Inleiding tot het FP7 – QBOL onderzoeksproject Martine Maes ILVO, Instituut voor Landbouw en Visserij Onderzoek, Eenheid Plant, Burg. Van Gansberghelaan 96 bus 2, 9820 Merelbeke QBOL (Quarantine organisms Barcode Of Life) is een project van 3 jaar (2009 - 2012) dat wordt gefinancierd binnen het 7de kaderprogramma van de Europese Unie. Het doel van QBOL is DNA-barcode informatie aan te maken voor getuigenspecimens van quarantainepathogenen en -parasieten. De DNA-sequentie wordt de basis van een publiek toegankelijke, doorzoekbare online databank. Met dat gratis instrument zal men bij middel van de DNAbarcode snel quarantainepathogenen en –parasieten kunnen identificeren op soort niveau. Er zullen volledige protocollen worden opgesteld waarmee eenieder die vertrouwd is met eenvoudige moleculaire technieken zoals PCR snel en makkelijk quarantaineorganismen zal kunnen identificeren. Focus op: Barcodes voor bacteriën Het onderzoek met betrekking tot QBOL is opgebouwd rond de verschillende groepen quarantaineorganismen: bacteriën, schimmels, aaltjes, ongewervelde dieren, fytoplasma’s en virussen. De afzonderlijke soorten waarnaar onderzoek wordt gedaan werden bepaald op basis van de EU-richtlijn (2000/29/EG van 8 mei 2000) en de EPPO lijst van organismen waarvoor reglementering als Q organisme aanbevolen wordt (A1, A2 en alarmlijsten). Dr. Martine Maes van het Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek (ILVO) staat aan het hoofd van de ‘Bacteria Barcoding’ groep. Binnen die groep zijn de taken in verband met barcoding verdeeld over verschillende QBOL partners: 1.Voor Xanthomonas: Instituut voor Landbouw & Visserij Onderzoek (ILVO), België 2.Voor Clavibacter: Laboratorium voor Microbiologie van de Universiteit Gent (UGent), België 3.Voor Ralstonia solanacearum en Xylella fastidiosa: Agroscope Changins-Wädenswil Research Station (ACW), Zwitserland. Er werden totnogtoe zo’n 950 bacteriestammen bestudeerd en meer dan 1750 sequenties aangemaakt. Een belangrijk werk daarbij was het verzamelen van alle relevante bacteriestammen die de diversiteit weergaven van de bestudeerde Q-bacteriën en hun taxonomisch verwanten en dubbelgangers, epifyten en saprofyten die zich op dezelfde waardplanten kunnen bevinden. De werkcollectie voor QBOL bestaat uit Q-bacteriën die werden geïsoleerd in de diverse geografische regio’s overal ter wereld waar de ziekten voorkomen en uit verschillende waardplanten. Zij werden bijeengebracht uit internationaal erkende bacterieverzamelingen (de meeste stammen werden verkregen uit de Belgische BCCM/ LM-UGent collectie), werkcollecties en isolatiecampagnes. 35 (de meeste stammen werden verkregen uit de Belgische BCCM/LM-UGent co bacteriële infectie van teeltma werkcollecties en isolatiecampagnes. opgemerkt tijdens de visuele ook insecten die verhandeld w Verspreiding van schadelijke bacteriën Verspreiding van schadelijke bacteriënwaarlangs schadelijke bacteri Wereldwijd is de belangrijkste weg waarlangs bacteriën worden Wereldwijd deinbelangrijkste waarlangs bac verspreid die van deis handel en het handelsverkeerweg van planten verspreid die van dezoals handel in en het handelsverk en zaaigoed. Sommige processen, de productie van teeltmateriaal, vinden bijvoorbeeld plaats in streken waar die bacteriezieken zaaigoed. Sommige processen, zoals de produ ten inheems zijn. Het materiaal wordt dan voor opkweek overgeteeltmateriaal, vinden bijvoorbeeld plaats in streke bracht naar de EU. Bovendien gebeurt een bacteriële infectie van bacterieziekten inheems zijn.zeHet materiaal wordt teeltmateriaal vaak zonder symptomen waardoor niet wordt opkweek overgebracht naar de EU. Bovendien ge opgemerkt tijdens de visuele inspectie bij binnenkomst in de EU. Naast teeltmateriaal kunnen ook insecten