Medische genetica samenvatting

2016/2017
Medische genetica samenvatting
3 typen genetische ziekten:
1. Chromosoom afwijkingen:
a. Medische genetica
2. Monogene aandoeningen:
a. Medische genetica
3. Multifactoriële aandoeningen:
a. Humane genetica & genomics
Medische genetica (1, 2):
-
-
-
Erfelijkheid binnen families
- Klinische genetica: terminologie naar aanleiding van neurogenetische aandoeningen
(bv. Huntington)
Mapping van ziektegenen op specifieke chromosoom posities
- Ziekte tot gen
- Linkage analyse (koppelingsonderzoek, 2)
- Homozygositeit mapping (2)
- Haplotype sharing test (2)
- Genome-wide associating studies (GWAS, 2)
Moleculaire mechanismes die ziektes kunnen veroorzaken (via genen).
- Van ziekte tot gen tot eiwit
1. Extra of ontbrekend chromosoom (numeriek). Kan komen door non-disjunctie tijdens meiose
I of II. Ontbrekend chromosoom (monosomie) is vrijwel altijd lethaal. Non-disjunctie meiose I
als er trisomie is met gameten van één ouder uit twee chromosomen. Non-disjunctie meiose
II als er trisomie is met gameten van één ouder uit één chromosoom.
Structureel:
- Translocaties
o Reciprook: fragmenten van twee verschillende chromosomen. Kan
gebalanceerd of ongebalanceerd zijn.
o Robertsoniaans: twee armen van verschillende chromosomen wisselen.
Kinderen kunnen mono- of trisomie hebben.
- Inversies
- (micro)deleties
- Duplicaties
Het vinden van een chromosomale afwijking:
- Karyotypering:
o Rangschikken van uitgeknipte gefotografeerde chromosomen tijdens mitose
op grond van:
 Lengte
 Plaats van het centromeer
 Bandenpatroon
o Deleties van >5 Mb te detecteren.
2016/2017
-
-
-
FISH
o
Detectie aan- of afwezigheid van een bepaalde genomische regio met
fluorescent gelabeld DNA (probe).
o Probe bindt aan specifieke positie op chromosoom
o Type FISH probes:
 Centromeer probes
o Aantal van een specifieke chromosoom
 Locus specifieke probes
o Deleties/inserties specifieke loci
 Kleuring hele chromosoom (Multicolor)
o Complexe translocaties
o Detectie numerieke afwijkingen
o Detectie microdeletie syndromen (ongeveer 1 Mb)
o Detectie structurele afwijkingen
Microarrays:
o Patiënt DNA vs. Normaal controle DNA
o Gelabeld met verschillende fluorescente kleuren
o Mix ze samen
o Voeg ze toe op een glazen plaatje met een hoge dichtheid DNA probes van
verschillende bekende locaties op het menselijk genoom
o Lees aan de kleuren ratio af waar de mutatie zit
o Interpretatie van array resultaten: copy number variants (CNV’s)
 Grafiek: afwijking van 0 zijn afwijkingen in het genoom
o Geeft geen duidelijke informatie, alleen onbalans weer
o Wel zeer hoge resolutie en veel tests in één
Single Nucleotide Polymorphism (SNP) micro-array
o Grafiek: omhoog is duplicatie, omlaag deletie
o B-allel frequentie: frequentie allel B ten opzichte van andere allelen op een
specifieke locatie aan de hand van een percentage (BAF)
2. Overervingspatroon:
- Mendeliaanse overerving:
o Autosomaal dominant
o Autosomaal recessief
 Als een ziekte redelijk frequent is: verwantschap heeft een kleine
invloed op incidentie
 Als een ziekte zeldzaam is: verwantschap heeft een grote invloed op
incidentie
o Geslachtsgebonden
Kan veroorzaakt worden door:
- Puntmutaties in exonen
- Puntmutaties in promotor
- Puntmutaties in intronen
Hoe vind je de mutatie?
- PCR
o Denaturatie
o Primer annealing
2016/2017
-
-
-
o Primer extensie/DNA synthese
o (soms in High Resolution Melting, mutaties in PCR producten zijn
detecteerbaar omdat ze de smeltcurve veranderen)
Sanger sequencing
o Denaturatie
o Primer annealing
o In 4 flesjes
o DNA polymerase toegevoegd
o Vrije nucleotiden (dNTPs) toegevoegd
o Gemodificeerde nucleotiden (ddNTPs) van één soort nucleotide (ACTG)
o Na binding van ddNTP stopt binding (geen OH brug)
o Verschillende lengtes in elektroforese
QF-PCR (quantitative-fluorescent polymerase chain reaction) (prenatale
diagnositiek!)
o Amplificatie, detectie en analyse van short tandem repeats (STRs) markers
(chromosoom specifiek)
o STRs kunnen qua lengte verschillen tussen ouders en erven over als allelen
o PCR-amplificatie van meerdere STRs op chromosoom 13/18/21/X/Y mbv.
fluorescentie PCR en scheiding op grootte mbv capillaire sequencer
o Vergelijking STRs tussen ouders mbv fluorescentie: mate van fluorescentie
geeft mate van product
Next generation sequencing (vervangend voor Sanger)
o Sample preparatie
 Fragmenteren van het genomisch DNA
 Size selectie van de fragmenten
 Adapters ligeren aan het gefragmenteerde DNA
 Geprept genomisch DNA
o Capturing
 Geprept DNA in custom made library
 24 uur hybridiseren bij 65 C
 Hybridisatie DNA (biotine) + magnetische bolletjes
 Bolletjes met magneet verwijderd
 Alleen fragmenten van interesse geïsoleerd
 Cluster generatie:
a. DNA hecht aan flow cell
b. Brug amplificatie
c. Dubbelstrengs fragmenten
d. Denatureren dubbelstrengs fragmenten
e. Clusters gegenereerd
o Sequencen
 Annealen sequence primer
 Fluorescentie
o Plaatjes naar read
o Alignen
o Varianten benoemen
o Pathogene mutatie?
