UvA-DARE (Digital Academic Repository) Novel developments in

UvA-DARE (Digital Academic Repository)
Novel developments in the chemo-enzymatic synthesis of enantiopure -hydrogen- and
,-disubstituted -amino acids and derivatives
Sonke, T.
Link to publication
Citation for published version (APA):
Sonke, T. (2008). Novel developments in the chemo-enzymatic synthesis of enantiopure -hydrogen- and ,disubstituted -amino acids and derivatives
General rights
It is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s),
other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Disclaimer/Complaints regulations
If you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, stating
your reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Ask
the Library: http://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam,
The Netherlands. You will be contacted as soon as possible.
UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl)
Download date: 19 Jul 2017
Nederlandstalige samenvatting
Naast nucleïnezuren, vetten en koolhydraten vormen eiwitten een zeer belangrijke
klasse van biomoleculen. Zij spelen een cruciale rol in vrijwel alle biologische processen.
Zo zijn ze ondermeer betrokken bij het transport van velerlei moleculen, de afweer tegen
ziekteverwekkers, de transmissie van zenuwimpulsen en het versnellen van reacties
(katalyse). Eén van de kenmerken van eiwitten is dat ze zijn opgebouwd uit aminozuren.
Hoewel er in de natuur meer dan 300 verschillende aminozuren zijn aangetoond komen er
maar twintig voor in eiwitten. Dit zijn de zogenaamde proteïnogene aminozuren. In eiwitten
zijn deze aminozuren met peptidebindingen aan elkaar gekoppeld tot een lineaire keten.
De volgorde van de vaak meer dan 100 aminozuren in deze keten, die uniek is voor ieder
eiwit, bepaalt de eigenschappen van het eiwit en dus uiteindelijk ook zijn biologische
functie.
Vanwege hun sleutelrol als een van de bouwstenen van het leven zijn proteïnogene
aminozuren belangrijke voedingsingrediënten. Vandaar ook dat ze veelvuldig gebruikt
worden in de (dier)voedingsindustrie om de nutritionele waarde van bepaalde
voedingsmiddelen te verhogen, maar bijvoorbeeld ook als smaakversterker. Een bekend
voorbeeld van dit laatste is het gebruik van mononatriumglutamaat, het hoofdbestanddeel
van het Chinese keukenkruid Ve-tsin. Toevoeging van deze smaakversterker aan het
voedsel resulteert in een “hartiger” (meer “umami”) smaak. Naast deze toepassingen in
voeding worden aminozuren vanwege hun unieke chemische en fysische eigenschappen
in toenemende mate gebruikt in ondermeer de cosmetische, agrochemische,
farmaceutische en biomedische industrie. Niet alleen proteïnogene maar vooral de nietproteïnogene aminozuren en derivaten worden in deze branches veelvuldig toegepast,
waarbij hun enantiomere zuiverheid vaak essentieel is.
265
Samenvatting
Intermezzo 1
Chiraliteit
Met het begrip chiraliteit, wat afkomstig is van het Griekse woord voor hand (FHLU
[cheir]), wordt in de scheikunde het verschijnsel aangeduid dat twee moleculen die
beeld en spiegelbeeld van elkaar zijn niet tot dekking gebracht kunnen worden. Dit
verschijnsel treedt bijvoorbeeld op als een molecuul een koolstofatoom bevat
waaraan vier verschillende groepen gebonden zijn in de vorm van een tetraëder. Een
dergelijk koolstofatoom wordt dan een chiraal centrum genoemd. De beide
spiegelbeelden van een chiraal molecuul worden enantiomeren genoemd. Als de
enantiomeren in exact dezelfde hoeveelheid voorkomen, is een verbinding een
racemisch mengsel of een racemaat. Indien slechts een van beide enantiomeren in een
stof voorkomt is deze enantiomeer zuiver. De mate van enantiomere zuiverheid wordt
kwantitatief uitgedrukt in enantiomere overmaat (ee [enantiomeric excess]), die
varieert van 0% (racemisch mengsel) tot 100% (enantiomeer zuiver).
