MEDISCHE GENETICA
advertisement
MEDISCHE GENETICA UITGEWERKTE COLLEGES – JOYCE LOPES [11-11-2013] CHROMOSOMALE AFWIJKINGEN – WESTERS Oorzaken van een ziekte kunnen bij de omgeving liggen (influenza, mazelen etc.), genetisch bepaald zijn (cystic fibrosis) of een mengelmoes zijn van beide (diabetes, hartziektes). Medische genetica: het achterhalen van de rol die genetica speelt in de ontwikkeling van humane ziektes. Er zijn drie types genetische ziektes: 1) Chromosoom afwijkingen. Verlies van een chromosoom of een extra chromosoom is vaak niet verenigbaar met het leven en is de belangrijkste oorzaak van spontane abortussen (50%) 2) Monogene aandoeningen: vaak zeldzaam, veroorzaakt door 1-2 sterke mutaties. Er zijn >6000 ziektes bekend die door een mutatie in 1 gen veroorzaakt worden. 3) Multifactoriele (polygene) aandoeningen: algemeen voorkomend, combinatie van genetische en omgeving oorzaken, veroorzaakt door veel zwakke mutaties. Wat houdt medische genetica in? Kijken naar erfelijkheid van een ziekte binnen families; “Mapping”van ziektegenen op specifieke chromosoom posities: van gen tot eiwit tot ziekte; Linkage analyse (koppelingsonderzoek) Homozygosity mapping Genome-wide association studies (GWAS) Bestuderen van de moleculaire mechanismes waardoor genen ziekte kunnen veroorzaken; Genetische counseling. Erfelijke ziektes worden veroorzaakt door mutaties. CHROMOSOMALE AFWIJKINGEN: cytogenetica Numeriek aneuploidies: extra of ontbrekend chromosoom en poly-ploidies: extra complete set. Door nondisjunctie in de meiose 1 of meiose 2 krijg je een cel zonder chromosoom en een met 2, leidend tot trisomie en monosomie. Er is toename van het risico op nondisjunctie leidend tot trisomie 21 bij toenemende leeftijd. Autosomale monosomie is vrijwel altijd lethaal. Trisomie (op bv 13, 18, 21) is niet lethaal. Sex chromosoom numerieke afwijkingen: Man: Klinefelter (47,XXY) Vrouw: Turner (45,X) Structureel translocaties (reciprook en Robertsoniaans), inversies, deleties, duplicaties. Translocatie: Reciproke translocatie: is het meest voorkomend. breuken in twee verschillende chromosomen, beide chromosomen wisselen fragmenten uit. Een gebalanceerde translocatie geeft doorgaans geen problemen bij de persoon zelf. Wel kunnen deze personen de gebalanceerde translocatie, ongebalanceerd doorgeven aan hun kinderen. Robertsoniaanse translocatie: 2 lange (q) armen van twee verschillende acrocentrische chromosomen (13, 14, 15, 21 en 22) versmelten. De twee korte (p) armen van deze chromosomen gaan meestal verloren (geen essentiële informatie). Ook hier is de drager fenotypisch normaal, de kinderen kunnen trisomie of monosomie hebben. Inversie: een chromosoomdeel wordt er omgekeerd ingezet. Deletie: chromosoomdeel ontbreekt. Dit kunnen ook hele kleine delen zijn microdeletie. Duplicatie: een chromosoomdeel wordt er dubbel ingezet. Bij vermoeden op een chromosomale afwijking: chromosomenpatroon bepalen! Karyotypering: Rangschikken van uitgeknipte, tijdens celdeling (mitose) gefotografeerde chromosomen op grond van lengte, plaats van het centromeer en bandenpatroon. Je kweekt eerst het bloed op lymfocyten gaan delen cellen vastleggen tijdens de mitose cellen op laten zwellen fixeren karyogram bekijken onder de microscoop. Chromosomen zijn aan een specifiek bandenpatroon te herkennen; deleties > 5Mb zijn te detecteren. Andere manier om chromosomale afwijkingen te detecteren is FISH: Fluorescence In Situ Hybridisation. Principe: Detectie aan- of afwezigheid van een bepaalde genomische regio met fluorescent gelabeld DNA (probe). Probe bindt aan specifieke positie op het chromosoom. Met FISH is detectie van microdeletie mogelijk (~1MB). Type FISH probes Centromeer probes: om het aantal van een specifiek chromosoom te bepalen. Locus specifieke probes: om deleties of toename van specifieke loci te bestuderen. Probes die het hele chromosoom aankleuren (bv. Multicolor): om complexe translocaties te bestuderen. M-FISH: multicolor FISH translocaties zijn goed zichtbaar [11-11-2013] MONOGENE AFWIJKINGEN – WESTERS MENDELIAANSE OVERERVING Autosomaal recessief Autosomaal dominant Geslachtsgebonden Autosomaal recessieve overerving ouders van de patiënt hebben de aandoening niet en zijn meestal asymptomatische dragers vaker voorkomen van genetisch verwante ouders (bv neef – nicht) aandoening komt bij mannen en vrouwen in gelijke mate voor voor elk volgend kind van dezelfde ouders is de kans op herhaling 25% vb. cystic fibrosis en Cockayne syndroom. De laatste is een aantasting van het centrale zenuwstel doordat myeline om de zenuwen beschadigd is. Bij een ziekte die erg zeldzaam is, heeft consanguiniteit veel invloed op het vóórkomen van die ziekte (bloedverwanten delen allelen/mutaties). Autosomaal dominante overerving aangedaan persoon heeft meestal tenminste 1 aangedane ouder aandoening komt bij mannen en vrouwen in gelijke mate voor wordt doorgegeven door zowel mannen als vrouwen voor elk volgend kind van dezelfde ouders is de kans op herhaling 50% (als de aangedane ouder heterozygoot is) X-gebonden (geslachtsgebonden) recessieve overerving Vrijwel alleen jongens krijgen ziekteverschijnselen Ouders van de patient zijn meestal niet aangedaan Moeder is vaak asymptomatische drager en kan aangedane mannelijke familieleden hebben Vrouwen kunnen aangedaan zijn, als de vader aangedaan is en de moeder drager is De aandoening wordt niet van een vader op een zoon overgedragen X-gebonden (geslachtsgebonden) dominante overerving zeer zeldzaam aandoening komt bij mannen en vrouwen voor, maar vaker bij vrouwen (vaak spontane miskraam van mannelijke foetussen) kind van een aangedane moeder heeft 50 % kans op de aandoening alleen alle dochters van een aangedane vader krijgen de aandoening Y-gebonden erfelijkheid alleen mannen zijn aangedaan, duh aangedane mannen hebben altijd een aangedane vader alleen overerving van man op man alle zonen van een aangedane man zijn aangedaan Genetische variatie/ mutaties 1) Puntmutaties: enkele basesubstituties in exonen Nonsense: stop codon eerder, verkort eiwit. Silent: vaak niet veroorzaker van ziekte! Missense: leidt tot aminozuur substitutie. Een puntmutatie kan ook in de promotor zitten i.p.v. in het exon. Dan is er geen transcriptie. 