Regenerative medicine 2015. #1 introductie college. 02-02
advertisement
Regenerative medicine 2015. #1 introductie college. 02-02-2015 Regenerative medicine is een multidisciplinair vak. Het betrekt moleculaire celbiologie, materiaalkunde, biomechanica, weefselontwikkeling en herstel, ontstekingen en immunologie. Het werd vroeger, en soms nog steeds, ook wel tissue engineering genoemd. Regeneratie is het vermogen van een organisme/orgaan/weefsel om zijn originele structuur en functie terug te krijgen. Geneeskunde nu. De huidige geneeskunde wordt voornamelijk uitgevoerd door middel van operaties en medicijnen. Veel van deze medicijnen zijn monodrugs – 1 pil met 1 werking. Hierdoor zijn er soms heel veel medicijnen nodig. Transplantatie. Iets wat een belangrijke rol speelt in de geneeskunde zijn transplantaties. Dit kan om ledematen gaan of organen, tegenwoordig kan bijna alles getransplanteerd worden. Ook al lijkt dit soms wel het geval, transplantatie is geen oplossing, maar een vorm van tijd rekken. Iemand met een getransplanteerd orgaan moet aan de immunosupressors – Medicijnen die het immuunsysteem onderdrukken. Dit moet omdat het immuunsysteem zorgt voor de afstoot reactie op lichaamsvreemde stoffen/materialen. Dit verkleint de kans op afstoting van het nieuwe orgaan, maar heeft daarbij ook zo zijn nadelen. Er kunnen sneller (ernstige) infecties in het lichaam optreden en er is een (bijna 100%) kans op kankervorming. Transplanteren kan met twee types weefsel: Autoloog – Weefsels/cellen afkomstig van jezelf Allogeen – Weefsel/cellen van een andere donor. TED talk. Een TED talk over regenerative medicine. Hierin wordt verteld dat er tegenwoordig al heel veel kan en wordt geëxperimenteerd. Het is echter nog lang niet allemaal klinisch toepasbaar. Een interessant voorbeeld is de salamander, die bij het verliezen van een ledemaat gewoon een nieuwe aan laat groeien. De vraag is waarom kan de mens dit niet? Nou dat kan de mens wel, maar dan alleen over kleine afstanden. De diffusie afstand van regeneratie in de mens is niet zo groot. Hier bij zijn stamcellen, zuurstof en voedingsstoffen van belang. Simpele organen, zoals de blaas, kunnen al ‘gekweekt’ worden en gebruikt worden in de mens. Hiervoor wordt een soort ‘mal’ (=matrijs = scaffold). Bedekt met de juiste type cellen waardoor er een blaas ontstaat. Complexe organismen zoals lever en hart kunnen we nog niet namaken omdat hier ook een heel netwerk aan zenuwen en bloedvaten doorlopen. Weefselontwikkeling. Bij het ontwikkelen van weefsels spelen moleculen een belangrijke rol. Voornamelijk de communicatie doormiddel van moleculen. Dit kan bijvoorbeeld door chemoattractantia – moleculen die cellen kunnen aantrekken door aan te grijpen op cel receptoren. Regulatoire moleculen – Deze zorgen voor communicatie door signalen af te geven die andere cellen kunnen aanzetten tot; proliferatie, differentiatie en functionaliteit. Adhesie moleculen – Deze moleculen zijn ook belangrijk in de weefselontwikkeling om dat zij zorgen voor; ondersteuning, instructie signalering, vastleggen van regulatoire moleculen. Doel van RM. Tissue engineering zou je de voorloper van regenerative medicine kunnen noemen. Hieruit is de RM ontstaan. Er kleeft een lange definitie aan RM met als belangrijkste punten: Het is een interdisciplinair veld met focus op herstel, vervanging of vernieuwing van cellen/weefsels/organen. De aanpak stimuleert en ondersteunt de capaciteit van het lichaam om zichzelf te genezen/repareren. Het doel van RM zie je eigenlijk al in de definitie. Er moeten nieuwe therapieën ontwikkeld worden voor patiënten met verwondingen of chronische ziekten, door de lichaamseigen reactie van herstel te versterken. Een voorbeeld van gevallen waarbij RM een grote rol speelt/kan spelen zijn: brandwonden, hartfalen, alzheimer, diabetes etc. Bouwen. Om iets te bouwen heb je een structuur, bouwstenen en cement nodig. Daarnaast moet het geheel worden aangestuurd. Dit is bij het bouwen van bijvoorbeeld een orgaan niet anders. Hier gebruiken we een matrijs/matrix/scaffold als basis structuur. De bouwstenen hieromheen zijn de cellen. En om alle cellen bij elkaar te houden zijn de adhesie moleculen van belang. Om dit geheel aan te sturen zijn er groeifactoren. Daarnaast speelt de omgeving een belangrijke rol. Dit is ook wel de RM ‘trinity’. RM ‘trinity’- De 3 belangrijke onderdelen in RM zijn de cellen, de matrijs en moleculen. We gaan in deze cursus dan ook vooral in op de ‘cel gebaseerde RM’. Cellen. Welke cellen gebruik je om een RM ontwikkeling te maken. Autoloog of allogeen. Eigen cellen lijken altijd beter, maar dat gaat niet altijd op. Het is per geval belangrijk om de voor en nadelen af te wegen. Autoloog. Deze cellen komen van de patiënt zelf en komen uit biopsies of bloed. Ze zijn lichaamseigen en kunnen dus niet worden af gestoten. Ze zijn geschikt voor permanent herstel. Het nadeel is dat ze door een (aangeboren) afwijking aangetast kunnen zijn. Je kunt ze maar in kleine aantallen afnemen en ze moeten persoonlijk gekweekt worden wat het duur maakt. Dit kan geen algemene geneesmiddelen vormen. Allogeen. Deze cellen kunnen van bloed/beenmerg/vet en nog meer bronnen komen. Zijn het best te gebruiken voor tijdelijk herstel. De voordelen zijn dat je ze in grote nummers kan kweken en opslaan. Hierdoor zouden ze ook ‘off-the-shelf’ kunnen zijn omdat één soort voor veel patiënten gebruikt kan worden. Het nadeel is natuurlijk de kans op rejectie waardoor immunosuppressie nodig kan zijn. Stamcellen. Stamcellen spelen een sleutelrol in de cel RM. Deze cellen zijn ongespecialiseerd en kunnen nog (eindeloos) delen. Daarnaast hebben ze nog geen functie en kunnen ze nog tot verschillende types differentiëren. Embryo stamcellen – Cellen afkomstig van het blastoom van de embryo. Dit is een ethisch gevoelig onderwerp, maar deze cellen zijn nog het meest potent (pluripotent) van alle stamceltypes. Ze moeten dan gecontroleerd zich ontwikkelen tot de gewenste cel. Dit is een uitdaging omdat de cel uit zich zelf zó veel kanten op kan. De nadelen zijn wel dat ze genetisch instabiel kunnen zijn en teratomen (kankergezwellen) kunnen ontwikkelen. Volwassen stamcellen – Deze cellen zijn natuurlijk niet ‘volwassen’ maar afkomstig van een volwassene. Deze zijn multipotent dus bepaalde cellen kunnen zich nog tot veel ontwikkelen maar niet meer tot alle types. Daarom zijn ze ook makkelijker om door te laten differentiëren, ze zijn immers al op weg. Deze cellen kunnen zich echter minder goed vernieuwen en worden sneller af gestoten wanneer afkomstig van een andere patiënt. Vormen van stamcellen. Het creëren van celtypes uit een stamcel gebeurt met eiwitten zoals groeifactoren. Ook de omgeving, dus het substraat speelt een hele belangrijke rol. Dit vormen kan op 3 hoofdmanieren. 1. Chemisch - Groeifactoren, cytokines, chemokines - Extracellulaire matrix componenten - Chemicaliën 2. Physisch - 2D/3D matrijsen - Staat van matrijs (ruw, vochtgehalte etc.) 3. Mechanisch - Druk/spanning - Shear stress Voorbeelden van de 3 types signalering zijn: 1. Groeifactoren, bijvoorbeeld de factoren die zorgen voor de transitie van mesenchymal naar epitheel. Dit is MET. Maar cellen kunnen ook van epitheel weer terug naar mesenchymal en dat gaat dan onder invloed van TGFβ. 2. Het creëren van een 3D culture is met cellen erg moeilijk. Daarom zijn de matrijsen van belang. Ook de ruwheid van een matrijs heeft invloed omdat bepaalde cellen voorkeur hebben voor dikkere/dunnere matrijssen. 