invloed van metronomische chemotherapie op myeloid
advertisement
UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Voeding, Genetica en Ethologie Laboratorium voor Gentherapie Academiejaar 2013-2014 INVLOED VAN METRONOMISCHE CHEMOTHERAPIE OP MYELOID-DERIVED SUPPRESSOR CELLEN Marjolein DE BRUYCKER Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Prof. Dr. N. Sanders Commissarissen Prof. Dr. S. De Smedt Dr. I. Lentacker AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.” 27/05/2014 Promotor Auteur Prof. Dr. N. Sanders Marjolein De Bruycker SAMENVATTING “Myeloid-derived suppressor cellen” (MDSC) zijn afkomstig van de myeloïde cellijn van het immuunsysteem. Inflammatoire mediatoren van tumorale oorsprong verhinderen de normale differentiatie van MDSC tot mature cellen zoals macrofagen en dendritische cellen. Ze verwerven een immunosuppressief karakter en zijn in staat de angiogenese te stimuleren. MDSC zijn overvloedig aanwezig bij kankerpatiënten, waar ze gunstige condities genereren voor de tumor. Dit vormt dus een probleem voor de behandeling van de kankerpatiënt. Het laatste decennium heeft metronomische chemotherapie veel interesse opgewekt als immunomodulerende en antiangiogenetische behandeling bij kanker. Daarom wensen wij in deze thesis specifiek te onderzoeken of lage dosissen van twee chemotherapeutica (mitoxantrone en doxorubicine) in vitro een effect hebben op het aantal MDSC in een suspensie van muriene splenocyten. Het onderzoek bestond uit 2 grote onderdelen: Ten eerste zijn we erin geslaagd een in vitro model op te stellen dat de in vivo tumorale micro-omgeving simuleert. Hierdoor is het experimenteel model van de eigenlijke proef relevanter en ethisch meer verantwoord dan wanneer we splenocyten van een gezonde muis of van een muis geïnoculeerd met tumorcellen zouden gebruiken. Ten tweede hebben we aangetoond dat een 1/20 verdunning van de cytotoxische concentratie doxorubicine in staat is de ratio MDSC/CD8+ T-cellen te doen dalen. Van de 1/15 verdunning hebben we geen statistische significantie aan kunnen tonen, mogelijks door onvoldoende power van de proef. Toch is deze concentratie interessant voor verdere evaluatie. Met mitoxantrone en de hogere doses doxorubicine (1/5 en 1/10) werd geen effect waargenomen op de ratio MDSC/CD8+ T-cellen. Het is wenselijk in de toekomst de interessante concentraties (1/20 en 1/15 doxorubicine) te bevestigen met bijkomende in vitro proeven, nog lagere concentraties van doxorubicine te onderzoeken en functionele testen uit te voeren om andere effecten van de chemotherapeutica (dan het cytotoxisch effect) te evalueren. Na identificatie van de ideale dosering kan overgegaan worden naar proeven met tumordragende dieren, waarbij de hond een waardevol alternatief vormt voor het klassiek murien diermodel. DANKWOORD Vooreerst wens ik mijn promotor, Professor Dr. N. Sanders te bedanken voor het mogelijk maken van deze thesis en het ter beschikking stellen van zijn labo en materialen. Vervolgens wil ik Sofie Denies en Laetitia Cicchelero hartelijk bedanken voor hun uitmuntende begeleiding, hun geduld en vooral voor het besteden van hun kostbare tijd aan het verbeteren van mijn teksten en het samen uitwerken van de praktische proeven. Verder gaat mijn dank uit naar de mensen in en rond het labo: Tinne, Sara, Philippe, Wenwen, Yana, Mario, Ruben, Linda, Wei, Jozefien en Domi. Bedankt voor de leuke momenten tijdens pauzes en de lekkere tussendoortjes. Ook mijn ouders verdienen een dankwoord. Dankjewel Mama, voor je toewijding, geduld en steun. Zonder jou zou ik niet zijn wie ik ben vandaag. Dankjewel Papa, voor je aanmoedigingen, voor je steun en voor het meermaals nalezen van mijn thesis. Ten slotte wil ik mijn vriend, James, bedanken voor de ontspannende momenten tijdens het schrijven van deze thesis en voor zijn luisterend oor en motiverende woorden tijdens minder goede momenten. Ik ben jullie allen erg dankbaar! Marjolein INHOUDSOPGAVE 1. INLEIDING .................................................................................................................... 1 1.1. 1.2. 1.3. GESCHIEDENIS VAN KANKERBEHANDELING ....................................................... 1 EVOLUTIE VAN CHEMOTHERAPIE ....................................................................... 1 ANTITUMORALE IMMUUNRESPONS .................................................................. 3 1.3.1. Antigen presenterende cellen .......................................................... 3 1.3.2. Natural Killer cellen.......................................................................... 4 1.3.3. CD4+ en CD8+ T-cellen ..................................................................... 5 1.3.4. B-cellen en antilichamen .................................................................. 5 1.4. EVASIE VAN HET IMMUUNSYSTEEM .................................................................. 6 1.4.1. Directe immuunevasie ..................................................................... 6 1.4.2. Indirecte immuunevasie ................................................................... 7 1.4.2.1. 1.4.2.2. 1.4.2.3. 1.4.2.4. 1.4.2.5. 1.4.2.6. 1.5. Micro-omgeving van tumoren ............................................ 7 Regulatorische T-cellen ........................................................ 7 Myeloid-derived suppressor cellen ..................................... 9 Immunosuppressief effect van MDSC ............................... 11 Tumorigene effect van MDSC ............................................ 12 Therapieën voor het manipuleren van MDSC ................... 13 EFFECTEN VAN METRONOMISCHE CHEMOTHERAPIE ..................................... 13 1.5.1. Remmen van de angiogenese .......................................................... 14 1.5.2. Immunomodulatie .......................................................................... 14 1.5.2.1. Manipulatie van regulatorische T-cellen .......................... 14 1.5.2.2. Manipulatie van MDSC ...................................................... 15 1.6. FLOW CYTOMETRIE........................................................................................... 15 1.6.1. Hydrodynamisch focusseren ........................................................... 15 1.6.2. Lichtbron ........................................................................................ 16 1.6.3. Lichtverstrooiing ............................................................................. 16 1.6.4. Fluorescentie .................................................................................. 17 2. OBJECTIEVEN ........................................................................................................ 18 3. MATERIALEN EN METHODEN ................................................................................ 20 3.1. PROEF 1 – INVLOED VAN CYTOKINES OP MDSC ............................................... 20 3.1.1. Splitsen van de B16F10 tumorcelcultuur .......................................... 20 3.1.2. Maken van een miltcelsuspensie ..................................................... 21 3.1.3. Incubatie van de splenocyten met B16F10 supernatans ................... 21 3.1.4. Kleuring van MDSC.......................................................................... 22 3.1.5. Analyse met de flow cytometer ....................................................... 22 3.1.6. Statistische analyse ......................................................................... 22 3.2. PROEF 2 – VIABILITY GATING SPLENOCYTEN ................................................... 23 3.2.1. Miltcelsuspensie ............................................................................. 23 3.2.2. Inductie van celdood ....................................................................... 23 3.2.2.1. Apoptose door serumdeprivatie ....................................... 23 3.2.2.2. Necrose door een vries/dooi cyclus .................................. 24 3.2.2.3. Heat shock ......................................................................... 24 3.2.3. Celkleuring met 7-AAD .................................................................... 24 3.2.4. Flow cytometrische analyse ............................................................ 24 3.3. PROEF 3 – INVLOED VAN DE CHEMOTHERAPEUTICUM CONC. OP MDSC ....... 25 3.3.1. Opstellen van de chemotherapie verdunningsreeks ......................... 25 3.3.1.1. Bereiden van stockoplossingen ........................................ 25 3.3.1.2. Bereiden van werkoplossingen ......................................... 26 3.3.2. Poweranalyse ................................................................................. 26 3.3.3. Bereiding van de miltsuspensies ...................................................... 27 3.3.4. Coïncubatie met supernatans van tumorcellen ................................ 27 3.3.5. Behandeling met metronomische chemotherapie ........................... 27 3.3.6. Celkleuring ...................................................................................... 27 4. RESULTATEN ......................................................................................................... 28 4.1. 4.2. 4.3. PROEF 1 – INVLOED VAN TUMORALE CYTOKINES OP MDSC ........................... 28 PROEF 2 – VIABILITY GATING ............................................................................ 30 PROEF 3 – INVLOED VAN METRONOMISCHE CHEMOTHERAPIE OP MDSC ..... 32 4.3.1. Het effect van doxorubicine op de ratio MDSC/CD8+ T-cellen .......... 33 4.3.2. Het effect van mitoxantrone op de ratio MDSC/CD8+ T-cellen ......... 36 5. DISCUSSIE ............................................................................................................. 38 6. CONCLUSIES ......................................................................................................... 43 7. LITERATUURLIJST .................................................................................................. 45 LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN 7-AAD 7-Aminoactinomycine D ADCC Antibody dependent cell mediated cytotoxicity APC Antigen presenterende cel CD Cluster of differentiation cGMP Cyclic guanosine monophosphate COX Cycloöxygenase DMEM Dulbecco’s modified eagle medium DNA Desoxyribonucleic acid DOX Doxorubicine EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FCS Fetal calf serum FMO Fluorescence minus one FSC Forward scatter channel GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor IDO Indoleamine 2,3-dioxygenase IFN Interferon IL Interleukine iNOS Inducible nitrogen oxide synthase MDSC Myeloid-derived suppressor cellen MHC Major Histocompatibility Complex MTD Maximaal Tolereerbare Dosis MTX Mitoxantrone NK-cel Natural Killer cel NO Nitrogen oxide PBS Phosphate-buffered saline PGE Prostaglandine E RBC Rode bloedcellen RNA Ribonucleic acid ROS Reactive oxygen species rpm Rotaties per minuut RV Relatieve vochtigheid SD Standard deviation SSC Side scatter channel TCR T-cel receptor TGF-β Transforming growth factor β TNF Tumor necrosis factor Tregs Regulatorische T-cellen VEGF Vascular endothelial growth factor 1. INLEIDING 1.1. GESCHIEDENIS VAN KANKERBEHANDELING Kankerbehandeling steunt voornamelijk op volgende pijlers: chirurgie, radiotherapie en chemotherapie. Chirurgie is veruit de oudste behandelingsmethode en is vandaag de dag nog steeds de belangrijkste (1). De tweede voorwaartse stap in de behandeling van kanker kwam er na de ontdekking van isotopen die γ-stralen uitzenden. Radiotherapie zag het levenslicht toen men in het begin van de 20ste eeuw aantoonde dat deze γ-stralen de groei van tumoren konden onderdrukken (2). De focus van deze masterproef ligt op de derde therapie, nl. chemotherapie. Het ontstaan ervan dateert van Wereldoorlog II: toen werd per toeval ontdekt dat bepaalde oorlogsgassen (de stikstofmosterd derivaten) invloed hadden op delende cellen. Hematologen ontdekten dat deze effectief bleken te zijn als behandeling voor bepaalde leukemieën (2). Steeds meer chemotherapeutica werden ontwikkeld, waardoor de verschillende klassen ontstonden die nu nog steeds gehandhaafd worden, ondermeer: antimetabolieten, alkylerende agentia, microtubulaire inhibitoren en antitumorale antibiotica (2). De geneesmiddelen uit deze klassen hebben als gemeenschappelijk kenmerk dat ze aangrijpen op de celcyclus. Ze interfereren met de DNA/RNA synthese of met de vorming van microtubuli, om zo de celdeling te onderbreken. Daarom vallen ze onder de overkoepelende term ‘cytostatica’ (1;3). Tijdens het experimentele werk voor deze masterproef wordt gebruik gemaakt van 2 cytostatica: doxorubicine en mitoxantrone. Doxorubicine behoort tot de klasse van de anthracyclines en is dus een oncolytisch antibioticum. Mitoxantrone is een anthracycline analoog (4). 