2) Insertie of deletie: is eigenlijk ook een puntmutaties. Frameshift vindt plaats. 3) Mutatie van de splice-site: normale splicing bij 5’GT donor site en 3’AG acceptor site. Bij een mutatie vindt splicing later plaats dan waar het hoort. Het intron blijft deels achter als de mutatie aan het begin van het intron zit. Als de mutatie verderop zit, krijg je een normaal deel en een niet-normaal deel. MAAAAAAR hoe vind je die mutatie? Je haalt DNA uit het bloed en vermeerdert de exonen met PCR: denaturatie d.m.v. hitte, primer ‘annealing’, primer extensie. Daarop kun je analyse doen met een DNA sequencer. Het gen met de mutatie is hierbij bekend. Een veel gebruikte methode is Sanger sequencing of dideoxy sequencing. Dideoxynucleotides hebben i.p.v. een OH-groep een H, waardoor DNA synthese stopt als deze bindt. Zo krijg je stukken DNA van verschillende lengtes die eindigen met een dideoxynucleotide. Vervolgens doe je een gel elektroforese om te bepalen wat de sequentie is en daarna gooi je er een software analyse op los. Als de dideoxynucleotides fluorescent gelabeld zijn, kun je de reactie in 1 keer doen scheiden in capillair. ZIE FILMPJE OP NESTOR. Scanning techniek: High Resolution Melting. DNA wordt verwarmd en denatureert. Mutaties in PCR producten zijn detecteerbaar dan omdat ze de vorm van de smeltcurves veranderen. Hierna moet je nog wel sequensen!! Dit is dus wat je daaraan vooraf doet. [12-11-2013] DNA MARKERS EN LINKAGE – VERBEEK Ergens in het genoom moet de positie worden vastgesteld waar de ziekte is begonnen, de chromosomale locus. Vervolgens kun je het gen aanwijzen en inzoomen op de afwijking in het gen. SpinoCerebellar Ataxia (SCA): verkleind cerebellum (kleine hersenen). Mensen met deze ziekte zijn ‘altijd dronken’, lopen wijdbeens, praten met dikke tong etc. Het is een autosomaal dominant overervende ziekte 50% van de kinderen krijgt ook de ziekte. Het is een monogenetische aandoening variatie in 1 gen zorgt voor de ziekte. Linkage analyse kan alleen bij monogenetische/ Mendeliaanse aandoeningen (!!!). Het is wel zeer heterogeen! Meerdere genen kunnen onafhankelijk van elkaar SCA veroorzaken. Slechts in 30% van de mutatie screenings wordt de mutatie gevonden in een set bekende SCA genen. Genetische marker: variatie in bekende DNA sequentie. Deze zijn nodig om de chromosomale locus te bepalen. Een set van 2 allelen voor een marker noem je een genotype. Een marker kan homozygoot of heterozygoot zijn. Ze worden ook gebruikt om vaderschaptesten op te doen of om deleties te vinden in het genoom. Er zijn verschillende types markers: Restricties sites; Polymorfe markers; SNPs. Restrictie sites: RLFPs DNA sequenties worden herkend door restrictie enzymen DNA knippers. Met RLFPs kun je het verschil tussen geknipt en ongeknipt laten zien. Bij een gel elektroforese zijn dan de mogelijke resultaten: homozygoot voor géén cutting site of heterozygoot of homozygoot voor cutting site. Polymorfe markers: Herhalende DNA sequenties in je erfelijke materiaal. Ze zitten vaak in het niet-coderende deel van het genoom. Polymorfe markers hebben veel verschillende allelen. Dit kan gebruikt geworden om te zien welk deel van het genoom over is geërfd van de vader en welk van de moeder. SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms. Een DNA sequentie variatie waarin er 1 nucleotide anders is. SNPs zijn de grootste bron van genetische variatie, er zijn mega veel bekend. Nadelen van SNPs en RLFPs zijn dat je altijd ‘smaak a’ of ‘smaak b’ krijgt. Ze zijn dus een stuk minder informatief dan polymorfe markers en ook nog duur. Maar er zijn nou eenmaal een stuk minder polymorfe markers. Haplotype: sterk gecorreleerde genetische markers op 1 chromosoom. Elk chromosoom heeft een unieke combinatie van allelen. De correlatie is sterk als de markers dichtbij elkaar liggen. Tijdens de meiose kan er recombinatie optreden door crossing-over. Er is ook alleen recombinatie als er geen sterke correlatie is er ontstaat een nieuw haplotype. De mate van correlatie tussen genetische markers is de Linkage Disequilibrium. Een lage LD zorgt voor meer recombinatie fracties. Recombinatie in lage LD gebieden (<0,5) leidt tot haplotype blocks. LD= 1: maximale correlatie. Genetische linkage studies: Polymorfe markers die op regelmatige afstand van elkaar af liggen worden 1 voor 1 getest op linkage met de ziekte van interesse. Principe: twee loci die dichtbij elkaar liggen op een chromosoom worden samen overgegeven ofwel ze zijn aan elkaar gelinkt. Bij een grotere afstand tussen de loci, kan er meer recombinatie plaatsvinden. Linked loci: recombination fraction θ < 50% Unlinked loci: recombination fraction