Mogelijkheden PCR

ELISA
PCR:
nieuwe mogelijkheden
antiserum
antilichaam
Bacterie of virus
(… maar wat zijn de
limiterende factoren?)
celwand
Masterclass aardappelselectie en
aardappelteelt - 29 juni 2010
ELISA
DNA
Gé van den Bovenkamp
Afdeling Laboratoriummethoden &
Diagnostiek
PCR
Bacterie- en Viruscel
Bacterie: 1 - 5 µm
(0,001 – 0,005 mm)
Virus: 20 – 300 nm
DE CEL
(0,00002 – 0,0003 mm)
Bacteriecel
TREK EENS AAN MIJN CHROMOSOOM!
1
DNA: Dubbele Helix
DNA?????
DNA bestaat uit:
- Basen
- Desoxyribosegroepen
- Fosfaatgroepen
De ruggegraat van het DNA!!!
DNA?????
DNA bestaat uit:
- Basen
Guanine G
Cytosine C
Adenine A
Thymine T
DNA?????
ATGCCGTTAGACCGTTAGCGGACCTGAC
TACGGCAATCTGGCAATCGCCTGGACTG
- Desoxyribosegroepen
- Fosfaatgroepen
De ruggegraat van het DNA!!!
DNA?????
ATGCCGTTAGACCGTTAGCGGACCTGAC
TACGGCAATCTGGCAATCGCCTGGACTG
Hoera!!! Een specifiek stukje
DNA!!!!!!!
Zit er Dickeya solani in die zieke
aardappelplant???
Kan ik dat specifieke stukje DNA van
Dickeya solani in die plant vinden???
ATGCCGTTAGACCGTTAGCGGACCTGAC
TACGGCAATCTGGCAATCGCCTGGACTG
(van bijv. Dickeya solani)
2
Procedure PCR
I.
Haal al het DNA uit de plant, het zaad of
de knol
Procedure PCR
II. Voer de PCR-reactie uit
PCR = Polymerase Chain Reaction
(Polymerase Ketting Reactie)
ATGCCGTTAGACCGTTAGCGGACCTGAC
TACGGCAATCTGGCAATCGCCTGGACTG
Benodigdheden PCR
Procedure PCR
Kookboek:
Kookboek:
Ingrediënten:
Benodigdheden:
het geëxtraheerde DNA
oligonucleotiden
primers
DNA-polymerase
alles tezamen in een “reactiemix”
het geëxtraheerde DNA = al het DNA uit die
zieke plant (ook dat van de plant zelf!)
een thermocycler
oligonucleotiden
primers
DNA-polymerase
een thermocycler
Procedure PCR
Kookboek:
n DNA !!!
Bouw uw eige
Benodigdheden:
het geëxtraheerde DNA
Procedure PCR
Kookboek:
Benodigdheden:
het geëxtraheerde DNA
oligonucleotiden
oligonucleotiden = bouwstenen voor een
DNA-streng: dATP, dCTP, dGTP en dTTP
primers
DNA-polymerase
primers: kleine, complementaire stukjes
DNA die dienstdoen als begin- en
eindpunt van de reactie
DNA-polymerase
een thermocycler
een thermocycler
3
PRIMERS
Procedure PCR
Kookboek:
ATGCCGTTAGACCGTTAGCGGACCTGAC
GGCAAT
Benodigdheden:
CGGACC
TACGGCAATCTGGCAATCGCCTGGACTG
DNA-polymerase: een enzym dat kapot
(enkelstrengs) DNA kan repareren
uit de bacterie Thermus aquaticus = Taqpolymerase = thermostabiel
het geëxtraheerde DNA
oligonucleotiden
primers
een thermocycler
Procedure PCR
PCR
Kookboek:
Benodigdheden:
het geëxtraheerde DNA
oligonucleotiden
primers
DNA-polymerase
alles tezamen in een reactiemix
een thermocycler
Bron: MaxAnimations
Wat is PCR????
PCR is niets meer dan het
vermeerderen van een specifiek
stukje DNA!!!
9’ 50ºC
40 x (30’’ 94ºC - 45’’ 68ºC - 45’’ 72ºC)
8’ 72ºC
Procedure PCR
III. Maak het
geamplificeerde
(vermeerderde) DNA
zichtbaar
Via gel-electroforese op
een gel
En dan kan ik het nog steeds niet
zien!!!
4
INTERMEZZO
INTERMEZZO
HET VIRUS
INTERMEZZO: HET VIRUS
Bijzondere vormen van
moleculaire methoden
• Onze aardappelvirussen bevatten alleen
RNA
• RNA is (bij onze virussen) enkelstrengs
• RNA bevat het nucleotide uracil (U) in
plaats van thymine (T)
AUGCCGUUAGACCGUUAGCGGACCUGAC
Wat is real-time PCR en wat is
die Taqman-methode????
De TaqMan-probe en het ABIapparaat
• Voorafgaande aan de PCR-reactie maken
we er eerst dubbelstrengs, complementair
DNA van (cDNA)
AUGCCGUUAGACCGUUAGCGGACCUGAC
UACGGCAAUCUGGCAAUCGCCUGGACUG
De PROBE ???