1.2. EVOLUTIE VAN CHEMOTHERAPIE Sinds het ontstaan van chemotherapie is er veel vooruitgang geboekt. De maximaal tolereerbare dosissen (MTD) (de hoogste dosis van een geneesmiddel waarbij de patiënt geen onaanvaardbare bijwerkingen vertoont) van chemotherapeutica werden bepaald en monotherapie evolueerde naar combinatietherapie, waardoor chemokuren steeds veiliger werden voor de kankerpatiënt. De laatste jaren werd ook onderzoek gevoerd naar 1 alternatieve toepassingen van chemotherapiedosissen – en schema’s, ondermeer naar de effecten van regelmatige lage dosissen chemotherapie in contrast tot de klassieke intermitterende hoge dosissen (5;6). Heden zijn klinische oncologen in staat om steeds hogere dosissen chemotherapie voor te schrijven, aangezien er veel meer ondersteunende faciliteiten voor de patiënten ter beschikking staan dan vroeger. Op die manier kunnen tumoren zo optimaal mogelijk bestreden worden. Het grootste probleem met hoge dosissen is echter dat patiënten te maken krijgen met sterke morbiditeit, zoals aantasting van het immuunsysteem. Hierdoor worden patiënten veel vatbaarder voor infecties, waaraan ze kunnen overlijden. Bovendien maskeren deze hoge dosissen de meer subtiele effecten van het chemotherapeuticum, zoals het antiangiogenetisch effect op tumoren (5;7). Deze masterproef kadert in het onderzoeksveld omtrent een nieuw concept in bestrijding van tumoren, met name metronomische chemotherapie. De definitie is door de jaren heen verschillende malen gewijzigd, maar het basisconcept blijft hetzelfde: bij metronomische chemotherapie wordt een klassiek cytotoxisch geneesmiddel via een atypisch behandelingsschema toegediend. De patiënt krijgt op regelmatige basis (bv. dagelijks) en ononderbroken een lage dosis chemotherapeuticum toegediend (8). Dit in tegenstelling tot de hoge MTD dosering en lange geneesmiddelvrije intervallen bij klassieke behandelingen. De metronomische chemotherapie biedt meerdere voordelen. Vooreerst is het toxiciteitsprofiel beter dan bij klassieke chemotherapie, waardoor patiënten die niet meer in aanmerking komen voor een klassieke behandeling wel nog geholpen kunnen worden. Bovendien kan gebruik gemaakt worden van orale medicatie. Dit kan de kostprijs van de therapie doen dalen en de patiënt de mogelijkheid bieden thuis behandeld te worden. Tevens draagt het verminderd optreden van ingrijpende bijwerkingen bij tot de lagere kost van metronomische chemotherapie (5). Het belangrijkste voordeel is echter dat metronomische chemotherapie de tumorcelgroei kan afremmen, onafhankelijk van het resistentiepatroon van de tumor. De genetische instabiliteit van tumorcellen resulteert in de toename van therapieresistentie, waardoor de behandeling met cytostatica aan hoge dosis gelimiteerd is. Dit maakt de zoektocht naar alternatieve behandelingen noodzakelijk (7). 2 Er zijn nog andere factoren die in belangrijke mate kunnen bijdragen tot het falen van conventionele therapie: de onderdrukking van de immuunrespons tegen de tumor en het feit dat MTD chemotherapie de angiogenese niet efficiënt inhibeert. Vasculaire endotheelcellen prolifereren trager dan tumorcellen, waardoor cytostatica minder kans hebben om hun farmacologisch effect hierop uit te voeren. Daarenboven kunnen de endotheelcellen tijdens de lange geneesmiddelvrije intervallen opnieuw prolifereren (9). De vorming en progressie van een tumor gaat gepaard met complexe interacties tussen de tumorcellen en de directe omgeving. Een tumor is geen op zichzelf staande eenheid. Niet enkel de tumorcellen, maar ook de vasculatuur en de cellen van het immuunsysteem vormen potentiële targets in de strijd tegen kanker. Daarom is metronomisch behandelen zo interessant: het chemotherapeuticum zal eerder de micro-omgeving van de tumor aanpakken i.p.v. de tumorcellen zelf (9). Helaas heeft metronomische chemotherapie een belangrijk nadeel ten opzichte van de conventionele MTD behandeling: de MTD behandeling kan curatief zijn, een metronomische behandeling niet. Metronomische chemotherapie is interessant in de palliatieve setting, als adjuvante therapie, als therapie bij tumoren die intrinsieke of verworven resistentie vertonen of bij patiënten die niet in aanmerking komen voor de MTD dosering (7;8). 1.3. ANTITUMORALE IMMUUNRESPONS Voor een efficiënte immuunrespons tegen tumorcellen zijn verscheidene componenten noodzakelijk. De T-cel gemedieerde immuunrespons is de belangrijkste hiervan, al spelen Natural Killer (NK-) cellen, B-cellen en dendritische cellen ook een rol in de antitumorale immuniteit (10). De antitumorale immuunrespons is veel complexer dan dit, met nog veel meer celtypes, maar in deze inleiding zullen we ons beperken tot het vermelden van de meest essentiële componenten. 1.3.1. Antigen Presenterende Cellen Antigen presenterende cellen (APC) zijn cellen van het immuunsysteem die proteïnen fagocyteren en fragmenten hiervan presenteren op hun celoppervlak. Er zijn drie soorten APC: dendritische cellen, macrofagen en B-cellen. Deze zijn cruciaal voor het activeren van naïeve cellen van het adaptief immuunsysteem tot effectorcellen (10). 3 APC beschikken over oppervlaktemoleculen die nodig zijn voor presentatie van antigenen: major histocompatibility complex (MHC). Deze moleculen worden onderverdeeld in twee klassen: MHC I en MHC II. MHC I moleculen komen voor op de celmembraan van alle lichaamscellen, uitgezonderd kernloze cellen. De MHC I moleculen presenteren peptiden afkomstig van intracellulaire proteïnen. MHC II moleculen komen slechts bij enkele celsoorten tot expressie, waarvan de APC de voornaamste zijn. Via de MHC II moleculen worden extracellulaire proteïnen gepresenteerd (11). Voor presentatie van tumorantigenen zijn de dendritische cellen het belangrijkst. Deze worden ook professionele APC genoemd en vertonen hoge intrinsieke co-stimulatoire activiteit. Deze co-stimulatie is strikt noodzakelijk om een naïeve T-cel te activeren tot een effector T-cel. Bovendien zetten dendritische cellen de T-cellen aan tot synthese van interleukine 2 (IL-2). IL-2 is een cytokine dat aanleiding geeft tot proliferatie en differentiatie van T-cellen (10;12). 1.3.2. Natural Killer cellen NK-cellen zijn in staat tumorcellen te lyseren via verscheidene mechanismen. Ze beschikken over cytotoxische granulen gevuld met perforines en granzymen die aanleiding geven tot afsterven van de targetcel. Dit wordt gereguleerd door inhiberende en activerende receptoren op hun celoppervlak (12;13). Sommige tumoren vertonen expressie van gemodificeerde MHC I moleculen of geen expressie van MHC I moleculen op hun oppervlak en kunnen zo de T-cel gebonden immuniteit omzeilen. De inhiberende receptoren van een NK-cel herkennen lichaamseigen MHC I moleculen. Als een tumor deze niet tot expressie brengt, valt het inhiberend signaal weg en zal de NK-cel zijn perforines en granzymen vrijstellen (12;13). Een tweede mechanisme is de antibody dependent cell mediated cytotoxicity (ADCC) waarbij NK-cellen de belangrijkste effectorcellen zijn. NK-cellen beschikken over Fcreceptoren op hun celmembraan. Een antilichaam dat gebonden zit op een tumorcel kan met zijn Fc-domein interageren met deze receptoren, waardoor de NK-cel een activerend signaal krijgt. Als gevolg hiervan secreteert de NK-cel zijn cytotoxische granulen, waardoor de gecoate tumorcel gelyseerd wordt (14). 4 1.3.3. CD4+ en CD8+ T-cellen Naïeve CD4+ T-cellen (of helper T-cellen) worden tot effectorcellen omgezet wanneer ze een antigen, dat via een MHC II molecule op een APC wordt gepresenteerd, herkennen en binden. De effectorcellen spelen een rol bij het activeren/stimuleren van macrofagen, Bcellen en cytotoxische T-cellen (10;11). Na de activatie worden de helper T-cellen onderverdeeld in 2 subgroepen: TH1- en TH2cellen. TH1-cellen produceren IL-2 en interferon (IFN)-γ en stimuleren B-cellen tot aanmaak van IgG2a, terwijl TH2-cellen IL-4, -5 en -6 produceren en B-cellen stimuleren tot aanmaak van IgG1 en IgE. De TH1 cytokines zijn het belangrijkst in de antitumorale immuniteit (10;11). CD8+ T-cellen, ook genaamd cytotoxische T-cellen, zijn belangrijk bij virale infecties en tumoren. In tegenstelling tot helper T-cellen, worden cytotoxische T-cellen geactiveerd na binding van een specifiek antigen gepresenteerd op een MHC I molecule. Zij kunnen, na de activatie door een APC, tumorcellen herkennen en doden. Dit doen ze door granzymen en perforines te secreteren waardoor de tumorcel sterft (10). 1.3.4. B-cellen en antilichamen Over de rol van B-cellen in de immuniteit tegen tumorcellen is relatief weinig gekend. Nochtans zijn ze overvloedig aanwezig in de omgeving van de tumor. Geactiveerde B-cellen produceren cytokines zoals IL-1, IL-6 en tumor necrosis factor (TNF) waardoor ze de differentiatie van naïeve CD4+ T-cellen tot effectorcellen beïnvloeden. B-cellen fungeren eveneens als APC, waarbij ze voornamelijk aanleiding geven tot TH2 activatie. Recentelijk werden studies gepubliceerd die suggereren dat bepaalde B-cellen negatieve invloeden hebben bij kanker en eerder tumorgroei bevorderen (15). De belangrijkste functie van B-cellen in het domein van kankeronderzoek is de productie van antilichamen tegen tumorantigenen. Antilichamen kunnen aanleiding geven tot activatie van het complementsysteem, de ADCC of de adaptieve immuunrespons alsook tot verstoring van de signaaloverdracht (14;15). Het complementsysteem is een verzameling van proteïnen die een complexe proteolytische cascade vormen na activatie. Deze activatie kan gebeuren via de klassieke pathway door interactie van het complement met antilichamen die gebonden zitten op een 5 targetcel. Het complementsysteem kan cellen lyseren door vorming van een porie in de membraan. Bovendien zorgen ze voor opsonisatie en stimuleren ze inflammatie (14;16). De functie van antilichamen in de ADCC werd reeds besproken in §1.3.2. Antilichamen binden met hun variabel deel aan de tumorcel, waardoor hun Fc-domein herkend kan worden door Fc-receptoren van een NK-cel. De NK-cel maakt aldus gebruik van de specificiteit van het antilichaam. Dit is een activerend signaal voor de NK-cel en geeft aanleiding tot vrijstelling van zijn cytotoxische granulen (12). De lyse van tumorcellen door het complementsysteem en de ADCC leidt tot vorming van tumorcelfragmenten en dus ook vrijstelling van antigenen, die opgenomen kunnen worden door APC. Samen met opsonisatie, dat aanleiding geeft tot efficiëntere fagocytose van tumorcellen door APC, zorgen al deze functies van antilichamen voor activatie van het adaptief immuunsysteem (14). Ten slotte veroorzaken antilichamen verstoring van signaaloverdracht door binding en neutralisatie van opgeloste moleculen, zoals cytokines of groeifactoren. Ook kunnen ze receptoren bezetten en functioneren als agonist of antagonist (14). Al deze eigenschappen van antilichamen kunnen gemanipuleerd en aangewend worden in de ontwikkeling van kankertherapieën (14). 1.4. EVASIE VAN HET IMMUUNSYSTEEM Tumoren gebruiken verscheidene mechanismen om toch te kunnen ontsnappen aan het immuunsysteem van de patiënt. Dit doen ze zowel op directe of indirecte manieren. 1.4.1. Directe immuunevasie De expressie van moleculen zoals MHC I op het oppervlak van tumorcellen kan onderhevig zijn aan downregulatie of complete deletie door hun genetische instabiliteit. Ook kan downregulatie van de expressie van tumorspecifieke antigenen optreden. Dit zorgt ervoor dat de cytotoxische T-cellen hun functie niet naar behoren kunnen uitvoeren. Veranderingen in expressie van oncogenen, tumorsuppressorgenen of onderdelen van signaaltransductie pathways kunnen aanleiding geven tot verstoring van antigenpresentatie 6 op het oppervlak van de tumorcel. Deze mechanismen dragen bij tot ontwijking van de herkenning door het immuunsysteem (10;17). 1.4.2. Indirecte immuunevasie 1.4.2.1. Micro-omgeving van tumoren Een tumor is geen op zichzelf staande eenheid, daar hij sterk interageert met zijn directe omgeving. Tumorcellen secreteren verscheidene immunosuppressieve factoren: vascular endothelial growth factor (VEGF), granulocyte-macrofage colony-stimulating factor (GMCSF), transforming growth factor (TGF)-β, IL-10, reactive oxygen species (ROS), inducible nitric oxide synthase (iNOS), arginase-1 en prostaglandines (17). Stromale cellen dragen eveneens bij tot de evasie van het immuunsysteem. Zij werden het laatste decennium intensief bestudeerd en hieruit blijkt dat zij een cruciale rol spelen bij het rekruteren, activeren en de expansie van diverse immunosuppressieve cellen, waaronder regulatorische T-cellen (Tregs) en myeloid-derived suppressor cellen (MDSC) (10;17). Al deze factoren dragen bij tot een gunstige micro-omgeving voor de tumor door het beïnvloeden van de balans tussen protumorale en antitumorale immuuncellen (zie Figuur 1.1) (18). Figuur 1.1: Balans tussen protumorale en antitumorale immuuncellen bepaalt de efficiëntie van de antitumorale immuniteit (18) 1.4.2.2. Regulatorische T-cellen Tregs spelen een belangrijke rol bij het onderhouden van self-tolerance en het voorkomen van auto-immuunziekten. Bij kankerpatiënten daarentegen hebben ze een 7 nadelige invloed omdat ze de immuunrespons tegen de tumor onderdrukken. Daarom zijn Tregs een interessante target voor kankertherapie (10;19). De belangrijkste antigenen die ze vertonen zijn een intracellulair antigen FoxP3 en twee oppervlakteantigenen, nl. CD4 en CD25 (10). Tregs migreren naar een tumor omdat ze aangetrokken worden door een gradiënt van chemokines aangemaakt door de tumorcellen. Vele antigenen afkomstig van een tumor worden door Tregs herkend als lichaamseigen antigenen. Dit verklaart gedeeltelijk waarom ze de immuunrespons tegen een tumor inhiberen (20). Hun immunosuppressief karakter komt tot uiting via verscheidene mechanismen, die verduidelijkt worden in Figuur 1.2. Figuur 1.2: Immunosuppressie door Tregs: werkingsmechanismen A: productie van IL-10, TGFβ en IL-35 geeft aanleiding tot inhibitie van effector T-cellen; B: Secretie van granzymen en perforines leidt tot T-cel apoptose; C: Depletie van IL-2 zorgt voor verstoring van de proliferatie van effector T-cellen; D: Direct contact tussen oppervlaktemoleculen van de Treg en een dendritische cel geeft een negatief signaal aan de dendritische cel en induceert secretie van een immunosuppressief enzyme (IDO) door de dendritische cel waardoor effector T-cellen geïnhibeerd worden (20). 