θ = 50% Wat je dus eigenlijk doet is recombinanten tellen. Zijn die er amper, dan is de correlatie tussen marker en ziektelocus sterk en weet je dat je in de buurt zit. θ is dus ook een maat voor afstand! Een centiMorgan wordt gedefinieerd door de recombinatie fractie: 1 cM = 1% recombinatie Je wil een haplotype vinden die de zieke mensen wel hebben en de gezonde niet. Hoe krijg je linkage? - Informatie op twee loci (ziekte- en markerlocus) wordt verzameld in een groep families, liefst 1 familie met meer dan 10 personen. - De kans op het verkrijgen van bepaalde data als de twee loci gelinkt zijn bij een specifieke recombinatie frequentie is vergeleken met de kans dat ze niet gelinkt zijn. - De ratio van de twee waarschijnlijkheden geeft de kansen voor linkage of tegen linkage. - Het resultaat wordt uitgedrukt als lod score =log van die waarschijnlijkheden. Bij een lod score van +3 is de linkage bevestigd. Elke informatieve meiose draagt 0.3 bij aan de totale lod score. Het is relatief makkelijk om een ziektegen te identificeren, hiervoor is wel functionele analyse nodig (op patiënt materiaal). VB. SCA: op patiënt materiaal kun je immunochemie toepassen, kijken naar de eiwit en RNA expressie en de proteomics (biologische pathways). Daarnaast kun je plasmides gebruiken en dan mutant eiwitten vergelijken met het wild type (lokalisatie, functie, expressie). Hier heb je models voor nodig, muizen bijvoorbeeld. [13-11-2013] HAPLOTYPE SHARING TEST – V/D ZWAAG De haplotype sharing test kan genen identificeren die Mendeliaanse ziektes veroorzaken. VB: erfelijke cardiomyopathie Erfelijke hartspierziektes kunnen leiden tot hartfalen en plotse hartdood op jonge leeftijd (voetballer die midden in een wedstrijd een hartstilstand krijgt bijvoorbeeld). Hierbij spelen variabele expressie van de aandoening en onvolledige penetrantie een rol. Bij onvolledige penetrantie heeft de persoon de aandoening wel, maar komt die niet of niet helemaal tot uiting. Van erfelijke cardiomyopathie zijn 5 subtypen. Het is autosomaal dominant en genetisch zeer heterogeen. Hypertrofische CM: linkerventrikel pomp te hard, je krijgt een vergroting van de hartspier. Dilaterende CM: ventrikel pompt niet hard genoeg, je krijgt vergrootte rechter en linkerventrikels. Bij meerdere aangedane familieleden kan linkage analyse worden overwogen. Meestal is de stamboom echter te klein: minder dan 10 meioses dus lod score van 3+ is onmogelijk. Een alternatief is dan de haplotype sharing test. Eventjes nog een keer, haplotype= combinatie van allelen op een chromosoom. Principe van de test: grote gedeelde haplotypes zijn afkomstig van een gedeelde voorouder. Je kijkt dus naar welk haplotype de aangedane familieleden gemeen hebben. Hoe groter het gedeelde haplotype, hoe groter de kans dat daar het gemuteerde gen gelegen is. Stappenplan bij de HST: Genotyperen van aangedane familieleden Bepalen van langste haplotypes Analyse van genen in deze haplotypes Het kan al vanaf 7 meioses helpen om het gemuteerde gen te vinden in families met autosomaal dominante ziektes. Autosomaal recessief? Dan homozygosity mapping. Hierbij wordt gezocht naar gedeelde homozygote ziekten. Vaak zijn hier aanwijzingen door consanguiniteit. Haplotype analyse van founder mutaties. Founder mutaties zijn afkomstig van een gedeelde voorouder. Het is het tegenovergestelde van recurrent mutaties. Ze zijn heel lang geleden gestaan en kunnen in meerdere groepen voorkomen. Haplotype analyse wordt gedaan d.m.v. microsatellieten (bv. CACA repeats) en wordt gebruikt om het founder effect aan te tonen en de leeftijd van de mutatie te bepalen aan de hand van lengte van het gedeelde haplotype (gedeelde haplotype wordt steeds korter met de tijd door recombinatie). [13-11-13] MULTIFACTORIELE AANDOENINGEN – WESTERS Multifactoriele/ polygene aandoeningen zijn vaak algemeen voorkomend, een combinatie van meerdere genetische en omgevingsfactoren, veroorzaakt door veel zwakke mutaties en de erfelijkheidspatronen zijn complex. VB. lengte: is sterk genetisch bepaald, maar in hoeverre? Dit kan berekend worden met de Pearson correlation 2 coëfficiënt (r). r x 100% = erfelijke bepaling. Kunnen we de genetische varianten ook vinden dan? Bij een complexe aandoening heb je goeie en slechte genetische varianten. Als je teveel slechte varianten hebt, ben je uit balans en word je ziek. Simpel model: een eigenschap wordt volledig door genen bepaald. Hoe meer genen erbij betrokken zijn, hoe betere normaal verdeling je krijgt. MAAR vaak speelt de omgeving ook een rol drempel model. Door een combinatie van te veel slechte genen en veel slechte milieufactoren kan de drempel worden overschreden en ben je ziek. Mensen met een goede combinatie hiervan vertonen een normaal fenotype. Er is vaak een variabel ziektebeeld, de ziekte uit zich niet altijd hetzelfde omdat de risicofactoren ook niet altijd hetzelfde zijn. Ernstige vormen zijn zeldzamer en hebben meer risicofactoren, ook meer risicogenen. Kans op multifactorieel bepaalde aandoening met drempelwaarde: het herhalingsrisico op de afwijking binnen een familie is groter naarmate meer familieleden de afwijking hebben en ook de afwijking bij een aangedaan familielid ernstiger is. Drempelwaarde kan voor mannen en vrouwen verschillend zijn. Het herhalingsrisico is groter als het aangedane familielid van het geslacht is dat het minst frequent de aandoening vertoont. VB. Pyloris stenose komt vaker voor bij jongens dan bij