Tumorcel exosoombiogenese en het actine cytoskelet: verkenning
advertisement
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2015 – 2016 Tumorcel exosoombiogenese en het actine cytoskelet: verkenning van de interconnectie gebruikmakend van cortactine nanobodies Delphine Devriese Promotor: Prof. dr. Jan Gettemans Prof. dr. Els Van Damme Tutor: Prof. dr. Jan Gettemans Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: cel- en genbiotechnologie De auteur en promotors geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. Gent, juni 2016 De promotors, Prof. dr. Jan Gettemans De auteur, Delphine Devriese Prof. dr. Els Van Damme Woord vooraf Dit voorwoord zou ik willen richten aan alle mensen die mij bijgestaan hebben en een steentje bijgedragen hebben om deze thesis tot een goed einde te brengen. Met dit werk rond ik mijn opleiding als bio-ingenieur af en door hun hulp kon ik dit met een goede ervaring afsluiten. Ik had graag mijn promotors prof. dr. Jan Gettemans en prof. dr. Els Van Damme willen bedanken om mij de kans te geven een stap in het wetenschappelijk onderzoek te zetten. Zo kon ik een jaar lang proeven van de onderzoekswereld binnen het boeiende labo van prof. dr. Jan Gettemans. Els Beghein wil ik uitgebreid bedanken voor alle hulp doorheen het jaar. Ze leerde me de technieken aan die ik nodig had in het labo en ook daarbuiten was ze van grote hulp. Ze was altijd bereid mijn vragen te beantwoorden en problemen op te lossen. Bovendien stond ze steeds paraat om de thesis na te lezen en feedback te leveren. Mede door deze goede begeleiding kon ik afgelopen jaar als een positieve ervaring beleven. Daarnaast richt ik ook een dankwoord aan Isabel, Laurence, Adriaan, Anneleen, Olivier, Thijs en Tim die me goed opgevangen hebben in de groep. Ze vormden allen samen een toffe bende en er heerste een aangename sfeer. Hiertoe droegen ook mede-thesisstudenten Jasmien en Lien bij. Een dankjewel gaat ook uit naar mijn ouders. Ze steunden me niet alleen dit jaar maar doorheen elk studiejaar. Mijn zus Joke verdient hier zeker ook een plaatsje. Bij haar kon ik steeds terecht en ze nam de moeite om mijn thesis na te lezen. Als laatste had ik mijn vriend Toon graag bedankt. Doorheen het jaar heeft hij altijd een luisterend oor geboden en klaargestaan voor mij. Hij wist me steeds te motiveren en tot rust te brengen bij stress momenten. Bedankt iedereen! Inhoudsopgave Samenvatting ........................................................................................................................ 8 Inleiding ................................................................................................................................. 9 1 Literatuurstudie .............................................................................................................10 1.1 Kanker: globaal overzicht .......................................................................................10 1.2 Exosomen ..............................................................................................................12 1.2.1 Inleiding...........................................................................................................12 1.2.2 Endocytotische pathway..................................................................................12 1.2.3 Intraluminale vesikel-/exosoomvorming ...........................................................13 1.2.3.1 ESCRT-afhankelijk ...................................................................................13 1.2.3.2 ESCRT-onafhankelijk ...............................................................................16 1.2.3.3 Gemengd model.......................................................................................16 1.2.4 Exosoomsecretie.............................................................................................17 1.2.5 De rol van exosomen in kanker .......................................................................18 1.3 Het actinecytoskelet ...............................................................................................19 1.3.1 Algemeen ........................................................................................................19 1.3.1.1 Inleiding....................................................................................................19 