die verhandeld worden als bestuivers of als biologische bestrijding, een weg zijn waarlangs schadelijke bacteriën binnenkomen. Schade en verlies De omvang van de gevolgen EPPO kan alleen maar worde en de daarmee gepaard gaan grootschalige verspreiding en weergegeven, gebaseerd op Schade en verlies veroorzaakt door enkele belan De omvang van de gevolgen van Q- en Q-alarm-bacteriën in de EU of de gebieden van de EPPO kan alleen maar worden geraamd. Totnogtoe waren de bestrijding van Q organismen en de daarmee gepaard gaande maatregebacteriën inheems zijn of niet len vrij succesvol in het vermijden van de grootschalige verspreiding en vestiging van de ziekteverwekker. Hierna wordt informatie weergegeven, gebaseerd op gegevens van EPPO, over schade en verliezen die worden veroorzaakt door enkele belangrijke Q-bacteriën, met vermelding van de plaatsen waar die bacteriën inheems zijn of niet worden bestreden. Clavibacter michigane • Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis: tomaat is de economisch belangrijkste waardplant terwijl een aantal gevoelige nachtschadigen mogelijke reservoirs van de ziekteverwekker kunnen zijn. Deze bacterie werd het eerst beschreven in 1910 in Noord-Amerika, waar ze vermoedelijk haar oorsprong vindt. Omdat tomatenzaad de belangrijkste lange-afstandsvector van de ziekteverwekker is, werkt de handel in zaaizaad de wereldwijde verspreiding van de ziekte in de hand. Er werden grote verliezen gemeld voor zowel kasals vollegrondsteelten van tomaten als gevolg van ofwel het afsterven van jonge plantjes of misvormde vruchten. In Noord Carolina (USA) werd in sommige jaren een opbrengstdaling van 70% vastgesteld. Bij recente proeven in Frankrijk werd een opbrengstdaling van 20-30% opgetekend. Op lokaal vlak kan via het gebruik van besmet materieel de ziekte worden overgebracht op andere planten in dezelfde serre of naar andere serres, percelen of bedrijven. Sinds de ziekte in 1910 voor het eerst werd gemeld in de USA heeft C. michiganensis subsp. michiganensis zich over de hele wereld verspreid. 36 Bij recente proeven in Op lokaal vlak kan via overgebracht op ande bedrijven. Sinds de zi michiganensis subsp. Ralstonia solanacearum h pathogene variëteiten (ras waardplanten. Binnen het daartoe behoren wel bela • Ralstonia solanacearum heeft e pathogene variëteiten (rassen) b waardplanten. Binnen het EPPO Ralstonia solanacearum heeft een brede waaier van waard- daartoe behoren wel belangrijke planten maar de verschillende pathogene variëteiten (rassen) Solanum dulcamara dat een gro binnen de soort hebben een kleinere reeks van waardplanten. Binnen het EPPO-gebied heeft ras 3 maar weinig waardplant-waterlopen en in irrigatiesystem soorten maar daartoe behoren wel belangrijke gewassen zoals aardappelen en tomaten en het onkruid Solanum dulcamaraaangetast in de warmere delen v dat een grote rol speelt als reservoir van de bacterie langsheen De grootste economische schad waterlopen en in irrigatiesystemen. Daarnaast kunnen ook andere waardplanten worden aangetast in de warmere delenzuidoosten van de USA en in Br van het EPPO-gebied waar de bacterie reeds voorkomt. De werd een verlies van de hele tom grootste economische schade werd gemeld in aardappelen, tabak en tomaten in het zuidoosten van de USA en in Brazilië,vooral tropische en subtropsiche Colombia, Zuid-Afrika, Indonesië en India. Soms werd een verlies van de hele tomatenoogst gemeld. Het is ook zo dat van R. solanacearum. In het stro meer dan 200, vooral tropische en subtropsiche, plantensoor-helft van de bananenplantages a ten gevoelig zijn voor een of meer rassen van R. solanacearum. In het stroomgebied van de Amazone in Peru is bijvoorbeeld de helft van de bananenplantages aangetast. Xanthomonas oryzae omvat twe • Xanthomonas oryzae omvat twee niet-Europese ziekteverwekkers bij rijst, de pathovars oryzae en oryzicola. Die pathovars tasten een aantal wilde of minder vaak gekweekte Poaceae aan maar ook onkruidsoorten die als locale vectoren kunnen optreden terwijl de verspreiding over grote afstanden gebeurt via besmet rijstzaad. Bacterieverwelkingsziekte wordt veroorzaakt door X. oryzae pv. oryzae en is de ernstigste ziekte die in Zuid-Oost-Azië voorkomt in rijst. Op de Filippijnen lopen de verliezen in gevoelige teelten op tot zo’n 22,5% in het regenseizoen en 7,2% in het droogseizoen. Het is bekend dat stikstofbemesting de gevoeligheid voor de ziekte vergroot. X. oryzae pv. oryzicola veroorzaakt bladstrepenziekte en is in een aantal gebieden belangrijk in zeer natte seizoenen en bij hoge stikstofgehalten. In India werden verliezen van 5-30% gemeld maar in het algemeen is bladstrepenziekte een minder belangrijke ziekte dan de bacterieverwelkingsziekte. X. oryzae pv. oryzae is een gevaarlijke ziekteverwekker die niet voorkomt in Europese rijstteelten maar waarschijnlijk wel kan overleven in de landen rond de Middellandse Zee en dan ook een ernstig risico vormt voor het EPPO-gebied. gevoeligheid voor de ziekte verg 37 Gekweekte aardbeien zijn de b • Gekweekte aardbeien zijn de belangrijkste waardplant van Xanthomonas fragariae, de oorzaak van de bladvlekkenziekte die gekenmerkt wordt door hoekige vlekken op de bladeren. De bacterie werd voor het eerst beschreven in 1962, in NoordAmerika en werd waarschijnlijk van daaruit naar andere landen overgebracht via plantgoed. X. fragariae leidt tot opbrengstverlies maar vernietigt de planten meestal niet hoewel bij nat weer en frequent beregenen zware verliezen kunnen optreden. De ziekte is nu al aanwezig in een aantal aardbeiproducerende landen in de EU en kan een vaste stek verwerven in de meeste landen waar aardbeien worden geteeld. In een poging om de verspreiding ervan tegen te gaan werd X. fragariae opgenomen in een lijst van quarantaineziekten in teeltmateriaal en plantgoed. bladstrepenziekte en is in een aantal gebieden bela hoge stikstofgehalten. In India werden verliezen van is bladstrepenziekte een minder belangrijke ziekte d oryzae pv. oryzae is een gevaarlijke ziekteverwekke rijstteelten maar waarschijnlijk wel kan overleven in en dan ook een ernstig risico vormt voor het EPPO- Gekweekte aardbeien zijn de belangrijkste waardpla oorzaak van de blad door hoekige vlekke voor het eerst besch werd waarschijnlijk overgebracht via pla opbrengstverlies ma hoewel bij nat weer verliezen kunnen op een aantal aardbeip een vaste stek verw aardbeien worden geteeld. In een poging om de ver X. fragariae opgenomen in een lijst van quarantaine aardbeien worden geteeld. In e X. fragariae opgenomen in een Barcodes bepalen voor bacteriën Prokaryoten zijn niet opgenom Canadian Centre for DNA Barc feiten en kenmerken van het b Barcodes bepalen voor bacteriën van barcodes voor bacteriën k ‘universeel’ barcodegen voor bacteriën of prokaryoten. H Prokaryoten zijn niet opgenomen in het Barcode of Life project. Het Canadian Centre for DNA Barcoding genetische diversiteit op aarde (CCDB) te vinden is in de prokary de bacteriën verschilt natuurlijke vermeldt de specifieke feiten en kenmerken van het bacteriegenoom dat de ontwikkeling van de barcodes voor diversificatie en dus nieuwe soorten in aanzienlijke mate bacteriën kan bemoeilijken. Er bestaat geen ‘universeel’ barcodegen voor bacteriën of prokaryoten. Hoewel de van de mechanisme eurokaryoten. grootste biochemische en genetische diversiteit op aarde te vinden is in de prokaryotische domeinen van de Dedemate van accumulatie nieuwe mutaties en het ve Archaea en de bacteriën verschilt de natuurlijke diversificatie en dus ook taxonomische