meisjes. De kans dat een jongen het ook krijgt is groter als hij een aangedane zus heeft dan als hij een aangedane broer heeft. Genetische risicofactoren voor complexe ziekte kunnen worden bepaald via onderzoek naar een cluster in een familie of tweelingonderzoek. Cluster familie: Probleem bij multifactoriele aandoeningen is dat er geen duidelijk overervingspatroon is. Er zijn meer aangedane gevallen dan wordt verwacht bij toeval in de populatie, maar je ziet geen duidelijke dominante, recessieve etc. overervingspatronen. Met familiestudies doe je onderzoek naar de recurrence risk: de kans dat een volgend kindje ook de ziekte krijgt. Daarvoor kijk je naar het aantal aangedane zusjes/broertjes in heel veel families: empiric risk. Het familierisico is groter dan het populatierisico sibling relative risk (λs). De λs voor een ziekte is de kans van een ziekte in een verwant gedeeld door het voorkomen in de populatie. VB: Type 2 diabetes mellitus (T2D) Aantal T2D verwanten met T2D: 18/100 Populatiefrequentie: 5/100 RR = (18/100)/(5/100) = 3,6 Conclusie: Een verwant van een T2D patiënt is 3,6 keer meer waarschijnlijk om aangedaan te zijn dan een verwant van een niet-T2D individu. Tweelingstudies Test of de ziekte concordantie (=gelijkheid) hoger is bij monozygote tweelingen (100% genetisch identiek) vergeleken met dizygote tweelingen (50% genetisch identiek). VB: T2D MZ tweelingen ~ 80% concordantie DZ tweelingen ~ 40% concordantie Conclusie: genen spelen een significante rol, maar omgevingsfactoren zijn ook belangrijk. Het relatieve risico van een sibling is niet gerelateerd aan het aantal ziekte-vatbaarheid genen! Het zegt alleen dat genetische factoren een rol spelen, maar niet hoeveel factoren en wat de individuele bijdrage van de factoren zijn. Welke genetische factoren spelen dan een rol?! SNPs bevatten heel veel genetische variatie, er zijn al mega veel bekend in het genoom. Die gebruik je bij GWAS: genome-wide association studies. Principe van GWAS: je neemt een grote groep zieke personen en een grote groep gezonde mensen (1000 bijv.) Van beide neem je DNA dat je op een SNP chip (>500,000 SNPs) zet. Als het DNA bindt op de chip weet je welke variant dat DNA bevat en kun je mogelijke nieuwe ziekteloci vinden. Zo kun je de verschillen in SNP frequentie zoeken om de SNPs geassocieerd met de ziekte te vinden. Het is belangrijk om je te realiseren dat GWAS chips slechts een deel van de genetische variatie in het menselijk genoom bevatten. Block structuren maken tag SNP selectie mogelijk: Hoe werkt tag SNP selectie? ONTHOUD: populatie associatie studies doe je dus bij multifactoriele ziektes. Het gedeelde DNA is maar klein (kb’s). Bij monogene ziektes doe je familie linkage studies, lange stukken gedeeld DNA (Mb’s). [18-11-13] ONCOGENETICA –WESTERS Kanker: verzamelnaam voor een zeer heterogene groep aandoeningen. Het biologische kenmerk is dat er een abnormale en ongecontroleerde groei is van lichaamscellen. Kanker ontstaat door veranderingen in erfelijk materiaal. Afwijkingen in het DNA: Spontane mutaties: bijv. tijdens DNA-replicatie, celdeling. Geïnduceerde mutaties: bijv. UV straling, radioactiviteit, chemische stoffen. Voorbeelden veroorzakers: chemicaliën in sigaretten, UV van de zon, virussen die genen voor celgroei veranderen. Kanker is soms erfelijk bepaald, van de meeste varianten bestaat een erfelijke variant. Erfelijke varianten van kanker zijn over het algemeen vrij zeldzaam. Ook bij kanker is vaak sprake van non-penetrantie: wel drager, ziekte komt niet tot uiting. Bewijs dat kanker en genetica gelinkd zijn: Chromosomale afwijkingen in kanker (vaak een wirwar van translocaties) Carcinogenen zijn mutagenen Clustering van kanker in families Individuen met een DNA herstel deficiëntie syndroom hebben een verhoogd risico op kanker Mutaties: somatisch en kiembaan Bij normale groei zal een cel waar geen reparatie bij DNA schade is, in apoptose gaan. Bij een ophoping van mutaties in een cel gaat de cel niet dood, maar ongecontroleerd groeien kankercel. Klonaal effect: 1 cel kan leiden tot een kanker. Proto-oncogenen: groeifactor bindt aan receptor signaling enzymes activeren transcriptie factoren in de kern DNA replicatie cel groei en proliferatie. Oncogenen: er is een altijd actieve groeifactor receptor / signaal eiwit van ander actief oncogen activeert regulatoir eiwit / overexpressie van intracellulair signaal eiwit transcriptie cel proliferatie. Tumorsuppressorgenen: Ze kunnen de verschillende stappen in de groei pathway inhiberen. Ontdekt doordat in tumoren verlies van stukken van een bepaald chromosoom werd waargenomen. Knudson two-hit hypothese: bij een tumorsuppressorgen (TSG); eerste ‘hit’ bijv. mutatie in één kopie van het allel nog niks aan de hand. Bij de tweede ‘hit’, bijv. een deletie in de andere kopie, zal er tumor groei plaatsvinden. Bij sporadische kanker treden er in de loop van de jaren 2 mutaties op. Bij erfelijke kanker heb je de eerste mutatie al geërfd, de kans op kanker is er eerder. Op celniveau is erfelijke kanker een recessieve aandoening; 1 e allel erft over. Maar de kans dat je later toch kanker krijgt (door mutatie 2 allel) is zo groot dat het een dominante aandoening wordt genoemd. p53 is een belangrijk tumorsuppressorgen. Het zorgt ervoor dat er genoeg tijd is om DNA mutaties te repareren door celgroei eventjes te stoppen. DNA herstel genen: bijv. Lynch syndroom (darmkanker). Het wordt veroorzaakt door mutaties in