kleine poriën. Deze zijn een stuk kleiner dan de poriën in de lever. Alleen hele kleine eiwitten kunnen erdoor. Nefron: Proximale tubulus – lis van Henle – distale tubulus – verzamelbuis. We hebben per nier 104 - 106 nefronen. De glomeruli zitten in de cortex (al zitten ze niet allemaal op dezelfde hoogte in de glomerulus) en de lis van Henle zit in de medulla, ook op verschillende hoogten. Als je een coupe maakt op de grens van cortex en medulla, zie je alle vaten en structuren van de nefronen. Wanneer je een coupe van de nier maakt, krijg je een heel complex plaatje. De glomerulus is goed te herkennen. Het zit er uit als de doorsnede van een granaatappel. In iedere plek van het nefron vindt een ander proces plaats. Er zijn zoutpompen nodig om tegen de gradiënt in zouten weg te pompen voor de resorptie. De zoutconcentratie is onder in de lis van Henle namelijk heel hoog. Het pompen is ATP afhankelijk. De mitochondriën zijn dus een heel cruciaal onderdeel van de niercellen! Functies van het nefron: - Glomerulus: filtreren van het bloed. o 15-20% van de plasmastroom (700 ml/min) wordt gefiltreerd. Het ultrafiltraat is 125 ml/min. o Alles kleiner dan 7,5-10 nm en eiwitten kleiner dan 50 kD worden doorgelaten. - Tubulus + lis van Henle: concentreren, resorberen en uitscheiden. o Proximale tubulus: resorptie van 50-60% van het water uit het ultrafiltraat. Lis van Henle: 15-20%, distale tubulus: de rest tot 99% van het filtraat. o Resorptie en uitscheiding naar het bloed van ionen, suiker, etc. (alles wat nuttig is) o Resorptie van kleine eiwitten o Uitscheiding van afvalproducten vanuit het bloed naar de urine. Niertoxiciteit: - Hoge blootstelling door grote bloedtoevoer 25% van de cardiac output = 1,2 L/min voor de nier, die zelf maar 0,5% van het lichaamsgewicht is. Ook is er actieve opname. - Essentiele functies - Gevoelig voor veranderingen in de doorbloeding (vasoconstrictie/dilatatie). Medicijnen die de doorbloeding beïnvloeden - hebben dus veel effect op de nieren. Te weinig doorbloeding leidt tot zuurstoftekort en dus tot necrose van de niercellen. De proximale tubulus is het belangrijkste target voor toxische stoffen o Concentrerend (want water reabsorptie) o Actieve opname (door carriers in de tubuluscel vanuit het bloed en de primaire urine) o Metabole activiteit CYT P450, UGT, etc. vorming reactieve metabolieten en ROS. C-S lyases breekt GSH-conjugaat verkeerd af en maakt hem toxisch. Prostaglandine synthetase epoxide vorming en oxidatie. Belangrijke mechanismen van niertoxiciteit: 1) GFR (glomerulary filtration rate) daling: de glomerulus is gevoelig voor vasoconstrictie/dilatatie 2) Celdood van de tubulus cellen door schade aan a. Membranen (lipideperoxidatie) b. Mitochondria (!) te weinig ATP c. Blokkade van de tubuli door dode tubulus cellen d. Terug lekken van ultrafiltraat van het lumen naar het bloed 3) Kanker Verlaagde GFR = nierschade. (!) Er kunnen heel veel redenen zijn voor een verlaagde GFR, waaronder inflammatie, intrarenale vasoconstrictie en nierblokkades. GFR wordt altijd gemeten bij een vermoeden van nierschade. Cellen van het tubulaire epitheel zitten vast aan het membraan en aan elkaar met een integrine-cytoskelet. Bij nierschade kunnen de cellen loslaten. Ze kunnen dan in apoptose gaan, maar ze kunnen ook blijven leven en samen gaan klonteren in de tubulus. Het gevolg is een verstopping en het terug lekken van het filtraat door de gaten in het epitheel. Niercellen kunnen elkaar vervangen. Een niet-beschadigde cel kan zich aanpassen door de capaciteit van functie te verhogen zodat ze de functie van de beschadigde cellen kunnen opvangen. Ze reguleren hiervoor een aantal eiwitten, ze worden groter, en ze kunnen delen. Zo