University of Groningen Experimental studies on dietary fibers

University of Groningen
Experimental studies on dietary fibers
Sahasrabudhe, Neha Mohan
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
2016
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Sahasrabudhe, N. M. (2016). Experimental studies on dietary fibers: Pattern recognition receptor
interactions [Groningen]: University of Groningen
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 19-07-2017
I
Nederlandse samenvatting
thesis.indb 175
10/04/16 4:54 PM
Bepaalde ziekten zoals diabetes, cardiovasculaire aandoeningen, en chronische
inflammatoire darmziekten komen vaker voor in de westerse wereld. Het ontbreken
van belangrijke koolhydraten in het westerse dieet wordt gezien als een mogelijke
oorzaak. Het westerse dieet bestaat uit veel bewerkt voedsel, wat minder voedzaam
is. Een groter probleem is echter dat dit voedsel minder vezels bevat. Er zijn vele
studies die hebben aangetoond dat voedingsvezels een positieve invloed hebben
op de gezondheid, zoals het vergroten van het volume van de ontlasting en het
bevorderen van een gezonde darmflora. Daarnaast vormen sommige voedingsvezels
ook een gel-achtige substantie in de maag, waardoor het hongergevoel afneemt. Het
meest bestudeerde effect is de invloed van voedingsvezels op de darmflora. Vezels
uit de voeding worden geconsumeerd door bacteriën in de darmen en afgebroken
tot immuun-regulerende korte-keten vetzuren. Voedingsvezels kunnen ook de groei
stimuleren van bepaalde gezonde bacteriën, terwijl de groei van pathogene bacteriën
wordt geremd. Daarnaast kunnen sommige voedingsvezels, zoals bijvoorbeeld
inuline, ook direct interacties aangaan met receptoren betrokken bij activatie van
het immuunsysteem. Deze receptoren worden pattern recognition receptoren
(PRRs) genoemd. Samenvattend kunnen we dus stellen dat voedingsvezels invloed
kunnen uitoefenen op het immuunsysteem via de darmflora, maar ook d.m.v. directe
interacties met immuunreceptoren. Momenteel is er nog weinig bekent over de
directe interacties tussen voedingsvezels en immuunreceptoren.
Het immuunsysteem in de darmen is het grootste immuunsyteem van het hele
menselijke lichaam. Het bevat ongeveer 70% van het totale aantal immuuncellen. In
hoofdstuk 1 hebben we de verschillende mechanismen beschreven die ten grondslag
liggen aan het behouden van een gezonde balans tussen de darmflora en het
immuunsysteem in de darmen. Een van de factoren die een rol spelen bij de regulatie
van het immuunsysteem zijn de PRRs. Toll-like receptoren (TLRs) zijn de meest
bestudeerde PRRs en zijn te vinden in darmepitheelcellen en ook in immuuncellen.
TLRs herkennen structuren van bacteriën, virussen, en ook bepaalde componenten
van het eigen weefsel. Na herkenning van deze structuren door TLRs wordt het
aangeboren immuunsysteem geactiveerd. In de darmen van een gezond persoon
zorgen TLRs echter voor een reductie van immuunactivatie door het initiëren
van regulatoire responsen. Daarnaast komen TLRs verminderd tot expressie in
de darmepitheelcellen om immuunactivatie te beperken. Naast TLRs zijn er nog
andere PRRs, zoals bijvoorbeeld Dectin-1. Deze receptor kan interacties aangaan
met de voedingsvezel β-glucaan. Dectin-1 speelt een rol in verscheidende processen,
waaronder antigeen presentatie en regulatie van inflammatie. Sommige structuren
worden herkend door een enkele PPR, maar er zijn ook structuren die herkend worden
door een combinatie van PRRs. Bijvoorbeeld TLR2 kan een combinatie vormen met
TLR1 of TLR6. De combinatie TLR2-TLR1 induceert een inflammatoire respons,
Page |176
thesis.indb 176
10/04/16 4:54 PM
Nederlandse samenvatting
terwijl TLR2-TLR6 een regulatoire respons teweeg brengt. Er zijn ook aanwijzingen
dat een combinatie van Dectin-1 en TLR4 het immuunsysteem kan activeren. Of
deze combinatie van receptoren ook een rol speelt in de herkenning van β-glucaan is
niet bekend. PRRs vormen de frontlinie van afweermechanismen tegen inkomende
vreemde moleculen in de darmen. Het valt dus te verwachten dat ook voedingsvezels
interacties aangaan met PRRs. Wij hebben de directe immuunmodulerende effecten
bestudeerd van voedingsvezels afkomstig van graanproducten, zoals β-glucaan,
arabinoxylaan, en pectine. Deze voedingsvezels zijn goedkoop te verkrijgen en
kunnen worden toegepast in het voedsel voor zowel dieren als mensen. Het gebruik
van voedingsvezels in voer voor dieren is bestudeerd om het immuunsysteem
te stimuleren, waardoor er minder antibiotica aan de dieren gegeven zou hoeven
worden. Een beter begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de
immuunmodulerende effecten van voedingsvezels zal bijdragen aan de ontwikkeling
van voedsel voor dier en mens waarmee het immuunsysteem op de gewenste manier
beïnvloed kan worden.