3. Shear stress is wat je in bloedvaten tegenkomt. De vorm van de eptiheelcellen in het bloedvat verandert dan door de schuivend druk die het bloed op het bloedvat uitoefend. Scaffolds/matrijsen. De matrijs is (vaak) gemaakt van polymeren die uit natuurlijke of chemische elementen kunnen bestaan. Ze ondersteunen de opbouw van het nieuwe weefsel maar zijn (vaak) niet permanent en moeten dus van een stof ontwikkeld die in de loop van de tijd verdwijnt/oplost. Tissue engineering houdt zich daarom bijvoorbeeld bezig met het uitkiezen van de juiste materialen. Bij de verkeerde keuze kan het immuunsysteem zorgen voor een reactie en ontsteking. Regenerative medicine op de markt. Om een product te ontwikkelen moet je heel veel stappen doorlopen. Eerst moet je iets ontwikkelen en daarna uitvoerig testen. Vervolgens moet er nog een klinische procedure komen, die ontzettend langdradig is en bij elke stap goed moet gaan. Loop je ergens tegen aan ben je terug bij af. Er zijn inmiddels al enkele toepassingen van regenerative medicine op de markt. Dit zijn soms off-the-shelf producten, die voor iedereen beschikbaar zijn. Of echt persoonlijk aangepaste producten, zoals een nieuwe blaas. Samenvatting van dit college. Het herstellen, vervangen of verbeteren van weefsels in het lichaam door gebruik te maken van de eigen zelf helende kracht van het lichaam is het doel van RM. De trinity van RM zijn de cellen, de scaffold (matrijs) en (signaal)moleculen. Voorbeelden van klinische vraag van RM zijn: Huid bij verbranding, nieuwe aderen bij verkalking, nieuwe eilandjes van Langerhans bij diabetes. Voorbeelden van tissue engineerde organen zijn de blaas of halsslagader (alleen bij dieren). Voor RM worden stamcellen gebruikt. Deze kunnen van embryo komen (totipotent) of van een volwassene (pluripotent). Beide kennen hun voor- en nadelen. #2 Moleculaire organisatie van cellen. 03-02-2015. Een cel bestaat voor 90% uit water plus een lipide membraan. Een weefsel bestaat dan weer uit een verzameling van deze cellen, bijeen gehouden door adhesie. Deel 1. Cel adhesie. Adhesie. Er zijn 3 verschillende adhesie functies: 1. Afsluiten 2. Verankeren/vastleggen 3. Communicatie 1. Afsluiten. Afsluitende cel-cel adhesies zijn de tight junctions. Dit is goed te vergelijken met klittenband, twee cellen sluiten naadloos op elkaar aan. De eiwitten die hierin een belangrijke rol spelen zijn claudines en occludines. De belangrijkste functie van deze tight junctions is het voorkomen van (passieve) backflow. Dit is goed te zien in het plaatje hier, de TJ voorkomt dat het tracer molecuul, opgenomen door de darmcel, buiten de cel om weer terugvloeit in het darmlumen (oranje). 2. Verankering/vastleggen. Deze anchoring junctions zorgen dat twee cellen aan elkaar vast liggen. Hierbij wordt kracht uitgeoefend, als een soort touwtrekken. Hierbij komt alleen een probleem kijken. De lipide laag van een cel is heel zwak en als je hier kracht op uitoefent laat het zo weer los. Daarom maakt de AJ gebruik van het cytoskelet. Zo kan er wel kracht uitgeoefend worden en kan een cel zich verankeren of bewegen door zich ergens naar toe te trekken. Het cytoskelet bestaat uit 3 belangrijke componenten, namelijk; 1. Actinefilamenten – Dit zijn de stijve/sterke onderdelen van het skelet. 2. Intermediaire filamenten - Deze zijn sterk en flexibel. 3. Microtubuli – Dit zijn de slappe/flexibele onderdelen van het skelet die alle filamenten met de celkern verbinden. De verhoudingen van de verschillende filamenten zorgt voor verschil in flexibiliteit van de cellen in je lichaam. Zo kun je je voorstellen dat je huid flexibeler moet zijn dan je botten. AJ’s kunnen tussen twee cellen zitten, zoals de adhesie junctions en de desmosomen. Ze kunnen echter ook tussen de cel en een extracellulaire matrix zitten, zoals de focale adhesie en hemidesmosomen (wordt verderop uitvoerig behandeld). Alle AJ’s bestaan uit een (dimeer) van cadherines. Er zijn verschillende soorten cadherine, maar het bindt altijd homeotypisch. Oftewel; Ncadherine bindt N-cadherine van andere cel enzovoorts. Op de cadherine dimeren zitten Ig-loops. Deze loops zijn afhankelijk van Ca2+ waardoor het hele verankeren afhankelijk is van calcium. Dit is nuttig omdat er zo regulatie plaats kan vinden. Overzicht: Junction Cell-Cell Adhesie junction Desmosomen Cell-Matrix Focal adhesie Hemidesmosmen Filament Adhesie eiwit Actine Intermediair Cadherine Cadherine Actine Intermediair Integrine Integrine 3. Communicatie. Communicatie junctions zijn de gap junctions. Dit zijn kleine poriën tussen twee cellen die zorgen voor communicatie mbv kleine (<1 kD) moleculen. De opbouw van een GJ is alsvolgt: 6 connexins vormen 1 connexon. Beide cellen hebben dan een connexon en deze kunnen op elkaar binden en vormen zo 1 intercellulair kanaal. Al deze intercellulaire kanalen bij elkaar in een groep van (min.) 10.000 vormen 1 gap junction. Hierbij kunnen de intercellulaire kanalen homotypisch of heterotypisch zijn. Dit houdt respectievelijk in dat de connexons beide uit één type of uit meerdere types connexins bestaan. Ook de gap junctions zijn afhankelijk van Ca2+ omdat ze op deze manier bescherming kunnen bieden tegen beschadigende signalen. Verankering aan extracellulaire matrix. Zoals eerder genoemd kunnen cellen aan elkaar kleven/verankeren met behulp van de AJ’s. Als je een weefsel hebt van gehechte cellen, moet dit weefsel ook nog aan de matrix hechten. Dit kan met de volgende twee type adhesies: - Focale adhesie - Hemidesmosomen Deze type adhesies bestaan niet uit de eerder genoemde cadherines maar uit integrines. Deze integrines bestaan altijd uit twee ketens; Een α-keten – bepaalt de stabiliteit van het complex. En een β-keten – bepaalt de specificiteit voor het type matrix. Overzicht van de cell adhesies: Het belang van deze adhesie is erg groot. Een goed voorbeeld om het belang te laten zien is de blaren ziekte. Dit is een autoimmuun ziekte waarbij cadherines worden vernietigd. Hierdoor heb je geen cel-cel adhesie. Cellen laten van elkaar los en daarom blijven cellagen niet bij elkaar. Zo krijgt deze persoon blaren over zijn hele lichaam, de huid blijft namelijk niet vastliggen. Dit raakt geïnfecteerd en je overlijdt daardoor (gemakkelijk) aan een infectie. Deel 2 Communicatie. Communicatie tussen cellen kan via contact communicatie of via chemische communicatie. Chemische communicatie – Dit gaat om communicatie via receptor signalering. We onderscheriden hiervan 4 typen: 1. Paracriene secretie Een cel produceert een eiwit en een andere cel pikt dit op. 2. Hormonale secretie Een cel/weefsel produceert hormoon en geeft dit af aan het bloed, vervolgens pikt een andere cel het op. 3. Neurotransmitter secretie Een neuron geeft neurotransmitters af aan een cel. 4. Neurohormoon secretie Een neuron geeft hormonen af aan het bloed, vervolgens pikt een andere cel dit op. Signaaltransductie gaat altijd door middel van fosfaat, op 2 uitzonderingen na die we later behandelen. Fosfaat is het intercellulaire signaal eiwit wat er voor zorgt dat transcriptie factoren worden geactiveerd. Dit fosfaat wordt hiertoe aangezet op het moment dat de receptor wordt gebonden door het juiste eiwit. Hoe sterk het signaal is hangt af van de hoeveelheid signaalstof en hoeveelheid receptoren. Een signaal heeft altijd signalen nodig, zonder signalen gaat een cel dood. Alle signalen die tegelijk binnenkomen hebben samen 4 mogelijke uitkomsten voor de cel: 1. Blijven leven 2. Delen 3. Differentiatie 4. Apoptose In dit proces spelen ook verschillende receptoren een rol. Ionen kanalen Mbv een signaalmolecuul verandert de confirmatie van het kanaal. Hierdoor gaat het kanaal open en kunnen ionen zoals kalium en natrium het kanaal passeren. Enzym receptoren Deze receptoren worden geactiveerd door een ligandbinding. Twee helften van de receptor worden door het molecuul bijeengebracht en kunnen elkaar dan activeren. Dit geactiveerde complex kan