1.3.1.2 Actine .......................................................................................................19 1.3.1.3 Actinebindende proteïnen ........................................................................19 1.3.1.4 Actinerijke protrusies ................................................................................20 1.3.2 Cortactine........................................................................................................21 1.3.3 Invadopodia ....................................................................................................22 1.3.3.1 Inleiding....................................................................................................22 1.3.3.2 Precursorvorming .....................................................................................22 1.3.3.3 Actinepolymerisatie ..................................................................................23 1.3.3.4 Rekrutering proteasen ..............................................................................25 1.3.3.5 Verband tussen invadopodia en exosomen ..............................................26 1.4 Nanobodies ............................................................................................................27 2 Materialen en methoden ................................................................................................29 2.1 Verband tussen cortactine en exosomen................................................................29 2.1.1 Exosoomsecretie na inhibitie cortactine met nanobodies ................................29 2.1.1.1 Celcultuur .................................................................................................29 2.1.1.2 Antilichamen ............................................................................................29 2.1.1.3 OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie ...........................................29 2.1.1.4 Western blot .............................................................................................30 2.1.1.5 Exosoomkwantificatie via nanoparticle tracking analysis ..........................31 2.1.1.6 Statistische analyse .................................................................................31 2.1.2 Exosoomsecretie na expressie neerregulatie cortactine met shRNA ...............31 2.1.2.1 Celcultuur .................................................................................................31 2.1.2.2 Transfectie ...............................................................................................31 2.1.2.3 Cellen lyseren en eiwitconcentratie bepalen.............................................31 2.1.2.4 Antilichamen ............................................................................................32 2.1.2.5 Western blot .............................................................................................32 2.1.2.6 Immunostaining en fluorescentiemicroscopie ...........................................32 4 2.2 Verband tussen invadopodia en exosomen ............................................................33 2.2.1 Celcultuur ........................................................................................................33 2.2.2 Antilichamen ...................................................................................................33 2.2.3 Immunostaining en fluorescentiemicroscopie ..................................................33 2.2.4 Kwantificatie en statistische analyse ...............................................................34 3 Resultaten .....................................................................................................................35 3.1 Verband tussen cortactine en exosomen................................................................35 3.1.1 Exosoomsecretie na inhibitie cortactine met nanobodies ................................35 3.1.1.1 OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie ...........................................35 3.1.1.2 Western blot ter detectie zuiverheid OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie ........................................................................................................37 