L-enantiomeer
Figuur
D-enantiomeer
Aminozuren hebben een chiraal centrum, en dus bestaan er twee ruimtelijke
vormen die spiegelbeelden van elkaar zijn en enantiomeren genoemd worden.
Eiwitten, echter, bevatten uitsluitend L-aminozuren. De R staat voor de
verschillende zijketens.
Enantiomeren hebben dezelfde fysische en chemische eigenschappen zoals kookpunt,
smeltpunt, dichtheid, brekingsindex en zuursterkte. Een uitzondering hierop is de
richting waarin zij gepolariseerd licht draaien. Terwijl de ene enantiomeer
gepolariseerd licht naar rechts draait, draait de andere enantiomeer dit naar links.
Enantiomeren zijn optisch actief en worden daarom ook wel optische isomeren
genoemd.
Hoewel enantiomeren dus veelal dezelfde eigenschappen hebben gedragen ze zich
volledig verschillend als ze zich in een chirale omgeving bevinden. Omdat de meeste
receptoren voor medicijnen, smaak- en geurstoffen zelf ook chiraal zijn, zullen de
twee enantiomeren dus vaak een radicaal verschillend effect in het menselijk lichaam
hebben. Een voorbeeld hiervan is
het effect van het aminozuur
dihydroxyphenylalanine (DOPA). Terwijl de L-enantiomeer van dit aminozuur gebruikt
wordt voor de behandeling van de ziekte van Parkinson, veroorzaakt de andere
enantiomeer levensbedreigende bijwerkingen. Het zal daarom duidelijk zijn dat het in
vele gevallen gewenst is om uitsluitend de werkzame enantiomeer van een chirale
biologisch actieve verbinding te produceren.
266
Samenvatting
Intermezzo 2
Resolutiereacties
Zoals al in intermezzo 1 werd aangegeven kunnen enantiomeren een dramatisch
verschillend effect hebben in bijvoorbeeld het menselijk lichaam. Daarom is het van
groot belang dat het enantiomeer met de gewenste werking in enantiomeer zuivere
vorm geproduceerd kan worden. Omdat de fysische en chemische eigenschappen van
enantiomeren identiek zijn, kunnen deze echter niet gescheiden worden met
conventionele technieken als extractie en destillatie. Toch is het mogelijk om
enantiomeer zuivere verbindingen te maken volgens de volgende drie benaderingen:
-
Chirale poel: omzettingen uitgaande van enantiomeer zuivere verbindingen
uit de natuur waarbij het chirale centrum intact blijft
Resolutie: splitsen van beide enantiomeren
Asymmetrische synthese: omzetten van niet-chirale verbindingen in chirale
De resolutiemethode die al in 1847 door Louis Pasteur ontdekt werd, is nog steeds een
veelgebruikte methode in de industrie voor de productie van enantiomeer zuivere
verbindingen. In zijn klassieke uitvoering laat men een racemisch mengsel van de te
splitsen verbinding reageren met één enantiomeer van een ander chiraal molecuul.
Hierbij ontstaan twee soorten zouten die geen beeld-spiegelbeeld isomeren meer zijn.
Daardoor hebben deze een andere oplosbaarheid in bepaalde oplosmiddelen kunnen
dus van elkaar gescheiden worden.
Een modernere resolutiemethode maakt gebruik van enzymen. Aangezien het actieve
centrum van een enzym een driedimensionale structuur heeft met een nauwkeurig
gedefinieerde ordening van de atomen kunnen enzymen enantiomeren over het
algemeen goed onderscheiden. Deze eigenschap van enzymen wordt enantioselectiviteit genoemd. Bij inwerking van een enantioselectief enzym op een racemisch
mengsel zal slechts één van de enantiomeren selectief omgezet worden in een andere
verbinding, waarna enantiomeer zuiver product en uitgangsmateriaal van elkaar
gescheiden kunnen worden. Een dergelijk resolutieconcept wordt een enzymatische
kinetische resolutie genoemd.