op hun beurt weer een enzym activeren. Signaalcomplex Dit is een receptor met inwendig een heel complex met meerdere intracellulaire eiwitten. Afhankelijk van welke eiwitten aan het complex zijn gebonden vindt er een reactie plaats. G-eiwit gekoppelde receptoren Bij deze receptoren zit er een G-eiwit aan de binnenkant van de receptor. Bij activatie van een receptor wordt het G-eiwit geactiveerd en dit kan op zijn beurt weer andere eiwitten/enzymen activeren. Het is een G-eiwit genoemd omdat dit eiwit gebruikmaakt van GTP en GDP ipv het bekende ATP en ADP. Receptor Tyrosine Kinases (RTK) Dit is de MAP/Ras kinase pathway. Ze zijn belangrijk voor groeifactoren. Er zitten target domains aan de buitenkant van de cel en inwendig zit een enzymatisch domein om te reageren. Bij binding van het RTK, wordt RAS geactiveerd (ook met GDP/GTP). Hierdoor krijg je actief Ras. Dit kan op zijn beurt MAP-kinase-kinase-kinase activeren, die activeert MAP-kinase-kinase en die activeert weer MAP-kinase. Deze kan doelwit eiwitten en genen aanzetten. DUS: RTK actief Ras MKKK MKK MK Doelwit eiwit/gen Een simpel voorbeeld van een RTK is een TGFβ. De uitzonderingen op fosfaat signalering. Er waren 2 uitzonderingen op de signalering via fosfaat en dat zijn de volgende: Wnt signalering. Wnt receptor heeft een bijbehorend eiwit en in dit eiwit zit β-catinine. Dit draagt fosfaat met zich mee en dit fosfaat zorgt voor INACTIVATIE van het eiwit. Als de Wnt receptor wordt geactiveerd zorgt dit er voor dat β-catinine wordt afgebroken, dus fosfaat verliest, en dan wordt het geheel actief en kan het zorgen voor afschrijving van genen. Oftewel Wnt activatie vindt plaats bij verlies van een fosfaat! Notch/Delta signalering. De tweede uitzondering zijn Notch en Delta. Notch is een receptor bestaande uit een inwendig en uitwendig deel, met hieraan ook nog eens een staart. Deze staart kan geactiveerd worden bij binding van zijn ligand delta. Na binding van delta worden de 3 eerder genoemde onderdelen van Notch geknipt. Hierdoor kan het inwendige deel loskomen van de celwand en in de cel zorgen voor activatie en gen transcriptie. Signalering kan op heel veel verschillende manieren verlopen. Inwendig zijn er vaak veel factoren die een rol spelen bij gen transcriptie. Hoe meer intercellulaire eiwitten een rol spelen, hoe meer mogelijkheden er zijn. Op die manier kunnen heel veel uitkomsten komen uit heel veel signalen. Deel 3. Opbouw van multicellulaire weefsels/organismen. Het doel van RM is om te begrijpen hoe de pathway van de ontwikkeling loopt, zodat we het na kunnen maken. Zo kunnen we nieuwe weefsels creëren, dit noemen we tissue generation of weefsel generatie. Bij een embryo ontwikkelen zich 3 kiemlagen, het ectoderm/mesoderm/endoderm. Alle 3 de kiemlagen ontwikkelen zich tot hun eigen specifieke weefsels. Hier ligt het begin van de RM, om de juiste celtypes te kiezen en laten ontwikkelen. Cellen moeten zich niet allen delen/prolifereren maar ook specialiseren. Welke cel zich gaat specialiseren tot welke kiemlaag is puur random, de cel die het hardst signalen uitscheidt onderdrukt de rest het sterkst en wint, want daardoor kan hij niet meer geremd worden door de andere cellen. De eerste specialisatie gaat via Delta-Notch. Zo heb je de eerste twee celtypes. Verdere onderscheiding gaat nu via patterning. Met patterning wordt bedoeld dat de gradiënt van hoeveelheid uitgescheiden signaalstof ook zorgt voor verschillen tussen cellen. Cellen die het dichtst bij de uitscheidende cel zitten worden het sterkst beïnvloed en die verder weg liggen minder of helemaal niet. In de ontwikkeling is er niet één gradiënt die een rol speelt, maar meerdere. OP deze manier zorgen alle gradiënt hoeveelheden bij elkaar voor verschillende celtypes. Zo worden de eerste 3 kiemalgen gevormd. Bij ontwikkeling van celtypes zijn er cadherines die specifiek zijn voor hun eigen celtype. Deze cadherines kunnen alleen mono-specifiek binden en op deze manier vindt er zelfherkenning tussen de zelfde celtypes plaats en kunnen ze samen groeperen. Zo ontwikkelt zich bij een embryo (van vertebraten) de neurale buis. Dit is versimpeld weergegeven in het plaatje hieronder: Eptiheel-mesenchymaal transitie. Epitheelcellen zijn cellen die strak aan elkaar zitten door middel van adhesie. Deze cellen kunnen ‘terug differentiëren’ in het mesenchym. Dit gebeurt vaak bij RM epitheel weefsel. SNAIL zorgt dat de epitheelcellen hun adhesie verliezen en daardoor laten ze los en verliezen ze hun functie. Vervolgens komt MMP’s waardoor de cellen ook niet meer aan de matrix kleven met hun hemidesmosomen en focale adhesies. Ook wordt de migratie gestimuleerd. Hierdoor vallen de cellen los van elkaar en terug naar de basale lamina, het mesenchym. De MMP’s worden ook wel pacman’s genoemd. Van Epitheel naar Mesenchym is EMT en van Mesenchym naar Eptiheel is MET. Samenvatting van dit college. Voor celadhesie heb je adhesie junctions en desmosomen voor cel-cel en focale adhesie en hemidesmosomen. Voor cel-cel adhesie heb je de cadherines, die monospecifiek binden. Voor Cel-matrix adhesie heb je integrines. Er zijn verschillende receptor types die op verschillende manieren werken. Signaaltransductie gaat altijd via fosfaat, behalve bij Wnt en Delta/Notch signaling. Weet hoe TGFβ, NOTCH, MAPK, Wnt werken. Hoe ontwikkelen de verschillende celtypes zich in multicellulaire weefsels/organismen. EMT gaat door het verlies van adhesie dankzij SNAIL. Vervolgens komt MMP/pacman langs om cel-matrix adhesie te verbreken. Ook komen er signalen vrij die motiliteit beïnvloeden waardoor een epitheelcel terug kan migreren naar het mesenchym. #3 Stamcellen 04-02-2015 Deel 1. Embryonale stamccellen. Stamcellen zijn cellen die zichzelf kunnen vernieuwen, en bij het delen vormen ze een exacte kloon dochtercel, plus een nieuwe cel die zich vervolgens kan differentiëren in verschillende celtypes. Een stamcel deelt niet vaak, hij creëert een dochtercel en deze cel gaat delen en specialiseren. De gespecialiseerde cel kan dan nog meer delen. Op deze manier is het ook niet nodig om veel te delen voor de stamcel. Alle soorten stamcellen op een rij: Totipotent Dit zijn de stamcellen van de bevruchtte oöcyt. Deze cellen kunnen nog alles worden, inclusief weefsels buiten het embryo om, zoals placenta en navelstreng. Pluripotent De cellen die alle embryo weefsels kunnen vormen, inclusief de 3 kiemlagen. Multipotent De cellen die al in een van de 3 kiemlagen zijn gedefinieerd, maar binnen die kiemlaag nog alle celtypen kunnen vormen. Oligopotent De cellen die binnen hun eigen specifieke lijn, kunnen differentiëren in verschillende types. Unipotent Een cel die zich kan delen en zo alleen cellen van zijn eigen soort produceert. Dit zijn de meeste cellen in ons lichaam. Het bijzondere aan een stamcel boven alle andere cellen is dat hij zichzelf vernieuwd en zo oneindig kan delen. Daar spelen 3 dingen een belangrijke rol in. Ten eerste behoudt de stamcel zijn eigen DNA template en de gerepliceerde template gaat in de dochtercel. Zo worden mutaties voorkomen. Daarnaast wordt het telomeer van een stamcel niet korter, omdat zij het enzym telomerase bij zich dragen. Elke keer als het telomeer korter wordt, wordt er door dit enzym weer een stukje bij aan gezet. De derde truc is het feit dat de stamcel zich niet zo vaak deelt, dit is niet nodig omdat de transit amplifying cell’s zicht vaker delen. Embryonale stamcellen zijn de stamcellen afkomstig van een embryo. Hierbij worden de inner cell mass cellen bedoeld. Dit zijn de cellen die zich in de blastocyst vormen. Uit deze ICM vormen de drie kiemalgen. Voorbeeld wat hieruit ontgroeit. 