3.1.2 Exosoomsecretie na expressie neerregulatie cortactine met shRNA ...............38 3.1.2.1 Western blot na cotransfectie ...................................................................38 3.1.2.2 Immunostaining na cotransfectie ..............................................................39 3.1.2.3 Western blot na enkele transfectie ...........................................................40 3.2 Verband tussen invadopodia en exosomen ............................................................42 3.2.1 Nabijheid invadopodia en exosomen na immunostaining ................................42 3.2.1.1 Parentale MDA cellen...............................................................................42 3.2.1.2 CRN Nb expressie ...................................................................................42 3.2.2 MT1-MMP, invadopodia en exosomen ............................................................45 3.2.2.1 Nabijheid MT1-MMP, invadopodia en exosomen .....................................45 3.2.2.2 Degradatie assay .....................................................................................46 3.2.3 Controles.........................................................................................................46 3.2.3.1 Andere merkers........................................................................................46 3.2.3.2 CD63 en het Golgi-apparaat.....................................................................46 3.2.3.3 Immunostaining met secundair antilichaam ..............................................47 3.2.4 Invadopodiavorming op polystyreen ................................................................47 4 Discussie .......................................................................................................................50 4.1 Verband tussen cortactine en exosomen................................................................50 4.1.1 Exosoomsecretie na inhibitie cortactine met nanobodies ................................50 4.1.2 Exosoomsecretie na expressie neerregulatie cortactine met shRNA ...............52 4.2 Verband tussen invadopodia en exosomen ............................................................54 5 Algemene conclusie ......................................................................................................56 6 Ideeën voor verder onderzoek .......................................................................................57 Referenties ...........................................................................................................................58 Addendum.........................................................................................(elektronisch beschikbaar) 5 Lijst met afkortingen AAA ABP ADAM ADF ALIX AMSH ARF6 Arg Arp2/3 CD CH CHMP CL CIP4 CRN dox DRF EAP ECM EGFR EMT Ena/VASP ER ESCRT EV Fab F-actine FC FH2 FSN G-actine GAP GEF GLUE GSN HB-EGF HDAC6 HPV HRS IARC ILV MMP MT1-MMP MV MVB MVE ATPases associated with diverse cellular activities actinebindende proteïnen A disintegrin and metalloproteinase actin-depolymerizing factor apoptosis-linked gene 2-interacting protein X associated molecule with the SH3 domain of STAM ADP ribosylation factor 6 Abl-related gene actin-related protein 2 and 3 cluster of differentiation constant domain of heavy chain charged multivesicular body protein constant domain of light chain Cdc42 interacting protein 4 cortactine doxycycline diaphanous-related formin ELL-associated protein extracellulaire matrix epidermal growth factor receptor epitheel-mesenchym transitie enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein endoplasmatisch reticulum endosomal sorting complex required for transport extracellulaire vesikels fragment antigen-binding filamenteus actine fragment crystallizable formin homology 2 fascine globulair actine GTPase activating protein guanine exchange factors GRAM-like ubiquitin-binding motif in EAP45 gelsoline heparin binding epidermal growth factor histon deacetylase 6 humaan papillomavirus hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate International Agency for Research on Cancer intraluminale vesikels matrix metalloproteïnase membrane type 1 matrix metalloproteinase microvesikels multivesicular body