de mismatch repair (MMR) genen. Het MMR systeem herkent normaal gesproken fouten in het DNA die gebeurden tijdens DNA replicatie en repareert ze. Mensen worden gescreend op MLH1, MSH2 en MSH6 genen van het MMR systeem. De mutaties zitten vaak in microsatellieten: herhalende sequenties. Door een defect in het MMR krijg je microsatelliet instabiliteit (MSI), een genetische instabiliteit. Er worden grote hoeveelheden microsatellieten aangemaakt of ze gaan verloren. Dit is een kenmerk van Lynch syndroom! Er zijn markers voor marker length analyse (marker korter= instabiliteit). ≤ 1 marker instabiel: tumor MSI-Low ≥ 2 unstable: tumor MSI-High Meerdere mutaties veroorzaken kanker. Goedaardige tumorcellen groeien lokaal en kunnen niet uitzaaien. Kwaadaardige tumorcellen gaan in bloedvaten, omliggende weefsels en metastaseren. Onduidelijkheden over kanker” Borstkanker. 5-10% heeft BRCA1/BRCA2 mutaties, 10-20% heeft familie history maar geen mutaties. Er is dus familie clustering, maar geen duidelijk overervingspatroon. En er zijn ook nog eens honderden mutaties bekend van BRCA1 en BRCA2. Epigenetica: door methylatie van een promoter is er lagere expressie van herstelgenen meer mutaties, microsatelliet instabiliteit. miRNA: het is betrokken bij sommige kankers, door een gebrek of teveel aan een bepaald miRNA. Het heeft een effect op de hoeveelheid eiwit in een cel. [18-11-13] ERFELIJKE KANKER &DE PRAKTIJK –SIJMONS Multipele Endocriene Neoplasie type 2B (MEN2B): agressieve schildklierkanker. Veroorzaakt door een specifieke RET mutatie. RET is een proto-oncogen, bij te hard werkend RET gaat er te veel groei signaal naar de kern gevolgen zijn afhankelijk van de plaats (codon) van de mutatie. MEN2A is milder dan MEN2B. Het herkennen van erfelijke kanker is belangrijk voor de patiënt én asymtomatisch familielid. Alarmsignalen: 1. belaste familieanamnese, combinatie van tumoren 2. jonge leeftijd bij diagnose (voor dat type kanker) 3. multipele primaire tumoren, in zelfde of verschillende organen Negatieve familie anamnese sluit de diagnose erfelijke kanker in een patiënt met kanker uit. Eigenlijk is dat fout. Het kon om een de novo mutatie gaan; patiënt is de eerst in de familie met de ziekte. Verder kan het komen door non-penetrantie of de vader is niet de echte vader. Familiaire Adenomateuze Polyposis (FAP), ziekte waarbij er megaveel poliepen komen op de darm. Door mutatie in APC gen (tumorsuppressorgen) gaat het epitheel hyperprolifereren ontstaan adenoma (goedaardige woekering) ontstaan carcinoma (kwaadaardige woekering). Retinoblastoom: oogkanker ziekte. Er komt eiwit in het oog waardoor de pupillen wit zijn. Als het multifocaal is, is het 100% erfelijk, unifocaal is 15% erfelijk. In Nederland krijgt 1 op de 8 vrouwen borstkanker. De genen die betrokken zijn bij borstkanker zijn BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN en nog niet ontdekte genen. De mutaties hierin erven autosomaal dominant over. Bij BRCA1 mutatie zijn de cumulatieve kansen op borstkanker en eierstokkanker het hoogst. BRCA2 mutatie kan ook bij mannen zorgen voor borstkanker. De kans dat ze het krijgen is wel veel kleiner, maar als ze het hebben is het erger dan bij vrouwen. Vroege opsporing en preventie is belangrijk bij borstkanker. Gevolgen DNA onderzoek voor verzekeringen: er zijn beschermende afspraken. [19-11-2013] ARRAY ANALYSE – SUIJKERBUIJK Met array-based genoom analyse kun je op zoek naar grootschalige genetisch aangeboren en verworven afwijkingen. Fouten in het genoom kunnen ziekte veroorzaken. De grootschalige chromosomale herschikkingen (deleties, duplicaties, amplificaties, translocaties, inversies,) zijn te onderzoeken met array analyse. De herschikkingen kunnen erfelijk/aangeboren zijn: verandering in alle cellen. Of ze zijn verworven (kanker): verandering alleen in de tumorcellen. Er wordt chromosoom onderzoek (karyotypering) gedaan om afwijkingen in de chromosomen op te sporen en vervolgens na te gaan of de eventuele afwijkingen een verklaring voor het ziektebeeld kan zijn cytogenetisch onderzoek. De celcyclus wordt dan geblokkeerd met colcemid tijdens de metafase, zodat de chromosomen zichtbaar zijn. Kenmerk van karyotypering is dat je een algehele analyse kan doen per individuele cel. Voordeel is dat grote chromosomale afwijkingen worden gedetecteerd, het is goedkoop, geen dure apparatuur nodig. Nadeel is de resolutie 5-10 Mb en delende cellen zijn nodig. Dus noodzaak tot verbeteren van techniek. Met moleculaire cytogenetica kijk je onder de resolutie van chromosomen (<5 Mb). Principe van FISH: Aantonen van aan-/afwezigheid van een bepaalde genomische regio via met fluorescente gemarkeerde DNA (probe) in een microscopisch preparaat. Detectie van microdeleties en structurele afwijkingen zijn mogelijk. Met multicolor FISH is er directe herkenning van kleine translocaties. Is vooral handig bij tumoren, die hebben complexe karyotypes. Beperking bij FISH is het aantal probes en ook dat je delende cellen nodig hebt. CGH: comparative genomic hybridization CGH is een soort omgekeerde hybridisatie: Niet de (oligonucleotide) probe wordt gelabeld (zoals bij FISH), maar het DNA van het te onderzoeken sample. Test genomisch DNA wordt groen gelabeld en referentie DNA rood. Dit laat je hybridiseren op een normaal chromosoom. Daarna kun je het vergelijken: meer groen te zien op het chromosoom duplicatie. Meer rood deletie. Beperking hierin is weer de resolutie van de