1. Ectoderm – Huid/pigmentcellen/Neuronen 2. Mesoderm - Meerdere spiercellen/ rode bloedcellen 3. Endoderm - Lever/pancreas/thymus. De kiemlagen ontwikkelen zich door de volgende mechanismen: Ze kruipen, bewegen en migreren Ze worden minder potent. Totipotent pluripotent Ze vormen de grenzen van de organen Groeien en delen Reguleren Als je ESC kweekt in vivo en er verder niet weer naar omkijkt, ontstaat er in de loop van de tijd een ‘kloppende’ cel. Het komt er op neer dat zonder invloeden de stamcel zich ontwikkelt tot hartspiercel. Hij verliest zijn eigenschappen van een stamcel. De factoren die er normaal voor zorgen dat een stamcel ‘self-renewal’ behoudt zijn: Extrensiek; LIF en BMP en intrinsiek; Oct4, Nanog, Sox2. Yamanaka Yamanaka is een onderzoeker die wilde uitvinden hoe wij zelf een ESC kunnen ontwikkelen. Hij heeft gekeken welke factoren een rol spelen in het behoudt van de stamcel. Hij ontdekte 24 factoren en heeft daar mee getest welke factoren echt van belang zijn. Hieruit kwamen 4 factoren. Bij het toevoegen van deze 4 factoren aan een gewone cel, creëer je een cel die hetzelfde is als een ESC, ook wel de induced pluripotent Stem Cel , of IPS genoemd. De volgende 4 factoren zijn hier belangrijk: Oct 4 - voor zelf vernieuwing Sox2 - voor zelf vernieuwing C-Myc - voor transcriptie activatie Klf-4 - in leven houden van de cel Deel 2. Beenmerg en Mesenchym Een stamcel vind je in zijn niche. De micro-omgeving die nodig is voor de overleving van de stamcel. Er moeten de juiste voedingsstoffen en omgeving zijn, maar vooral moet er gezorgd worden dat de stamcel zelf zich niet differentieert. Beenmerg. Het beenmerg ligt in de holle botten. De bekendste plek is in je borstbeen. Hier liggen verschillende stamcellen, plus de cellen die hun ondersteunen. Hematopoietische stamcel Uit deze stamcel ontstaan alle rode & witte bloedcellen, maar ook enkele niet-bloed gerelateerde cellen. Uit de stamcel ontstaan 2 types voorlopercellen en uit deze cellen kunnen zich verschillende bloedcellen differentiëren. Hoe de cellen zich specialiseren heeft te maken met hun niche. In het beenmerg onderscheiden wij twee verschillende niches, die ontstaan door het verschil in voedingsstoffen. Veel voedingsstoffen vlak bij de bloedvaten, minder voedingsstoffen richting de rand van het bot. Vasculaire niche en de osteoblastische niche. In de osteoblastische niche zit de stamcel vast aan het bot door de adherens junctions, en focale junctions. . Deze adhesie is onder invloed van Ca2+. Op het moment dat er ergens in het lichaam een beschadiging plaats vindt worden er signaalstoffen uitgescheiden. Deze stoffen zijn bijvoorbeeld stamcelfactoren en MMP’s (pacman’s). Hierdoor worden de adhesies losgeknipt en zo kan de cel gaan delen. Vervolgens kan de cel migreren naar de vasculaire niche. Hier zijn veel meer voedingsstoffen en kan de cel prolifereren. Vervolgens kunnen de cellen het bloed in en hier verder rijpen en naar de plek rijzen waar ze nodig zijn. Mesenchymale stamcel Mesenchymale stamcellen vind je in het beenmerg, maar ook in vele andere weefsels. Ze kunnen in alle mesenchymale celtypes differentiëren onder invloed van de juiste factoren. Twee belangrijke factoren in de differentiatie zijn TGFβ en BMP’s. Deze cellen hebben de voorkeur om in hard weefsel (zoals bot/kraakbeen) te differentiëren. Deel 3. Stamcel applicatie en toepassing in ziektes. Applicaties van de hierboven genoemde stamcellen zijn het behandelen van bloedziektes met behulp van HSC, of bot herstel met de MSC. Hiervoor heb je alleen de juiste matrix, groeifactoren en buurcellen nodig. Bloedstamcel. In het geval van leukemie zit er een mutatie in de myeloide stamcel, dat is de voorloper cel die voortkomt uit de hematopoetische stamcel. Een behandeling met stamcellen zou kunnen zijn om de stamcellen er uit te halen en vervolgens de rest van het beenmerg te bestralen. Zo worden hopelijk alle (slechte) cellen gedood en na de behandeling kunnen de hematopoetische stamcel stamcellen weer worden terug geplaatst. Het idee is dan dat uit deze stamcel alle andere cellen in goede vorm terug groeien. Het nadeel is natuurlijk dat tijdens de behandeling er veel minder witte en rode bloedcellen zijn en ook de bloedplaatjes verminderd. Hierdoor heb je sneller infecties, vermoeidheid en kneuzingen. Een andere toepassing van de hematopoetische stamcel is bloed doping voor wielrenners. Mesenchymale stamcel. Om de mesenchymale stamcel te gebruiken in bijvoorbeeld botherstel, moet je rekening houden met verschillende factoren. Je moet zorgen dat de MSC zich ontwikkelt tot osteoblast. Daarna moet je zorgen dat deze osteoblast gaat prolifereren en niet differentieert in kraakbeen, of overgaat in apoptose. Als dat allemaal lukt kun je, onder invloed van TGFβ, zorgen voor mineralisatie en dus een hard bot. Dit kun je terugplaatsen in een defect bot om groei e.d. te stimuleren. Deel 4. Perifere bloed stamcellen. Bloed uit de periferie is makkelijk te bereiken en dit is direct verbonden met het beenmerg. Vanuit hier kun je met de density gradient separation zorgen dat de celtypen gescheiden werden. Hierin zakken de zwaarste cellen naar beneden en kun je de stamcellen ongeveer onderscheiden. Als je de juiste laag pakt kun je onder invloed van fluorescentie de stamcellen onderscheiden. Uit deze cellen kun je de EPC filteren, epitheel voorloper cel. De EPC cellen zijn van belang voor het vormen van bloedvaten. Dit kan op twee manieren. 1. Sprouting angiogenesis. Hierbij wordt er een nieuw bloedvat gecreëerd vanuit een bestaand bloedvat. Een afsplitsing als het ware. 2. Vasculogenesis. Dit houdt in dat er een totaal nieuw vat vanuit 0 wordt gemaakt. Voor het creëren van nieuwe bloedvaten zijn er twee verschillende types EPC’s. Vroege uitgroei en late uitgroei EPC. Vroege uitgroei EPC’s kun je na 2 dagen zien. Deze zijn eigenlijk geen stamcel, maar onder invloed van signalen banen zij de weg voor de groei van nieuwe vaten. De late uitgroei is wél een echte stamcel, zij zorgen voor instructies bij het vormen van nieuwe vaten. Samenvatting van dit college. De eigenschappen van stamcellen, zoals het zelf vernieuwen, het behouden van de originele streng en het gebruik van telomerase, om zo oneindig te kunnen delen. Stamcel niches ontstaan door voedingsstoffen gradiënten. Voorbeeld is het beenmerg, waarin we de osteoblastische en vasculaire niche onderscheiden. Een stamcel creëert een kloon van zich zelf en één dochtercel. Deze dochtercel kan zich vervolgens differntiëren en als TA (transit amplifying) cel veelvuldig delen. De stamcel heeft een identieke kopie en vult zijn telomeer weer aan met telomerase waardoor hij oneindig kan delen. De hematopoetische stamcel en mesenchymale stamcel hebben hun eigen eigenschappen en functies en differentiatie mogelijkheden. Bestudeer deze. Differentiatie van stamcel gaat onder invloed van de signalen die ze krijgen, maar ook de niche met buurcellen spelen een belangrijke rol. De toepassing van stamcellen staat nog in zijn kinderschoenen. Een paar voorbeelden zijn het behandelen van leukemie met stamcellen, bloed doping of het inspuiten van EPC voor het doorbloeden van een hart na een infarct. #4 Extracellulaire matrix 05-02-2015 In een cel zit een cytoskelet, met zijn 3 onderdelen. Actine, intermediate en microbuli filamenten. Alle 3 de onderdelen hebben hun eigen functie. De intermediate filamenten zijn het sterkst (!!) Want deze zijn als touw, sterk en flexibel en zorgen zo voor trekkracht.. Actine filamenten zijn sterk en stijf en zorgen voor beweging. De microtubuli zijn slap, maar zijn van belang voor intracellulair transport. Voor het verankeren van een cel aan de matrix hebben cellen anchoring junctions. Zoals eerder beschreven zijn dat de hemidesmosomen, en de focale adhesies. De kracht van deze