In hoofdstuk 2 hebben we de immuunmodulerende effecten van β-glucaan
geïsoleerd uit haver geanalyseerd. Er is eerder aangetoond dat deze voedingsvezel
immuunmodulerende effecten heeft in vivo. Echter had haver β-glucaan weinig
effecten op immuuncellen in in vitro experimenten. Zoals hierboven beschreven
kunnen voedingsvezels worden afgebroken door darmbacteriën. Daarom hebben
we onderzocht of enzymen afkomstig van deze bacteriën de invloed van haver
β-glucaan op immuuncellen kan vergroten. In hoofdstuk 2 laten we zien dat het
enzym endoglucanase de immuunstimulerende werking van haver β-glucaan
verhoogt. Om het onderliggende mechanisme verder te onderzoeken, hebben we de
interacties bestudeerd tussen Dectin-1 en haver β-glucaan behandeld met of zonder
endoglucanase. Dectin-1 is een receptor specifiek voor de β(1-3) verbindingen van
β-glucaan. De activiteit van Dectin-1 kan worden verhoogd door β-glucaan in de vorm
van deeltjes en niet door oplosbaar β-glucaan. Om te bevestigen dat endoglucanase
de activiteit van β-glucaan verhoogt door de grootte van de deeltjes te veranderen,
hebben we de grootte van β-glucaan deeltjes gemeten na behandeling met of zonder
endoglucanase. De grootte van de β-glucaan deeltjes was inderdaad kleiner na
endoglucanase behandeling. Bovendien had behandeld β-glucaan meer beschikbare
β(1-3) verbindingen. We laten dus zien dat de verhoogde immuunstimulatie van
β-glucaan na behandeling met het enzym endoglucanase wordt veroorzaakt door
een verkleinging van de grootte van de β-glucaan deeltjes en door een verhoogde
beschikbaarheid van β(1-3) verbindingen aan het oppervlak van de β-glucaan
deeltjes. Deze structurele modificaties kunnen gebruikt worden voor het maken van
immuunstimulerende β-glucaan voedingsvezels.
I
Page | 177
thesis.indb 177
10/04/16 4:54 PM
Graan bevat vele verschillende voedingsvezels en één van de meest
voorkomende voedingsvezels in graan is arabinoxylaan. Van deze voedingsvezel is
het ook bekend dat het immuunmodulerende activiteit heeft in vitro. Aangezien
arabinoxylaan een chemische structuur heeft die erg lijkt op β-glucaan, was onze
hypothese dat arabinoxylaan ook interacties kan aangaan met PRRs. In hoofdstuk
3 laten we zien dat arabinoxylaan Dectin-1 kan activeren. Zoals eerder beschreven,
wordt de Dectin-1 receptor verschillend geactiveerd door β-glucaan in oplosbare
vorm of in de vorm van deeltjes. Dectin-1 activatie door arabinoxylaan was
vergelijkbaar met oplosbaar β-glucaan. Bovendien kon arabinoxylaan de interactie
tussen β-glucaan deeltjes en Dectin-1 beïnvloeden in reporter cellijnen en in humane
Dendritische cellen. We laten dus zien dat de Dectin-1 receptor meer structuren kan
herkennen dan alleen β-glucaan en dat goedkope voedingsvezels zoals arabinoxylaan
gebruikt kunnen worden om het immuunsysteem te beïnvloeden. Het feit dat zowel
β-glucaan als arabinoxylaan interacties kunnen aangaan met Dectin-1 suggereert dat
in vivo beide voedingsvezels concurreren om te binden aan de Dectin-1 receptor.
Daarom is het wellicht mogelijk om de invloed op het immuunsysteem te veranderen
door de ratio tussen de twee voedingsvezels aan te passen in de voeding.
Zoals reeds vermeld wordt de Dectin-1 receptor geactiveerd door β-glucaan
deeltjes, maar niet door oplosbaar β-glucaan. In hoofdstuk 4 demonstreren we dat
dit verschil wellicht veroorzaakt wordt door een verschil in synergie tussen Dectin-1
en TLR4. Het was al bekend dat een combinatie van Dectin-1 en TLR4 activatie
door β-glucaan en de TLR agonist LPS zorgt voor een synergie in cytokineproductie
door monocyten. Beide receptoren waren nodig voor een immuunrespons tegen de
pathogene schimmel Candida albicans en muizen zonder functioneel TLR4 waren
gevoeliger voor infectie met deze schimmel. Het was dus al bekend dat er synergie
kan optreden tussen Dectin-1 en TLR4, maar of deze combinatie ook een rol speelt in
de herkenning van β-glucaan was nooit onderzocht. Om de synergie tussen Dectin-1
en TLR4 verder te onderzoeken hebben we reporter cellijnen gemaakt die de Dectin-1
varianten Dectin-1A of Dectin-1B tot expressie brengen in combinatie met TLR4.