sorting factor multivesikulair endosoom 6 Nb Nck1 NHE-1 NTA N-WASP NZF PA PDGFR PET PI PLD2 PX RAB Rb RNAi SCAR/WAVE SH3 SHIP2 SNARE STAM Tspan8 TGF TGN TSG101 TTP USP8/UBPY VAMP VH VHH VL VPS vWF WASH WASP WHO WIP Nanobody non-catalytic region of tyrosine kinase 1 sodium/hydrogen exchanger 1 amino-terminal acidic neuraal WASP Npl4-type zinc finger fosfatidezuur platelet-derived growth factor receptor positron emissive tomografie fosfatidylinositol fosfolipase D2 phox homoloog RAS-related in brain retinoblastoma proteïne RNA interference suppressor of cAMP receptor/WASP family verprolin homologous Src homoloog 3 SH2 domain-containing inositol 5-phosphatase 2 soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion attachment protein receptors signal transducing adaptor molecule tetraspanine 8 transforming growth factor trans-Golgi netwerk tumor susceptibility gene 101 trombotische trombocytopenische purpura ubiquitin specific peptidase 8 vesicle-associated membrane protein variable domain of heavy chain variable domain of heavy chain of heavy chain antibodies variable domain of light chain vacuolar protein sorting von Willebrand factor Wiskott-Aldrich syndrome protein and Scar homolog Wiskott-Aldrich syndrome protein World Health Organisation WASP-interacting protein 7 Samenvatting Exosomen zijn extracellulaire vesikels die endosomaal van oorsprong zijn en een grootte hebben van 30 tot 100 nm. Er wordt hen een functie in intercellulaire communicatie toegeschreven. Zo dragen ze in de ontwikkeling van kanker bij aan de wederzijdse communicatie tussen de verschillende cellen aanwezig in de tumor micro-omgeving. De belangrijkste doodsoorzaak van kanker is metastase. Hierbij zijn actinerijke protrusies, invadopodia genaamd, belangrijke mediatoren. Zij zorgen voor de afbraak van de extracellulaire matrix (ECM) en het doorbreken van de basale membranen. Het protease MT1-MMP speelt hierin een prominente rol. Er werd een mogelijk verband gesuggereerd tussen invadopodia en voornoemde exosomen. Exosomen zouden preferentieel ter hoogte van invadopodia gesecreteerd worden en zouden actief MT1-MMP bevatten dat bijdraagt aan ECM degradatie en afbraak van de basale membranen. Dit mogelijk verband werd verder onderzocht waarbij gebruikgemaakt werd van nanobodies (Nbs). Dit zijn geïsoleerde antigeenbindende domeinen van Camelidae zware keten antilichamen. Nbs gericht tegen functionele domeinen van cortactine (CRN), een essentiële component in invadopodiavorming en –functie, werden hiervoor aangewend. In een eerste reeks van experimenten werd aangetoond dat interferentie met het CRN NTA domein enerzijds en met het CRN SH3 domein anderzijds via Nbs leidde tot een daling van het aantal vrijgestelde exosomen. Aangezien CRN essentieel is voor invadopodia en voor de gebruikte Nbs reeds bewezen werd dat deze interfereren met invadopodiavorming en – functie, versterkte deze waargenomen daling het vermoeden van een mogelijk verband tussen invadopodia en exosomen. Later zullen deze resultaten geverifieerd worden via RNAi. Hiervoor werden gepaste shRNA-constructen geselecteerd. Een CRN effect op het gereduceerd aantal vrijgestelde exosomen, onafhankelijk van zijn functie in context van invadopodia, kon door bovenstaande experimenten niet uitgesloten worden. Daarom werd het verband ook meer rechtstreeks benaderd. Er werd aangetoond dat CD63-positieve exosomen steeds terug te vinden zijn in de nabijheid van invadopodia. De twee CRN Nbs leidden tot een toename in het spreidingsoppervlak van de invadopodia overheen de cel. Na expressie van deze Nbs werd ook een spreiding van de CD63-positieve exosomen waargenomen waarbij deze nog steeds gelegen waren binnen de invadopodiazone. Een extra argument voor het gepostuleerde verband tussen invadopodia en exosomen werd zo aangeleverd. Wat betreft de functionaliteit van de exosomen in context van invadopodia, werd onderzocht hoe MT1-MMP zich lokaliseerde t.o.v. invadopodia enerzijds en CD63-positieve exosomen anderzijds. In beide gevallen kon colokalisatie waargenomen worden. Bovendien werd aangetoond dat exosomen MT1-MMP bevatten en dat dit in staat is bij te dragen aan ECM degradatie. Deze resultaten sterken de hypothese van een mogelijk verband tussen invadopodia en exosomen en dienen als basis voor verder onderzoek naar deze interconnectie. 