AJ’s komt dus door de sterke cytoskelet elementen, omdat de lipide cellaag te slap is. Achter de junctions zit nog een hele signaaltransductie en integrines. Focale adheseis. De focale adhesies zitten puntsgewijs over het celmembraan. De focale adhesies vinden plaats via de integrines. Door de 20 soorten α-ketens en 3 soorten β-ketens zijn er ontzettend veel mogelijkheden qua type adhesies. Hemidesmosomen. De hemidesmosomen zijn belangrijk voor de trekkracht van een cel. Je hebt hiervan bijvoorbeeld veel in je cellen en weinig in je neuronen, omdat die trekkracht per celtype verschillend van belang is. Je huidt heeft namelijk wel invloeden van kracht, de neuronen niet. Extracellulaire Matrix De extracellulaire matrix is de structurele ondersteuning van weefsels en een substraat voor cel aanhechting. Verder is het van belang voor de regulatie van celdifferentiatie en metabole functies. Het ECM bestaat uit macromoleculen; - Polysacchariden - Fibreuze eiwitten Het ECM wordt vnl gevormd door fibroblasten die in het bindweefsel liggen. Het heeft een basaalmembraan waar de cellen hechten. Dit is een ~240-120nm dikke ‘mat’. Daarnaast is er een interstitiele matrix, dit is de opvulling tussen de weefselcellen. Deze bestaat voornamelijk uit collageen (type I). Fibroblasten liggen dus in het bindweefsel en produceren daar de vezels voor de Extracellulaire matrix. In het bindweefsel liggen niet zo veel cellen, maar is wel heel veel ECM. Het ECM ligt rond alle cellen in je lichaam, maar dit kan wel op verschillende manieren afhankelijk van het celtype. Het basale membraan heeft ook invloed op de cellen, zo ontstaan bijvoorbeeld de gepolariseerde cellen – Cellen met een duidelijke boven- en onderkant. Denk aan de epitheelcellen zoals in de darmen. Aan de onderkant zit het basaalmembraan omdat deze cel gepolariseerd is. Spiercellen daarentegen zijn niet gepolariseerd en je ziet dan ook dat het basale lamina rond de gehele cel ligt. Een ECM moet voldoen aan de volgende eigenschappen: Steun Sterkte Flexibiliteit Soepelheid Communicatie Aanpassingsvermogen ` ECM componenten. De polysacchariden in een ECM zijn voor de weerstand tegen compressie. Daarnaast zijn het opvullers in de vorm van glycosoaminoglycanen (GAG’s) of proteoglycanen De GAG’s zijn gunstig omdat er SO3- groepen aanzitten en deze negatieve lading trekt water aan. Er zijn verschillende typen, waarvan de hyaluronan een uitzondering is, omdat deze geen SO3 groep heeft maar COO- groep en op deze manier celmigratie vergemakkelijkt. De proteoglycanen zijn belangrijk voor de weerstand. Zij bestaan uit core-eiwitten en GAG zijketens. Er zijn hiervan heel veel variaties mogelijk en ze zijn belangrijke informatiedragers en kunnen op verschillende manieren reguleren: 1. Immobiliseren van uitgescheiden eiwitten 2. Remming van gebonden eiwitten 3. Reservoir van gebonden eiwitten, laat deze los ‘on demand’. 4. Bescherming van gebonden eiwitten (tegen afbraak). 5. Lokale concentratie van signalerende factoren. 6. Remming van extracellulaire proteasen en activatie van proteasen. De proteoglycanen kunnen groeifactoren binden en presenteren aal signaalreceptor. Hier kun je gebruik van maken in de RM. Bijvoorbeeld door mimetica sterker te laten binden wordt de signaalreceptor niet geactiveerd en hebben de groeifactoren geen invloed. Zo kan bijvoorbeeld angiogenese geremd worden. De fibreuze eiwitten zijn voor de weefselondersteuning en zorgen voor (cel)adhesie met de volgende stoffen; collageen, elastine, fibronectine en laminine. Deze bundels van fibreuze eiwitten liggen ingebed in een gel van proteoglycanen. Collageen. Collageen is het eiwit dat het meest voorkomt in het ECM. Het is een triple helix van α-ketens die rijk zijn aan Proline en Glycerine. Er zijn heel veel verschillende types maar vooral I, II, II, IV en IX komen veel voor, in totaal kennen we 25 typen. Synthese van collageen gaat door propeptiden. In het ER wordt er gehydroxileerd en door de OH groepen kunnen er tussen de collageenhelixen H-bruggen gevormd worden en zo ontstaat de triple helix. Vervolgens vindt er secretie plaats in de extracellulaire ruimte. Een voorbeeld van gebrek aan collageen is de ziekte scheurbuik. Dit ontstaat bij een gebrek aan vitamine C. Hierdoor verlies je je tanden en haar en verliezen vloedvaten hun sterkte waardoor bloedingen ontstaan. Een andere ziekte is een te veel aan collageen hierdoor wordt alles heel soepel, is dit je huid of je gewrichten dan is het niet ernstig, maar té soepele bloedvaten dan wordt het gevaarlijk. Het systeem. RNA Eiwit Hydroxilatie van prolines en lysines in het ER triplehelix vorming in het golci secretie vanuit vesikels verwijderen van propeptides Collageen moleculen samenvoegen tot sterke fibrillen. Elsaticiteit. In weefsels kan elasticiteit erg van belang zijn .Neem de bloedvaten, die bestaan voor 50% uit elastine. Elastine kan zich strekken en relaxeren en alle elastine moleculen worden bijelkaar gehouden omdat ze gecross-linked zijn. Ze bestaan uit twee segmenten, een hydrofoob segment, van belang voor elasticiteit. Daarnaast AL/Lys-rijke α-helices voor de X-linking. Celadhesie. Celadhesie van het ECM ontstaat door fibronectine (Fn). Zij hebben RGD zones. Dit zijn zones met Arg-Gly-Asp (oftewel R-G-D). Hier kunnen integrines binden. Fibronectine komt in 2 vormen voor, plasmavorm en fibrillaire vorm. De eerste is vnl van belang voor bloedstelling, wondgenezing en fagocytose. De laatste vorm ligt op het celoppervlakte en in het ECM, hierdoor integrinegedreven fibrilvorming voor adhesies. De basale lamina zijn matten met structurele rol. Het is een mat/barrière en kan zo zorgen voor scheiding van cellen. Het is samengesteld uit Collageen IV, perlecan, nidogen, laminine. De integrines bevorden de celadhesie en overleving door aan het ECM te binden. Intracellulaire signaaltransductie kan geactiveerd worden door binding en via FAK. Fak activeert vervolgens Ras-MAPkinase pathway. Turnover De extracellulaire matrix moet regelmatig vervangen worden (turnover) om homeostasis, ontwikkeling en wondgenezing te bevorderen. Eerst moet de ECM afgebroken worden, dit gaat met de al eerder genoemde MMP’s (pacmans). Deze MMP’s activeren elkaar weer waardoor een cascade ontstaat en de ECM snel kan worden afgebroken. Een andere klasse proteasen die kan afbreken zijn de ADAMs. Deze type proteases die ECM afbreken lijken allemaal op elkaar. Niet alles moet worden afgebroken dus om onnodige afbraak te voorkomen scheiden cellen een blokker af. Dit is TIMP. (De stok in de krokodillenbek). Moleculen in het ECM samengevat. Glycosaminoglycanen – GAGs Collageen Elastine Fibronectine Laminine #6 Mechanica. H13 + H15. Mechanica in het lichaam. In ons lichaam hebben we verschillende mechanische onderdelen. Zij zijn de ‘kleerhangers’ van het lichaam. Voorbeelden zijn; de huid, skelet spieren, cardivasculaire systeem, veteringssyteem, het hart. In RM is het van belang om hier mee rekening te houden, wat is de mechanische omgeving van het weefsel wat je wilt repareren. Biomechanica en veroudering gaan hand in hand. ZO zie je bijvoorbeeld op den duur atherosclerose in de vaten of osteoartritis bij de gewrichten. Julius Wolff stelde de wet van Wolff op: Architectuur van weefsels volgen hun functie. Hiervoor is constante remodeling op, dit gebeurt onder de invloeden van krachten waar het lichaam regelmatig aan bloot wordt gesteld. Een goed voorbeeld hiervan is het bot. Bij dit heupbot komt de druk vanaf de paarse pijl. Daarom wordt er verderop bij het bot verschillende krachten uitgeoefend. De roze pijlen laten zien dat daar compressie plaatsvindt, terwijl aan de andere kant volgens de blauwe pijlen uitrekking plaatsvindt. Als je die bot dan goed bekijkt