metafase chromosomen (~3-5 Mb). Daarom worden er microarrays gebruikt: korte geselecteerde segmenten DNA worden in spots geprint op een glasplaatje waarop verschillende DNA probes zitten met bekende locatie aCGH (array-based CGH). Interpretatie van array CGH: SNP array analyse: SNP zijn single nucleotide polymorfism, variaties in enkele base paren die willekeurig door het hele genoom (coderend en niet coderend) zitten. Bij SNP array analyse vergelijk je allel A met allel B. SNP array analyse weergeeft B-allel frequentie (BAF): dit geeft weer hoe vaak het B allel voorkomt ten opzichte van het A allel op een specifieke locatie van het DNA aan de hand van een percentage. Dit geeft extra informatie dan alleen de log R ratio (genomisch). Je ziet namelijk niet alleen of er duplicaties of deleties zijn, maar ook of er verlies van heterozygotie is of juist extra allelen. Hoe ontstaan deleties en duplicaties? Er zijn 3 belangrijke mechanismen: NAHR: non-allelic homologous recombination Tijdens meiose: recombinatie en crossing over tussen sequenties die op verschillende plekken op het genoom liggen, maar wel sterke homologie vertonen wat betreft hun sequentie. Z.g. “Low-CopyRepeats” ofwel LCRs. Ook wel aangeduid als “segmental duplications”. NHEJ: non-homologous end joining Proces van breuken in het DNA die vervolgens foutief worden gerepareerd FoSTeS: Fork Stalling and Template Switching A replication-based mechanism. Low copy number repeats zijn aanwezig in blokken van segmental duplication (sd’s). Resolutie van array CGH dichtheid van de oligos: aantal oligos per eenheid van DNA lengte. In het design van het UMCG zijn de oligos evenredig verdeeld over het genoom. Bij andere instellingen hebben ze een dichte opvulling van oligos op meest relevante gebieden (targets). Dit heeft consequenties voor de plaatselijke resolutie. Array CGH in de diagnostiek: hoe veroorzaken deleties en duplicaties een ziektebeeld? De novo CNV (copy number variant) = verandering in patiënt welke niet aanwezig is bij één van de ouders. Er moet onderscheid gemaakt worden tussen de novo, familiair en neutrale CNV (onschuldige variatie). CNVs: Elk (gezond) individu heeft tenminste 3-11 onschuldige CNVs in zijn genoom; De omvang van onschuldige CNVs kan variëren van <100kb→>>Mb; Deze onschuldige CNVs vindt je dus ook in je patiënt en moet je als zodanig herkennen database. Mozaïek: een deel van de cellen heeft de duplicatie/deletie wel, een deel niet. Verlies van heterozygotie klein aantal genen heeft een ouder-afhankelijk functie, omdat ze verschillend gereguleerd zijn in vader en moeder (= GENOMIC IMPRINTING). VB: patiënt met 46,XX en twee kopieën chromosoom 15 van één van beide ouders (= uniparentale disomie: UPD) 2 kopieën #15 van maternale origine geeft Prader-Willisyndroom (15q11-13) 2 kopieën #15 van paternale origine geeft Angelman syndroom (15q11-13) [20-11-13] NEONATALE SCREENING –DE KONING INBORN ERRORS OF METABOLISM A wordt normaal gesproken gebruikt, maar nu hoopt het zich op doordat het enzym niet werkt. Het lichaam gaat een andere manier bedenken om er toch vanaf te komen, er vormt zich een alternatieve/abnormaal opruimingsstof D. Stofwisselingsziektes zijn genetische aandoeningen, enzymen zijn namelijk eiwitten die door DNA gecodeerd worden. De meeste zijn autosomaal recessieve aandoeningen. Ze zijn makkelijk te behandelen, maar lastig te detecteren. In de meeste aangeboren stofwisselingsziekten worden de hersenen beïnvloed. Patiënten lijden aan: Mentale retardatie; Epileptische aanvallen; Bewegingsstoornissen. In tegenstelling tot de meeste genetische aandoeningen ligt de nadruk op behandeling. Vaak worden de diagnoses al gesteld bij kinderen, maar de ziektes kunnen zich ook op latere leeftijd openbaren. Newborn screening (de hielprik) Wordt al 3-7 dagen na geboorte gedaan bij baby’s. Het bloed komt op filtreerpapiertjes in bloedspots, die vervolgens op de post gaan. Baby’s worden wereldwijd zo vroeg gescreend om te zien of er gelijk gestart kan worden met behandeling als ze een aandoening hebben: hoe eerder je erbij bent, hoe beter. Eerste behandeling stofwisselingsziektes door ontdekking PKU: enzym phenylanaline hydroxylase kan Phe niet verwerken ze worden omgezet tot phenylketonen wordt uitgeplast. De ziekte zorgt voor een verstandelijke beperking. Phenylalanine is een essentieel aminozuur en zit in praktisch al je eten. Proefpersoon kreeg een phenylalanine loos dieet, dit hielp meteen. Serine deficiëntie: patiënten kunnen geen L-serine maken doordat het enzym 3-phosphoglyceraat dehydrogenase (3-PGDH) niet werkt. Symptomen zijn microcefalie, epileptische aanvallen en psychomotorische retardatie. Patiënten worden behandeld met L-serine. Dit is erg effectief tegen de aanvallen, bij vroege behandeling helpt het een beetje tegen de retardatie. Behandeling werkt het best als je begint voordat de symptomen zijn begonnen behandelen tijdens zwangerschap kind kreeg geen symptomen na geboorte. Stofwisselingsziektes vormen de meerderheid van bewegingsstoornissen bij kinderen. Bewegingsstoornissen zijn ziekten waarbij patiënten onwillekeurige bewegingen of abnormale bewegingen maken. Diagnostische procedures worden geleid door de indeling van de bewegingen. Bij kinderen is het gebruikelijk om meerdere bewegingsstoornis fenotypen hebben, anders dan volwassenen. Classificatie bewegingsstoornissen: Hypokinetic movements (move to little) Hyperkinetic movements (move to