β-glucaan deeltjes konden inderdaad de combinatie van Dectin-1 en TLR4 activeren
wat leidde tot een synergie in immuunstimulatie. In experimenten met humane
Dendritische cellen gaf het blokkeren van TLR4 juist een hogere immuunstimulatie.
Deze resultaten tonen aan dat β-glucaan deeltjes zowel Dectin-1 als TLR4 activeren,
waarbij TLR4 stimulatie leidt tot inductie van regulatoire responsen. De Dectin-1
varianten lieten verschillende synergistische responsen zien na stimulatie met
oplosbaar β-glucaan. Dectin-1A-TLR4 werd synergistisch geactiveerd door oplosbaar
β-glucaan, maar Dectin-1B-TLR4 niet. Het feit dat er geen synergie was tussen
Dectin-1B en TLR4 na stimulatie met oplosbaar β-glucaan zou kunnen bijdragen
aan de verminderde immuunstimulerende activiteit van oplosbaar β-glucaan in
Page |178
thesis.indb 178
10/04/16 4:54 PM
Nederlandse samenvatting
vergelijking met β-glucaan deeltjes.
In dit proefschrift (hoofdstuk 2, 3, en 4) hebben we drie verschillende
mechanismen beschreven hoe β-glucanen het immuunsysteem kunnen beïnvloeden.
We hebben laten zien dat immuunstimulatie door β-glucaan kan worden verhoogd
door afbraak door de darmflora in vivo. Daarnaast kan het immuunmodulerende
effect van β-glucaan beïnvloed worden door andere voedingsvezels zoals
arabinoxylaan. Het derde mechanisme wat een rol speelt in het immuunmodulerende
effecten van β-glucaan is de synergie tussen verschillende PRRs. Dus hoewel het
immuunstimulerende effect van β-glucaan goed gedocumenteerd is, kan het
uiteindelijke effect op het immuunsysteem afhangen van verschillende mechanismen.
Om het verband tussen voedingsvezel structuur en interactie met PRRs
verder te onderzoeken, hebben we onze aandacht gericht op citroen pectine. Deze
voedingsvezel kan verkregen worden met een verschillende graad van methyl
esterificatie hoeveelheden (DM). Daarom is dit molecuul een goed model om
te onderzoeken hoe verschillen in de chemische structuur de binding aan PRRs
beïnvloeden. Eerst bekeken we of pectine interacties kon aangaan met PRRs en
we ontdekten dat pectine de activiteit van TLR2 kon blokkeren. Bovendien was de
inhibitie afhankelijk van de DM graad van pectine. We hebben laten zien dat laag DM
pectine het beste in staat was om TLR2 te blokkeren. De oorzaak van deze inhibitie
was binding van pectine aan TLR2. Laag DM pectine kon het beste binden aan TLR2,
waarbij we een negatieve correlatie zagen tussen DM graad en binding aan TLR2.
Ook in humane Dendritische cellen was pectine in staat om cytokineproductie na
TLR2 stimulatie te blokkeren. Zoals hierboven beschreven kan TLR2 verschillende
responsen stimuleren afhankelijk van de combinatie die deze receptor vormt met
andere PRRs. In hoofdstuk 5 laten we zien dat pectine pro-inflammatoire TLR2TLR1 activatie blokkeert, maar niet de regulatoire TLR2-TLR6 stimulatie. Dus
pectine kon specifiek de pro-inflammatoire respons blokkeren, terwijl de regulatoire
respons niet werd beïnvloed.
Om de anti-inflammatoire eigenschappen van laag DM pectine te bevestigen
in vivo, gebruikten we een muismodel waarbij inflammatie wordt geïnduceerd door
toediening van doxorubicine. Eerder was aangetoond dat in dit model inflammatie
minder was in muizen die geen functioneel TLR2 hebben. Pectine zorgde voor een
vermindering van de symptomen van inflammatie, zoals infiltratie van neutrofielen
in het peritoneum en celdood in de crypten van de darmen. Daarnaast was er een
vermindering van pro-inflammatoire cytokines in zowel het peritoneum als in het
plasma na toediening van pectine. De meest opvallende observatie was dat de mate
van onderdrukking van inflammatie door pectine te vergelijken was met een antistof
die TLR2 blokkeert. Dit suggereert dat pectine de inflammatie geïnduceerd door
I
Page | 179
thesis.indb 179
10/04/16 4:54 PM
doxorubicine verminderde door inhibitie van TLR2.