zie je het volgende. Een veel dikkere wand op de plek waar meer druk wordt uitgeoefend. Dit is een bewijs voor Wolff’s wet. ZO zijn de gebogen beenderen het dikts op de plek waar ze het meest waarschijnlijk zouden kunnen breken. Daar waar compressie is in een bot, wordt nieuw bot gevormd, daar waar spanning is wordt bot weg geresorbeerd. De situatie vormt zich alsvolgt: - Mechanische koppeling. - Biochemische reactie hier op. - Signaaltransmimssie door de reactie. - Cellulaire response op de afgegeven signalen. Hierdoor vormt zich nieuw bot, of resorbeert bot. Hoeveel en hoe sterk hangt af van hoe lang en vaak de kracht werkt en hoe zwaar deze kracht is. Definities. Vervormingsspannig (strain) Dit is de mate van vervorming van het bot t.o.v. het oude bot en wordt dus in % uitgedrukt. Het kan samengedrukt worden door druk, of uit verlengd worden door trekkende kracht. Ook heb je shear straindoor glijden/buigen. Spanningskracht (stress) Dit is de kracht per oppervlakte. Dit is absoluut te meten en uit te drukken in Pascal. Shear stress is een verschijnsel wat je o.a. in bloedvaten ziet door het stromen van bloed parallel over de epitheelcellen. Elasticiteit Elasticiteit is de mate van vervorming die een weefsel kan doorgaan en vervolgens terug kan keren naar de originele staat. (Denk aan elastiek) Plasticiteit Plasticiteit lijkt op elasticiteit want gaat ook over de mate van vervorming, alleen in dit geval kan het object niet terugkeren naar de originele vorm. (Denk aan kauwgom) Flexibiliteit De uiterste bewegingsvrijheid (/range) van een weefsels zoals een gewricht. (Denk aan ballet of een split maken). Young heeft een elalsticiteits module opgesteld. Een formule die Krachtspanning en vervorming tegen elkaar uitzet en zo bepaalt of een materiaal plastisch of elastisch is. Voor RM en het kweken van cellen is dit van belang want de omgeving heeft veel invloed op hoe flexibel/stijf een product is. De ondergrond waarop cellen gekweekt worden bijvoorbeeld kan een wereld van verschil maken. Verschillende vormen van kracht. Kracht kan in verschillende manieren voorkomen en zo ook verschillende effecten uitoefenen op remodeling. Neem de continuous loading. Dit gaat om kracht wat in vicieuze cirkels voorkomt, dus steeds een periode van kracht en ontspanning afgewisseld. Dit is bijvoorbeeld lopen of ademen. In het lichaam passen de weefsels zichzelf ook continu aan. Door het beladen van hetzelfde bot kan je het bot zo trainen dat het minder snel breekt. Daarnaast is bijvoorbeeld het aantal circulaties dat het hart aan kan, zo groot dat dit nooit in een leven kan voorkomen, je hart mag niet eerder stoppen dan jij. In de Tissue engineering is dit ook van belang om rekening te houden, daarom worden sommige gecreëerde weefsels getraind, dit noemen we tissue training. Morfogenese is de vorm en structuur van het weefsel. Deze kan worden verbeterd voor zijn doel. Een voorbeeld hiervan is de shear stress op het bloedvat epitheel. Door de bloedstroom over de epitheelcellen veranderen deze cellen van vorm, ze worden langwerpiger. Deze vorm heeft een positieve invloed op de NO afgifte. NO zorgt voor relaxatie van de gladde spiercellen, die om het bloedvat heen liggen. Door de shear stress ontstaat er dus meer relaxatie in de bloedvaten. In de bloedvaten kunnen plaques ontstaan die de vaten vernauwen. Deze plaques zie je (vaak) op splitsingen van de bloedvaten. Het bloed stroomt dan tegen de bloedvatwand op en daardoor ontstaan bloedkolken. (Zie afbeelding). Deze kolken zorgen voor verandering van het epitheel het verandert namelijk bij gebrek aan de shear stress. Het epitheel ondergaat EMT onder invloed van TGFβ. Er ligt dan mesenchym en dit kan zich ophopen en tot plaques vormen. Ook is er minder epitheel en dus minder NO afgifte en meer contractie van het gladdespierweefsel. Hierdoor versmallen de bloedvaten ook nog eens en kan het bloed er niet goed meer door en zo krijg je verstoppingen. Sheer stress is dun van belang voor een bloedvat. Het voorkomt apoptose, en stimuleert veel factoren waaronder de NO afgifte. Mechanische stress heeft niet alleen in de bloedvaten invloed, dit kan ook werking hebben op bijvoorbeeld de botten. Bij trainen van de botten, zoals bij material arts, ontstaan er steeds kleine beschadigingen. Deze beschadigingen worden dan weer opgevuld met nieuwe botafzetting. Dit ontstaat door repetitive loading. Dus kleine kracht en beschadigingen meerdere keren opnieuw. Je botten kunnen ook acute loading ondergaan. Dit is je botten dan (vaak) te veel en dan breken ze. Om je botten te trainen moet je dus de balans vinden tussen de frequentie van training en de zwaarte van training, té vaak of té zwaar kunnen je botten doen breken. Aanpassingsvermogen van de verschillende weefsels. Spierweefsel Kan zich goed herstellen/aanpassen aan stress. Bij de juiste vorm van training kun je spieren doen groeien en versterken. Je moet ze wel de tijd geven om te herstellen. Botweefsel Kunnen goed aanpassen aan stress, maar deze aanpassing gaat langzaam. Na een verwonding kan het zich volledig weer herstellen. Kraakbeen Past zich moeilijk aan en heeft de neiging om af te breken bij te veel en te lange invloeden van stress. Kan ook bijna niet weer herstellen. Kapsels van gewrichten. Zal zich wel aan stress aanpassen, maar duurt erg lang want slecht doorbloed dus weinig turnover. Het herstellen na verwonding duurt ook lang en herstel is niet altijd volledig. De laatste twee weefsels bestaan uit weinig cellen en zijn minder doorbloed vandaar dat de adaptatie minder goed verloopt. De weefsels die een uitdaging zijn om te maken in de tissue engineering zijn botten, kraakbeen, spier, hartkleppen etc. dit komt door hun biomechanische functies. Sensors Cellen kunnen signalen ontvangen en verwerken, dit is mechanosensing. Dit kan op twee niveaus: Macroscopisch – Op niveau van het weefsel Microscopisch – Op niveau van de individuele cel. Zij ontvangen met die signalen mechanische informatie en kunnen deze verwerken. Vervolgens kunnen ze hier op reageren en zo blijft er controle. De sensoren hiervoor zijn integrines of de cel-cel adhesie moleculen (CAM’s). Ook cilia of ionenkanalen zijn voorbeelden. In epitheelcellen heeft het cytoskelet ook invloed. Het cytoskelet is namelijk een zelfdragend systeem. Aan de buitenkant van de cel ligt het corticale cytoskelet en deze heeft zijn verbindingen door de hele cel heen, waardoor bij druk/trekkracht de hele cel meevormt. Op deze manier kunnen er ook in de cel signalen afgegeven worden of transcriptie factoren aan/uitgezet worden. Trekkracht komt vanuit de microfillamenten of intermediaire fillamenten. De compressie vanuit de microtubuli en ECM adhesies. Focale adhesies worden gedacht hier ook belangrijk in te zijn omdat zij verbindingen hebben met actine filamenten. Het idee is dus dat cellen mechanische stimuli kunnen aanvoelen en focale adhesies een voorbeeld hiervan is. Er is echter nog veel onbekend. Bioreactoren. Om een weefsel te maken moet je met heel veel aspecten rekening houden. Hoeveel cellen en dichtheid heb je nodig, de cellen moeten onder de juiste signalen delen, prolifereren en differentiëren. Ook is er behoefte aan (veel) zuurstof. In een bioreactor moet je de omgeving zo goed mogelijk nabootsten afhankelijk van wat voor cellen/weefsels je wilt kweken. Chemische omgeving – De voedingsstoffen moeten in voldoende concentratie aanwezig zijn. Daarnaast moet er genoeg zuurstof zijn. Te weinig O2 Weinig/geen groei. Te veel O2 Kan toxisch zijn vanwege oxidative stress. Geometrische omgeving – Moet het 2D of 3D zijn. Verder moet er transport zijn, en moeten cellen kunnen communiceren met ECM. Het is dus erg van belang om goede scaffolds te ontwikkelen. Omdat