PCR technieken. Verslag Controle-run PCR 22-12

PCR technieken.
Verslag Controle-run PCR 22-12-2015. Two dicotyle
plants tested on mitochondrial highly preserved genelocations.
INLEIDING
Gezien het feit dat de laaste PCR-tests op Solanum steeds slechter gingen scoren, zelfs bij
aardappels di ervoor wel resultaat gaven, is het de hoogste tijd dat een analyse plaatsvindt die
moet blootleggen wat er gaande is.
Het vermoeden bestaat dat er toch contaminatie optreed, dNase;s in de oplossingen terecht
komen en dat de concentraties onvoldoende in de gaten worden gehouden.
In deze test wordt uitsluitend gewerkt met de controlprimer en met beide sets planten-kts:
F130 en F160.
Als modelplant werden genomen: spinazie en een lipbloemige uit de tuin.
UITVOERING:
Uitsluitend worden in deze test de controlprimers gebruikt (met gele dopje).
Primers voor Solanum.
Locus
Control1
Control1
repeat
chloroplast DNA
chloroplast DNA
Primer
AGTTCGAGCCTGATTATCCC
GCATGCCGCCAGCGTTCATC
Tm*
Tm
62
62
Alleles
1
1
size
297 bp
297 bp
Genbankno
De control-primers testen op een stuk DNA dat alle (groene) planten in hun chloroplasten
bezitten (highly conserved). Alle groene plantendelen zouden een positieve uitslag moeten
geven.
Er werden in deze test twee protocollen gebruikt: F130 en F160.
F130:
10 uL PCR-buffer
0,5 uL Control-primersset
0,4 uL DNA-polymerase II
0,5 uL Sample
8.6 uL Water, feitelijk namen we 9,0 uL (AQ, hot-sterile)
Hier de poging om 0,5 uL te nemen door 1,2 uL op te zuigen en te splitsen; de pipet werkt slecht met hoeveelheden < 1,0 uL
F160
10 uL
0,5 uL
0,5 uL
9,0 uL
PCR MasterMix
Control-primersset
Sample
Water (dNase free water fabrikant)
Van de planten is 3 mm2 gesneden en met cruching in een 0,2 ml ep onder toevoeging van
20ul Dilutionbuffer het DNA vrijgemaakt. Van beide planten zijn ook twee vedunninge
gemaakt door 2 uL vloeistof te nemen en aan te vullen met 18 uL dNase-vrij water (AQ, hotsterile).
Volgens onderstaande werkwijze is de PCR ingezet:
buis 1 Spinazie, F130
buis 2 Spinazie, F130, 10x verdund DNA
buis 3 Lip, F130
buis 4 Lip, F130, 10x verdund DNA
buis 5: 50 bp ruler.
buis 6 Spinazie, F160
buis 7 Spinazie, F160, 10x verdund DNA
buis 8 Lip, F160
buis 9 Lip, F160, 10x verdund DNA
Procedures in schema:
1.
3.
Het maken van de gel:
1.
25 ml 10X TBE buffer
2.
Voeg toe tot 250 ml met auqadest
3.
Hiervan 80 ml genomen voor de gel. Toevoegen 1,6 gr agarose (2%)
4.
45 sec magnetron -> swirl -> 45sec magn. -> swirl-> 30 sec magn.
5.
Cool down
6.
6 uL EtBr erbij (vanuit 1% flesje)
7.
Zijkantjes goed vastzetten en gel gieten bij net niet pijn-temperatuur.
8.
Als de zaak gestold is: Overgieten met de rest van de buffer.
Totaal zit erin de bak 300-350 ml TBE buffer.
DILUTED: Per plant-materiaal PROTOCOL F130
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
13.
13.
4.
DILUTED: Per plant-materiaal PROTOCOL F160
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
12.
13.
13.
13.
5.
0.2 epje
20 uL Dilutionbuffer
Crush 2 mm2 met pipetpunt.
vortex kort 10 sec
centrifuge 30 sec
Laat even staan 2 min.
Neem 0.5 uL supernatant.
0.2 epje
10 uL PCR buffer
0.6 uL primermengsel CONTROL
0.5 uL Polymerase
voeg die 0.5 uL supernatant toe.
Vul met water aan tot 20 uL
vortex en centrifugeer beide kort ca 20 sec.
Laat 30 min staan.