8 Inleiding Kanker is één van de grootste oorzaken van ziekte en dood wereldwijd. Normale cellen zullen zich hierbij omvormen tot kankercellen die gekenmerkt worden door een abnormale, buitensporige groei. In een tumor zijn naast kankercellen ook verschillende andere celtypes aanwezig die bijdragen tot de ontwikkeling van een tumor. Wederzijdse communicatie tussen kankercellen en hun tumor micro-omgeving wordt onder andere door exosomen bewerkstelligd. Exosomen zijn extracellulaire vesikels met een grootte van 30 tot 100 nm en hebben een endosomale oorsprong. Ze worden gevormd als intraluminale vesikels (ILV’s) tijdens maturatie van vroege tot late endosomen. De aanwezigheid van ILV’s zorgt ervoor dat het late endosoom ook aangeduid wordt als multivesikulair endosoom (MVE). ILV’s kunnen enerzijds gevormd worden met behulp van de endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) complexen. Anderzijds bestaan ook mechanismen onafhankelijk hiervan. MVE’s kunnen zich naar het plasmamembraan begeven en hiermee fusioneren. Daarbij worden de ILV’s vrijgesteld in het extracellulair milieu en worden dan exosomen genoemd. Na bepaalde tijd zullen kankercellen uit de primaire tumor breken en zich via het bloed- of lymfevatenstelsel verspreiden naar andere organen, wat aangeduid wordt als metastase. Dit is de belangrijkste doodsoorzaak van kanker. Voor metastase is afbraak van de basale membranen en de extracellulaire matrix (ECM) nodig. Dit wordt bewerkstelligd met behulp van actinerijke protrusies die gevormd worden door invasieve kankercellen en aangeduid worden als invadopodia. Deze bestaan uit een actinekern omgeven door verschillende eiwitten die bijdragen tot hun vorming en maturatie, zoals cortactine, cofiline, N-WASP, het Arp2/3 complex en Tks5. Gematureerde invadopodia zijn in staat de ECM af te breken waarbij het matrix metalloproteïnase MT1-MMP een belangrijke rol vervult. Reeds verschillende routes voor het rekruteren van MT1-MMP ter hoogte van het plasmamembraan van invadopodia werden beschreven. Recent werd gesuggereerd dat MT1-MMP-bevattende exosomen vrijgesteld worden ter hoogte van invadopodia en dat deze bijdragen tot invadopodiamaturatie en ECM degradatie. Nanobodies zijn geïsoleerde antigeenbindende domeinen van Camelidae zware keten antilichamen. Hiermee werd de interconnectie tussen deze actinerijke protrusies en exosomen verder onderzocht. Twee nanobodies gericht tegen verschillende functionele domeinen van cortactine, een cruciale component binnen invadopodiavorming en –functie, werden hiervoor aangewend. 9 1 Literatuurstudie 1.1 Kanker: globaal overzicht Kanker behoort tot één van de grootste oorzaken van ziekte en dood wereldwijd. In 2012 waren er ongeveer 14 miljoen gevallen van kanker bekend en zorgde deze ziekte nog voor 8,2 miljoen doden [1]. Kanker houdt in dat normale (meestal epitheliale) cellen zich omvormen tot kankercellen die gekenmerkt worden door een abnormale, buitensporige groei. Dit leidt tot een grote massa aan kankercellen, anders gezegd een tumor. Deze abnormale groei kan op elke plaats in het lichaam voorkomen. Een tumor blijft groeien en zal naburige weefsels binnendringen. Cellen uit deze tumor zullen zich na verloop van tijd ook verspreiden via het bloed- of lymfevatenstelsel naar andere organen om daar aanleiding te geven tot een secundaire tumor. Dit laatste wordt metastase genoemd en is de belangrijkste doodsoorzaak van kanker. Het type kanker wordt steeds bepaald aan de hand van waar hij oorspronkelijk is ontstaan, ongeacht de plaats van deze secundaire tumoren [1], [2]. De meest voorkomende kankers in 2012 waren: long- (1,59 miljoen doden), lever- (745 000 doden), maag- (723 000 doden), darm- (694 000 doden), borst- (521 000 doden) en slokdarmkanker (400 000 doden) [1]. Het proces waarbij normale cellen zich omvormen tot kankercellen, bestaat uit meerdere stappen. Deze omvorming gebeurt onder invloed van een samenspel tussen interne genetische factoren en externe factoren. Bewezen risicofactoren zijn: UV-straling, ioniserende straling, asbest, roken, alcohol, bepaalde chronische infecties, hepatitis, humaan papillomavirus (HPV), obesitas, onvoldoende beweging en leeftijd [2]. Voor een volledig