er zoveel aspecten een rol spelen is bij de tissue engineering tot nu toe het meeste succes geboekt bij dunnere weefsels die niet doorbloed hoeven te worden. Het wordt moeilijker bij grotere/dikkere weefsels waar doorbloeding nodig is en meerdere celtypen een rol spelen. #7 Biomaterialen voor RM Biomaterialen zijn nodig om; - Kapotte weefsels te vervangen/herstellen/ondersteunen - Stabiliteit creëren en zo veilige omgeving voor wond - Om belaste gebieden zoals botten/kraakbeen te herstellen (mechanisch). - Cellen te creëren voor weefsels of stamcellen. Een natuurlijke polymeer om een scaffold van te maken is collageen. Kan als molecuul voorkomen, maar gedenatureerd is heet gelatine. Het is een structureel eiwit en komt in veel organismen hetzelfde voor. 30% van alle eiwitten in je lichaam is collageen. Er zitten echter nadelen aan het gebruik van collageen: Beschikbaar voornamelijk uit dieren Hierdoor kan immuunrespons ontstaan. Overbrengen van ziekten Dit komt niet heel veel voor omdat het collageen wordt behandeld en zo prionen worden verwijderd. Batch-to-batch Materialen doen niet allemaal hetzelfde. Recombinant maken is niet mogelijk Je kunt niet hetzelfde natuurlijke collageen terugkrijgen. De voordelen zijn voornamelijk dat het onbeperkt verkrijgbaar is en daarom ook erg goedkoop. In de praktijk wordt collageen al veel gebruikt, denk aan: - Rimpels opvullen - Sluitspier verdikken tegen urine continentie - Huidtransplantatie - ACI Chondrocyten implantatie, collageen wordt overheen geplaaatst. - Bloedstolling dmv sclerogens. Structuur van collageen. In de cel zijn collageen moleculen groter dan buiten de cel. Dit komt omdat de uiteinden buiten de cel afgeknipt, daardoor kan het buiten de cel vezels maken. Het ontstaat door 3 α-ketens. Er zitten steeds gaten tussen de vezels omdat dit energetisch voordelig is. Er zijn verschillende typen collageen. Type 4: Voor basaal membraan Type 6: Voor kraakbeen en fibrotisch weefsel Type 7: Komt weinig voor, maar verbindt het basale lamina aan ECM Type 8&10: Hypertroof kraakbeen, is de voorloper van het bot wat daar gevormd wordt. Type 9,12,14: FACIT, fibrilgeassocieerde collagenen. Deze binden verschillende vezels aan elkaar. Het heeft een typische structuur en collagenen kunnen energie opslaan. Stabiliteit. Colalgeen ingebracht in het lichaam non-crosslinked is niet heel stabiel en wordt binnen 4-6 weken weer afgebroken. Daarom wrodt het collageen gecrosslinked. Dit kan met glutaraldehyde of EDCNHS. Glutaraldehyde is een sterke crosslinker, maar crosslinked ALLES. Is ook toxisch in het lichaam. EDC-NHS is een peptide binding tussen twee collageen moleculen. Je kunt zelf variëren met de mate van crosslinking. Chitosan Is een ander biomateriaal. Afkomstig uit garnalen. Het wordt gemaakt door de-acetylering. In het lichaam wordt het afgebroken door lysoszyme van de macrofagen e.d. van het immuunsysteem. Hoe snel het afgebroken wordt is afhankelijk van de hoeveelheid de-acetylering. De weefselreactie op chotisan is minimaal. Er gebeurt weinig en een reactie is vaak heel mild. Er is geen FBR. Het is echt mechanisch niet heel sterk. Je kunt het gebruiken voor: - Verbandmiddelen, - Scaffold voor chondrocyten - Scaffold voor stamcellen bij tissue engineering van het bot ECM ECM kun je decellularizeren en vervolgens van nieuwe cellen voorzien bij weefsels of organen. Het decelluleren is echter nooit 100% compleet en als er nog oude cellen aanwezig zijn krijg je een imuunrespons: - Van T-helper 2 cellen. - Geen Th-1 cellen, dus geen celgemedieerde afstoting. - Ook nauwelijks complement activatie. - Wordt vaak afgebroken en vervolgens vervangen door lichaamseigen. Door het te crosslinken kan het niet degradeerbaar of langzaam degradeerbaar worden. De reactie van het lichaam is vervolgens om nieuwe bloedvaten in het ECM aan te maken. Vervolgens komen er monocyten op af en wordt er een nieuw ECM gemaakt. Hierin kunnen de volgende factoren een rol spelen: groeifactoren, cytokines, bioactive metaboliten. Silk fibroin Dit wordt gebruikt voor structuren in het oog. Dit vliesje wordt transparant door polyetheen er door te mengen. #8 Synthetische polymeren. We kunnen ook hier stoppen, maar we kijken verder naar de mogelijkheden van de synthetische polymeren. Zij moeten: - Lijken op ECM, dus adhesie, differentatie, proliferatie. - Gepast zijn voor specifieke gevallen - Poriën hebben voor goede communicatie en voedingsstoffen - In het beste geval ook drug release. In ons lichaam vinden we de volgende polymeren terug: DNA RNA Eiwitten Polysacchariden Cellen kunnen met/door elkaar organiseren. Neem de menselijke tand. Ontstaat uit 2 celtypes en in een uiteindelijke tand zitten veel meer cel typen. Als je de twee eerste celtypes isoleert en ergens anders plaatst, groeit er alsnog een tand uit. Bioinert – Producten die in het lichaam geen reactie oproepen zijn bioinert. Uiteindelijk roepen synthetische biomaterialen altijd een reactie op, maar dit hoeft niet verkeerd te zijn. Bioactief – Producten in het lichaam die uit zich zelf degraderen en groei van cellen stimuleren. Tegenwoordig willen we geen biomaterialen die bio-inert zijn of bioactief, maar regeneratief. Dus die in het lichaam het vermogen van regeneratie stimuleren, door bijvoorbeeld drug release. Er zijn verschillende biomaterialen die al veelvuldig worden gebruikt, deze zijn niet RM maar vaak inert. Voorbeelden zijn; dacron, teflon, polyurethane en siliconen. Polymeren Polymeren hebben mechanische eigenschappen zoals elasticiteit, stress/strain, sterkte of isotropie. – De eigenschappen zijn in alle richtingen hetzelfde. Een bot is anisotrope want het is niet in alle richtingen even sterk. Polymeren ontstaan door polymerisatie. Als je polymeren wilt gebruiken als biomateriaal mag geen enkele stof die een rol speelt in de polymerisatie giftig zijn. Denk aan alle monomeren, starters/stoppers. We maken onderscheid tussen de degraderende en niet-degraderende polymeren. Niet-degraderende polymeren PMMA – Poly Methyl metha crylate. Dit is een polymeer die als een soort ‘cement’ wordt gebruikt. Wordt veel gebruikt bij de orthopeed, tandarts . pHEMA – Dit is een polymeer die je terugvindt in de zacht contactlens. PEG/PEO – Poly ethylene oxide Deze polymeren binden heel veel water, hierdoor ontstaat er een hydrogel en dit voorkomt binding van materialen zoals eiwitten en cellen. Dit is handig bij toepassing als je iets door het lichaam wilt laten reizen maar het niet afgebroken mag worden. PDMS – Polydimethylsiloxane. Dit zijn siliconen. Deze worden gebruikt als implantaten, maar ook voor contactlenzen. Wel degraderende polymeren. Dit wordt veel gebruikt voor bijvoorbeeld hechtingen die uit zich zelf moeten oplossen, maar ook voor ‘drug delivery’ in het lichaam. Ook zijn ze handig bij open buik operaties, om verklevingen te voorkomen leggen ze er adhesie preventies tussen die in de loop van de tijd weer oplossen. Zonder deze zou alles in de buik (kunnen gaan) verkleven. Het degraderen hoeft niet oiv een biologische agent, kan ook door hydrolyse – het oplossen door water. Polyesters – Polyurethaan – Crosslinking polymeer netwerken – Door crosslinking kunnen polymeren stabieler gemaakt worden. Hydrogel – Kunnen worden ingebracht via injectie, is een biomimetica en kan goed overleven door hoge H2O gehalte. Als er degraderende biomaterialen gebruikt worden is het idee dat deze in de loop van de tijd degraderen en in die tijd het lichaam zelf het weefsel vervangt. Cel oppervlakte De oppervlakte is ook van belang. Zo is er een wet die wat zegt over hydrofiliteit. Grote binding met oppervlak Hydrofoob Kleine binding met oppervlak Hydrofiel Aan een oppervlakte gaan eiwitten kleven, aan deze eiwitten kunnen