Figuur
Bij een enzymatisch kinetische resolutie wordt slechts een van de enantiomeren in
een racemisch mengsel (grijze cirkels) omgezet in een product (witte cirkel). Het
niet gereageerde uitgangsmateriaal en gevormde product zijn beide enantiomeer
zuiver.
267
Samenvatting
Momenteel worden de meeste proteïnogene aminozuren geproduceerd met behulp
van fermentatieve processen. Dit zijn processen waarin levende micro-organismen
(bacteriën, schimmels en gisten) goedkope uitgangsstoffen zoals suikers via uitgebreide
metabole netwerken omzetten in waardevolle producten, in dit specifieke geval dus
aminozuren. Biokatalytische processen, aan de andere kant, genieten nog steeds de
voorkeur voor de productie van enantiomeer zuivere niet-proteïnogene aminozuren. Bij dit
soort processen wordt niet uitgegaan van suikers, maar van chemisch bereide
uitgangsverbindingen (“substraten”), die met behulp van slechts één of enkele enzymen
omgezet worden in de gewenste producten. Kenmerkend aan deze processen is de
combinatie van chemische synthese (bijvoorbeeld voor de substraatbereiding) en
enzymatische katalyse, waardoor deze ook wel chemo-enzymatische processen genoemd
worden. Het amidaseproces, dat door DSM sinds de tachtiger jaren wordt toegepast, is
één van dergelijke processen. Het is gebaseerd op de kinetische resolutie van racemische
aminozuuramides met behulp van enantioselectieve (amino)amidases. Het amidaseproces
heeft een aantal belangrijke voordelen. Naast een gemakkelijke substraatbereiding uit
goedkope grondstoffen en een gunstige ligging van het thermodynamisch evenwicht,
bestaan er verschillende biokatalysatoren die een breed en elkaar aanvullend
substraatbereik combineren met een goede enantioselectiviteit zodat beide enantiomeren
van een groot aantal producten gesynthetiseerd kunnen worden. Hoewel het
amidaseproces door deze voordelen een aantrekkelijk platform is voor de grootschalige
productie van verschillende typen enantiomeer zuivere aminozuren, dienden een aantal
aspecten van dit proces nog verder verbeterd te worden om de aantrekkelijkheid op lange
termijn te waarborgen.
De ontwikkeling van de recombinant-DNA technologie heeft in de afgelopen
decennia een veel efficiëntere en daardoor ook goedkopere productie van enzymen
mogelijk gemaakt. Bij deze technologie wordt het gen dat codeert voor het gewenste
enzym op een zodanige manier in een makkelijk te cultiveren gastheermicro-organisme
(bijvoorbeeld Escherichia coli) ingebracht, dat dit het enzym in grote hoeveelheden gaat
produceren. Productie van één van DSM’s meest veelzijdige L-amidase biokatalysatoren,
Ochrobactrum anthropi NCIMB 40321, middels recombinant DNA technologie was echter
nog niet mogelijk omdat het L-amidase gen niet bekend was. Dit belemmerde de
toepassing van deze biokatalysator op commerciële schaal omdat de productie ervan in O.
anthropi een gecompliceerd fermentatieprotocol met een dure inductor vereist en omdat
O. anthropi een micro-organisme is van pathogeniteitsklasse 2. Hoofdstuk 2 beschrijft de
manier waarop met behulp van moleculair biologische technieken een E. coli stam
geconstrueerd werd die het L-amidase efficiënt produceert.
Na zuivering en karakterisering van een L-specifiek amidase uit O. anthropi NCIMB
40321 kon worden aangetoond dat dit enzym vrijwel dezelfde grote verscheidenheid aan
substraten hydrolyseert als O. anthropi cellen. Op basis van de aminozuursequentie van
268
Samenvatting
een aantal interne peptiden van het gezuiverde L-amidase werd het gen voor dit enzym
geïsoleerd met behulp van PCR. De afgeleide aminozuursequentie van dit 314 aminozuur
tellende L-amidase heeft duidelijke homologie met een aantal andere stereoselectieve
amidases en de leden van de acetamidase/formamidase eiwitfamilie. Het L-amidase gen
werd vervolgens gekloneerd in een expressievector met een induceerbaar
promotersysteem, waarna het efficiënt geproduceerd kon worden in Escherichia coli (17voudige overexpressie). Ontkoppeling van de groei- en inductiefase bleek hierbij
essentieel te zijn.