8 Tregs kunnen immunosuppressieve cytokines zoals IL-10, TGF-β en IL-35 secreteren die aanleiding geven tot inhibitie van effectorcellen. Andere cytokines, zoals VEGF, stimuleren angiogenese. Tevens hebben Tregs een negatief effect op verschillende effector immuuncellen, waaronder dendritische cellen, NK-cellen en cytotoxische T-cellen. Dit via verschillende mechanismen, waaronder lyse door granzymen en perforines, depletie van IL-2 alsook via direct contact tussen oppervlaktemoleculen van de Treg en een dendritische cel waardoor de dendritische cel een negatief signaal ontvangt en een immunosuppressief enzym secreteert dat effector T-cellen inhibeert (20). De drie belangrijkste methoden om Tregs te manipuleren zijn: inhibitie van hun functie, het blokkeren van hun migratie naar een tumor en depletie (20). De functie van Tregs kan ontregeld worden door gebruik van inhiberende antilichamen die binden op targetmoleculen (bv. CTLA-4, GITR, OX40) welke constitutief tot expressie gebracht worden op het oppervlak van deze cellen (20). Inhibitie van de functionaliteit van Tregs werd tevens aangetoond met een peptide inhibitor (P60) van FoxP3 in muizen (21). Verhinderen van de migratie van Tregs naar een tumor is mogelijk door het manipuleren van chemokines en chemokine receptoren. Dit werd reeds onderzocht zowel met monoklonale antilichamen (bv. anti-CCL22) als met kleine moleculen die antagonistisch werken op een bepaalde chemokinereceptor, nl. CCR4 (20;22). Voor de depletie van Tregs werd reeds een antilichaam tegen CD25 onderzocht, zowel in muizen als bij patiënten. Deze strategie bleek niet efficiënt aangezien ook geactiveerde Tcellen hierdoor gereduceerd worden (20). 1.4.2.3. Myeloid-derived suppressor cellen MDSC zijn een heterogene groep immature cellen van de myeloïde cellijn van het immuunsysteem. Ze komen meer voor in het lichaam van kankerpatiënten, waar ze een immunosuppressief karakter vertonen. Ze bestaan uit granulocyten en monocytische cellen wiens normale differentiatie tot mature myeloïde cellen zoals macrofagen of dendritische cellen onderbroken werd door inflammatoire mediatoren van tumorale oorsprong. Typerend voor muriene MDSC zijn twee oppervlakteantigenen: CD11b en Gr-1 (23). Deze merkers kunnen gebruikt worden voor analyse van deze cellen met flow cytometrie. 9 De MDSC zullen uitgebreider besproken worden dan de Tregs aangezien de focus van het experimentele werk in kader van deze masterproef op deze cellen ligt. MDSC ontstaan via wijziging van de myelopoësis door chronisch inflammatoire mediatoren. Ze komen voort uit de hematopoëtische stamcellen van het beenmerg, maar hun generatie, expansie, activatie en migratie worden beïnvloed door verschillende factoren aanwezig in de tumorale micro-omgeving (24). Dit wordt geïllustreerd in Figuur 1.3. Figuur 1.3: Invloed van factoren gesecreteerd door een tumor op de myelopoësis Een tumor produceert verscheidene cytokines, groeifactoren en chemokines die zijn microomgeving vormen. Deze factoren beïnvloeden de ontwikkeling van MDSC, de migratie van MDSC naar de tumor en induceren de immunosuppressieve functies van MDSC (24). Groeifactoren en cytokines zoals VEGF, GM-CSF, TGF-β, IL-1β, IL-10, TNF-α en IFN-γ, chemokines, cycloöxygenase(COX)-2 en prostaglandine E2 (PGE2) kunnen bijdragen tot de inflammatoire omgeving van de tumor. Al deze factoren hebben invloed op de myelopoësis en bevorderen de vorming van MDSC (24). VEGF en TGF-β worden copieus gesecreteerd door vele tumoren en spelen een rol in de regulatie van de hematopoësis. Tevens werken ze sterk in op de ontwikkeling en expansie van MDSC. IL-1β geproduceerd door een tumor heeft een direct effect op de vorming van 10 MDSC in het beenmerg en de migratie naar de tumorsite. Bovendien induceert IL-1β een upregulatie van zowel COX-2 als TNF-α en stimuleert het de vorming van IL-10 door MDSC (24). Daarenboven wordt de werking van APC verstoord door COX-2 en PGE2 die samen de maturatie van APC verhinderen. Al deze chemokines en cytokines samen induceren dus een verstoorde myelopoësis, met toename van het aantal MDSC als gevolg, alsook een gunstigere omgeving voor de tumor. Daarnaast leiden al deze mediatoren tot vorming van stikstofmonoxide (NO) dat het immunosuppressief karakter van MDSC induceert (24). 1.4.2.4. Immunosuppressief effect van MDSC Het immunosuppressief karakter van MDSC vertaalt zich voornamelijk in de inhibitie van de T-cel gebonden immuniteit (25). Verschillende mechanismen dragen hiertoe bij en worden geïllustreerd in Figuur 1.4 (26). Figuur 1.4: Immunosuppressie door MDSC – Werkingsmechanismen MDSC produceren NO en ROS waardoor T-celmigratie geblokkeerd wordt en T-cellen in apoptose gaan. Ze induceren een tekort aan aminozuren (arginine en cysteïne) die cruciaal zijn voor het normaal functioneren van T-cellen. Ze induceren een downregulatie van de TCR ζ-keten waardoor de T-cel geen activatiesignaal meer kan doorgeven. Productie van iNOS en arginase-1 door MDSC zorgt voor depletie van arginine en toename van NO, dat de immunosuppressieve functie van MDSC onderhoudt. Dit alles resulteert in inhibitie van dendritische cellen, normale T-cellen en stimuleert de expansie van Tregs (26). 11 Ten eerste heeft de productie van NO en ROS een drieledig effect. Het geeft aanleiding tot T-cel apoptose. Ze veranderen de functie van chemokines en T-cel receptoren (TCR) door nitratie. Hierdoor blokkeert de T-cel migratie. Bovendien inhiberen ze de vorming van cytokines die cruciaal zijn voor de antitumorale functies van T-cellen (26-28). Ten tweede induceren MDSC een tekort aan arginine en cysteïne, welke nodig zijn voor verscheidene T-cel functies. Ze bevorderen anergie van effectorcellen door het induceren van de expressie van TGF-β1 op de celmembraan. Ze zorgen voor downregulatie van de TCR ζ-keten expressie, waardoor de T-cellen geen activatiesignalen meer kunnen overbrengen. Ook produceren geactiveerde MDSC arginase-1 en iNOS, enzymen die arginine als substraat gebruiken, waardoor de hoeveelheid NO stijgt en hun immunosuppressieve functie onderhouden wordt (28;29). Deze factoren stellen MDSC in staat dendritische cellen en normale T-cellen te inhiberen en de expansie van Tregs te stimuleren. Over hun invloed op NK-cellen is er onenigheid. Verscheidene studies beweren dat MDSC de activatie van NK-cellen blokkeren en zo hun cytotoxiciteit ondermijnen, terwijl andere studies rapporteren dat MDSC juist voor activatie van NK-cellen zorgen (26;30). 1.4.2.5. Tumorigene effect van MDSC MDSC vertonen tumorigene activiteit. Ze zijn in staat angiogene factoren, zoals VEGF, te secreteren en zo de vorming van bloedvaten te stimuleren. Ze produceren groeifactoren (TGF-β) en cytokines (IL-1, IL-6, TNF-α) die de tumorgroei op een directe manier stimuleren. Deze beïnvloeden ook de ombuiging van de immuunrespons van een antitumoraal naar een protumoraal type en activeren Tregs (17). Het is dan ook niet verwonderlijk dat deze cellen veel interesse opwekken als target voor kankertherapie. Anderzijds zouden MDSC in het kader van auto-immuniteit wel een gunstige invloed hebben omdat ze, net zoals Tregs, T-celresponsen kunnen inhiberen. MDSC als therapie bij auto-immuunziekten werd tot nu toe weinig onderzocht, maar kan in de toekomst wel een interessante strategie vormen (31). 12 1.4.2.6. Therapieën voor het manipuleren van MDSC Het reduceren van het aantal MDSC of hun activiteit vormt een nieuwe strategie om de ontwikkeling van een tumor af te remmen en de prognose te verbeteren. Dit werd zowel in preklinische modellen als bij kankerpatiënten aangetoond (32-35). Dit kan bereikt worden via verschillende mechanismen, die in vier categorieën onderverdeeld kunnen worden: deactivatie van MDSC, differentiatie van MDSC naar mature cellen, inhibitie van de ontwikkeling van myeloïde cellen tot MDSC en ten slotte depletie van reeds gevormde MDSC (36). Van verscheidene chemotherapeutica is het bewezen dat ze het immunosuppressief karakter van MDSC kunnen omkeren door hun maturatie te stimuleren of ze direct af te doden, zowel in muriene modellen als bij patiënten. Doxorubicine is hier een voorbeeld van (7;23;25). Tevens zijn er therapieën voorhanden die MDSC kunnen deactiveren of de ontwikkeling van myeloïde cellen tot MDSC kunnen inhiberen. Verschillende geneesmiddelen worden reeds onderzocht in klinische studies als potentiële MDSC inhibitoren bij de mens (36). Fosfodiësterase-5 inhibitoren zoals sildenafil reduceren de expressie van arginase-1 en iNOS door inhibitie van de degradatie van cyclisch guanosine monofosfaat (cGMP) (36;37). COX-2 inhibitoren, zoals celecoxib, kunnen de expressie van arginase-1 reduceren en zo het aantal MDSC doen dalen alsook hun activatie blokkeren (36;38;39). All-trans retinoïnezuur kan de maturatie van MDSC tot volledig gedifferentieerde cellen induceren (36;40). Gemcitabine en cisplatine induceren depletie van MDSC via een nog onvolledig opgehelderd mechanisme. Dit zijn slechts enkele voorbeelden van geneesmiddelen die inwerken op MDSC (36). 1.5. EFFECTEN VAN METRONOMISCHE CHEMOTHERAPIE Initieel schreef men de antitumorale activiteit van lagere doses chemotherapie enkel toe aan het feit dat zij angiogenese tegengaan. Uit onderzoek tijdens het laatste decennium blijkt dat dit slechts een deel van het verhaal is (9). 13 1.5.1 Remmen van de angiogenese Bij toepassen van specifieke toedieningschema’s van bepaalde chemotherapeutica zag men dat de groei van endotheliale cellen afnam en de tumorcellen als gevolg hiervan in apoptose gingen (41). Vasculaire endotheelcellen zijn gevoeliger aan lage concentraties chemotherapie dan de tumorcellen en de andere cellen van de patiënt (7). Dit antiangiogenetisch effect is specifiek voor de metronomische dosering omdat bij de traditionele MTD behandeling de tumorale vasculatuur herstelt tijdens de lange geneesmiddelvrije intervallen (42). 1.5.2. Immunomodulatie Dit is het minder gekende mechanisme dat bijdraagt tot de werking van metronomische chemotherapie: het beïnvloeden van het lichaamseigen immuunsysteem. De groei van de tumorcellen wordt geïnhibeerd door de directe tumoromgeving minder gunstig te maken (8). Metronomische chemotherapie heeft als doel de immuunrespons tegen een tumor te versterken door ondermeer het manipuleren van MDSC en Tregs. 1.5.2.1. Manipulatie van regulatorische T-cellen Het selectief manipuleren van Tregs is niet eenvoudig omdat ze meerdere gemeenschappelijke fenotypische merkers vertonen met geactiveerde T-cellen (20). Van verschillende cytostatica werd reeds aangetoond dat ze in staat zijn Tregs selectief te reduceren, zowel in preklinische als klinische studies (9). Het frequentst gebruikte chemotherapeuticum voor deze studies is cyclofosfamide. Een metronomische behandeling met dit geneesmiddel geeft aanleiding tot selectieve depletie van Tregs bij kankerpatiënten. Desondanks is er nog geen consensus omtrent een behandelingsschema, aangezien de “therapeutisch (Tregs elimineren)/toxische (effector Tcellen elimineren) marge” gering is (20). Een in vitro studie heeft reeds een deel van het moleculair mechanisme opgehelderd dat verklaart waarom cyclofosfamide is staat is selectief Tregs te elimineren, zonder de normale CD4+ T-cellen aan te tasten (43). 14 Tevens werd aangetoond met muriene diermodellen en in vitro experimenten dat metronomische doseringen van andere chemotherapeutica zoals temozolomide, vinblastine en paclitaxel invloed hebben op Tregs (44-47). De invloed van cyclofosfamide op Tregs werd ook bij honden aangetoond (48;49). 1.5.2.2. Manipulatie van MDSC Het effect van metronomische chemotherapie op MDSC wordt nog maar recentelijk onderzocht. Metronomische behandeling met paclitaxel, 5-fluorouracil of gemcitabine leidt tot veel belovende resultaten zowel in vitro als in vivo. Cyclofosfamide daarentegen levert tegenstrijdige resultaten op (7;25;36). 1.6. FLOW CYTOMETRIE Flow cytometrie wordt gebruikt om celsuspensies te analyseren. De analyse kan enerzijds gebeuren op basis van celgrootte en granulariteit en anderzijds via fluorescentie. Om fluorescentie te bekomen worden cellen vooraf gemerkt met antilichamen die gekoppeld zijn aan een fluorochroom. 