0.2 epje
20 uL Dilutionbuffer
Crush 2 mm2 met pipetpunt.
vortex kort 10 sec
centrifuge 30 sec
Laat even staan 2 min.
Neem 0.5 uL supernatant.
0.2 epje
10 uL PCR MASTERMIX F160
0.6 uL primermengsel CONTROL.. Stap 11 ontbreekt.
voeg die 0.5 uL supernatant toe.
Vul met water aan tot 20 uL
vortex en centrifugeer beide kort ca 20 sec.
Laat 30 min staan.
PCR programma 70-72-74
fase 1:
15 min 98 oC
fase 2:
5 sec 98 oC
5 sec 51 oC (Volgens literatuur en eerdere goede resultaten)
30 sec 72 oC
herhaal hierna nog 39 X
fase 3:
5 min op 72 oC
fase 4:
oneindig op 4 oC
Geen bellen!
6.
DNA 50 bp Ladder:
1.
Neem 0.2 ml epje
2.
Voeg 3.0 uL DNA-ladder toe
3.
Voeg 3.0 uL Loading dye toe #SM0613
4.
Voeg nog 12 ml H2O toe. Samen 18 uL Is meer dan genoeg voor één gel.
7.
1.
2.
3.
4.
Gel electroforese
Nadat de PCR klaar iswordt aan alle epjes die blanco zijn, extra loading dye toegevoegd.
Laden van 18 uL van elk monster in de gel:
Run:
10 min op 50 Volt
1,5 uur op 100 Volt.
VERWACHTING
De verwachting is dat alle acht tests een positieve uitslag geven op de control-primer.
Hoewel van spinazie en lipbloemigen niets bekend wordt gemeld door de fabrikant, gaan we
er vanuit dat de controlprimers ook hier zullen werken. Een bandje op 297 bp moet dus overal
zichtbaar zijn.
1e run
lane
1
Spinazie
F130
2
Spinazie
F130 10D
3
Labiaat
F130
4
Labiaat
F130 10D
5
50 bp
6
Spinazie
F160
7
Spinazie
F160 10D
8
Labiaat
F160
9
Labiaat
F160 10D
RESULTATEN
Onderstaande table geeft de uitslage weer na het draaien van de gel gedurende ruim 1 uur.
Spinazie
F130
Spinazie
F130 10D
Labiaat
F130
Labiaat
F130 10D
vaag
bandje op
ca 300 bp
vaag, iets
helderder
300 bp
vaag, iets
helderder
300 bp
smear
50 bp
Spinazie
F160
Spinazie
F160 10D
Labiaat
F160
Labiaat
F160 10D
scherp en
duidelijk
op ca 300
bp
smear
scherp en
duidelijk
op ca 290
smear
DISCUSSIE en CONCLUSIE
Gezien de uitslag is: de F130 kit flink uitgewerkt. De F160 kit doet het aanzienlijk beter in
vergelijk met de F130 kit.
Wat opvalt is dat de F130 kit kan dealen met een 10x verdunning van DNA terwijl de F160
kit dat niet lukt; er ontstaan in twee lanes beide smears. Bij nauwkeuriger onderzoek zien we
zelfs een enorme rij van kleine bandjes bij beide verdunningen F160.
De conclusies:
1.
De PCR gel doet het.
2.
De loopvloeistof is goed (100% vers)
3.
De TM waarde van 51 graden is goed.
4.
De gekozen tijden in programma 70 zijn toereikend.
5.
De DNA-extractie werkt dus wel.
6.
De F130 kit is op z'n einde: de dNTP's zullen aan kracht verloren hebben.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
De F160 kit doet het prima. Is ook in overeenstemming met de vorige uitslag van de
controletest.
De dNTP's van de F160 kit zijn dus nog sterk genoeg
De oorzaak van de vorige keer dat alle vloeistof bovenin de buis zat tijdens PCR, werd
veroorzaakt door tussendoor (op het verkeerde moment) even spieken. Klep eraf: temp
daalt, de inhoud vliegt tegen het koudere deksel en blijkt daar zitten… (cohesie
vloeistof/wand)
Gebruikte rules is , ondanks de hoge mate van (onnodige) precisie toereikend.
De bandjes die in de smear ontstaan, zijn niet verklaard.
Kit F160 is dus op dit moment prima bruikbaar met protocol 70.
FOTOMATERIAAL
Figuur 1.0 DNA-gel (2%) van twee plantensoorten: Spinazie en een Labiaat..