overzicht van mogelijke risicofactoren wordt verwezen naar de classificatie van de organisatie International Agency for Research on Cancer (IARC), de afdeling binnen de World Health Organisation (WHO) die instaat voor kankeronderzoek. Hierbij worden risicofactoren ingedeeld als bewezen carcinogeen, waarschijnlijk carcinogeen, mogelijks carcinogeen, waarschijnlijk niet carcinogeen en niet classificeerbaar [3]. Omvorming van een normale cel tot kankercel gaat gepaard met genetische veranderingen. Mutaties zorgen enerzijds voor oncogenen die een dominerende functie verkrijgen en anderzijds voor het verlies van functie van tumorsuppressor genen. Hanahan en Weinberg beschrijven zes essentiële veranderingen die plaatsvinden bij de ontwikkeling van kanker. Een eerste verandering houdt in dat kankercellen minder afhankelijk worden van groeisignalen uit hun omgeving door zelf in hun groeisignalen te voorzien. Enerzijds kunnen ze zelf groeifactoren aanmaken (autocriene stimulatie) en anderzijds kunnen ze stromale cellen aanzetten tot secretie van groeifactoren (paracriene stimulatie). Een tweede verandering in kankercellen is de ongevoeligheid voor antigroeisignalen. Groei in normale cellen wordt op verschillende manieren geblokkeerd, bijvoorbeeld via de retinoblastoma proteïne (Rb)-pathway wat een rol speelt bij de overgang van een delende cel naar een rustfase G0 of bij contact-inhibitie. Deze mechanismen zijn op één of andere manier verstoord in kankercellen. Een derde verandering zorgt ervoor dat apoptose of geprogrammeerde celdood vermeden wordt. Naast apoptose blijken ook autofagie en necrose een rol te hebben in de ontwikkeling van een tumor. Een vierde verandering die cellen ondergaan is het verkrijgen van het vermogen om oneindig te vermenigvuldigen. Om een snelle klonale expansie mogelijk te maken dat leidt tot een macroscopische tumor, is angiogenese noodzakelijk. Dit is de vijfde verandering in de vorming van kanker. Tumoren activeren een zogenaamde angiogenic switch door het evenwicht te veranderen tussen 10 enerzijds induceerders en anderzijds inhibitoren. Een zesde en laatste verandering is de invasie van het omliggende weefsel en uiteindelijk metastase. Deze laatste verandering bestaat uit verschillende stappen waarbij er eerst een lokale invasie plaatsvindt, waarna intravasatie van de kankercellen in bloed- of lymfevaten gebeurt. Extravasatie in een nieuw weefsel zal dan aanleiding geven tot micrometastasen waarbij kankercellen eerst kleine nodules vormen. Deze kunnen uitgroeien tot macroscopische tumoren wat aangeduid wordt als kolonisatie [4], [5]. Naast deze zes veranderingen worden twee hallmarks gedefinieerd die voorgaande veranderingen in staat stellen te ontwikkelen. Enerzijds zal het genoom instabieler worden waardoor DNA gevoeliger wordt voor mutaties. Anderzijds kunnen immuuncellen tumorigenese promoten via ontstekingsreacties die bijvoorbeeld groeifactoren en andere moleculen aanleveren. Twee bijkomende veranderingen sinds de eerste review van Hanahan en Weinberg worden ook als essentieel gezien. De eerste houdt een verandering van het energiemetabolisme in, waarbij kankercellen hun energieproductie grotendeels beperken tot glycolyse, zelfs in de aanwezigheid van zuurstof. In een tweede verandering wordt de destructie van de kankercellen door het immuunsysteem vermeden, dit door bijvoorbeeld immunosuppressieve factoren te secreteren [5]. Zoals blijkt uit de veranderingen, zijn niet enkel de kankercellen zelf van belang bij de ontwikkeling van een tumor maar ook omliggende cellen. Hanahan en Weinberg spreken van een tumor micro-omgeving (Figuur 1) [5]. Kankerontwikkeling bestaat dus uit veel verschillende aspecten die samen een complex geheel vormen. Figuur 1: Tumor micro-omgeving. Een tumor bestaat uit kankercellen die de basis vormen van de ziekte en de specifieke oncogene en tumorsuppressor mutaties dragen. Daarnaast zijn ook kanker stamcellen, endotheelcellen (cfr. angiogenese als een essentiële verandering), pericyten, immuuncellen (zowel tumor antagoniserende als tumor stimulerende leukocyten), kanker-geassocieerde fibroblasten, stamcellen en progenitorcellen aanwezig in de tumor micro-omgeving [5]. 