2016/2017
-
Linkage analyse
o LOD score berekenen: kans dat een marker gekoppeld is aan de eigenschap
(kans dat de eigenschap bij toeval aanwezig is)
o Log (1/0,5^aantal aangedane kinderen) = LOD score
o Per kind + 0,3
o Min. LOD score van 3,0 (10 informatieve meioses)
o Stambomen vaak niet groot genoeg
- Haplotype sharing test
o Haplotype: combinatie allelen op een chromosoom
o Goed als alternatief voor linkage (kleinere families)
o Founder mutaties aantonen en leeftijd mutatie analyseren
o Kan al vanaf 7 meioses bij autosomaal dominant.
o Grote gedeelde haplotypes duidt op één voorouder
o Hoe groter gedeelde haplotype, hoe groter kans op daar gelegen
gemuteerde gen.
o Genotyperen van aangedane familieleden
o Bepalen langste haplotypes
o Analyse van genen in deze haplotypes
o Founder mutaties
 Mutatie afkomstig uit gedeelde voorouder
 Tegenovergestelde recurrent mutatie
 Haplotype analyse
a. Microsatellieten
b. Bv [CA]n repeats
 Leeftijd aan de hand van lengte van het gedeelde haplotype
- Homozygosity mapping (bij autosomaal recessief)
o Gedeelde homozygote gebieden zoeken
o Vaak bekende verwantschap of afkomst uit zelfde regio
o Exoom sequencing
o Vele mutaties: welke pathogeen?
 Filteren (met controle populaties)
 Prioriteiten
- Exoom sequencing
o Reguliere diagnostiek, vaak met virtueel genpanel
o Wordt veel gebruikt om nieuwe genen te vinden
o Validatie nieuwe genen is essentieel maar moeilijk
o Ethische aspecten zijn belangrijk
o Vastgestelde lijst in de filtering opnemen
o Filteren op fenotypische kenmerken met behulp van HPO (human phenotype
ontology)
o Met of zonder selectie op fenotype of linkage analyse
Kanker. Is een genetische ziekte want:
- Chromosomale afwijkingen in kanker
- Carcinogenen zijn mutagen
- Individuen met een DNA herstel deficiëntie syndroom hebben verhoogd risico
- Clustering van kanker in families
o Erfelijkheid (5-10%)
- Leeftijd waarop kanker zich openbaart
2016/2017
o Erfelijkheid (5-10%)
Mutaties: somatische en kiembaan:
- Somatisch:
o Komen voor in niet-kiembaan weefsels
o Niet erfelijk
- Kiembaan:
o Aanwezig in ei of sperma
o Erfelijk
o Veroorzaken kanker familie syndroom
Oncogenen zijn gemuteerde proto-oncogenen.
- Dominant
- Tumorsuppressorgenen zijn recessief
o Knudson two-hit hypothese (2 mutaties nodig)
miRNA kan kanker veroorzaken
- Gebrek of teveel van een bepaalde soort kan leiden tot kanker
- Overdreven onderdrukking van TSG
- Gebrek onderdrukking van oncogenen
Alarmsignalen erfelijke kanker:
- Belaste familieanamnese (dit bewijst of sluit echter niks uit)
- Jonge leeftijd voor de soort kanker
- Multipele primaire tumoren (in verschillende of hetzelfde orgaan)
3. Omgevingsfactoren spelen hierbij vooral een rol.
Aangeboren afwijkingen kunnen gevonden worden in:
- Prenataal weefsel:
o Chorion vlokken
o Vruchtwater
o Bloedonderzoek + nekplooimeting + leeftijd moeder + duur zwangerschap geeft de
kans op een trisomie
- Postnataal weefsel:
o Bloed
o Huid
o Wangslijmvlies
o Abortus weefsel
o (alles met DNA?)
o Diagnose bevestigen/uitsluiten
o Dragerschap bevestigen/uitsluiten
o Presymptomatisch
DNA isolatie:
-
Rode en witte bloedcellen worden opgeblazen door cellysis buffer
DNA in oplossing kapotte bloedcellen
Magnetische bolletjes toegevoegd
Buffers toegevoegd
DNA plakt aan bolletjes onder invloed van chemische samenstelling oplossing
2016/2017
-
Door magneet bolletjes + DNA uit de oplossing gehaald
Wassen van het DNA
DNA laat los door een verandering in de samenstelling van de buffer
Anticipatie: volgende generaties krijgen de symptomen/ziekte op steeds jongere leeftijd.
Pleiotropie: mutaties in één gen kunnen verschillende fenotypische effecten teweeg brengen.
Variabele expressie: verwijst naar de mate van ernst van het fenotype. Waarom verschillen?
-
Interactie genotype + omgeving
Sequentie: nucleotidevolgorde van een DNA-fragment
Read: sequentie zoals deze is afgelezen van een DNA-fragment (in bp)
Q30: kwaliteitscriterium. Kwaliteit van Q30 betekent: 1 op de 1000 nucleotiden wordt verkeerd
afgelezen.
LOH: loss of heterozygosity (verlies van heterozygositeit)
Fenokopie: niet erfelijke vorm in een familie waar erfelijke vorm (ook) voorkomt