much) Dystonia, Chorea, Ballism, Myoclonus, Tics, Tremor Ataxia (uncoordinated movements) Symptomen van bewegingsstoornissen zijn in het begin niet heel specifiek. Next generation sequencing gaat verandering brengen in de manier van diagnoses stellen. Er wordt een lange lijst gemaakt van ziektes en gekeken of de patiënt ermee in aanmerking komt. [20-11-13] DIAGNOSTIEK IN DE PRAKTIJK – WESTERS DNA onderzoek proces: Aanvraag formulier wordt ingevuld door een arts voor onderzoek naar desbetreffende ziektes die bij de symptomen horen. Dan moet DNA worden geïsoleerd, kan op verschillende manieren: Perifeer bloedmonster: DNA isolatierobot Chorion villus (foetale vlokken), vruchtwaters, weefselkweken,weefsel in paraffine: DNA isolatierobot Spoedonderzoek: soms handmatige isolatie Principe van isolatie: Zowel rode als witte bloedcellen worden “opgeblazen” door cellysis buffer DNA zit in een oplossing van kapotte bloedcellen Magnetische bolletjes en buffers worden toegevoegd DNA plakt aan de bolletjes M.b.v. magneet worden bolletjes met DNA uit oplossing gehaaldNa wassen van DNA is het DNA klaar om gebruikt te worden DNA laat los van bolletjes door verandering samenstelling buffer. VB. Rett syndroom, MECP2 gen. X gebonden dominante overerving, zeer zeldzaam bij jongens. Grove en fijne motoriek gaan achteruit, stereotypische handbewegingen, verlies communicatie. PCR wordt gedaan van de 3 coderende exonen van MECP2 en daarna DNA sequentie analyse. Bij een mutatie in het gen wordt een stopcodon eerder ingebouwd: CGA naar TGA verkort eiwit VB. SCA spinocerebellaire ataxie Autosomaal dominante overerving, ontstaat door mutatie expansie CAG repeats in SCA genen. Tot 36 CAG repeats ben je gezond. CAG lengtes verschillen bij iedereen, ze worden wel steeds langer per generatie. Bij analyse van SCA mutaties kijk je dan naar de lengte van CAG d.m.v. PCR en agarose gel. Prenatale diagnostiek:doel is opsporen van chromosoomafwijkingen en andere genetische ziektes in foetaal materiaal. Gebruikte materiaal zijn vlokken (vroeg stadium) en vruchtwater (later in zwangerschap). Snelle diagnostiek is vaak gewenst, kan met behulp van QF-PCR: quantitative fluorescent PCR. QF-PCR betreft amplificatie, detectie en analyse van short tandem repeat (STR) markers, die chromosoom specifiek zijn. STRs kunnen qua lengte verschillen tussen ouderlijke chromosomen en erven over als allelen. De primers zijn fluorescent zodat je fragmenten kan detecteren. Bij normale heterozygoot zie je 2 pieken, bij homozygoot 1 piek die 2x zo hoog is (kwantitatieve PCR). Bij een trisomie zie je 3 even grote pieken of 2 pieken waarbij 1 2x groter is. Er zijn STR markers voor chromosomen 13, 18, 21, X en Y. Als je de chromosomen rangschikt op aantal genen, zie je dat op chromosoom 13, 18 en 21 de minste genen zitten. Daarom zijn dat de levensvatbare vormen als daar trisomie is. Autosomale monosomie is niet levensvatbaar. Preimplantatie genetische diagnose (PGD). Via IVF worden eitjes bevrucht. Na dag 3 wordt er gekeken of er bevruchting heeft plaatsgevonden, 8-cellige eitjes worden geselecteerd en getransferd naar de baarmoeder. PGD vindt eerst plaats na de selectie: het membraan wordt opengebroken en 1 cel wordt eruit gehaald daar wordt een embryo biopsy op gedaan (in NL mag dit alleen in Maastricht). Op die ene cel wordt FISH gegooid. Voor sommige ziektes is bepalen van het geslacht genoeg. Voor bijv. testen op Huntington’s syndroom wordt er een PCR gedaan. Is het een gezond celletje, dan kan het in de baarmoeder worden getransferd. [21-11-13] FARMACOGENETICA –HAISMA Klinisch onderzoek bepaalt de effectiviteit en de veiligheid van een geneesmiddel in de gemiddelde populatie. Maar: individuele patienten vertonen een grote variatie in respons op een geneesmiddel. Dus hoe bepalen we welke mensen het meest plezier hebben van geneesmiddelen zonder te veel bijwerkingen? Personalized medicine: maakt gebruik van informatie over een individuele patiënt om preventieve en therapeutische zorg te selecteren of te optimaliseren. Dit is gebaseerd op informatie over gen expressie en DNA sequenties. Farmacogenetica: Onderzoekt het verband tussen genetische variatie en verschillen in de respons op geneesmiddelen. Farmacogenomics: Onderzoekt genoombreed, daar waar farmacogenetica de variatie van slechts enkele genen bestudeert. Farmacokinetiek: de lotgevallen van een stof die aan het lichaam wordt toegediend. ADME: Absorption, Distribution, Metabolise, Elimination Geneesmiddel reageert anders bij een ander genotype, het kan minder snel worden afgebroken langer een hogere concentratie geneesmiddel in het bloed. Farmacodynamiek: de effecten van een toegediende stof op het aangrijpingspunt Receptor, eiwit Normaal neemt de effectiviteit toe bij een hogere dosis en daarmee ook de toxiciteit. Bij een receptor mutatie is er alleen een curve te zien voor toxiciteit en nauwelijks voor effectiviteit. Voor iedereen is dit natuurlijk verschillend! Sommige geneesmiddelen moeten i.p.v. afgebroken juist geactiveerd worden, bijv. codeïne prodrugs. De ‘factor V Leiden-mutatie’ (APC-resistentie) komt bij ongeveer vijf procent van de bevolking voor. De factor V blijft langer actief door de mutatie waardoor de stollingsneiging toeneemt. Door het slikken van de pil wordt de kans op trombose nog meer verhoogd. Hier is sprake van gen-geneesmiddelinteracties waarbij het gen-product een rol speelt in het ontstaan van een ziekte. Het cytochroom P450-systeem speelt