De PROBE ???
In de reactiemix nu ook nog een specifieke
probe!!!
ATGCCGTTAGACCGTTAGCGGACCTGAC
TACGG
Forward primer
In de reactiemix nu ook nog een specifieke
probe!!!
ATGCCGTTAGACCGTTAGCGGACCTGAC
TACGG
GGCAATC
Forward primer
Reverse primer
CTGAC
TACGGCAATCTGGCAATCGCCTGGACTG
Reverse primer
CTGAC
TACGGCAATCTGGCAATCGCCTGGACTG
5
Real-time PCR
Bron: Veterinary Sciences Tomorrow
De resterende vragen
Wat is een
multiplex-PCR?
Multiplex PCR
Plant sap
plantensap
Elisa in
plant sap
PCR
ELISA
X
Knolsap
Direct
Tuber
Testing
ELISA
A
één reactie:
PVY
Y
PVY
X
S
PVA
Bladrol
PVX
Bladrol
Bladrol
Bladrol
De resterende vragen
Wat is een
multiplex-PCR?
plantensap
4 virussen
PVX
PVA
A
PCR
Y
Wat zijn de voordelen van moleculaire
methoden?
• toepasbaar waar serologie faalt (virussen zonder
eiwitmantel als PSTVd en Tabaksratelvirus in
aardappel, virusstammen die geen verschil in
eiwitmantel hebben zoals PVYn en PVYntn of
pathogene en niet-pathogene Pcc’s)
Eén reactiemix met
8 primers en 4
verschillende probes,
iedere probe met zijn eigen
fluorescerende label
Real-time PCR in het ABIapparaat; iedere probe
geeft zijn eigen signaal
PCR
Y
X
A
• in bepaalde gevallen: hoge gevoeligheid
(bijv. 1 wortelknobbel-eiprop in 100
aardappelschilletjes, PSTVd 1 ziek blad in 100
gezonde blaadjes etc.)
• in het geval van het nacontroleonderzoek:
snelheid (opkweken van topogen niet nodig)
Bladrol
• verruimt de mogelijkheden tot multiplexen (bijv. 4
aardappelvirussen)
6
Wat zijn de nadelen van moleculaire
methoden?
• duurder dan ELISA
200 knollen virusonderzoek (Y, A, X):
Elisa: € 95
PCR: € 350
• vraagt beter opgeleid (duurder) personeel
Waarom is PCR duur t.o.v. ELISA I
• chemicaliën, primers, probes etc. zijn
duurder dan bij ELISA
• er is altijd een extra stap nodig na
sapwinning: de DNA- of RNA-extractie
(dus meer werk!)
• gemiddeld duurder personeel, vooral bij
probleemoplossing
• de NAK/de klant wil vaak een
(semi)kwantitatieve uitslag!
Waarom is PCR duur II
Monstergrootte:
Statistische kans op het missen van 1% Erwiniabesmetting in de partij, bij een bepaalde grootte van het
te onderzoeken monster
Een kwalitatieve PCR is relatief goedkoop!
Het Q-organisme PSTVd in aardappel:
100 blaadjes, 1 reactie
ja of nee
40
37
35
30
procenten
Een (semi)kwantitatieve PCR is duur,
ondanks het samenvoegen van 10
naveleindjes in de nacontrole:
200 knollen = 20 pooltjes van 10 knollen =
20 PCR (multiplex) reacties
25
kans op het missen van
1% besmetting in de partij
20
14
15
10
5
5
2
1
400
500
0
100
200
300
aantal knollen in het monster
Toepassingen NAK/NAK AGRO
• DTT: 3-4 virussen, rechtstreeks aan de
knol (nacontroleonderzoek)
• BioPlex Erwinia-onderzoek: alle
pathogene ‘Erwinia’soorten (vrijwillig
onderzoek)
• Najaar 2010: 4 wortelknobbelaatjes,
waaronder Meloidogyne chitwoodi en
M. fallax, rechtstreeks (kwantitatief) in
grond
Masterclass aardappelselectie & -teelt
Waar zouden we eens over moeten praten?
- Is de teler zich altijd wel zo bewust dat de
voorspellende waarde van het door hem
aangevraagde/voor hem uitgevoerde
onderzoek afhangt van de door hem
gekozen monstergrootte (goedkoop is
duurkoop)
- Ligt er ergens een grens aan wat het
laboratorium kan en wat betaalbaar is
voor de klant? Willen we altijd
moleculaire methoden (bijv. nacontrole?)
7
Masterclass aardappelselectie & -teelt
Waar zouden we eens over moeten praten?
- Hoe kunnen NAK en NAK AGRO het
gemakkelijker maken voor de klant:
* goedkopere toetsen (gevoeliger
moleculaire methoden, dus grotere
submonsters samenvoegen)
* duidelijke (duidelijker?) voorlichting
over wat kan en wat niet kan?
* ?????
met dank aan:
Eisse de Haan & Toos Dekker
PRI, Wageningen
PD, Wageningen
CSL, York - Engeland
INRA, Angers - Frankrijk
Lars van den Bovenkamp
e.v.v.v.v.a.
DISCUSSIE!!!
8