kunnen ze de beschadigde cel, wanneer deze dood gaat, vervangen. De mogelijke mechanismen van nierschade kunnen dus zijn: prerenaal, vasoconstrictie, crystalluria, tubulaire toxiciteit, endotheelschade, glomerulopathy en interstitiële nephritis. Er zijn specifieke markers voor de verschillende onderdelen van de nefronen. Hiermee kun je kijken waar het probleem zit. Paracetamol wordt afgebroken. In de urine zijn de afbraakproducten te vinden. Glutathion kan in de lever een medicijn conjugeren en zo de toxiciteit verminderen. Dit gebeurt bijvoorbeeld bij NAPQI, dat onder invloed van gluathion wordt omgezet in APSP-SG en APAP-Cys. Dit glutathionconjugaat kan vervolgens in de nier omgezet worden tot het toxische APAP-SH (mercaptuurzuur) door het enzym C-S-lyase. In de nier kan het gedetoxificeerde paracetamol dus weer toxisch worden! Cisplatine is een platinum atoom met 2 NH3 en 2 Cl groepen. Het is een medicijn dat werkt tegen testiculus-, ovarium-, hoofd- en nekkanker. Het is echter niet effectief tegen borst- en darmkanker (omdat verschillende kankertypen verschillende transporters hebben). Het heeft veel bijwerkingen, omdat hij ook niet-kankercellen binnengaat. Vooral de niertubulicellen zijn hier gevoelig voor. Cisplatine kan binden aan 2 G’s van het DNA (ten koste van de 2 Cl groepen) en laat het DNA buigen. Deze buiging is schadelijk voor het DNA. Cisplatine geïnduceerde niertoxiciteit: - Een koper-transporter in de nier kan de platinum van cisplatin herkennen - De OCT2 transporter kan hem opnemen. - Eenmaal opgenomen worden de Cl groepen geoxideerd en kan cisplatine binden aan het DNA, oxidatieve stress veroorzaken of de mitochondriën beschadigen. Detoxificatie door reacties met thiolen: - Glutathion (GSH) - Cysteinylglycine (Cys) - Metallothionines (MTs) Cisplatine activeert het apoptose pathway in de niercellen. OCT2 en Ctr1 zijn betrokken bij de opname van cisplatine in de niercel. In de cel activeert cisplatine het intrinsieke mitochondriële pathway van apoptose en het extrinsieke death receptor pathway van apoptose. Daarnaast stimuleert het het ER tot caspase 12 activatie. Via deze 3 pathways zorgt cisplatine voor apoptose. NSAID’s - Remming van het prostaglandine synthese verlaagde vasodilatatie verhoogde vasoconstrictie verlaagde bloedflow en GFR ischemie. (vooral oudere mensen zijn hier gevoelig voor) - Necrose met nefritis door een reactieve metaboliet - Interstitiële nefritis Cyclosporine: - Immunosuppressivum, peptide van 11 aminozuren - Acute en chronische effecten (incl. Fibrose), maar de mechanismen zijn nog niet helemaal bekend. - Beschadiging van de endotheelcellen in de glomerulus - Opname door transporters (OATPs) in de proximale tubulus - Remming van de mitochondriële functie - Nier-bloedflow verlaagd door vasoconstrictie door verlaging van de synthese van thromboxanen en prostaglandines en afname van de vasodilatatie (verlaging van NO en prostacycline) Aminoglycosiden: - binden aan de fosfolipiden in de villi van de tubulus cel. - Er vindt endocytose plaats - Er is ophoping van aminoglycosiden in de lysosomen o Remmen fosfolipide degradatie: myeloid o De lysosomen breken celschade, LPO en ROS - De lysosomen in de mitochondria raken heel erg vol en knappen - In de lysosomen zitten enzymen die onderdelen van de cel af breken - Aminoglycosiden remmen ook Na/K ATPase, transporters, mitochondriële ademhaling en eiwitsynthese. Lactam antibiotica (neg. geladen) (bijv. caphaloridine) - Ophoping in de tubulus cel door anion-transporters (OAT1, OAT2 en OAT3) - De toxiciteit is te remmen met een opnameremmer (probenecide). Er wordt bij dit antibioticum dus altijd probenecide gegeven. - Metabole activatie redox cycling ROS GSH uitputting + covalente binding aan eiwitten. Klinische parameters (biomarkers) voor nierschade: - Urine volume, pH en osmolariteit - Creatine klaring (bloed vs. urine meting)(er is GFR + beetje tubulaire secretie, dus je geeft een kleine overschatting. Het kan ook met inuline, dat nauwkeuriger is, maar dat moet geïnjecteerd worden en is dus invasiever. Creatine komt al gewoon in je lichaam voor.) De klaring is normaal ongeveer 125 ml/min - BUN (bloed-urine-stikstof meting) - Inuline klaring (GFR) - Para-aminohippuurzuur (PAH) (GFR + tubulaire excretie, ca. 700 ml/min = nierbloedflow) - Glucose in de urine. Als het aanwezig is, is er of schade aan de nier of verzadiging van de terugtransporters (zoals bij diabetes) - Eiwit in de urine o Albumine en IgG = proteïnurie. Grote eiwitten = glomerulus schade. o Kleine eiwitten = schade aan de re-uptake in de proximale tubulus o Lekkage uit dode cellen: biomarkers, cel-specifiek (GST en gammaglutamyl transpeptidase (gammaGT), KIP-1 voor de proximale tubulus) - Endogene metabolieten in de urine (metabolomics) - Histologie van een nierbiopt Modellen om renale functie te bestuderen: - In vivo: o Continuous microperfusion o Stopped-flow microperfusion - o Free-flow micropuncture o Confocal microscopy Ex vivo: o Isolated perfused kidney o Isolated perfused tubulus In vitro: o Renal slices o Isolated and purified glomeruli o Isolated and purified tubular segments o Isolated and purified proximal tubular epithelial cells. o Primary cultures of renal cells (tubular epithelial cells, glomerular cells en fibroblasts) o Immortaliazed renal epithelial cell lines (LLC-PK1, MDCK, NRK52E, OK, HK-2) College 6 (2 mrt) Reproductie toxiciteit: Reproductie toxiciteit leidt tot schade aan het reproductieve systeem, zoals de vruchtbaarheid, het libido, de implantatie van de eicel en de spermatogenese. Er zijn veel dierstudies gedaan naar reproductie toxiciteit. Er is hierbij vooral gekeken naar het geboortegewicht, de duur van de zwangerschap, het aantal pups, het geslacht van de pups, het gewicht van de pups, de vitaliteit van de pups, afwijkingen aan de pups en de lactatie. Geneesmiddelen (o.a. cytostatica en hormonen) maar ook alcohol, roken en milieuverontreinigingen zoals PCBs en ftalaten kunnen schade aanbrengen aan de geslachtscellen. - Mannen en vrouwen: o Libido - Mannen: o Leydig cellen (androgenen) o Sertoli cellen (spermatogenese) o Spermatogeen epithelium - Vrouwen: o Ovulatie o Bevruchting o Transport o Innesteling van de eicel Teratogeen = Iedere factor die schade aan een foetus of embryo veroorzaakt tijdens de prenatale periode met geboortedefecten als gevolg. De belangrijkste oorzaken van geboortedefecten zijn chemicaliën, geneesmiddelen, alcohol, roken, virus infecties bij de moeder, chromosomale afwijkingen, voedsel deficiënties en genetische factoren. Veel voorkomende geboortedefecten zijn storing in de differentiatie, storing in de groei, storing in de functie, misvorming en dood van de foetus. Toxiciteit tijdens de pre-implantatie: Tijdens de pre-implantatie is er en hele snelle celdeling. De blastocyst is dan dus nog heel gevoelig voor DNA beschadiging en microtubulus beschadiging. Als dit gebeurt, gaat hij dood. Teratogenen die tijdens de pre-implantatie schadelijk zijn, zijn cyproteroneacetaat, nicotine en DDT. Toxiciteit tijdens de embryonale periode: Tijdens de embryonale periode vindt de gastrulatie plaats. In deze periode vormen het endoderm, mesoderm en ectoderm zich. Er is dus grote gevoeligheid voor teratogenese. Dit leidt tot misvormingen. Tijdens de embryonale fase vind ook de organogenese plaats (week 3-8). Er is grote gevoeligheid door snelle celdeling en differentiatie. Teratogenen in deze periode kunnen