vormingvan van nieuwe genoverdracht resulteert immers in een vrij snel evoluer soorten in aanzienlijke mate van de mechanismen die bekend zijn bij de eurokaryoten. gaand met virulentie en specialisering in bepaalde waar wellicht onmogelijk om een universeel barcodegen te vin De mate van accumulatie van nieuwe mutaties en het verschijnsel vanom de laterale resulteert im- van die groep van de zeergenoverdracht aanzienlijke biodiversiteit onvoldoende ontwikkeld. van de grootste moeilijkhe mers in een vrij snel evoluerend genoom, eveneens gepaard gaand met virulentie en specialiseringEen in bepaalde soorten. Dat is allicht ook het geval voor de soorten Xan waardplanten. Het is daarom moeilijk en wellicht onmogelijk om een universeel barcodegen te vinden voor bacPseudomonas en Ralstonia waarin een aantal belangrijk teriën en de strategie om de zeer aanzienlijke biodiversiteit van die groep van organismen in barcodes te vertalen voorkomen. is onvoldoende ontwikkeld. Een van de grootste moeilijkheden betreft het karakteriseren van de soorten. Dat De meeste Q-bacteriën moeten worden geïdentificeerd is allicht ook het geval voor de soorten Xanthomonas, Clavibacter, Pseudomonas en Ralstonia waarin een aantal niet mogelijk om één enkel gen te gebruiken dat represe belangrijke plantenziektenverwekkers voorkomen. identificatie van alle plantpathogene bacteriën die verme elke ontwikkeling is een uitgebreide validatie vereist. De meeste Q-bacteriën moeten worden geïdentificeerd op pathovar- of subsoortniveau. Het is niet mogelijk om één enkel gen te gebruiken dat representatief en betrouwbaar is voor de identificatie van alle plantpathogene Symp pv. di bacteriën die vermeld zijn op de quarantainelijst. Voor elke ontwikkeling is een uitgebreide validatie vereist. Barcodes bepalen voor bacteriën Prokaryo Canadian feiten en van barco ‘universeel’ barcodegen voor bacte genetische diversiteit op aarde te v de bacteriën verschilt de natuurlijke nieuwe soorten in aanzienlijke mat eurokaryoten. De mate van accumulatie van nieu genoverdracht resulteert immers in gaand met virulentie en specialiser wellicht onmogelijk om een univers om de zeer aanzienlijke biodiversit onvoldoende ontwikkeld. Een van d soorten. Dat is allicht ook het geva Pseudomonas en Ralstonia waarin voorkomen. 38 De meeste Q-bacteriën moeten wo soorten. Dat is allicht ook het geval voor de soorten Xan Pseudomonas en Ralstonia waarin een aantal belangrij voorkomen. De meeste Q-bacteriën moeten worden geïdentificeerd niet mogelijk om één enkel gen te gebruiken dat repres identificatie van alle plantpathogene bacteriën die verm elke ontwikkeling is een uitgebreide validatie vereist. Sym pv. d Symptomen van Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae 39 Strategie in verband met barcoding De barcode-identificatiestra deze studie geprioriteerde d Strategie in verband met barcoding een beslissingsschema. De barcode-identificatiestrate Als eerste verkennende deze studie dov van hetgeprioriteerde 16S rRNA gen een beslissingsschema. geen idee heeft van het Als eerste verkennende een plantaardig productp van hetvolgende 16S rRNA gengeb vo In de stap geen idee heeft van het tyb genlocus om bacteriën een plantaardig product w onderscheiden. Dat resu In de volgende stap gebr middel van een tweede barcode. Strategie in verband met barcoding genlocus om bacteriën bi Om een nog verder doorgedreven onderschei De barcode-identificatiestrategie in deze studie geprioriteerde doelgroepen verloopt vol- Dat onderscheiden. de pathovarvoorofde verschillende het fylotype worden extra barcodes in resul ande gens een beslissingsschema. middel van een tweede barcode. gen geïdentificeerd. • Als eerste verkennende proef wordt de sequenering van het 16S rRNA gen voorgesteld