1.6.1. Hydrodynamisch focusseren Dit is het proces waarbij het toestel tracht de willekeurig georiënteerde cellen van het staal te ordenen, zoals verduidelijkt wordt in Figuur 1.5 (50). Figuur 1.5: Flow cytometrie - hydrodynamisch focusseren De opgezogen celsuspensie komt terecht in de centrale kamer van de flow cytometer. Deze wordt omhuld door de sheath fluid, die sneller stroomt. Hierdoor worden de cellen op 1 rij gesleept en kunnen de cellen elk apart geanalyseerd worden door de laser (50) http://www.bdbiosciences.com/instruments/lsr/features/fluidics.jsp (21/04/2014) 15 De te analyseren celsuspensie wordt opgezogen door het toestel en komt terecht in de centrale kamer van het vloeistofsysteem. Deze centrale kamer wordt omhuld door een andere laag vloeistof die sneller stroomt, genaamd sheath fluid. Hierdoor ontstaat een drag effect op de plaats waar de centrale vloeistof samenkomt met de buitenlaag, waardoor de cellen op één rij gesleept worden. In ideale omstandigheden, t.t.z. optimale snelheid, zullen beide vloeistoffen niet mengen. Dankzij dit systeem ontstaat een geordende rij van cellen die elk apart geanalyseerd kunnen worden. 1.6.2. Lichtbron Na hydrodynamisch focusseren, wordt elke cel bestraald met licht met een specifieke golflengte. Hiervoor wordt bij de flow cytometer een laser gebruikt omdat lasers slechts één golflengte produceren. Dit is praktisch aangezien er geen extra filter nodig is om de juiste golflengte te selecteren. Afhankelijk van het feit of een cel gelabeld is met een fluorochroom of niet, zal het toestel lichtverstrooiing of fluorescentie meten. Deze worden apart in verschillende kanalen gedetecteerd. 1.6.3. Lichtverstrooiing Voor het meten van verstrooid licht worden twee kanalen gebruikt: Forward Scatter Channel (FSC) en Side Scatter Channel (SSC). Forward scatter is verstrooid licht gemeten in de voorwaartse richting, tot op een hoek van 20° van de as van de laserstraal (zie Figuur 1.6). Ze is een maat voor de grootte van een cel. Side scatter is verstrooid licht gemeten op 90° van de as van de laser en is een maat voor de granulariteit en complexiteit van een cel (51). Figuur 1.6: Flow cytometrie – lichtverstrooiing Side scatter channel (SSC) detecteert side scatter (een maat voor de granulariteit en complexiteit van een cel); Forward scatter channel (FSC) meet forward scatter (een maat voor de grootte van een cel) (51). 16 1.6.4. Fluorescentie Fluorescentie kunnen we meten met de flow cytometer indien we de cellen vooraf gelabeld hebben met een fluorochroom. Een fluorochroom is een molecule die bij bestraling met licht van een bepaalde golflengte energie absorbeert en zo in de geëxciteerde toestand terecht komt. Bij het terugkeren naar de grondtoestand zendt deze molecule licht uit met een grotere golflengte (52) http://static.abdserotec.com/Lit-pdfs/ (18/02/2014). Het fluorochroom zit gebonden op een antilichaam, waardoor bepaalde cellen specifiek getarget kunnen worden. Er zijn een hele reeks fluorochromen ter beschikking, waardoor we in verschillende kanalen signaal kunnen opvangen. Elk fluorochroom wordt getypeerd door zijn absorptiemaximum. Bij dit maximum zal de molecule meer licht absorberen en dus een sterker signaal genereren. Meestal wordt gekozen voor de golflengte die overeenkomt met het absorptiemaximum, om zo maximale emissie te bekomen. Dit bepaalt dus van welke laser gebruik gemaakt wordt (52) http://static.abdserotec.com/Lit-pdfs/ (18/02/2014). 17 2. OBJECTIEVEN MDSC zijn immature myeloïde cellen van het immuunsysteem die bij gezonde personen een rol spelen bij het voorkomen van auto-immuunziekten. Bij kankerpatiënten daarentegen zijn deze cellen ongewenst aangezien ze in staat zijn de antitumorale immuniteit om te buigen naar een protumoraal type. Daarom vormen deze cellen een interessante target voor kankertherapie. Er zijn aanwijzingen dat frequente lage dosissen chemotherapie zonder lange geneesmiddelvrije perioden, genaamd metronomische chemotherapie, deze cellen zouden kunnen elimineren of laten differentiëren naar mature cellen. Zo wenst men het immunosuppressief karakter van deze cellen tegen te gaan en de micro-omgeving van de tumor ongunstig te maken voor de tumor. Het doel van deze thesis is het vinden van een in vitro concentratie aan chemotherapeuticum die specifiek het aantal MDSC doet dalen, zonder de CD8+ T-cellen af te doden. We behandelen muriene splenocyten met lage dosissen van twee geselecteerde chemotherapeutica (doxorubicine en mitoxantrone), waarvan we een verdunningsreeks hebben opgesteld. Na de metronomische behandeling kleuren we de splenocyten met antilichamen specifiek voor MDSC en CD8+ cytotoxische T-cellen om via flow cytometrie het effect te bestuderen. Teneinde meer informatie te verzamelen ter optimalisatie van deze proef, worden vooraf twee bijkomende experimenten uitgevoerd. In de eerste proef willen we nagaan of het mogelijk is een in vitro systeem te ontwikkelen dat de in vivo tumorale micro-omgeving nabootst. Om dit te onderzoeken, coïncuberen we muriene splenocyten met supernatans afkomstig van B16F10 tumorcelculturen. Na de incubatie worden de splenocyten gemerkt met antilichamen specifiek voor MDSC (antiCD11b en anti-Gr-1) waarop fluorochromen gebonden zitten. Deze fluorochromen kunnen we analyseren met de flow cytometer om te bepalen of het aantal MDSC gewijzigd is. Indien het aantal MDSC toegenomen is door incubatie met tumorcelsupernatans, zullen we dit in vitro systeem toepassen in de eigenlijke (derde) proef. 18 Tijdens de tweede proef voeren we een viability gating experiment uit omdat we geen standaard viabiliteitskleuring kunnen includeren tijdens de derde proef. De ter beschikking gestelde flow cytometer beschikt over 3 detectoren* waarmee fluorescentie gemeten kan worden. Doxorubicine en mitoxantrone vertonen autofluorescentie en bezetten reeds één van deze detectoren. Voor identificatie van MDSC zijn twee merkers vereist, waardoor alle detectoren bezet worden en er dus geen merker voor celdood meer toegevoegd kan worden. Muriene splenocyten worden via drie verschillende methoden tot celdood geïnduceerd. Apoptose wordt uitgelokt door serumdeprivatie, terwijl necrose door een vries/dooi cyclus geïnduceerd wordt. Heat shock gedurende 30 minuten bij 43°C levert een mix van apoptose en necrose op. Deze tweede proef wordt opgesteld om tijdens een flow cytometrische analyse de fout door inclusie van dode cellen bij het plaatsen van een gating te kunnen inschatten en minimaliseren. *Eigenlijk beschikt de flow cytometer over 4 detectoren waarvan er 2 overlappen. Daarom worden deze als 3 functionele detectoren beschouwd. 19 3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1. PROEF 1 – INVLOED VAN CYTOKINES OP MDSC Het doel van dit experiment was nagaan of het mogelijk is om de in vivo situatie van een muriene tumor te kunnen nabootsen in vitro. M.a.w. we wilden nagaan of het mogelijk is de interactie tussen een tumor en het immuunsysteem in vitro te simuleren. Hiervoor werden B16F10 melanomacellen (een gift van professor Johan Grootten van de Universiteit Gent; afkomstig van een C57BL/6-muizenlijn) in cultuur gehouden om supernatans te kunnen oogsten. Van deze tumorcellen werd reeds aangetoond dat ze immunosuppressieve cytokines secreteren in cultuur (53). Vervolgens werden splenocyten, verkregen uit de milten van 3 gekruiste BALBc x C57BL/6 muizen, gesuspendeerd in het supernatans en 48u geïncubeerd. Op twee tijdspunten (na 24u en 48u incubatie) werd de celsuspensie gekleurd met cell staining antibodies specifiek voor MDSC. De gekleurde celsuspensies werden met de BD Accuri™ C6 Flow Cytometer (BD Biosciences, San Jose – VS) geanalyseerd. Er werd gecompenseerd voor spectrum overlap d.m.v. Fluorescence Minus One (FMO) tubes (54). 3.1.1. Splitsen van de B16F10 celcultuur De B16F10 tumorcellijn werd in cultuur gehouden in compleet medium, bestaande uit Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts – VS) waaraan 10% fetal calf serum (FCS) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts – VS) en 1% penicilline/streptomycine (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts – VS) werd toegevoegd. De B16F10 celcultuur werd vooraf gecontroleerd op contaminatie en confluentie met de lichtmicroscoop. Het medium werd verwijderd uit de cultuurfles en 5 minuten gecentrifugeerd bij 1300rpm. Het supernatans werd gecollecteerd en ingevroren bij -20°C (54). De celcultuur werd gespoeld met Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts – VS) en vervolgens 2 minuten geïncubeerd met trypsine (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts – VS) bij 37°C, 5% CO2 en 95% relatieve vochtigheid 20 (RV). Hierna werd een geschikte hoeveelheid cellen overgezet naar een nieuwe cultuurfles, aangevuld met vers compleet medium en geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 en 95% RV. 3.1.2. Maken van een miltcelsuspensie Drie gekruiste BALBc x C57BL/6 muizen werden verdoofd met isofluraan (Isoflo®, Abbott; verdeeld via Ecuphar, Oostkamp – België) en geëuthanaseerd d.m.v. cervicale dislocatie. Bij elke muis werd de milt geïsoleerd en in een petrischaal met DMEM (Thermo Fisher Scientific) geplaatst. Van elke milt werd een aparte celsuspensie gemaakt. Het maken van de celsuspensie werd uitgevoerd met de naaldperfusie methode. Bij deze methode wordt een naald omgebogen, een spuit gevuld met DMEM (Thermo Fisher Scientific) en oppervlakkig in de milt gestoken. Het medium wordt uitgespoten, waardoor de cellen loskomen en in het medium van de petrischaal terecht komen (55). Het medium en de splenocyten werden vervolgens overgebracht in een centrifugeerbuis doorheen een filter van 70µm (BD Falcon cell strainer; BD Biosciences, Erembodegem – België). Na 5 minuten centrifugeren en verwijderen van het supernatans, werden de rode bloedcellen (RBC) gelyseerd met 5ml RBC lysebuffer. De RBC lysebuffer werd aangemaakt door het samenvoegen van 8,26g ammoniumchloride (Merck, Darmstadt – Duitsland), 1g kaliumbicarbonaat (Sigma-Aldrich, Saint-Louis – VS) en 0,037g EDTA.2H2O (VWR, Radnor – VS) om vervolgens op te lossen en aan te lengen met gedestilleerd water tot een eindvolume van 1L. Deze RBC lysebuffer werd geautoclaveerd voor gebruik. Na 5 minuten inwerken van de RBC lysebuffer volgde opnieuw een centrifugatiestap om de pellet te kunnen wassen met 20ml PBS (Thermo Fisher Scientific). Na een laatste keer centrifugeren werd de pellet gesuspendeerd in 1ml PBS (Thermo Fisher Scientific) voor concentratiebepaling met de flow cytometer (BD Biosciences). 3.1.3. Incubatie van de splenocyten met B16F10 supernatans Na concentratiebepaling van de miltcelsuspensie werden de splenocyten gecentrifugeerd om vervolgens de pellet te hersuspenderen in vooraf gecollecteerd supernatans van B16F10 tumorcellen tot een concentratie van 2,5x106 cellen/ml. Het supernatans was afkomstig van meerdere celculturen en werd geoogst op verschillende tijdstippen. Daarom werd het 21 supernatans op voorhand ontdooid en gemengd om de cytokineconcentratie te poolen. Deze suspensies werden uitverdeeld over meerdere cultuurflessen en gedurende 24u en 48u in de incubator geplaatst bij 37°C, 5% CO2 en 95% RV (56). 3.1.4. Kleuring van MDSC Celkleuring werd op twee tijdspunten uitgevoerd: na 24u en na 48u incubatie. De miltcelconcentratie werd bepaald met de flow cytometer (BD Biosciences). De celsuspensie werd gecentrifugeerd om vervolgens de pellet in PBS (Thermo Fisher Scientific) te hersuspenderen om een concentratie van 5x106 cellen/ml te bekomen. Van de bekomen celsuspensie werd 100µl gekleurd met 1µl anti-muis CD11b antistof (eBioscience, San Diego – VS) en 0,15µl anti-muis Gr-1 antistof (eBioscience, San Diego – VS) voor detectie van MDSC. Bovendien werd hier 10µl 7-AAD (Southern Biotech, Alabama - VS) aan toegevoegd voor cell viability assay. Na toevoegen van de kleurstoffen werden de tubes 30 minuten in de koelkast geïncubeerd. 3.1.5. Analyse met de flow cytometer Na de kleuring werden de splenocyten gewassen met 2ml PBS (Thermo Fisher Scientific) en gecentrifugeerd om de pellet te hersuspenderen in 250µl PBS (Thermo Fisher Scientific) voor analyse met de flow cytometer (BD Biosciences). Levende cellen werden geselecteerd door te gaten op 7-AAD negatieve cellen. Kleurencompensatie en het bepalen van de grens voor positieve cellen gebeurde aan de hand van FMO-controles. Het percentage cellen positief voor zowel Gr-1 als CD11b werd bepaald. 3.1.6. Statistische analyse Aangezien de sample size zeer klein is, is het niet mogelijk de distributie van de data te beoordelen. Daarom werd gekozen voor de robuuste permutatietest, die volledig onafhankelijk is van de achterliggende distributie van de data. In het statistische softwareprogramma R werd de situatie onder H0 nagebootst, nl. dat de gegevens van de controlegroep en de supernatansgroep hetzelfde zijn, i.e. er is geen verschil tussen beide groepen. Alle bekomen waarden per tijdspunt werden in één vector opgeslagen en hieruit werden at random opnieuw twee groepen uit samengesteld. Onder de 22 H0 situatie is het nl. even waarschijnlijk dat een bepaalde waarde in één van de groepen terecht komt. Dit werd 10.000 keer herhaald en vervolgens werd berekend in hoeveel gevallen dit leidde tot een verschil tussen de groepen dat minstens even extreem was als geobserveerd in onze dataset. Dit is namelijk de definitie van een p-waarde: de kans op een verschil dat minstens zo extreem is als geobserveerd door zuiver toeval, i.e. onder de situatie van H0. 