Voedingsvezels zoals pectine worden gefermenteerd door de darmflora
waarbij korte-keten vetzuren geproduceerd worden. Om uit te sluiten dat korte-keten
vetzuren verantwoordelijk waren voor het remmen van inflammatie, hebben we de
concentratie van deze moleculen gemeten in het cecum. Pectine had geen invloed
op de concentratie korte-keten vetzuren, wat suggereert dat het anti-inflammatoire
effect van pectine afhankelijk was van blokkade van TLR2 en niet door korte-keten
vetzuur productie te beïnvloeden. Deze resultaten tonen aan dat het in principe
mogelijk is om de interacties tussen PRRs en voedingsvezels toe te passen in vivo
als medicijn om het immuunsysteem te sturen in de gewenste richting. Bovendien
tonen we aan dat de immuunmodulerende effecten van voedingsvezels zoals pectine
gunstig kunnen zijn voor het behouden van de juiste balans in het immuunsysteem
in de darmen.
Om te begrijpen waarom laag en hoog DM pectine verschillend binden aan
TLR2, hebben we het gedeelte van TLR2 waar pectine aan bindt verder onderzocht.
In hoofdstuk 6 hebben we bepaalde aminozuren van TLR2 veranderd die mogelijk
betrokken zijn bij de binding aan pectine. Alleen laag DM pectine kon aan TLR2
binden. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat laag DM pectine een sterk negatieve
lading heeft. Daarom was onze hypothese dat de aminozuren betrokken bij de
binding van pectine positief geladen zouden moeten zijn. Verder gingen we ervan uit
dat de plek waar pectine bindt dicht bij de plek moet zijn waar TLR2 een combinatie
vormt met TLR1, aangezien pectine TLR2-TLR1 activatie remde, maar geen TLR2TLR6 activatie. We selecteerden de positief geladen aminozuren R315, R316, R321,
en K347, die werden vervangen door het ongeladen aminozuur glutamine (Q). R321
en K347 waren geselecteerd vanwege hun betrokkenheid in de interactie tussen
TLR2 en TLR1. R315 en R316 waren geselecteerd vanwege hun nabijheid tot de plek
waar agonisten van TLR2 normaalgesproken binden. We hebben twee mutanten
gemaakt: TLR2 RRQQ (R321 en K347 veranderd in Q) en TLR2 QQQQ (R315, R316,
R321, en K347 veranderd in Q). We zagen dat laag DM pectine minder goed aan
TLR2 RRQQ kon binden in vergelijking met TLR2 QQQQ. Dit verschil was er niet
met hoog DM pectine. Deze resultaten bevestigen dat laag DM pectine bind aan
TLR2 d.m.v. elektrostatische krachten. Ook zagen we dat hoog DM pectine beter
aan de TLR2 mutanten kon binden dan aan normaal TLR2. Blijkbaar heeft de
aanwezigheid van het neutraal geladen aminozuur glutamine een positieve invloed
op de binding tussen hoog DM pectine en TLR2. Vergeleken met laag DM pectine is
hoog pectine meer gestabiliseerd d.m.v. waterstofverbindingen. Mogelijk kan hoog
DM pectine beter aan de TLR2 mutanten binden door waterstofverbindingen aan
te gaan met deze mutanten. Dit soort onderzoeken naar de plek waar de interactie
tussen voedingsvezels en PRRs plaatsvindt kunnen gebruikt worden om specifiek
Page |180
thesis.indb 180
10/04/16 4:54 PM
Nederlandse samenvatting
voedingsvezels te ontwikkelen met de meest efficiënte immuunmodulerende effecten.
In dit proefschrift hebben we nieuwe mechanismen ontdekt waarmee
voedingsvezels het immuunsysteem kunnen beïnvloeden door interacties aan te
gaan met PRRs. Het begrijpen van deze mechanismen is van belang om te kunnen
voorspellen wat de immuunmodulerende effecten zullen zijn in vivo. Daarnaast kan
deze kennis gebruikt worden voor de ontwikkeling van voeding voor mens en dier
met het doel het immuunsysteem op de gewenste manier te sturen. Voedingsvezels
kunnen bijvoorbeeld gebruikt worden om het immuunsysteem te stimuleren
waardoor er minder antibiotica gebruikt hoeft te worden in de veeteelt. De
immuunmodulerende effecten van voedingsvezels kunnen ook gebruikt worden om
ziekten te bestrijden die vaker voorkomen bij mensen uit westerse landen.
I
Page | 181
thesis.indb 181
10/04/16 4:54 PM
Page |182
thesis.indb 182
10/04/16 4:54 PM