als men vooraf geen idee heeft van het type (genus) bacterie dat uit eenbarcoding plantaardig productdoorgedreven werd geïsoleerd. Strategie in verband met Om een nog verder onderscheid •Dat In de volgende stap gebruiken wij één universele genlocus om bacteriën binnen het genus van voor elkaarde te verschillende in De barcode-identificatiestrategie is de basis voor de identificatie van quarantainebacteriën de pathovar ofworden het bevestigd fylotype worden extra barcodes involgens ander deze studie geprioriteerde verloopt onderscheiden. Dat resultaat kan bij middel van een tweede barcode. doelgroepen een beslissingsschema. van de fytosanitaire risicobeoordeling. •concept Om een nog verder doorgedreven onderscheid te maken op het niveau van de pathovar of het fylotype worgen geïdentificeerd. Als eerste verkennende proef wordt de sequenering den extra barcodes in andere kern- of bijgebieden van het gen geïdentificeerd. van het 16S rRNA gen voorgesteld als men vooraf geen idee heeft van het type (genus) bacterie dat uit Dat is de basis voor de identificatie van quarantainebacteriën en bijgevolg van het hele concept van de fytosanieen plantaardig product werd geïsoleerd. taire risicobeoordeling. In de volgende stap gebruiken wij één universele genlocus om bacteriën binnen het genus van elkaar te onderscheiden. Dat resultaat kan worden bevestigd bij middel van een tweede barcode. Om een nog verder doorgedreven onderscheid te maken op het niveau van de pathovar of het fylotype worden extra barcodes in andere kern- of bijgebieden van het gen geïdentificeerd. Dat is de basis voor de identificatie van quarantainebacteriën en concept van de fytosanitaire risicobeoordeling. Dat is de basis voor de identificatie van quarantainebacteriën en bijgevolg van het hele concept van de fytosanitaire risicobeoordeling. 40 Lijst van prioritaire Q- Op de 2000/2 Op 200 ‘candi ‘ca in dein dl pat pathov ste steunt Lijst van prioritaire Q-bacteriën voor barcoding Lijst van prioritaire Op de gecombineerde lijst van de EPPO en de EU (EU-Richtlijn 2000/29/EG) staan thans 27 Q- en Q-alert-bacteriën (fytoplasma’s en ‘candidatus’ bacteriën niet inbegrepen). Men weet intussen dat een aantal in de lijst vermelde Q-bacteriën heterogenetisch zijn en dat vele ook als pathovars worden vermeld. Die indeling beoogt een bijzonder doel en steunt op een pathologisch kenmerk dat taxonomisch irrelevant is. Binnen QB een aantal subsoorten rekening g de comple Binnen QBOL werd een eerste doelgroep van Q-bacteriën bepaald; het gaat om een aantal Xanthomonas soorten en pathovars, 3 Clavibacter michiganensis subsoorten, Ralstonia solanacearum en Xylella fastidiosa. Bij die keuze werd rekening gehouden met de Q-relevantie en de verwachte rendabiliteit alsook met de complexiteit binnen de taxa. Binnen QBOL een aantal Xa subsoorten, R Ralstonia rekening geho de complexite Ralstonia solanacearum De lijst van prioritaire De lijst van prioritaire bacteriën voor barcoding conform de wetgeving betreffende planten van de EU en de deEPPO EU en de EPPO. Bijlage 2000/29/EC EPPO Xylella fastidiosa IA A1 Xylella fastidiosa Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus IA A2 Clavibacter michigan Pseudomonas solanacearum = Ralstonia solanacearum IA Xanthomonas stammen die pathogen zijn voor citrusvruchten II A A2 Pseudomonas solana A1 Xanthomonas oryzae pv. oryzae & oryzicola II A A1 Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus II A Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis II A Xanthomonas campestris (axonopodis) pv. phaseoli II A Xanthomonas vesicatoria & X. campestris (axonopodis) pv. vesicatoria II A Ralstonia sol A2 Xanthomonas stamm citrusvruchten De lijst van prioritaire ba oryzae A2 Xanthomonas Clavibacter michigan de EU enA2 