3.2. PROEF 2 – VIABILITY GATING SPLENOCYTEN Het is niet mogelijk een viabiliteitskleuring te includeren in de derde proef aangezien mitoxantrone en doxorubicine autofluorescentie vertonen, we twee merkers nodig hebben om MDSC te kleuren en de gebruikte flow cytometer beperkt is tot detectie van drie fluorescente merkers. We voeren dit viability gating experiment uit om na te gaan of we de fout door meting van dode cellen in de door ons geplaatste gating (met de door ons als levend beschouwde populatie) kunnen inschatten en minimaliseren. Muriene splenocyten werden via drie verschillende methoden geïnduceerd tot celdood. Elke methode geeft aanleiding tot een andere verhouding apoptose/necrose. Vervolgens werden de cellen met 7-AAD (Southern Biotech) gekleurd voor cell viability assay met de flow cytometer (BD Biosciences). 3.2.1. Miltcelsuspensie De miltcelsuspensie werd gemaakt zoals beschreven in proef 1 (§3.1.2.3), behalve dat slechts 1 BALBc x C57BL/6 muis geëuthanaseerd werd om de milt te bekomen, waarvan drie technische replica per methode van celdoodinductie gemaakt werden. De celsuspensie werd in eppendorftubes uitverdeeld. De rest van de celsuspensie werd op ijs geplaatst om later ook te analyseren met de flow cytometer (BD Biosciences) ter controle. 3.2.2. Inductie van celdood 3.2.2.1. Apoptose door serumdeprivatie Drie eppendorftubes werden gecentrifugeerd om vervolgens de pellet te hersuspenderen in DMEM (Thermo Fisher Scientific) zonder toegevoegd FCS (Thermo Fisher Scientific). Deze 23 suspensie werd uitgeplaat in een 6-well plaat en gedurende 6u geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 en 95% RV (57). 3.2.2.2. Necrose door een vries/dooi cyclus Drie eppendorftubes werden gecentrifugeerd om de pellet in 0,5ml PBS (Thermo Fisher Scientific) te suspenderen. Deze werden 10 minuten in een diepvriezer geplaatst bij -150°C. Hierna werden de eppendorftubes snel ontdooid in het warmwaterbad (58). 3.2.2.3. Heat shock Heat shock geeft aanleiding tot zowel necrose als apoptose. De verhouding tussen apoptose en necrose wordt bepaald door de gekozen condities. Enkele minuten bij een hoge temperatuur veroorzaakt voornamelijk necrose, terwijl een langere periode bij lagere temperatuur meer apoptose veroorzaakt. Daarom kozen we voor heat shock bij 43°C gedurende 30 minuten. Hierna werd de celsuspensie 6u geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 en 95% RV (57;59). 3.2.3. Celkleuring met 7-AAD Na inductie van celdood werden de splenocyten in een 15ml tube verzameld om te centrifugeren. De pellet werd in PBS (Thermo Fisher Scientific) gesuspendeerd om uit te verdelen over drie 15ml tubes en te kleuren met 7-AAD (Southern Biotech). Per 100µl celsuspensie werd 10µl 7-AAD (Southern Biotech) toegevoegd. De tubes werden 30 minuten in de koelkast geïncubeerd (60) https://www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols (11/04/2014). 3.2.4. Flow cytometrische analyse Na incubatie werden de splenocyten gespoeld met een overmaat PBS (Thermo Fisher Scientific), gecentrifugeerd en gehersuspendeerd in 200µl PBS (Thermo Fisher Scientific) voor analyse met de flow cytometer (BD Biosciences). Er werd een gating (R5) geplaatst op het FSC/SSC densiteitsplot (basisbeeld) om cellulair debris uit te sluiten. Om na te gaan waar de viability gating geplaatst moet worden om de levende cellen te omvatten, werd het FSC/SSC beeld van 7-AAD negatieve cellen bepaald. Het aandeel 7-AAD positieve en negatieve cellen werd bepaald d.m.v. een histogram. Dit wordt afgebeeld in Figuur 4.2 en Figuur 4.3 in §4.2.. 24 3.3. PROEF 3 – INVLOED VAN DE CHEMOTHERAPEUTICUM CONCENTRATIE OP MDSC Via deze proef willen we nagaan of het mogelijk is in vitro het aantal MDSC te doen dalen met metronomische chemotherapie, zonder CD8+ T-cellen aan te tasten. Om dit te onderzoeken werd een verdunningsreeks opgesteld van 2 chemotherapeutica: doxorubicine en mitoxantrone. Muriene splenocyten werden eerst 24u geïncubeerd met het supernatans van B16F10 tumorcellen om de micro-omgeving van een tumor in vitro te simuleren. Hierna werden de splenocyten 24u behandeld met de chemotherapie verdunningsreeks. Ten slotte werden de splenocyten gekleurd met cell staining antibodies specifiek voor MDSC en CD8+ T-cellen. 3.3.1. Opstellen van de chemotherapie verdunningsreeks De chemotherapie verdunningsreeks werd opgesteld a.d.h.v. een literatuurstudie en staat geïllustreerd in Tabel 3.1 (6;7;25;61-63). Tabel 3.1: Verdunningsreeks chemotherapie – eindconcentratie in 96-well plaat Verdunningb MTX.2HCla (µg/ml) DOX.HCla (µg/ml) Cytotoxisch 0,25 0,25 1/5 0,05 0,05 1/10 0,025 0,025 1/15 0,0167 0,0167 1/20 0,0125 0,0125 a MTX.2HCl = mitoxantrone.dihydrochloride; DOX.HCl = doxorubicine.hydrochloride (Beide van Sigma Aldrich, Saint Louis - VS) b De concentraties aangegeven in de tabel zijn de uiteindelijke concentraties in de 96-well plaat. De oplossingen die vooraf bereid werden, waren dubbel zo geconcentreerd. 3.3.1.1. Bereiden van stockoplossingen Uitgaande van 1mg doxorubicine.HCl (Sigma Aldrich) werd een stockoplossing gemaakt van 0,1 mg/ml door het poeder in oplossing te brengen in 10ml gedestilleerd water. Van mitroxantrone.2HCl (Sigma Aldrich) was reeds een stockoplossing van 0,25 mg/ml voorhanden. 25 3.3.1.2. Bereiden van werkoplossingen De werkoplossingen met de cytotoxische concentratie aan chemotherapeuticum werden verkregen door de stockoplossing meermaals te verdunnen met compleet medium tot de gewenste concentratie. De 1/5 tot 1/20 verdunningen werden verkregen door samenvoegen van de geschikte volumes van compleet medium en van de werkoplossing met de cytotoxische concentratie. Deze volumes zijn dezelfde voor de twee chemotherapeutica en staan opgesomd in Tabel 3.2. Tabel 3.2: Benodigde volumes voor de bereiding van de chemotherapie verdunningsreeks Volume werkoplossing met Gewenste verdunninga Volume compleet mediumb (ml) cytotoxische concentratie (ml) 1/5 2 8 1/10 1 9 1/15 1 14 1/20 0,5 9,5 a Ten opzichte van de werkoplossing met cytotoxische concentratie Compleet medium bestaat uit: Dulbecco’s modified eagle medium waaraan 10% FCS en 1% penicilline/streptomycine werd toegevoegd, allen afkomstig van Thermo Fisher Scientific. b 3.3.2. Poweranalyse Voor de start van de proef werd een poweranalyse uitgevoerd met G*Power software, versie 3.1.7. Het gemiddelde en de standaarddeviatie werden bepaald a.d.h.v een literatuurstudie. Correlatie werd gelegd op 0,5. Tevens wensen we een verschil van 20% tussen de controlegroep en de behandelde groep aan te tonen; dit vormt nl. een biologisch relevant verschil voor ons op basis van de gegevens in de literatuur (25;64). We kozen een tweezijdige t-test omdat we ervan uitgaan dat de data normaal verdeeld zijn en omdat we zeker willen zijn dat we zowel een daling als een stijging kunnen rapporteren. De α-waarde werd op 0,05 gelegd en de power op 0,80. Dit zijn standaardwaarden. Na het invoeren van deze parameters berekende het programma de grootte van de steekproef: nl. 4. Het protocol voor de uiteindelijke proef werd verder uitgewerkt met 4 muizen als steekproef. 26 3.3.3. Bereiding van de miltcelsuspensies De miltcelsuspensies werden vervaardigd zoals in proef 1 (§3.1.2.), behalve dat hiervoor 4 muizen geëuthanaseerd werden zoals bepaald tijdens de poweranalyse (§3.3.2.). 3.3.4. Coïncubatie met supernatans van tumorcellen De verkregen miltcelsuspensies werden gecentrifugeerd om de pellet te kunnen hersuspenderen in vooraf gecollecteerd supernatans afkomstig van B16F10 tumorcelculturen. Deze suspensies werden 24u geïncubeerd bij 37°C, 5% CO2 en 95% RV. 3.3.5. Behandeling met metronomische chemotherapie Na incubatie werden de celculturen verzameld, gecentrifugeerd, gehersuspendeerd in het supernatans van B16F10 tumorcellen tot een concentratie van 107 cellen/ml en uitverdeeld aan 50µl per well in een 96-well plaat. Aan de gewenste wells werd 50µl chemotherapie verdunning toegevoegd. Aan de controlewells werd 50µl compleet medium toegevoegd. Vervolgens werden de splenocyten 24u geïncubeerd met de lage dosissen chemotherapie. 3.3.6. Celkleuring De splenocyten werden na de metronomische behandeling gekleurd voor analyse van het aantal MDSC en CD8+ T-cellen met de flow cytometer. De hoeveelheid toegevoegde kleurstof per 100µl celsuspensie wordt weergegeven in Tabel 3.3. Tabel 3.3: Kleuring van splenocyten - Benodigde kleurstoffen Celtype Merker Hoeveelheid kleurstofa (µl) MDSC CD8+ T-cellen Firma CD11b 1 eBioscience Gr-1 0,15 eBioscience CD8 2 Biolegendb a Toegevoegd aan 100µl celsuspensie; bSan Diego - VS Na toevoegen van de kleurstoffen, werden de tubes 30 minuten in de koelkast geplaatst. Na kleuring werden de splenocyten met 2ml PBS (Thermo Fisher Scientific) gespoeld. De gekleurde splenocyten werden in eppendorftubes overgebracht voor analyse met de flow cytometer (BD Biosciences). 27 4. RESULTATEN 4.1. PROEF 1: INVLOED VAN TUMORALE CYTOKINES OP MDSC Bij kankerpatiënten wordt een sterke stijging van MDSC gezien in vergelijking met gezonde personen. Deze stijging in MDSC wordt veroorzaakt door cytokines afkomstig van de tumor. Om na te gaan of we deze situatie in vitro kunnen nabootsen, werd het supernatans afkomstig van B16F10 tumorcellen toegevoegd aan het cultuurmedium van splenocyten (i.e. immuuncellen geïsoleerd uit de milt). Als controle werden splenocyten van dezelfde muis geïncubeerd met cultuurmedium zonder supernatans van tumorcellen. In totaal werden splenocyten van 3 muizen verzameld. Na 24u en 48u incubatie werden de splenocyten, m.b.v. fluorescente antilichamen, gekleurd en werd via flow cytometrie het aantal MDSC bepaald. De resultaten worden weergegeven in Figuur 4.1 op de volgende bladzijde. De verkregen data werden statistisch geanalyseerd d.m.v. een permutatietest, zoals beschreven in §3.1.6.. Na een incubatietijd van 24u was het percentage MDSC ( bij de splenocyten blootgesteld aan tumorale cytokines (4,07±0,85) reeds licht gestegen in vergelijking met controle (2,17±0,59). Hier werd een p-waarde van 0,005 bekomen. Na 48u was het verschil tussen behandelde splenocyten (39,2±25,7) en controle (3,03±1,15) vertienvoudigd (p=0,004). De sterkte stijging van het aantal MDSC na incubatie van splenocyten met het supernatans van tumorcellen toont aan dat men het effect van de micro-omgeving van een tumor op immuuncellen in vitro kan simuleren. Dit maakt het mogelijk om in een relevant in vitro model de inhiberende werking van laag gedoseerde chemotherapeutica op MDSC te evalueren. 28 Figuur 4.1: Invloed van tumoraal supernatans op het aantal MDSC A: Het afgebeelde percentage is het gemiddelde afkomstig van de analyse van splenocyten verkregen uit 3 muizen; de foutvlaggen staan voor ±1SD; B: Individuele weergave per muis van de incubatie na 48u; de hoge stijging in muis 2 verklaart de relatief grote SD bij splenocyten geïncubeerd met tumoraal supernatans te zien in panel A. 29 4.2. PROEF 2: VIABILITY GATING Aangezien het door technische beperkingen niet mogelijk is om een viabiliteitskleuring in te sluiten in de derde proef, werd in dit experiment nagegaan of men via de flow cytometer de levende splenocyten kan onderscheiden van de dode op basis van de forward scatter en side scatter. Splenocyten werden op 3 manieren tot celdood geïnduceerd, waarvan gekend is dat ze een verschillend aandeel van necrose en apoptose veroorzaken, en vervolgens gekleurd met 7-AAD voor analyse met flow cytometrie. In Figuur 4.2 en Figuur 4.3 staan grafieken die de flow cytometrische metingen afbeelden. De linkse grafiek is het basisbeeld: forward scatter (FSC) en side scatter (SSC), waar een gating (R5) op geplaatst werd om cellulair debris uit te sluiten. Om na te gaan waar de viability gating geplaatst moet worden om de levende cellen te omvatten, werd het FSC/SSC beeld van 7-AAD negatieve cellen bepaald (middelste plot). Hier plaatsten we nogmaals een gating (P4) op. Om te evalueren of deze gate zinvol is om dode cellen te excluderen, werd binnen deze gate (P4) het percentage dode cellen (grafiek rechts) bepaald en vergeleken met het globale percentage (rechts onderaan) dode cellen in R5. Figuur 4.2: Flow cytometrie: Onbehandelde splenocyten Links: Gating R5 werd geplaatst om cellulair debris uit te sluiten Midden: De populatie die ons interesseert (P4) wordt geselecteerd uit de levende cellen van R5 Rechts: Percentage dode cellen in P4 Rechts onder: Globaal percentage celdood 30 Figuur 4.3: Flow cytometrie: Celdood geïnduceerd via 3 methoden Panel A: apoptose door serumdeprivatie; Panel B: necrose door een vries/dooi cyclus; Panel C: heat shock Links: Gating R5 werd geplaatst om cellulair debris uit te sluiten Midden: De populatie die ons interesseert (P4) wordt geselecteerd uit de levende cellen van R5 Rechts: Percentage dode cellen in P4 Rechts onder: Globaal percentage celdood 31 Voor dezelfde gate werden, afhankelijk van de methode van celdoodinductie, erg verschillende waarden bekomen voor de hoeveelheid dode cellen in de populatie P4 (gemiddelde±SD: serum deprivatie 2,87±0,40% vs. vries/dooi cyclus 19,5±2,52% vs. heat shock 55,9±1,35%). Hieruit concluderen we dat het niet mogelijk is een gating te plaatsen waarbij we met zekerheid kunnen rapporteren dat er geen dode cellen aanwezig zijn in die gating. Echter, door te gaten op P4 excluderen we bij de meeste condities wel het merendeel van de aanwezige dode cellen: 93% bij onbehandelde cellen, 90% bij serumdeprivatie en 88% bij een vries/dooi cyclus. Enkel bij heat shock bevindt het merendeel van de dode cellen zich in de geselecteerde gate, namelijk 69%. Op basis van deze resultaten wordt besloten om gate P4 te gebruiken tijdens verdere experimenten. Hoewel dit de fout, veroorzaakt door inclusie van dode cellen in de analyse, gevoelig verkleint, blijft deze zeker bestaan. Hier moet rekening mee gehouden worden in de interpretatie van de resultaten. 