In Hoofdstuk 3 wordt de ontwikkeling beschreven van een Dynamisch Kinetische
Resolutie (DKR) variant van het DSM amidaseproces. Dit tweede generatie proces is
gebaseerd op de gelijktijdige werking van een tweetal enzymen, te weten een
enantioselectief amidase (bijvoorbeeld het L-aminopeptidase uit Pseudomonas putida) en
een D-H-D-aminozuuramide racemase. Dit laatste enzym katalyseert de in situ racemisatie
van die D-H-D-aminozuuramide enantiomeer welke niet door het amidase wordt omgezet,
wat resulteert in een theoretische conversie van 100% in plaats van de maximale 50% die
inherent is aan het eerste generatie proces. Probleem was echter dat een dergelijk
aminozuuramide racemase nog niet bekend was bij de start van dit onderzoek. Hoewel het
vinden van dit enzym veel gecompliceerder bleek dan aanvankelijk gedacht, werd
uiteindelijk een micro-organisme (Ochrobactrum anthropi NCIMB 41129) met de gewenste
D-H-D-aminozuuramide racemase activiteit geïsoleerd via ophoping op groeimedia met
D-amino-H-caprolactam (ACL) als enige stikstofbron. Na expressie van het bijbehorende
gen in E. coli werd het racemase gedeeltelijk gezuiverd en gekarakteriseerd. Dit nieuwe
racemase combineert een goede temperatuurstabiliteit met een breed pH-optimum, maar
wordt helaas geremd door een aantal tweewaardige metaalionen, die noodzakelijk zijn
voor activatie van het P. putida L-aminopeptidase. Dit probleem kon worden opgelost door
optimalisatie van type en concentratie metaalion, waarbij bleek dat 0,6 mM Mn2+ het
optimale compromis is. Dit aminozuuramide racemase heeft een redelijke activiteit voor
lineaire D-H-D-aminozuuramides met een korte en CE-onvertakte alifatische zijketen, al is
de activiteit voor D-aminolactamen (intramoleculaire, cyclische amides) minimaal een
factor tien hoger. Het substraatbereik van dit racemase bleek echter vlug uitgebreid te
kunnen worden want twee ronden “directed evolution” bleken voldoende te zijn om de
activiteit van dit enzym voor een aminozuuramide met een lange (7 koolstofatomen)
onvertakte maar onverzadigde zijketen (ANEA-amide) met een factor 35 te verhogen.
Door deze verbeterde mutant te combineren met het P. putida L-aminopeptidase werd het
gewenste aminozuur (S)-ANEA in 94% conversie en 98% enantiomere overmaat
gesynthetiseerd uit het corresponderende racemische amide, een resultaat dat
overduidelijk de potentie aangeeft van de DKR-variant van het DSM amidaseproces.
269
Samenvatting
In het tweede deel van dit proefschrift worden een aantal concepten verkend die
mogelijk tot een doorbraak zouden kunnen leiden in de synthese van enantiomeer zuivere
aminozuren en afgeleiden daarvan. Zo handelt Hoofdstuk 4 over mogelijke toepassingen
van het enzym peptide deformylase (PDF). Hoewel PDF een cruciale rol speelt bij de
eiwitsynthese van bacteriën en er daardoor over dit enzym al zeer veel details bekend zijn
was toepassing ervan als biokatalysator in synthese reacties nog niet eerder beschreven.
Om de potentie van het E. coli PDF als biokatalysator te kunnen onderzoeken werd het
coderende gen gekloneerd en tot expressie gebracht in een E. coli K12 stam, waarna het
eiwit gezuiverd werd met behulp van affiniteitschromatografie. Dit eenvoudige en efficiënte
zuiveringsprotocol resulteert in ongeveer 200 mg zuiver EcPDF per liter cultuurvloeistof.