leiden tot misvormingen, dood en groeivertraging, maar het effect is afhankelijk van het tijdstip van de blootstelling. Toxiciteit tijdens de foetale periode: In de foetale periode (dag 56 tot de geboorte) vindt weefseldifferentiatie, groei en rijping van de foetus plaats. Toxiciteit leidt tot groeivertraging, lichamelijke en geestelijke functionele defecten of misvormingen. Softenon: Softenon, oftewel thalidomide, is een sedativum. Dit is een middel tegen misselijkheid en braken bij het begin van de zwangerschap. De therapeutische dosis is 50-20 mg, maar bij 14 gram is het toxisch. In 1960-1970 werden veel kinderen geboren met hele korte ledematen. Deze ziekte heet focomelia/amelia en werd veroorzaakt door een overdosis softenon. Foetaal alcohol syndroom: Deze ziekte ontstaat door te veel alcoholinname tijdens de zwangerschap. Het wordt gekenmerkt door een korte platte neus, een dunne bovenlip, een plat philtrum en een kleine kin. Ook hebben deze kinderen een laag geboortegewicht, een klein hoofd, een klein lichaam en een laag IQ door apoptose van neuronen. Wanneer je alleen het eerste trimester gedronken hebt, zijn er nog steeds milde factoren van FAS te zien, zowel bij de geboorte als op latere leeftijd. Enkele teratogenen: - Softenon tegen misselijkheid en rustgevend - Diethylstilboestrol (DES) voorkomt een miskraam - Retinoiden, vit A derivaten tegen acne - Valproinezuur bij epilepsie - Cocaïne lokaal anestheticum - Alcohol - Straling - Tabaksrook - Dieet deficiënties (foliumzuur) - Meer dan 20 andere geneesmiddelen Structurele geboortedefecten - - 1:50 in Europa 1:33 in de USA o 25% genetische oorzaak o 10% door een teratogene stof o 65% door een onbekende oorzaak 1:1000 gespleten gehemelte (dit komt het vaakst voor) Er zijn meer dan 4 miljoen geneesmiddelen, maar er zijn er slechts 4100 met dierproeven getest op teratogeniteit. Ongeveer 25% van de geteste geneesmiddelen heeft teratogene effecten en 9% is verdacht. Op mensen zijn slechts 50-60 geneesmiddelen getest op teratogeniteit. Van de oudere geneesmiddelen die al langer op de markt zijn is de teratogeniteit niet goed bekend. Er zijn nu 202 geneesmiddelen geclassificeerd als potentieel teratogeen. Ook stoffen uit het milieu zijn bekend als teratogeen, zoals pesticiden, dioxines en PCB’s. Toxicokinetiek bij teratogenese: - De placenta bevat vele transporters voor de opname van voedingsstoffen en de excretie van afvalstoffen - De barrière verandert gedurende de zwangerschap - Doorbloeding is van groot belang voor de ontwikkeling van het kind - Het tijdstip van de blootstelling is van groot belang. In de eerste 50 dagen zijn de teratogene stoffen het gevaarlijkst. In die 50 dagen verschilt het elke dag welk orgaan aan het ontwikkelen is. De teratogene effecten zijn afhankelijk van het tijdstip van blootstelling. Er kan een NOAL gevonden worden voor teratogenen. Het is mogelijk dat bij eenzelfde dosis zowel letaliteit, retardatie als malformatie plaatsvindt. Al deze effecten hebben een andere curve, maar deze curven overlappen dan deels. Een teratogeen kan dus tot verschillende dingen leiden. Mechanisme van teratogeniteit: Verschillende stoffen kunnen tot verschillende effecten leiden. Het verschilt per stof of ze voor letaliteit, misvorming, groeivertraging, dood of een combinatie daarvan leiden. Voorbeelden van teratogene geneesmiddelen: (!) - Retinoiden specifiek receptor gemedieerd (RAR), genregulatie. - hERG blokkers remming van de hartslag, hypoxia. - Valproic acid (VPA) anti-epilepticum specifieke veranderingen in de genregulatie. Je moet hierbij de risico’s van epileptische aanvallen afwegen tegen de risico’s van het geneesmiddel. - Overige anti-epileptica hERG (K+ kanaal) remming, hypoxia. - ACE remmers en AT antagonisten RAAS systeem, bloeddruk. Let op! dit geneesmiddel is niet een risico in trimester 1 (zoals andere geneesmiddelen) mar in trimester 3. (!) - Warfarine remming van de bloedstolling, remming van de carboxylering van eiwitten. DES verstoring van de hormoonbalans, gen-methylering. Thalidomide (softenon) immuunsysteem, cell signalling. NSAID’s COX remming? Roken Alcohol apoptose van de hersencellen? 