4.3. PROEF 3 – INVLOED VAN METRONOMISCHE CHEMOTHERAPIE OP MDSC Dit is de ultieme proef die werd uitgevoerd om na te gaan of we met metronomische chemotherapie het percentage MDSC aanwezig in een suspensie van muriene splenocyten kunnen reduceren. Hiervoor werd het in vitro model gebruikt, dat bekomen werd dankzij proef 1 (§4.1.), om de in vivo tumorale micro-omgeving te simuleren. Na 24u coïncubatie van de muriene splenocyten met B16F10 tumor supernatans, werd de celsuspensie (nog steeds in cultuurmedium met tumor supernatans) uitgeplaat in een 96well plaat en behandeld met een verdunningsreeks van 2 geselecteerde chemotherapeutica: doxorubicine en mitoxantrone. De plaat werd 24u geïncubeerd. Enkel een dosis die de immunosuppressieve MDSC reduceert en de CD8+ T-cellen onaangetast laat, is interessant. Daarom werden de splenocyten gekleurd voor detectie van MDSC en cytotoxische CD8+ T-cellen. Om de problematiek omtrent multiple testing zoveel mogelijk te beperken, voeren we de statistische analyse enkel uit op de ratio MDSC/CD8+ Tcellen in plaats van op zowel MDSC als CD8+ T-cellen. Zo verminderen we de kans op een vals positief resultaat. Aangezien er heel veel variatie aanwezig was tussen muizen 32 onderling, maar de correlatie van de metingen binnen elke muis >90% was, hebben we met het verschil tussen controle en behandelde splenocyten gewerkt i.p.v. de absolute percentages. Dit gemiddeld verschil is veel informatiever dan het gemiddelde van de absolute data. Concreet betekent dit dat: Gemiddelde verschil = 0  geen verschil tussen de controle- en behandelde groep; Gemiddelde verschil < 0  stijging van de verhouding MDSC/CD8+ T-cellen; Gemiddelde verschil > 0  daling van de ratio MDSC/CD8+ T-cellen. Vooraleer we een statistische test kozen, werden de data gecontroleerd op outliers via boxplots en op normale verdeling via een histogram van residuals. 4.3.1. Het effect van doxorubicine op de ratio MDSC/CD8+ T-cellen De data van splenocyten behandeld met doxorubicine werden eerst geanalyseerd. Bij deze data werden geen outliers gedetecteerd en de residuals waren normaal verdeeld. Daarom voerden we een parametrische gepaarde t-test uit op de ratio’s MDSC/CD8+ Tcellen bekomen door behandeling met doxorubicine. De uitkomst van de gepaarde t-test staat afgebeeld in Tabel 4.1. Tabel 4.1: Resultaten gepaarde t-test - Doxorubicine Verdunning Gemiddelde verschil ( ) (%) SD (%) p-waarde 1/5 -0,70 0,51 0,14 1/10 -0,27 1,05 0,70 1/15 0,73 0,56 0,15 1/20 0,64 0,11 0,009 = 0 : Geen verschil tussen de controle- en behandelde groep < 0 : De ratio MDSC/CD8+ T-cellen is gestegen t.o.v. de controlegroep > 0 : De ratio MDSC/CD8+ T-cellen is gedaald t.o.v. de controlegroep is het gemiddelde verschil tussen de controle- en behandelde groep (%); n = 3 33 Uit deze tabel kunnen we afleiden dat de ratio MDSC/CD8+ T-cellen enkel bij splenocyten behandeld met de 1/20 verdunning doxorubicine een statistisch significante daling bevonden werd. Bij de 1/5 en 1/10 verdunningen zien we duidelijk dat er geen daling is van de ratio. De 1/15 verdunning vormt een twijfelgeval omdat het gemiddeld verschil vrij groot is en het wel in de juiste richting gaat. Dit bereikt echter geen statistische significantie. In Tabel 4.2 en Figuur 4.4 worden de resultaten voor MDSC en CD8+ T-cellen apart voorgesteld om te kunnen illustreren dat een verandering van de MDSC/CD8+ T-cellen ratio voornamelijk veroorzaakt wordt door een verandering in het aandeel MDSC. Tabel 4.2: MDSC na behandeling met doxorubicine Behandeling MDSC (%) CD8+ T-cellen (%) Dox 1/5 -2,70 ± 2,62 0,30 ± 1,05 Dox 1/10 0,65 ± 1,70 0,40 ± 1,37 Dox 1/15 3,30 ± 2,06 -0,20 ± 1,00 Dox 1/20 4,67 ± 1,50 -0,27 ± 0,60 De resultaten worden weergegeven als ± SD (%); is het gemiddelde verschil tussen de controle- en behandelde groep (%); n = 3. 34 Figuur 4.4: Resultaten na doxorubicine behandeling – aparte data Panel A: Gemiddelde verschil tussen controle en behandelde MDSC, Panel B: Gemiddeld verschil tussen controle en behandelde CD8+ T-cellen per behandeling; Foutvlaggen stellen ± 1SD voor. Uit deze grafieken kunnen we afleiden dat een verandering van de MDSC/CD8+ T-cellen ratio voornamelijk afkomstig is van het aandeel van de MDSC. Het percentage CD8+ T-cellen blijft nagenoeg constant bij behandeling met doxorubicine. 35 4.3.2. Het effect van mitoxantrone op de ratio MDSC/CD8+ T-cellen De data van splenocyten behandeld met mitoxantrone werden eerst statistisch geanalyseerd. Er werden geen outliers waargenomen op boxplots, maar de data waren niet normaal verdeeld na het uitzetten van de residuals in een histogram. Daarom werden de data getransformeerd met een factor 10-0,5. Na deze transformatie was de verdeling acceptabel om als normaal verdeeld te beschouwen en werd een gepaarde t-test uitgevoerd. Aan de resultaten van deze test konden we zien dat onze verdunningsreeks mitoxantrone geen effect heeft op de ratio MDSC/CD8+ T-cellen, zowel omwille van grote p-waarden als zeer kleine gemiddelde verschillen. Er werd geen enkel statistisch significant resultaat of een trend daartoe bevonden. In Figuur 4.5 (zie volgende bladzijde) worden histogrammen afgebeeld waarin de data van MDSC en CD8+ T-cellen apart beschouwd worden. We nemen waar dat zowel de percentages MDSC als de percentages CD8+ T-cellen vrijwel constant blijven. 36 Figuur 4.5: Resultaten na mitoxantrone behandeling – aparte data Panel A: Gemiddelde verschil tussen controle en behandelde MDSC, Panel B: Gemiddeld verschil tussen controle en behandelde CD8+ T-cellen per behandeling; Foutvlaggen stellen ± 1SD voor. Zowel het percentage MDSC als het percentage CD8+ T-cellen blijft nagenoeg constant bij behandeling met mitoxantrone. 37 5. DISCUSSIE We zijn erin geslaagd een in vitro systeem te ontwikkelen om de in vivo tumorale microomgeving te simuleren met behulp van splenocyten van gezonde muizen en supernatans van een tumorcellijn. Dit supernatans was afkomstig van B16F10 melanoma tumorcellen, waarvan geweten is dat ze immunosuppressieve cytokines zoals IL-10, TGF-β en VEGF secreteren. Tevens werd reeds aangetoond dat dit supernatans muriene splenocyten kan inhiberen. Wij hebben met onze proef voor het eerst aangetoond dat deze inhibitie van splenocyten (gedeeltelijk) gemedieerd wordt door een sterke verhoging van het aantal MDSC (53). Dankzij dit eerste experiment, waarin we aantoonden dat incubatie van splenocyten met het supernatans van tumorcellen de populatie van MDSC sterk verhoogt, konden we het effect van metronomische chemotherapie op het aantal MDSC in een relevant in vitro model bestuderen dat de reële in vivo situatie goed nabootst. Gezonde muizen vertonen slechts 2 tot 4% MDSC in de milt, terwijl MDSC in verscheidene muriene tumormodellen 20-40% van de splenocytenpopulatie uitmaken. De percentages MDSC die bekomen werden dankzij het door ons ontwikkelde in vitro model liggen in dezelfde grootteorde als de in vivo muriene tumormodellen (27;65). Tevens is dit model ethisch meer verantwoord dan splenocyten te isoleren van muizen waarbij een tumor geïnoculeerd werd. Tumorinoculatie louter voor het verkrijgen van splenocyten onderhevig aan tumorale invloeden wordt veelvuldig toegepast. Dankzij dit in vitro systeem kan dit vermeden worden, wat een belangrijke toepassing is van verfijning. Verfijning is een onderdeel van het VVV-principe in het proefdieronderzoek: Verfijning, Vervanging en Vermindering. Euthanasie en splenocyten verzamelen van gezonde muizen is een handeling onder terminale anesthesie en is dus geen dierproef, terwijl een tumor laten ontwikkelen minstens een P1 proef is (66). Dit in vitro model is bovendien snel, goedkoop en eenvoudig. Het supernatans van tumorcellen kan in grote hoeveelheden geproduceerd worden door tumorcellen in cultuur te houden en kan ingevroren worden tot gebruik. Reeds na 24u incubatie van splenocyten met dit supernatans is er een verdubbeling van het aantal MDSC, dat zich doorzet tot een tienvoud binnen 48u. 38 Voor de evaluatie van het effect van metronomische chemotherapie op het aantal MDSC in de muriene milt werden doxorubicine en mitoxantrone geselecteerd. Doxorubicine werd gekozen omdat hiervan reeds één artikel gevonden werd in de literatuur waarin het effect ervan op MDSC bestudeerd en interessant bevonden werd. We verkozen een verdunningsreeks van beide chemotherapeutica op te stellen om na te gaan wat de optimale dosering is. Bovendien verkleint een lagere dosering de kans op cardiotoxiciteit dat een gevreesde bijwerking is van anthracyclines (25;67). Mitoxantrone werd geselecteerd omdat het tot dezelfde klasse behoort als doxorubicine, waardoor de kans op een gelijkaardig effect op MDSC plausibel lijkt. Bovendien is mitoxantrone interessant omdat het minder cardiotoxiciteit vertoont dan doxorubicine. Momenteel zijn enkel formulaties voor parenterale toediening op de markt van deze twee chemotherapeutica, maar er wordt onderzoek gedaan naar formulaties voor orale administratie. We verwachten dat in de toekomst deze chemotherapeutica beschikbaar zullen zijn voor orale toediening en dus in aanmerking kunnen komen voor metronomische behandeling van patiënten (67-70). De evaluatie van metronomische chemotherapie met onze proefopzet heeft uitgewezen dat een 1/20 verdunning (0,0125µg/ml) van de cytotoxische dosis van doxorubicine de ratio MDSC/CD8+ T-cellen significant doet dalen in vitro. De 1/15 verdunning (0,0167µg/ml) van dit chemotherapeuticum vormt een twijfelgeval: we hebben hiervoor geen statistische significantie kunnen aantonen, ook al nemen we wel een groot gemiddeld verschil waar tussen controle en behandelde splenocyten. (NB: de concentraties vermeld tussen haakjes zijn de exacte concentraties doxorubicine.HCl die tijdens de behandeling aanwezig waren op de cellen. De werkoplossingen werden dubbel zo geconcentreerd aangemaakt om te compenseren voor de 1/2 verdunning veroorzaakt door het samenvoegen van 50µl celsuspensie en 50µl chemotherapeuticum.) Dit kan mogelijks verklaard worden door een tekortkoming aan power van deze proef. Tijdens de poweranalyse hebben we bepaald dat vier muizen nodig waren om voldoende power te bekomen. Door onvoorziene omstandigheden ging er iets mis met de staalverwerking, waardoor data van slechts 3 muizen bekomen werden. Wegens tijdsgebrek kon dit niet herhaald worden. 39 Mitoxantrone en hogere dosissen doxorubicine (1/5 en 1/10 verdunning) daarentegen leverden geen effect op. Deze data gaven aanleiding tot hoge p-waarden en bovendien slechts zeer kleine gemiddelde verschillen tussen controle en behandelde splenocyten. Hier dienen wel enkele kanttekeningen bij gemaakt te worden. Ten eerste is het theoretisch gezien mogelijk dat we een vals negatief resultaat rapporteren door inclusie van dode cellen in de geselecteerde gating. Na de uitvoering van het viability gating experiment hebben we gezien dat het niet mogelijk is met zekerheid dode cellen te excluderen door het plaatsen van een gating. We verwachten niet dat de kans groot is dat dit een klinisch relevant verschil gemaskeerd heeft aangezien bij normale splenocyten, serum gedepriveerde splenocyten en vries/dooi behandelde splenocyten het merendeel van de dode cellen buiten de gating aanwezig waren. Ten tweede hebben we enkel onderzoek gedaan naar het cytotoxisch effect van de chemotherapeutica, maar niet naar functionele veranderingen van de MDSC. Zoals beschreven in de inleiding (§1.4.2.6.) zijn er meerdere mogelijkheden om MDSC te manipuleren, waarvan het aantal reduceren er slechts één is. Ook het deactiveren of stimuleren tot differentiëren zijn mogelijkheden (in het laatste geval zal het aantal ook dalen). Wij hebben gekozen voor deze proefopzet omdat verhoogde of verlaagde gevoeligheid voor chemotherapeutica het meest waarschijnlijke mechanisme is van immunomodulatie, in tegenstelling tot bijvoorbeeld biologische of moleculaire geneesmiddelen. Bovendien kunnen we met deze proefopzet reductie zowel door celdood als door maturatie van MDSC detecteren. Met enkele zeldzame uitzonderingen, verliezen MDSC normaal gezien hun typische merkers tijdens het maturatieproces (71). Zoals besproken in §1.4.2.6. werd doxorubicine reeds toegepast in muriene diermodellen, waarbij één studie heeft aangetoond dat doxorubicine het aantal MDSC doet dalen in de milt. De muizen werden twee keer met 2,5mg/kg of 5mg/kg behandeld, 17 dagen na tumorinoculatie. Deze dosissen komen overeen met respectievelijk 1/4 en 1/2 van de MTD dosering (25). 