een belangrijke rol farmacokinetische reacties. Fase 1 is de biotransformatie fase, fase 2 is de conjugatiefase waardoor het geneesmiddel makkelijk uit te scheiden wordt. Er is een grote variatie aan geneesmiddelen in dit systeem. Er zijn 4 standaard fenotypes (metabolisers) die bij het cytochroom systeem worden gebruikt, bijv. voor CYP2D enzym activiteit varianten. Extensive betekent bijv. dat je het geneesmiddel sneller afbreekt dan normaal. Binnen een populatie zijn er verschillende varianten, er zijn zelfs etnische verschillen. Met een Amplichip450 kun je van 2/3 cytochromen vaststellen wat het genotype is. Met de kennis over de genetische eigenschappen van een persoon kan het effect van geneesmiddelen worden geoptimaliseerd (doseringsadviezen) → geneesmiddelentherapie aangepast aan het genotype van de patient. Maaaaar zeldzame allelvarianten worden met de AmpliChip niet gediagnostiseerd en naast genotype zijn ook andere factoren van invloed op het fenotype. Tamoxifen: een prodrug dat wordt gegeven bij de behandeling van estrogen receptor-positive (ER+) borstkanker. Het wordt omgezet door CYP2D6 in een actieve vorm. 70% van alle borstkankers is ER+ en deze patiënten krijgen Tamoxifen Echter, de frequentie van allelen met gereduceerde of afwezige voorspelde enzymactiviteit is relatief hoog. Het blijkt ook dat trage metaboliseerders (PM) en de gemiddelde metaboliseerders (IM) patiënten minder voordeel hebben van therapie met Tamoxifen dan extensieve metaboliseerders (EM). Meestal is het juist een nadeel dat je een geneesmiddel te snel verbruikt. Thiopurine S-transferase is een fase II enzym betrokken bij inactivatie van een prodrug dat wordt gebruikt bij kankerbehandeling. Bij slechte werking leidt het tot beenmergtoxiciteit. Het wildtype kan een veel kleine dosis medicijn hebben dan de variant genotype. Coumarines remmen de aanmaak van stollingseiwitten in de lever. CYP2C9 betrokken bij het metabolisme van coumarines, bij inactief CYP2C9 hogere dosering nodig. VKORC codeert voor vitamine K epoxide reductase (VKOR), het doelwitenzym van coumarines. Hier moet je de dosering dus aanpassen door te kijken naar beide enzymen. Er kan een voorspellende waarde gecreëerd worden bij borstkanker aan de hand van een genexpressie profiel. Je kijkt naar de genexpressie (RNA) en dan kun je al een voorspelling doen van welke patiënten het beter zullen doen dan anderen. Herceptin werd altijd gebruikt tegen borstkanker maar is alleen effectief in HER2 positieve tumoren. Er wordt een kleuringstest gedaan om HER2 eiwit overexpressie te detecteren. Geneesmiddelen op maat: Recombinante DNA technieken maken onderzoek naar de genetische basis van aandoeningen mogelijk. Dit maakt gerichte ontwikkeling van geneesmiddelen mogelijk. [21-11-13] GENTHERAPIE –HAISMA Principe gentherapie: het gen verpak je als DNA in bijv. een virus komt vervolgens in de kern van de target cel wordt daar afgelezen eiwit productie. Het eiwit is het geneesmiddel. Als je een virus gebruikt, moet je verschil maken in RNA en DNA virussen, of ze delende en niet-delende cellen kunnen infecteren. Adenovirus kan beide infecteren, maar integreert niet. Lenti virus infecteert alleen delende cellen en integreert wel. Bij een niet-virale vector moet er een positieve lading worden toegevoegd worden aan DNA om het de cel binnen te krijgen, of het kan verpakt worden in liposomen (vetbolletjes). Dit kun je gebruiken bij gene repair: je knipt de mutatie open donor DNA zonder mutatie breng je in kans dat DNA gaat uitwisselen. RNA bindt aan het mRNA waardoor dit wordt geïnactiveerd. Er wordt geen eiwit geproduceerd dat je ziek maakt. Small interfering RNA (siRNA): dubbelstrengs RNA dat de cel zelf knipt. Vervolgens wordt er ook in het mRNA geknipt, zo zijn er meerdere ‘aanvallen’ mogelijk. Het retrovirus is een RNA virus. Er zitten terminale repeats (LTR) op het begin en het eind van het genoom. De virusgenen voor replicatie gaan eruit, de eigen genen erin. De LTR blijft en wordt gebruikt als promotor. Ψ= packaging signal, het herkenningssignaal voor het virus. De packaging cell line kun je zien als het fabriekje van de virus, die zijn bij alle volgende dochtercellen aanwezig. Reverse transcriptase is belangrijk bij het retrovirus. Dit principe is gebruikt bij SCID: severe combined immunodeficiency. Bij een mutatie in de γc-keten werkt de cytokine receptor niet meer, waardoor er allerlei regeling wegvalt. Door genen van een gezond iemand via virussen in te brengen bij een ziek kind, kan het beter worden. MAAR de virus promotor kan ook andere genen activeren waardoor er in cellen leukemie kan ontstaan! Adeno-geassocieerde virus is een DNA virus. Het heeft een eiwit mantel. Uiteindelijk dooft expressie van het virus uit omdat het niet integreert met de target cel. Leber’s congenital amaurosis: oogziekte. Mutatie in RPE65. Virus met gezond RPE65 werd in het oog gespoten verbetering in visie! Lipoprotein lipase (LPL) deficiency: vetten kunnen niet goed opgenomen worden uit het bloed. Hiertegen was de eerste gentherapie bedacht. Hemofilie B: Korte-termijn voordelen zijn waargenomen bij adeno-geassocieerd,virus bemiddelde overdracht van de factor IX-gen in de lever in klinische proeven van deze bloedziekte. Adenovirus: is iets groter en heeft meer genen. Dubbelstrengs DNA virus. Alleen de genen die het virus nodig heeft voor replicatie worden eruit gehaald. Wordt vaak gebruikt bij kankerbehandeling kortdurend effect.
