pBRLambda15

Sla dit PowerPoint bestand nu eerst onder je groepsnaam op (rechtsklik>End Show, dan: File>Save As)
Opdracht 1
Om DNA te knippen en te kunnen bekijken in een agarose-gel, knipt men veelal een paar honderd nanogram
DNA met een paar units restrictie-enzym in 10 tot 25 microliter van een (voor het enzym optimale)
bufferoplossing.
Onderstaande zes pipetteerschema’s zijn bedoeld voor de volgende knipreactie:
0,5 microgram DNA moet worden geknipt met 5u EcoR I in een volume van 20 microliter
(EcoR I heeft Buffer 1 nodig voor optimale werking).
De hieronder afgebeelde schema’s 1 t/m 6 zijn niet allemaal correct..
Welke van de schema’s is/zijn wél goed voor het inzetten van deze reactie?
(zie ook Info over de gebruikte eenheden) Vul je antwoord in op je antwoordformulier.
1
2
Hulp bij Opdracht 1
• Hoe zat het ook alweer met die eenheden en afkortingen?
Terug naar Opdracht1? Klik hier.
Opdracht 2
3
Zie hieronder een onvolledig kaartje (links) van een fictief plasmide en een nep-gelfoto (rechts) met het
bandjespatroon van digesties daarvan.
Bekijk de twee onderstaande afbeeldingen, probeer ze te begrijpen en vind uit, welke van de
herkenningsplaatsen I t/m IV in het kaartje geknipt kunnen worden door welke van de restrictie-enzymen x,
y en z.
Op welke van de posities 01 t/m 08 in de gel bevinden zich fragmenten a,b,c en d (of combinaties
daarvan). Invullen in op je antwoordformulier.
(z)
(x)
(x)
(y)
Over
pBRl15
pBRl15 DNA, het recombinante plasmide dat gecontroleerd moet worden,
is opgestuurd door een bevriende onderzoeker.
Het is een recombinant plasmide: een klein, circulair DNA uit een bacterie, met een stukje DNA van een
ander organisme, in dit geval een bacterie-virus (een bacteriofaag Lambda) , erin.
De collega meldt ons:
“het kleine EcoRI - BamHI fragment in pBR322 is vervangen door
het EcoRI (positie 26104) - BamHI (positie 27972) - fragment uit Lambda”
en vermeldt ook nog, dat hij niet helemáal zeker weet of het opgestuurde DNA inderdaad het juiste is.
Wij zijn daar mooi klaar mee..
We moeten dus controleren of de DNA-oplossing, die we gekregen hebben inderdaad pBRl15 DNA
bevat.
Dat doen we door dit DNA te knippen met de drie restrictie-enzymen, die we tot onze beschikking
hebben: BamH I, EcoR I en Pst I.
Van zowel het plasmide pBR322 als de bacteriofaag Lambda is de hele basenvolgorde bekend, en dus
ook alle restrictie-enzym-herkenningsplaatsen, die erin voorkomen.
Reken uit, nu je weet hoe pBRl15 in elkaar gezet is, en m.b.v. de informatie op de volgende dia’s,
- hoe groot het pBRl15 plasmide is,
- wáar de EcoR I, de BamH I en de Pst I herkenningsplekken in dat plasmide zitten, en hoevér van
elkaar.
Deze informatie bij elkaar vormt een restrictie-kaart van het plasmide, en kan als een plaatje
weergegeven worden.
4
Info over
pBR322
Nog even ter herinnering: over pBRl15 was het volgende vermeld:
“het kleine EcoRI - BamHI fragment in pBR322 is vervangen door
het EcoRI (positie 26104) - BamHI (positie 27972) - fragment uit Lambda”
Restrictiekaartje van pBR322 met de posities van de BamH I, EcoR I en Pst I
herkenningsplaatsen:
5
Info over
Lambda DNA
Nog even ter herinnering: over pBRl15 was het volgende vermeld:
“het kleine EcoRI - BamHI fragment in pBR322 is vervangen door
het EcoRI (positie 26104) - BamHI (positie 27972) fragment uit Lambda”
Bacteriophage Lambda DNA omvat 48502 baseparen, en is lineair.
Het bevat de volgende BamH I, EcoR I en Pst I herkenningsplaatsen:
5 BamH I knipplaatsen:
op posities
5505 22346 27972 34499 41732
5 EcoR I knipplaatsen:
op posities
21226 26104 31747 39168 44972
28 Pst I knipplaatsen:
op posities
2560 2824 3629 3644 3860 4374 4713 4913 5124 5218 5686 8524 9617 9781
11767 11839 14298 14385 16085 16235 17394 19837 20285 22425 26932
32009 32256 37005
6
Opdracht 3
Gebruik de info van de vorige dia’s om zelf een schetsje te tekenen van pBRl15.
Doe aan de hand van je schetsje het volgende:
Reken uit en vul verder in (op je antwoordenformulier) :
wáar zitten wélke knipplaatsen, als we plek I (zie hieronder) een Pst I plaats laten zijn.
Vul II t/m IV in:
I = Pst I herkenningsplaats (hp)
II = EcoR l hp
III = Pst l hp
IV = Bam H l hp
Vul lengtes (aantal baseparen) in
a = 3332
b = 654
c = 827 of 1041
d = 1041 of 827
7
Opdracht 4
Welk bandenpatroon verwacht je van je digesties, die
je op dit moment in hebt staan?
“Teken” de DNA-bandjes in de gel hiernaast:
Ga over naar EditView (rechtsklik>End Show).
Gebruik onderstaand witte rechthoekje (uit
Autoshapes>BasicShapes>Rectangle) om “bandjes”
te maken in de gelfoto (laan 8 is al ingevuld; zie voor
de groottes van de markerfragmenten je infoblaadje).
Ctrl-sleep het blokje om een nieuw bandje te maken;
Shift-sleep om gemakkelijk precies horizontaal of verticaal te slepen..
Vergeet niet tussendoor je wijzigingen op te slaan!
Vergeet niet, na het maken van de “bandjes”, deze presentatie
op te slaan, en ga dan de ingevulde gel foto van hiernaast
vergelijken met die van een paar andere groepjes, en zorg
ervoor dat jullie het eens worden over de correcte voorspelling
….
Ga dan een foto maken van je échte gel en vergelijk die met de
8
9
Je pBRl15 digestie
Voor als je je infoblaadje niet bij de hand hebt:
Even ter herinnering: als het goed is, heb je je gel “geladen” met de volgende
knipreactiemengsels:
(B = BamH I, E = EcoR I, P = Pst I)
( x = geknipt met)
1.
pBRl15 x B
2.
pBRl15 x E
3.
pBRl15 x P
4.
pBRl15 x BE (= geknipt met BamH I én tegelijk met EcoR I
5.
pBRl15 x BP
6.
pBRl15 x EP
7.
pBRl15 x BEP
8.
Een mengsel DNA fragmenten van bekende grootte en hoeveelheid (is al
afgebeeld op de in te vullen gel..)
Terug naar opdracht 4
Tijd over?
Als je tijd over hebt, kun je hieronder een restrictiekaartje van pBRl15 tekenen,
zoals in dia Opdracht 3, maar deze keer op de juiste schaal…
(zorg, dat je via View>Toolbars>Drawing onderaan je scherm de attributen om te kunnen
tekenen beschikbaar hebt)
10