40 Het verschil in grootteorde (verhouding tot de MTD dosering) tussen de gebruikte doseringen voor het in vitro experimentele werk (1/15 – 1/20) voor deze thesis en de in vivo doseringen (1/2 – 1/4) waarmee een daling in MDSC gezien werd, heeft verscheidene mogelijke verklaringen. Enerzijds wordt het chemotherapeuticum bij in vitro proeven direct aan de cellen toegevoegd terwijl bij in vivo studies de toedieningsroute, metabolisatiekarakteristieken en weefseldistributie een sterke invloed hebben op de hoeveelheid chemotherapie die uiteindelijk bij de cellen terecht komt. Anderzijds veroorzaakten de hoge in vivo doseringen ook afname van de tumorgrootte. Het is waarschijnlijk dat hierbij de cytokineproductie afneemt. Bovendien geeft doxorubicine aanleiding tot immunogene celdood, voornamelijk door het induceren van een antitumorale CD8+ cytotoxische T-cel respons, waardoor het cytokinepatroon gewijzigd kan worden (72). De daling van het aantal MDSC kan in deze in vivo studie dus een gevolg zijn van een combinatie van afname/wijziging van de invloed van cytokines en een rechtstreeks effect van het chemotherapeuticum op de MDSC. Tevens werd in dit artikel een mogelijks mechanisme besproken dat verklaart waarom MDSC gevoeliger zouden zijn aan doxorubicine dan andere cellen van het immuunsysteem. De auteurs suggereren dat productie van ROS na behandeling met doxorubicine mogelijks een rol speelt in het selectief elimineren van MDSC. Bovendien was de functionaliteit van de resterende MDSC na behandeling gewijzigd: ze vertoonden verminderde immunosuppressieve activiteit. Ditzelfde mechanisme is waarschijnlijk niet van toepassing op mitoxantrone (25;73). De relevantie van het aantonen van depletie van MDSC door metronomische chemotherapie ligt enerzijds in het mede verklaren van het klinisch effect van metronomische chemotherapie op zichzelf, maar is voornamelijk interessant in combinatie met immunotherapie anderzijds. Zoals beschreven in de inleiding is de immunobiologie van tumoren zeer complex en kan immunotherapie enkel slagen indien de verschillende aspecten van het immuunsysteem getarget worden. De immunosuppressieve MDSC zijn hierbij zeer belangrijk. Depletie van MDSC kan een interessante aanvullende strategie 41 vormen in combinatie met immunotherapie. Zo werd reeds beschreven in meerdere studies dat combinatie van MDSC depletie en immunotherapie aanleiding kan geven tot een betere antitumorale immuunrespons en langere overleving bij muizen (25;39;74). Met onze proefopzet hebben we slechts een screening uitgevoerd hebben naar potentieel interessante concentraties van mitoxantrone en/of doxorubicine voor het elimineren van MDSC. Daarom is het nodig om het effect van de interessant bevonden concentraties (doxorubicine 1/20 en 1/15) te bevestigen met extra in vitro proeven. Bovendien kan verder onderzoek naar nog lagere concentraties van doxorubicine nuttig zijn, vermits we een effect zagen bij de laagste concentratie. Vervolgens zijn functionele testen aangewezen om eventuele andere effecten dan cytotoxiciteit van de chemotherapeutica te bestuderen. Zo kan analyse van arginase-1 en iNOS meer informatie opleveren over het immunosuppressief karakter van de gedetecteerde MDSC (71). Na definitieve identificatie van de optimale dosering in vitro kan overgegaan worden naar onderzoek d.m.v. een diermodel. Hierbij kan de hond een waardevol alternatief vormen voor het alomtegenwoordig murien diermodel. Er zijn steeds meer wetenschappelijke aanwijzingen dat de hond een beter experimenteel model vormt dan de muis voor het bestuderen van humane tumoren. Tumoren bij honden komen immers biologisch, klinisch en epidemiologisch veel sterker overeen met humane tumoren dan geïnoculeerde tumoren bij muizen (75). 42 6. CONCLUSIES We hebben aangetoond dat het mogelijk is d.m.v. een snel, eenvoudig en goedkoop in vitro model de interactie tussen de tumor en het immuunsysteem te simuleren. Na incubatie van muriene splenocyten met supernatans van B16F10 tumorcellen stelden we vast dat het percentage MDSC significant gestegen was t.o.v. splenocyten die in cultuurmedium zonder tumor supernatans geïncubeerd werden. De percentages MDSC bekomen met het door ons ontwikkeld experimenteel model liggen in een vergelijkbare range als het in vivo percentage MDSC aanwezig in de milt van muizen met een tumor, d. i. 20-40%. Dit vormt een relevanter model voor onze proefopzet dan splenocyten van gezonde muizen en is ethisch meer verantwoord dan splenocyten te gebruiken van muizen na tumorinoculatie. Voor de evaluatie van het effect van verschillende concentraties doxorubicine en mitoxantrone hebben we gekeken naar de verhouding MDSC op CD8+ T-cellen, aangezien enkel een daling van MDSC zonder aantasting van de CD8+ T-cellen gewenst is. De behandeling met doxorubicine aan een 1/20 verdunning t.o.v. de cytotoxische dosis resulteerde in een significante daling van de ratio MDSC/CD8+ T-cellen. Van de 1/15 verdunning waren we niet in staat een significante daling in de ratio MDSC/CD8+ T-cellen aan te tonen, hoewel er duidelijk wel een trend naartoe aanwezig is. Dit kan mogelijks verklaard worden door een tekort aan power van de proef door het niet naleven van de steekproefgrootte berekend tijdens de poweranalyse. Dit was niet mogelijk door problemen met staalverwerking en kon niet meer tijdig herhaald worden. De 1/5 en 1/10 verdunning doxorubicine en de volledige reeks mitoxantrone verdunningen gaven geen effect op de ratio MDSC/CD8+ T-cellen. De kans op een klinisch relevant vals negatief resultaat, door afwezigheid van een viabiliteitskleuring en dus inclusie van dode cellen, is zeer klein. We hebben namelijk aangetoond dat, na verschillende manieren van celdoodinductie, de overgrote meerderheid dode cellen zich buiten onze gekozen gate bevonden. Dit wil zeggen dat we ook het merendeel van het effect van de chemotherapeutica hebben waargenomen. Deze proef was opgezet als een eerste screening van verschillende verdunningen van zowel doxorubicine als mitoxantrone. Multiple hypothese testing is hierbij niet te 43 verwaarlozen en het effect van de 1/20 verdunning van doxorubicine moet nog definitief bevestigd worden in een nieuwe proef. Gezien de twijfelachtige resultaten bij de 1/15 verdunning van doxorubicine is ook deze interessant voor verdere evaluatie. Gezien de laagste dosis het meest effect vertoonde, is het eveneens interessant om nog lagere dosissen doxorubicine te evalueren. Deze studie zou verder nog gecomplementeerd kunnen worden door functionele testen, zodat niet alleen het aantal maar ook de functionaliteit van MDSC geëvalueerd kan worden. Wanneer de meest optimale dosis vaststaat, kan omgerekend worden met welke in vivo dosering dit overeenkomt en kan de definitieve evaluatie in tumor dragende dieren plaatsvinden. Hierbij zouden studies bij de hond een waardevol alternatief voor muizenproeven kunnen vormen. Bovenop de vele voordelen die de hond biedt qua fysiologische, epidemiologische en klinische overeenkomsten met de mens is het ethisch aspect ook een belangrijke factor. Deze dieren vertonen spontane tumorontwikkeling waardoor tumorinoculatie, dat immers een belasting vormt voor het dier, overbodig is. 44 7. LITERATUURLIJST (1) Allen-Mersch, T.; Hortobagyi, G.; Khayat, D.; Picksley S. M.; Sugarbaker, P.; Taguchi, T.; et al. Basics of Oncology. New York: Springer (2009). (2) Stephens, F. O.; Aigner, K. R.; et al. Induction Chemotherapy. New York: Springer (2011). (3) Park, J. Y.; Jang, M. J.; Chung, Y. H.; Kim, K. Y.; Kim, S. S.; Lee, W. B.; et al. Doxorubicin enhances CD4(+) T-cell immune responses by inducing expression of CD40 ligand and 4-1BB. Int. Immunopharmacol. Dec, 9(13-14):1530-9 (2009). (4) Tyleckova, J.; Hrabakova, R.; Mairychova, K.; Halada, P.; Radova, L.; Dzubak, P.; et al. Cancer cell response to anthracyclines effects: mysteries of the hidden proteins associated with these drugs. Int. J. Mol. Sci. 13(12):15536-64 (2012). (5) Lien, K.; Georgsdottir, S.; Sivanathan, L.; Chan, K.; Emmenegger, U. Low-dose metronomic chemotherapy: a systematic literature analysis. Eur. J. Cancer. Nov, 49(16):3387-95 (2013). (6) Kaneno, R.; Shurin, G. V.; Tourkova, I. L.; Shurin, M. R. Chemomodulation of human dendritic cell function by antineoplastic agents in low noncytotoxic concentrations. J. Transl. Med. 7:58 (2009). (7) Landreneau, J. P.; Shurin, M. R.; Agassandian, M. V.; Keskinov, A. A.; Ma, Y.; Shurin, G. V. Immunological Mechanisms of Low and Ultra-Low Dose Cancer Chemotherapy. Cancer Microenviron. Nov 29 (2013). (8) Loven, D.; Hasnis, E.; Bertolini, F.; Shaked, Y. Low-dose metronomic chemotherapy: from past experience to new paradigms in the treatment of cancer. Drug Discov. Today. Feb 18(3-4):193-201 (2013). (9) Romiti, A.; Cox, M. C.; Sarcina, I.; Di, R. R.; D'Antonio, C.; Barucca, V.; et al. Metronomic chemotherapy for cancer treatment: a decade of clinical studies. Cancer Chemother. Pharmacol. Jul 72(1):13-33 (2013). (10) Campoli, M.; Ferrone, S. Cancer Drug Discovery and Development: Immunotherapy of Cancer. New Jersey: Humana Press Inc. (2006). (11) Emens, L. A.; et al. General Principles of Tumor Immunotherapy. New York: Springer (2007). 45 (12) Janeway, C. A. Jr.; Travers, P.; Walport, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th ed. New York: Garland Science (2001). (13) Ames, E.; Murphy, W. J. Advantages and clinical applications of natural killer cells in cancer immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother. Jan 63(1):21-8 (2014). (14) Shuptrine, C. W.; Surana, R.; Weiner, L. M. Monoclonal antibodies for the treatment of cancer. Semin. Cancer Biol. Feb 22(1):3-13 (2012). (15) Zhang, Y.; Schreiber, T. H.; Rosenblatt, J. D. The Role of B Cells in Shaping the Antitumor Immune Response. In: Advances in Tumor Immunology and Immunotherapy. Editors: Rosenblatt, J. D.; Podack, E. R.; Barber, G. N.; Ochoa, A. New York: Springer; p. 19-36 (2014). (16) Carter, D.; Lieber, A. Protein engineering to target complement evasion in cancer. FEBS Lett Jan 21;588(2):334-40 (2014). (17) Umansky, V.; Sevko, A. Tumor microenvironment and myeloid-derived suppressor cells. Cancer Microenviron. Aug 6(2):169-77 (2013). (18) Ostrand-Rosenberg, S. Immune surveillance: a balance between protumor and antitumor immunity. Curr. Opin. Genet. Dev. Feb 18(1):11-8 (2008). (19) Ghiringhelli, F.; Larmonier, N.; Schmitt, E.; Parcellier, A.; Cathelin, D.; Garrido, C.; et al. CD4+CD25+ regulatory T cells suppress tumor immunity but are sensitive to cyclophosphamide which allows immunotherapy of established tumors to be curative. Eur. J. Immunol. Feb 34(2):336-44 (2004). (20) Pere, H.; Tanchot, C.; Bayry, J.; Terme, M.; Taieb, J.; Badoual, C.; et al. Comprehensive analysis of current approaches to inhibit regulatory T cells in cancer. Oncoimmunology May 1;1(3):326-33 (2012). (21) Casares, N.; Rudilla, F.; Arribillaga, L.; Llopiz, D.; Riezu-Boj, J. I.; Lozano, T.; et al. A peptide inhibitor of FOXP3 impairs regulatory T cell activity and improves vaccine efficacy in mice. J. Immunol. Nov 1;185(9):5150-9 (2010). (22) Bayry, J.; Tchilian, E. Z.; Davies, M. N.; Forbes, E. K.; Draper, S. J.; Kaveri, S. V.; et al. In silico identified CCR4 antagonists target regulatory T cells and exert adjuvant activity in vaccination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Jul 22;105(29):10221-6 (2008). (23) Greten, T. F.; Manns, M. P.; Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int. Immunopharmacol. Jul;11(7):802-7 (2011). 46 (24) Sevko, A.; Umansky, V. Myeloid-derived suppressor cells interact with tumors in terms of myelopoiesis, tumorigenesis and immunosuppression: thick as thieves. J. Cancer 4(1):3-11 (2013). (25) Alizadeh, D.; Trad, M.; Hanke, N. T.; Larmonier, C. B.; Janikashvili, N.; Bonnotte, B.; et al. Doxorubicin eliminates myeloid-derived suppressor cells and enhances the efficacy of adoptive T-cell transfer in breast cancer. Cancer Res. Jan 1;74(1):104-18 (2014). (26) Ostrand-Rosenberg, S.; Sinha, P. Myeloid-derived suppressor cells: linking inflammation and cancer. J. Immunol. Apr 15;182(8):4499-506 (2009). (27) Gabrilovich, D. I.; Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. Mar 9(3):162-74 (2009). (28) Khaled, Y. S.; Ammori, B. J.; Elkord, E. Myeloid-derived suppressor cells in cancer: recent progress and prospects. Immunol. Cell Biol. Sep 91(8):493-502 (2013). (29) Li, H.; Han, Y.; Guo, Q.; Zhang, M.; Cao, X. Cancer-expanded myeloid-derived suppressor cells induce anergy of NK cells through membrane-bound TGF-beta 1. J. Immunol. Jan 1;182(1):240-9 (2009). (30) Baniyash, M. Chronic inflammation, immunosuppression and cancer: new insights and outlook. Semin. Cancer Biol. Feb 16(1):80-8 (2006). (31) Cripps, J. G.; Gorham, J. D. MDSC in autoimmunity. Int. Immunopharmacol. Jul 11(7):789-93 (2011). (32) Filipazzi, P.; Huber, V.; Rivoltini, L. Phenotype, function and clinical implications of myeloid-derived suppressor cells in cancer patients. Cancer Immunol. Immunother. Feb 61(2):255-63 (2012). (33) Gabrilovich, D. I.; Ostrand-Rosenberg, S.; Bronte, V. Coordinated regulation of myeloid cells by tumours. Nat. Rev. Immunol. Apr 12(4):253-68 (2012). (34) Montero, A. J.; Diaz-Montero, C. M.; Kyriakopoulos, C. E.; Bronte, V.; Mandruzzato, S. Myeloid-derived suppressor cells in cancer patients: a clinical perspective. J. Immunother. Feb 35(2):107-15 (2012). (35) Kao, J.; Ko, E. C.; Eisenstein, S.; Sikora, A. G.; Fu, S.; Chen, S. H. Targeting immune suppressing myeloid-derived suppressor cells in oncology. Crit. Rev. Oncol. Hematol. Jan 77(1):12-9 (2011). 