Het gezuiverde enzym werd vervolgens ingezet met een reeks racemische
N-geformyleerde amines en aminozuurderivaten om vast te stellen welk type substraten
dit enzym enantioselectief omzet. Hieruit bleek dat het EcPDF een uitstekende
enantioselectiviteit combineert met een goede activiteit in de resolutie van
N-geformyleerde D- en E-aminozuren, D-aminozuuramides en D-aminonitrillen.
Daarentegen worden N-formyl derivaten van niet-gefunctionaliseerde amines en
E-aminoalcoholen slechts met een lage tot gemiddelde activiteit en enantioselectiviteit
omgezet. Omdat een aantal D-aminonitrillen onder de gebruikte reactiecondities niet
stabiel bleek te zijn is het hydrolyseconcept uitsluitend geschikt voor de synthese van de
achterblijvende (R)-N-formylaminonitrillen. Formatie van de andere enantiomeer bleek
echter mogelijk door toepassing van het EcPDF in de omgekeerde (formylerende) reactie,
omdat deze reactie resulteert in de stabiele (S)-N-formylaminonitrillen.
Naast de toepassing van EcPDF in resolutiereacties blijkt dit hydrolase ook geschikt
voor het mild en selectief verwijderen van de N-formyl-beschermgroep van peptiden. Een
additioneel voordeel van deze enzymatische ontscherming is dat het EcPDF uitsluitend de
N-formylgroep hydrolyseert als het N-terminale aminozuur de S-configuratie heeft.
Hierdoor zal deze enzymatische hydrolyse resulteren in een toename van de
diastereomere overmaat van het peptide, indien de diastereomere overmaat van het
geformyleerde peptide onvoldoende mocht zijn vanwege het optreden van racemisatie bij
de chemische peptidesynthese.
Hoewel fermentatie door de vaak lage kosten in toenemende mate gebruikt wordt
voor de productie van proteïnogene aminozuren, wordt deze methode nog nauwelijks
toegepast voor de productie van niet-proteïnogene aminozuren. In de afgelopen jaren
echter, zijn de methodes om metabole routes van micro-organismen aan te passen zodat
zij een gewenst metaboliet in hoge concentratie gaan maken, sterk verbeterd. In
Hoofdstuk 5 wordt nagegaan of deze recente vooruitgang in methodiek ook de productie
van niet-proteïnogene aminozuren middels fermentatie mogelijk maakt. D-Phenylglycine
(D-Phg) werd hierbij als modelsysteem gekozen.
270
Samenvatting
Omdat een natuurlijke synthese route naar D-Phg niet bekend is, diende een
artificiële metabole route naar dit aminozuur te worden ontworpen. Door combinatie van
de eerste twee stappen van de recentelijk opgehelderde L-p-hydroxyphenylglycine
biosyntheseroute uit actinomyceten met een stereo-inverterend D-specifiek
aminotransferase uit Pseudomonas putida werd een hybride metabole route
geconstrueerd voor de conversie van phenylpyruvaat via L-amandelzuur en
phenylglyoxylaat in D-Phg. De genen coderend voor de eerste twee benodigde enzymen
werden met behulp van PCR geïsoleerd uit Amycolatopsis orientalis (stap 1:
hydroxyamandelzuur synthase) en uit Streptomyces coelicolor (stap 2: hydroxyamandelzuur oxidase). Omdat het gen voor het derde enzym, een stereo-inverterend
D-specifiek aminotransferase, nog niet bekend was, werd dit met behulp van “highthroughput” screening geïsoleerd uit een P. putida genenbank. Gecombineerde expressie
van deze drie genen in een E. coli stam, die geoptimaliseerd is voor de productie van de
precursor phenylpyruvaat, resulteerde in de vorming van een duidelijk detecteerbare
hoeveelheid D-Phg. Naast dit gewenste aminozuur werden er echter ook relatief grote
hoeveelheden van de bijproducten L-phenylalanine en p-hydroxyphenylglyoxylaat
gevormd. Door het aanbrengen van verdere genetische aanpassingen in deze E. coli
stam, die gericht waren op het elimineren van concurrerende phenylpyruvaat verbruikende
metabole routes, werd de gevormde hoeveelheid D-Phg verdubbeld (tot 102 mg/g
biomassa), terwijl de concentratie van de twee belangrijkste bijproducten significant werd
verlaagd. Dit onderzoek resulteerde dus in ’s werelds eerste fermentatieve bereiding van
D-Phg, waarbij uitgegaan werd van glucose als hernieuwbare grondstof.