3 in vivo testen voor reproductie schade 1) Segment 1: fertility and early embryonic development. Ratten worden tot aan het begin van de zwangerschap gedoseerd. Je kijkt of er afwijkingen zijn aan: - spermatogenese - oöcyt formatie - vruchtbaarheid - libido - implantatie En in dierstudies: - Duur van de zwangerschap - Geboorteproces - Aantal pups - Geslacht van de pups - Gewicht van de pups - Abnormaliteiten - lactatie 2) Segment 2: Embryo-foetale ontwikkeling. Ratten krijgen gedurende de hele zwangerschap de dosering. De moeder wordt na de bevalling volledig ontleed en de jongen ook. 3) Segment 3: peri- en postnatale ontwikkeling. De dosering wordt gegeven tijdens de zwangerschap en de lactatie. De effecten op de lange termijn worden bij de jongen bepaald. Ze groeien op, gaan zelf paren, en worden vervolgens ontleed. Het is een discussiepunt hoe voorspellend een diermodel is voor mensen. - De meeste teratogene effecten kunnen achteraf worden gereproduceerd in een diermodel - Er is niet 1 algemeen voorspellend diermodel - Dierexperimenten zijn vaak met een hele hoge dosis - In ontwikkeling: o In vitro modellen (celkweken, embryonale stamcellen, bijvoorbeeld van het hart) o In vivo (zebravis. In de eerste 6 dagen na de bevruchting zie je de larven uitgroeien. Deze larven zijn doorzichtig, dus je kan de ontwikkeling van de organen heel goed zien.) Classificatie van teratogenen: - Klasse X = bewezen teratogeen in de mens. Dit heet contra-indicatie. - Klasse D = Het risico is aanwezig. Dierstudies zijn positief, maar de humane studies hebben nog niet goed genoeg bewijs geleverd. - Klasse C = Het risico kan niet worden uitgesloten. De benefits zijn groot en het risico is laag, dus het kan toch op de markt gebracht worden. Er zijn geen humane data en dierstudies zijn positief of afwezig. - Klasse B: het risico is gering, er is geen humane data en de dierstudies zijn negatief. - Klasse A: Geen effect in goed gecontroleerde humane studies. Safety assessment: Hazard = gevaar = biologische eigenschap. Er is altijd een gevaar aanwezig. Wanneer je dit gevaar op gaat zoeken neemt het risico toe. Risico = kans dat gevaar optreedt. Veiligheid = kans dat de schade niet optreedt. Hazard identificatie een karakterisering Er is een cascade aan studies die gebaseerd zijn op - of de interne en externe ethische grenzen niet worden overschreden - science rationale - regulatory guidelines (Hier beslissen de CBG, EMA en de FDA over) Wanneer er iets gebeurt, worden de regels aangescherpt. Dit gebeurde bijvoorbeeld door softenon en sulfanilamide. Sulfanilamide is tegen infecties met streptococcus. Ze losten het op in DEG, wat heel toxisch bleek te zijn en waar veel kinderen aan dood zijn gegaan. Je moet dus niet alleen naar het geneesmiddel, maar ook naar het oplosmiddel kijken. International conference on harmonisation (ICH). Studies die bijvoorbeeld in Amerika gedaan worden naar een bepaalde stof, mogen bijvoorbeeld ook in Europa gebruikt worden bij de ontwikkeling van het geneesmiddel. Onderzoek moet altijd gedaan worden op een knaagdier en een niet-knaagdier. Bij de ontwikkeling van geneesmiddelen moet je je heel erg aan de richtlijnen houden en moet je heel transparant zijn. Alles wat je doet wordt gecontroleerd door het GLP (good lab practice). In de jaren 70 was er een lab waar heel veel onderzoeken werden gedaan die heel slordig werden uitgevoerd. 