47 (36) Wesolowski, R.; Markowitz, J.; Carson, W. Myeloid derived suppressor cells - a new therapeutic target in the treatment of cancer. Journal for Immunotherapy of Cancer (2013). (37) Serafini, P.; Meckel, K.; Kelso, M.; Noonan, K.; Califano, J.; Koch, W.; et al. Phosphodiesterase-5 inhibition augments endogenous antitumor immunity by reducing myeloid-derived suppressor cell function. J. Exp. Med. Nov 27;203(12):2691-702 (2006). (38) Talmadge, J. E.; Hood, K. C.; Zobel, L. C.; Shafer, L. R.; Coles, M.; Toth, B. Chemoprevention by cyclooxygenase-2 inhibition reduces immature myeloid suppressor cell expansion. Int. Immunopharmacol. Feb 7(2):140-51 (2007). (39) Veltman, J. D.; Lambers, M. E.; van Nimwegen, M.; Hendriks, R. W.; Hoogsteden, H. C.; Aerts, J. G.; et al. COX-2 inhibition improves immunotherapy and is associated with decreased numbers of myeloid-derived suppressor cells in mesothelioma. Celecoxib influences MDSC function. BMC Cancer 10:464 (2010). (40) Hengesbach, L. M.; Hoag, K. A. Physiological concentrations of retinoic acid favor myeloid dendritic cell development over granulocyte development in cultures of bone marrow cells from mice. J. Nutr. Oct 134(10):2653-9 (2004). (41) Browder, T.; Butterfield, C. E.; Kraling, B. M.; Shi, B.; Marshall, B.; O'Reilly, M. S.; et al. Antiangiogenic scheduling of chemotherapy improves efficacy against experimental drug-resistant cancer. Cancer Res. Apr 1;60(7):1878-86 (2000). (42) Bocci, G.; Nicolaou, K. C.; Kerbel, R. S. Protracted low-dose effects on human endothelial cell proliferation and survival in vitro reveal a selective antiangiogenic window for various chemotherapeutic drugs. Cancer Res. Dec 1;62(23):6938-43 (2002). (43) Zhao, J.; Cao, Y.; Lei, Z.; Yang, Z.; Zhang, B.; Huang, B. Selective depletion of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells by low-dose cyclophosphamide is explained by reduced intracellular ATP levels. Cancer Res. Jun 15;70(12):4850-8 (2010). (44) Javeed, A.; Ashraf, M.; Riaz, A.; Ghafoor, A.; Afzal, S.; Mukhtar, M. M. Paclitaxel and immune system. Eur. J. Pharm. Sci. Nov 5;38(4):283-90 (2009). (45) Tanaka, H.; Matsushima, H.; Nishibu, A.; Clausen, B. E.; Takashima, A. Dual therapeutic efficacy of vinblastine as a unique chemotherapeutic agent capable of inducing dendritic cell maturation. Cancer Res. Sep 1;69(17):6987-94 (2009). 48 (46) Banissi, C.; Ghiringhelli, F.; Chen, L.; Carpentier, A. F. Treg depletion with a low-dose metronomic temozolomide regimen in a rat glioma model. Cancer Immunol. Immunother. Oct 58(10):1627-34 (2009). (47) Andre, N.; Padovani, L.; Pasquier, E. Metronomic scheduling of anticancer treatment: the next generation of multitarget therapy? Future Oncol. Mar 7(3):38594 (2011). (48) Burton, J. H.; Mitchell, L.; Thamm, D. H.; Dow, S. W.; Biller, B. J. Low-dose cyclophosphamide selectively decreases regulatory T cells and inhibits angiogenesis in dogs with soft tissue sarcoma. J. Vet. Intern. Med. Jul 25(4):920-6 (2011). (49) Elmslie, R.E.; Glawe, P.; Dow, S. W. Metronomic therapy with cyclophosphamide and piroxicam effectively delays tumor recurrence in dogs with incompletely resected soft tissue sarcomas. J. Vet. Intern. Med. Nov 22(6):1373-9 (2008). (51) Leach, M.; Drummond, M.; Doig, A. Practical Flow Cytometry in Haemotology Diagnosis. Chichester: John Wiley & Sons (2013). (53) Sun, L. X.; Lin, Z. B.; Duan, X. S.; Lu, J.; Ge, Z. H.; Li, X. J.; et al. Ganoderma lucidum polysaccharides antagonize the suppression on lymphocytes induced by culture supernatants of B16F10 melanoma cells. J. Pharm. Pharmacol. May 63(5):725-35 (2011). (54) Miranda-Hernandez, D. F.; Franco-Molina, M. A.; Mendoza-Gamboa, E.; ZapataBenavides, P.; Sierra-Rivera, C. A.; Coronado-Cerda, E. E.; et al. Expression of Foxp3, CD25 and IL-2 in the B16F10 cancer cell line and melanoma is correlated with tumor growth in mice. Oncol. Lett. Nov 6(5):1195-200 (2013). (55) Noori, S.; Hassan, Z. M. Dihydroartemisinin shift the immune response towards Th1, inhibit the tumor growth in vitro and in vivo. Cell Immunol. 271(1):67-72 (2011). (56) Cho, D.; Song, H.; Kim, Y. M.; Houh, D.; Hur, D. Y.; Park, H.; et al. Endogenous interleukin-18 modulates immune escape of murine melanoma cells by regulating the expression of Fas ligand and reactive oxygen intermediates. Cancer Res. May 15;60(10):2703-9 (2000). (57) Jemmerson, R.; LaPlante, B.; Treeful, A. Release of intact, monomeric cytochrome c from apoptotic and necrotic cells. Cell Death Differ. May 9(5):538-48 (2002). 49 (58) Hotchkiss, R. S.; Chang, K. C.; Grayson, M. H.; Tinsley, K. W.; Dunne, B. S.; Davis, C. G.; et al. Adoptive transfer of apoptotic splenocytes worsens survival, whereas adoptive transfer of necrotic splenocytes improves survival in sepsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA May 27;100(11):6724-9 (2003). (59) Reap, E. A.; Roof, K.; Maynor, K.; Borrero, M.; Booker, J.; Cohen, P. L. Radiation and stress-induced apoptosis: a role for Fas/Fas ligand interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA May 27;94(11):5750-5 (1997). (61) Albertsson, P.; Lennernas, B.; Norrby, K. Low-dosage metronomic chemotherapy and angiogenesis: topoisomerase inhibitors irinotecan and mitoxantrone stimulate VEGF-A-mediated angiogenesis. APMIS Feb 120(2):147-56 (2012). (62) Sundman-Engberg, B.; Tidefelt, U.; Gruber, A.; Paul, C. Intracellular concentrations of mitoxantrone in leukemic cells in vitro vs in vivo. Leuk. Res. Apr 17(4):347-52 (1993). (63) Keese, M.; Gasimova, L.; Schwenke, K.; Yagublu, V.; Shang, E.; Faissner, R.; et al. Doxorubicin and mitoxantrone drug eluting beads for the treatment of experimental peritoneal carcinomatosis in colorectal cancer. Int. J. Cancer Jun 1;124(11):2701-8 (2009). (64) Suzuki, E.; Kapoor, V.; Jassar, A. S.; Kaiser, L. R.; Albelda, S. M. Gemcitabine selectively eliminates splenic Gr-1+/CD11b+ myeloid suppressor cells in tumorbearing animals and enhances antitumor immune activity. Clin. Cancer Res. Sep 15;11(18):6713-21 (2005). (65) Le, H. K.; Graham, L.; Cha, E.; Morales, J. K.; Manjili, M. H.; Bear, H. D. Gemcitabine directly inhibits myeloid derived suppressor cells in BALB/c mice bearing 4T1 mammary carcinoma and augments expansion of T cells from tumor-bearing mice. Int. Immunopharmacol. Jul 9(7-8):900-9 (2009). (66) Smith, R. Animal research: the need for a middle ground. British Med. J. Feb 3;322(7281):248-9 (2001). (67) Chugun, A.; Uchide, T.; Tsurimaki, C.; Nagasawa, H.; Sasaki, T.; Ueno, S.; et al. Mechanisms responsible for reduced cardiotoxicity of mitoxantrone compared to doxorubicin examined in isolated guinea-pig heart preparations. J. Vet. Med. Sci. Mar 70(3):255-64 (2008). 50 (68) Bromberg, L. Polymeric micelles in oral chemotherapy. J. Control. Release Jun 4;128(2):99-112 (2008). (69) Kim, J. E.; Yoon, I. S.; Cho, H. J.; Kim, D. H.; Choi, Y. H.; Kim, D. D. Emulsion-based colloidal nanosystems for oral delivery of doxorubicin: improved intestinal paracellular absorption and alleviated cardiotoxicity. Int. J. Pharm. Apr 10;464(12):117-26 (2014). (70) Shapira, A.; Markman, G.; Assaraf, Y. G.; Livney, Y. D. Beta-casein-based nanovehicles for oral delivery of chemotherapeutic drugs: drug-protein interactions and mitoxantrone loading capacity. Nanomedicine Aug 6(4):547-55 (2010). (71) Youn, J. I.; Nagaraj, S.; Collazo, M.; Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. Oct 15;181(8):5791-802 (2008). (72) Laoui, D.; Van, O. E.; Van Ginderachter, J. A. Unsuspected allies: chemotherapy teams up with immunity to fight cancer. Eur. J. Immunol. Oct 43(10):2538-42 (2013). (73) Alderton, P. M.; Gross, J.; Green, M. D. Comparative study of doxorubicin, mitoxantrone, and epirubicin in combination with ICRF-187 (ADR-529) in a chronic cardiotoxicity animal model. Cancer Res. Jan 1;52(1):194-201 (1992). (74) Hosoi, A.; Matsushita, H.; Shimizu, K.; Fujii, S.; Ueha, S.; Abe, J.; et al. Adoptive cytotoxic T lymphocyte therapy triggers a counter-regulatory immunosuppressive mechanism via recruitment of myeloid-derived suppressor cells. Int. J. Cancer Apr 15;134(8):1810-22 (2014). (75) Pinho, S. S.; Carvalho, S.; Cabral, J.; Reis, C. A.; Gartner, F. Canine tumors: a spontaneous animal model of human carcinogenesis. Transl. Res. Mar 159(3):16572 (2012). (76) Attarwala, H. TGN1412: From Discovery to Disaster. J. Young Pharm. Jul 2(3):332-6 (2010). --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------(50) http://www.bdbiosciences.com/instruments/lsr/features/fluidics.jsp (21/04/2014). (52) Rahman, M. Introduction to Flow Cytometry. http://static.abdserotec.com/Litpdfs/Brochures1/flowcytometry.pdf (18/02/2014). (60) https://www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols (11/04/2014). 51 Lezingen Professor Daan J.A. Crommelin Wegens ziekte kon ik niet aanwezig zijn op de eerste twee lezingen. In dit verslag bespreek ik dus enkel de lezingen die ik heb kunnen bijwonen, nl. op 18 maart en 7 april 2014. 1. Animal experiments: what are animals trying to tell us? De lezing omtrent dierproeven sprak mij het meest aan aangezien ik voor mijn masterproef met muizen heb gewerkt. De uitdaging bij dierproeven is dat de predictieve waarde ervan niet consistent is en bovendien afhankelijk is van de indicatie (cardiovasculair, oftalmologisch, gastro-intestinaal, …). Verschillende studies werden aangehaald waarbij dierproeven achteraf zinloos bleken. Onder andere werd het Duitse biotechnologisch bedrijf TeGenero besproken. Dit bedrijf deed onderzoek naar een therapeutisch antilichaam (TGN1412) dat agonistisch werkt op de CD28 receptor, nodig voor activatie van regulatorische T-cellen (76). Het TGN1412 antilichaam werd zowel in vitro op humane leukocyten als in vivo op apen getest en werd veilig bevonden. Het bedrijf kreeg in 2006 toestemming om tot fase I klinische studies over te gaan met 6 gezonde vrijwilligers. De toegediende dosis was 500 maal lager dan de dosis veilig bevonden in de diermodellen, maar enkele minuten na infusie kregen de vrijwilligers te maken met ernstig orgaanfalen als gevolg van een cytokinestorm uitgelokt door de activatie van T-cellen (76). Als besluit stelde Prof. Crommelin dat effecten in diermodellen niet zomaar extrapoleerbaar zijn naar humane toepassingen. Proeven met dieren hoeven niet volledig afgeschaft te worden, maar indien mogelijk moet het VVV-principe toegepast worden: verminderen, verfijnen en vervangen. 2. Scenarios for the future of the pharmaceutical sciences and implications & Innovation and Public Private Partnerships De kernboodschap van dit betoog kan samengevat worden in een citaat van Charles Darwin: ‘It is not the survival of the fittest, it is the survival of those who can adapt best.’. Het komt erop neer dat we te vaak en te veel lineair denken en niet voorbereid zijn op abrupte veranderingen: dit is een normaal denkpatroon, maar het is vaak niet correct. De farmaceutische sector is continu onderhevig aan verandering, maar innovaties worden vaak tegen gegaan door budgettaire beperkingen en te strenge wetgevingen. Qua wetenschappelijk onderzoek doet België het goed, maar dit wordt niet omgezet naar innovatie. Europa hangt aan het staartje en is al lang voorbijgestreefd, o.a. door Aziatische landen en de Verenigde Staten. Het is belangrijk te investeren in wetenschap, maar dit geïnvesteerde geld moet leiden tot innovatieve producten en concepten. Heden verdwijnt het geïnvesteerde geld als het ware in een zwart gat. Vandaag de dag zijn de regulerende autoriteiten zoals de FDA (Food and Drug Administration) en het EMA (European Medicines Agency) totaal risk adverse. Als een geneesmiddel zoals paracetamol heden ontdekt zou worden, zou het nooit op de markt komen omwille van hepatotoxiciteit en hogere prevalentie van suïcidepogingen. Dit terwijl paracetamol een van de veiligste geneesmiddelen is en vele indicaties heeft. Het zou een spijtige zaak zijn als dergelijke moleculen ons ontglippen door te nauwe veiligheidsmarges, zowel heden als in de toekomst. Public Private Partnerships (PPP) vormen volgens professor Crommelin een cruciaal concept voor het streven naar innovatie. PPP vormen een niet-competitieve samenwerking tussen de industriële sector, regulerende overheden en de academische wereld waarbij kwaliteit prioritair is. 3. The changing role of the pharmacist in an international perspective Ook in deze stukken van de lezing kon ik mij vereenzelvigen met de mening van Prof. Crommelin: nationalisering van apotheken, internetapotheken en het Angelsaksisch systeem waarbij je OTC geneesmiddelen simpelweg uit de rekken van een supermarkt kan nemen lijken mij geen goed idee. Deze systemen brengen enorm veel risico’s met zich mee. Hoe kan een patiënt aan zelfmedicatie doen zonder professioneel advies, zeker als we bedenken dat de meerderheid van patiënten de bijsluiter niet leest? Bovendien krijgt de patiënt steeds meer zeggenschap, maar niet meer verantwoordelijkheid. De patiënt zou actiever betrokken moeten worden bij de behandeling. Prof. Crommelin pleit voor het meegeven van een basispakket omtrent geneesmiddelen in het secundair onderwijs. Ik ga hier volledig mee akkoord aangezien vele mensen geen idee hebben over de werking of de toxiciteit van een geneesmiddel.