de EPPO. A2 Clavibacter michigan A2 Xanthomonas campe Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae Xanthomonas axonopodis pv. allii II A Xanthomonas fragariae A1 Xanthomonas vesica Xylella fastidiosa A2 X. campestris (axono A2 ClavibacterXanthomonas michiganen axono Xanthomonas translucens pv. translucens Xanthomonas axono Pseudomonas solanace Xanthomonas fragari Xanthomonas translu Xanthomonas stammen citrusvruchten - Xylella fastid dwerggroei b chlorose bij c Xanthomonas oryzae pv - Clavibacter m Clavibacter michiganen bekend staat aardappelkn 41 Clavibacter michiganen - Ralstonia so mogelijke wa - - - - - - - - - - - - - Xanthomonas axonopodis en Xanthomonas citri hebben verschillende pathovars en varianten diebelangrijke kanker ziekteverwekker veroorzakenbijbijplanten; citrusplanten. Xylella fastidiosa is een veroorzaakt dwerggroei bij perzik, brandvlekkenziekte bij oleander, Pierce’s disease en bonte chlorose bij citrusvruchten (CVC). Rijst is de belangrijkste waardplant van Xanthomonas oryzae. De soort heeft twee Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus veroorzaakt een aardappelziekte die bekend staat als ringrot niet-Europese pathovars: Xanthomonas oryzae pv. oryzae en Xanthomonas oryzae vanwege de manier waarop ze het vaatweefsel in aardappelknollen infecteert. pv. oryzicola. Ralstonia solanacearum veroorzaakt bacteriële verwelking bij een groot aantal mogelijke waardplanten zoals tomaat, peper, aubergine en Pelargonium. -aardappel, Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus besmet alfalfa. Xanthomonas axonopodis en Xanthomonas citri hebben verschillende pathovars en varianten die kanker -veroorzaken Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis veroorzaakt bacteriële verwelking bij bij citrusplanten. tomaten. Rijst is de belangrijkste waardplant van Xanthomonas oryzae. De soort heeft twee niet-Europese pathovars: oryzae pv. oryzae en Xanthomonas oryzae pv. oryzicola. -Xanthomonas Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli is de verwekker van bacteriebrand bij bonen. Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus besmet alfalfa. -Clavibacter De belangrijkste waardplanten van Xanthomonas vesicatoria & X. axonopodis pv. michiganensis subsp. michiganensis veroorzaakt bacteriële verwelking bij tomaten. vesicatoria zijn pv. tomaten Capsicum. Xanthomonas axonopodis phaseoli isen de verwekker van bacteriebrand bij bonen. De belangrijkste waardplanten van Xanthomonas vesicatoria & X. axonopodis pv. vesicatoria zijn araceeën tomaten en en is het - Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae is pathogeen voor Capsicum. agressiefst op Anthurium. Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae is pathogeen voor araceeën en is het agressiefst op Anthurium. -Xanthomonas Xanthomonas pv.schade allii veroorzaakt axonopodis axonopodis pv. allii veroorzaakt in Allium teelten.schade in Allium teelten. fragariae veroorzaakt bladvlekkenziekte bij aardbei. -Xanthomonas Xanthomonas fragariae veroorzaakt bladvlekkenziekte bij aardbei. Xanthomonas translucens pv. translucens is de verwekker van bacteriële bladstrepenziekte in kleinkorrelige -graansoorten. Xanthomonas translucens pv. translucens is de verwekker van bacteriële - bladstrepenziekte in kleinkorrelige graansoorten. De database Q-bank bevat alle relevante gegevens die in QBOL aangemaakt met het oog op eenrelevante correcte barcode-identiDewerden database Q-bank bevat alle gegevens die in QBOL ficatie van plantpathogenemet quarantaineorganismen. werden aangemaakt het oog op een correcte barcodehttp://www.q-bank.eu/ identificatie van plantpathogene quarantaineorganismen. http://www.q-bank.eu/ Contact: Martine Maes ([email protected]) Contact: Martine Maes ([email protected]) 42