Hoofdstuk 6 ten slotte, handelt over de ontwikkeling van snelle analytische
methodes voor het screenen van enzymen met als doel de identificatie van nieuwe en/of
verbeterde enzymen op basis van een of meerdere gewenste eigenschappen, vaak
activiteit, stabiliteit of enantioselectiviteit. Vanwege zijn cruciale rol in biokatalyse is het niet
verwonderlijk dat enzymscreening frequent toegepast is binnen het onderzoek dat
beschreven is in dit proefschrift. De nadruk binnen dit laatste hoofdstuk ligt op de
ontwikkeling van activiteitsgebaseerde screeningen voor toepassing binnen de “Chemical
Custom Manufacturing” (CCM). Dit is het segment binnen de chemische industrie dat in
opdracht van de farmaceutische industrie allerlei verbindingen produceert. CCM is voor
(bio)katalysatorontwikkeling een van de meest uitdagende gebieden. De reden hiervoor is
dat vaak al enkele maanden na de vraag van de klant het eerste monstermateriaal
geleverd moet worden.
Doordat de beschikbare tijd in CCM zo beperkt is komen slechts twee verschillende
benaderingen voor het screenen van enzymen in aanmerking. De eerste is gebaseerd op
het gebruik van een aantal instrumentele analysetechnieken, zoals nucleaire magnetische
resonantie (NMR) en massaspectrometrie (MS). Dit soort technieken is zeer breed
271
Samenvatting
toepasbaar (“generiek”) omdat ze aparte signalen genereren voor veel verschillende
chemische functionaliteiten waardoor in vrijwel alle gevallen substraat en product van een
(enzymatische) reactie makkelijk te onderscheiden zijn. Hierdoor duurt de ontwikkeling van
een screeningsmethode, die gebaseerd is op een dergelijke instrumentele techniek, vaak
slechts enkele dagen, waardoor de eerste positieve resultaten al na een zeer korte tijd
verkregen kunnen worden.
Een dergelijk snelle en responsieve identificatie van biokatalysatoren blijkt ook
mogelijk met minder generieke analysemethodieken, mits de ontwikkeling ervan al voor
het overgrote deel proactief (d.w.z. voorafgaand aan de vraag van de klant) is uitgevoerd.
Spectrofotometrische analyses in microtiterplaatlezers zijn een typisch voorbeeld hiervan,
aangezien de meeste omzettingen niet gepaard gaan met een duidelijke verandering in
optisch signaal. Om dit soort omzettingen toch met een microtiterplaatlezer te kunnen
volgen moet de te screenen reactie gekoppeld worden aan een enzymatische of
chemische vervolgreactie, die wel resulteert in een meetbaar optisch signaal. Door de vele
parameters die voor dit soort gekoppelde analyses geoptimaliseerd moeten worden is de
ontwikkelingstijd ervan lang en daardoor niet verenigbaar met de korte tijdslijnen in CCM.
Proactieve ontwikkeling van robuuste analyses maakt dat deze minder generieke
analysemethodieken ook toegepast kunnen worden in deze branche. Omdat dit echter
aanzienlijke kosten met zich meebrengt is deze tweede benadering uitsluitend haalbaar
voor veelvoorkomende conversies of functionele groepen, zoals de bereiding van
aminozuren of voor reacties waarbij ammoniak als bijproduct wordt gevormd.
Beide benaderingen zijn succesvol toegepast binnen de verschillende
screeningsprojecten die beschreven zijn in dit proefschrift.
272