de cellen binden. Welke eiwitten in welke vorm gaan binden hangt af van de eigenschappen van het oppervlakte. Er zijn allemaal technieken om het oppervlak aan te passen. Zo kun je bijvoorbeeld een oppervlakte gevoelig maken voor een bepaald eiwit en dit eiwit zo immobiliseren. Je kunt een biomateriaal dus coaten met eiwitten. Normaal wordt een ECM geproduceerd en gehecht door de cel zelf. Je kunt ook synthetische polymeren combineren met de natuurlijke combineren. Een toepassing hiervan is heparine – Heparine voorkomt bloedstolling door het binden van groeifactoren zoals VEGF, TGF-β en bFGF. Met nanofibers kun je cellen laten differentiëren in plaats van alleen differentiëren. #9 Biomaterialen integratie Biologische knieprothese Een toepassing van biomaterialen is het maken van een knie prothese op de volgende wijze: Het wegnemen van kraakbeen in een gewricht (articulair kraakbeen) Cellen hieruit isoleren 3D printen en zo een scaffold maken Geïsoleerde cellen op de scaffold zetten Het geheel terug plaatsen. Dit alles is gebeurd bij een konijn en na verloop van tijd herstelt dit geheel tot een gewricht!! Dit is TE, maar door het gebruik van de scaffold is het dus ook een vorm van biomaterialen. De oppervlakte van het biomateriaal heeft veel invloed. Zo heb je materiaal met poriën van <60 nm dan gaan cellen hier in zitten. Zijn de porien >70 nm dan niet meer. Dit is aangetoond met fluorisatie tegen eiwitten die botcellen tot rijping brengen. Hoe meer stimulatie hoe meer botvorming en dit kun je dus meten door fluorisatie te meten. In een scaffold met de juiste grootte poriën zonder regelmaat was dit het sterkst. Nog een voorbeeld is fibrose. Een fibroblast of myofibroblast. Dit heeft te maken met hoe stijf het materiaal is waar het op groeit. #10 Foreign Body Reaction Biocompatibility – Verenigbaarheid met het lichaam. Om te testen of een product wel biocompatibel is wordt het onderworpen aan een heel scala van testen, dit is ISO testing. Er worden verschillende eisen gesteld aan een biomateriaal: Geen (locale) toxiciteit Het mag niet toxisch zijn voor omliggende cellen. Geen genotoxiciteit Het mag geen mutaties veroorzaken. Geen immuun toxiciteit Het moet geen immuunrespons oproepen. Geen pyrogeniciteit Het mag geen koorts veroorzaken. Hemocompatibel Moet opgaan in het bloed. Geen stolling veroorzaken. Geen systemische cytotoxiciteit Het mag geen andere delen van het lichaam beschadigen. Voor de locale cytotoxiciteit kun je dit gewoon testen op gekweekte cellen in vitro en het materiaal er bij aanbrengen. Daarnaast kun je de toxische ingrediënten van je biomateriaal bij gevoelige cellen toeveogen om te kijken hoe die reageren. Biocompatibiliteit houdt in dat een materiaal in staat moet zijn om te presteren in geschikt moet zijn voor een specifieke applicatie in de gastheer. Je wilt hierbij geen Foreign Body Reaction (FBR) oproepen. Dit is in de praktijk een probleem De reactie kan primair en secundair optreden. Dit kan zorgen voor (te vroege) resorbtie van het biomateriaal, het loslaten van een implantaat, of chronische ontsteking. Oplossingen hiervoor zijn modificatie van het materiaal en het beïnvloeden van de FBR door bijvoorbeeld ontsteking te remmen. Hoe de FBR reageert hangt af van waar geïmplanteerd wordt. Weefsels Hard/zacht weefsel of in het bloed Het niveau van de reactie Op moleculair/cellulair/weefsel/orgaan/systemisch/organisme niveau Fysische omstandigheden Denk aan PH en omgeving. Er kan zelfs een FBR ontstaan terwijl een implantaat niet giftig is. Neem collageen in de lippen, collageen is een lichaamseigen product. Het lichaam kan het toch aanvallen als er te veel is. Het proces van FBR 1. Er is een verwonding/lichaamsvreemd materiaal wat in het lichaam komt. 2. Er treed een ontstekingsreatie op: - Eerst komen de PMN’s = granulocyten. Dit is het pus wat je tegenkomt bij ontstekingen. - Daarna komen de macrofagen. Deze zijn voor het opeten van de stof en ook voor het reguleren van de cellen. - Dan komen de fibroblasten deze zijn van belang bij het herstellen/remoddelen. 3. Er vindt angiogenese plaats bij het materiaal, er worden dus nieuwe bloedvaten gevormd om het weefsel te voorzien van zuurstof en voedingsstoffen. 4. Er kunnen giant cells ontstaan. Deze zijn ook van belang bij het ‘verteren’van lichaamsvreemde materialen. 5. Inkapseling van het materiaal. Eiwitten in het serum gaan plakken aan de oppervlakte van biomaterialen. Dit komt omdat een eiwit verschillende eigenschappen kan hebben; polair/apolair/positief/negatief geladen. Een oppervlakte van een biomateriaal heeft vaak ook wel van deze eigenschappen. Afhankelijk van welke eigenschappen kunnen er verschillende type eiwitten gaan binden. Dit heeft te maken met het Vroman effect. Eerst gaan er makkelijke, mobile eiwitten aan het oppervlak binden, maar in verloop van tijd laten deze weer los omdat er (minder mobiele) eiwitten aan komen die een sterkere affiniteit hebben voor het oppervlak. Zo binden albumine > globuline >fibrogenen > Factor XII. Wondgenezing. Het proces van wondgenezing heeft wel wat weg van de FBR. In wondgenezing zijn er PMN’s en zij zorgen voor de recrutering van macrofagen en fibroplasten. Hierbij is fibrine een scaffold voor nieuw weefsel. De bloedvaten zijn nodig voor voedingsstoffen en afvoer van afvalstoffen. Bij een FBR is het bijzonder dat het op verschillende materialen en verschillende manieren kan reageren, maar het uiteindelijke resultaat is altijd het zelfde namelijk inkapseling. De belangrijkste cellen bij wondgenezing + FBR zijn: Bloedplaatjes Neutrofielen Macrofagen Fibroblasten Lymfocyten Er is altijd een balans van anti-inflammatoir en inflamatoire signalen: IL-1β, TNFα, IFNγ IL-10, IL-6. Bij het inplanteren van biomaterialen groeit er direct een netwerk aan bloedvaten om het materiaal heen, dit is belangrijk en gebeurt snel. In het biomateriaal zelf zit ook geen toevoer van bloed. Dit gaat door stimulatie van VEGF. Daarnaast worden er door de inflamatoire signalen PMN’s en macrofagen opgeroepen. Onder invloed van TGFβ groeit de matrix, en woren er fibroblasten gerecruteerd. Er kunnen ook rezue cellen ontstaan, deze liggen dan om het biomateriaal heen en geven cytokines af. Zij proberen het materiaal te verteren. Als het materiaal niet verteerd kan worden, wordt het ingekapseld. De afbraak kan van binnen – buiten of van buiten – binnen. De afbraak reactie is mild als er minder cellen omheen liggen en deze cellen rustig zijn. De reactie is dus sterker bij meer ccellen. Je ziet ook verschil tussen (knaag)dieren. Zo zie je duidelijke verschillen tussen de FBR op dezelfde producten in een muis of in een rat. Bij muizen is de ingroei/fagocytose en reuze cel formatie beduidend minder. Cross-linked collageen Collageen kan chemisch gecrosslinked worden met twee verschillende producten; HDSC of GDSC. De beide materialen creëren hun eigen verchillende micro omgeving en hierdoor kan HDSC niet worden afgebroken en GDSC wel. Biomaterialen hebben dus invloed op hun omgeving. Een groot verschil tussen de twee stoffen is de formatie van de reuze cellen. Deze worden niet of nauwelijks geproduceerd bij GDSC en wel bij HDSC. Wat tegenstrijdig lijkt omdat reuze cellen een functie hebben van degraderen van het materiaal. Hoe het dus komt dat juist HDSC niet wordt afgebroken, waarschijnlijk door de afgifte van IL-10 door de reuze cellen. Ook wordt er in HDSC zelf IL-10 geproduceerd. Hierdoor wordt TIMP-1 (stok in krokodillenbek) gestimuleerd en kunnen MMP’s (pacmans) hun werk niet doen, dus geen degradatie. In deze situatie is de reuze cel dus niet van belang voor degradatie maar voor regulatie. Zo kunnen ook wij gebruik maken van materialen in een scaffold om het FBR te beïnvloeden.