40% van alle toxiciteitstudies in de USA werden slordig gedaan en er werd aan data matching gedaan. De GLP is geïntroduceerd in de late 70’s om te zorgen dat onderzoek vanaf dat moment netjes gedaan zou worden. Je moet kunnen laten zien dat de resultaten kloppen. Je moet ervoor zorgen de dat kwaliteit van de resultaten onder controle is. Je moet alles bijhouden en je moet ervoor zorgen dat alles traceerbaar is. Vooral in de fase van preklinische ontwikkeling moet je je heel goed aan de regels houden. Tijdens de klinische development heb je iets meer vrijheid. Het duurt 10-13 jaar voordat een stof als geneesmiddel op de markt gebracht kan worden. Van drug discovery naar preclinical development: - compound activity profiling - screens for genetic toxicity en arrhythmogenic potential - acute in vivo toxicology (d7 dagen in ratten) Van preclinical development naar fase 1 van de clinical development - definitive genetic toxicity tests - dose-range and definitive 14-28 dagen toxicology (knaagdier en nietknaagdier) - safety pharmacology (CV, CNS en respiratory system) Welke studies worden gedaan met een nieuw geneesmiddel? - In vitro met hepatocyten cellijnen of microsomen. (let op, bij microsomen kun je niet alle metabolieten zien, omdat je een groot aantal enzymen mist.) - In vivo met proefdieren - Orale beschikbaarheid bestuderen of het geneesmiddel wel oraal ingenomen kan worden. - Weefseldistributie - Ontwikkeling van een dosis-effect curve en bepaling van de LOAEL en de NOAEL. De NOAEL bij het gevoeligste proefdier bepaalt de maximale startdosis bij mensen. - Maximum concentratie en totale blootstelling (ook na meervoudig doseren) Hiermee kun je de gevonden toxiciteit interpreteren - Genotoxiciteitsstudies zoals de AMES test of de micronucleus assay Er is een knaagdier en een niet-knaagdier nodig. De species selectie wordt gebaseerd op relevante farmacologie en vergelijking van het metabole profiel van dieren en mensen. Wanneer er een hogere AUC gemeten wordt, remt een geneesmiddel zijn eigen metabolisme en blijft zijn concentratie dus hoger. Een lagere AUC betekent juist dat hij zijn eigen metabolisme stimuleert. Toxicokinetiek bij animal safety studies - het support de interpretatie van herhaaldelijke dose toxiciteitsstudies - bewijs van absorptie en blootstelling in de tijd - determinatie van de exposure-effect relatie Voor fase 1: - Goede formulering o Hogere beschikbaarheid. Is het effectief? De ADI wordt niet zo veel meer gebruikt. Tegenwoordig reken we dat uit als Human starting dose = NOAEL / safety factor (= 10) * conversion based on body surface area. Klinische studies: - Fase 1: Bij gezonde vrijwilligers. Je kijkt naar de veiligheid, het biologische effect, het metabolisme en de kinetiek. - Fase 2: Geselecteerde kleine groepen patiënten. Je kijkt naar de therapeutische respons, dosis regime, het metabolisme en de kinetiek - Fase 3: grote groepen patiënten. Je kijkt naar de veiligheid en je vergelijkt het middel met dingen die al op de markt zijn (is het beter?) Tijdens het hele klinische proces blijf je doorgaan met proefdieronderzoek. Ook wordt er onderzoek gedaan aan nakomelingen van de proefdieren om teratogeniteit te bepalen. Case example: Drug X. Drug X was in klinische fase II gekomen. Alles leek goed in dieren. Bij mensen kregen ze 14C samples. Er werd ontdekt dat er bij mensen in het plasma een aantal hele andere metabolieten aanwezig waren die niet bij de rat en de hond gevonden werden. In apen bleek het metaboliet wel aanwezig te zijn. Alle studies werden herhaald bij de aap om te kijken of de metaboliet niet toxisch is.