11 1.2 Exosomen 1.2.1 Inleiding Exosomen zijn extracellulaire vesikels met een diameter van 30 tot 100 nm en zijn van endosomale oorsprong. Ze worden gevormd als intraluminale vesikels (ILV) in het multivesikulair endosoom (MVE) en komen in het extracellulair milieu door fusie van dit MVE met het plasmamembraan. Zo mediëren exosomen intercellulaire communicatie. Eiwitten afkomstig van endosomen, het plasmamembraan en het cytosol worden teruggevonden in exosomen. Voorbeelden van eiwitten die voorkomen in exosomen zijn componenten van de endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) complexen, adhesiemoleculen zoals tetraspaninen en integrinen, eiwitten van het cytoskelet en eiwitten met een rol in antigeenpresentatie. Daarnaast bevatten ze ook mRNA en miRNA. Hun membraan is aangerijkt in sfingomyeline, fosfatidylserine, cholesterol en ceramide [6], [7]. Enkele van deze componenten spelen een rol in de exosoomvorming en –secretie en komen verder aan bod. Exosomen zijn slechts één van de voorkomende extracellulaire vesikels (EV). Ook microvesikels (MV) en apoptotic blebs behoren tot deze groep. MV’s zijn vesikels met een diameter van 150 tot 1000 nm. Ze ontstaan door knopvorming van het plasmamembraan en afscheiding in het extracellulair milieu. Apoptotic blebs zijn blaasjes afgescheiden door een apoptotische cel en hebben een diameter van 1 tot 5 µm [6], [7]. Er dient opgemerkt te worden dat isolatie van een bepaald EV subtype soms resulteert in een aanrijking i.p.v. een volledige isolatie van het subtype en dat bij de isolatie van EV’s het moeilijk is een onderscheid te maken tussen de verschillende subtypes [7]. 1.2.2 Endocytotische pathway De endocytotische pathway start met endocytose, waarbij het celmembraan naar binnen toe plooit en er een vesikel afgescheiden wordt in het cytoplasma. Verschillende pathways voor endocytose zijn bekend, waarvan de clathrinegemedieerde pathway de meest gekende is. Andere pathways die endocytose bewerkstelligen, zijn caveolair-type endocytose, CLIC/GEEC-type endocytose en ARF6-afhankelijke endocytose [8]. De cargo van een endocytotisch vesikel bestaat uit o.a. nutriënten, receptor-ligand complexen, lipiden, membraanproteïnen, componenten van de extracellulaire matrix (ECM), virussen, enz. [9]. Deze endocytotische vesikels fusioneren met vroege endosomen. Een endosoom bestaat uit tubulaire en vacuolaire domeinen. Op het membraan van dit endosoom, vooral in het tubulaire gedeelte, zijn microdomeinen aanwezig die voor sortering zorgen. Vesikels worden ter hoogte van deze microdomeinen gecreëerd die de cargo, gerekruteerd aan dit microdomein, naar zijn specifieke bestemming brengen. Het grootste deel van de cargo wordt gerecycleerd. Dit is bijvoorbeeld het geval voor componenten van het plasmamembraan en housekeeping receptoren. Vesikels kunnen ook uitgewisseld worden met het trans-Golgi netwerk (TGN) [9], [10]. Het vacuolair domein van het vroege endosoom matureert tot het late endosoom. Deze maturatie gaat gepaard met veranderingen, o.a. de overschakeling van RAB5 naar RAB7, het vormen van intraluminale vesikels (ILV’s), verzuring en fosfatidylinositol (PI) conversie. Tijdens maturatie zullen de endosomen ook een nettobeweging ondergaan van de periferie naar de perinucleaire regio [9]. Door de vesikelvorming in het lumen worden late endosomen ook wel multivesikulaire endosomen (MVE) genoemd. MVE’s kunnen samensmelten met lysosomen waarbij de inhoud van de vesikels afgebroken wordt. Daarnaast kunnen MVE’s migreren naar het plasmamembraan en ermee fusioneren. ILV’s worden zo vrijgesteld en worden dan exosomen genoemd [7]. 12 1.2.3 Intraluminale vesikel-/exosoomvorming 1.2.3.1 ESCRT-afhankelijk ILV’s kunnen enerzijds gevormd worden met behulp van de endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) complexen. Anderzijds bestaan ook mechanismen onafhankelijk hiervan en worden verderop besproken (sectie 1.2.3.2). De ESCRTafhankelijke pathway start met ESCRT-0. Dit complex bindt en clustert geübiquitinileerde cargo componenten [7]. Vervolgens bindt ESCRT-I enerzijds aan ESCRT-0, anderzijds aan de geübiquitinileerde componenten. ESCRT-I interageert met ESCRT-II en samen induceren ze knopvorming in het endosoom. Deze twee complexen zijn gelokaliseerd aan de nek van de gevormde knop en zorgen voor stabilisatie van de nek (Figuur 2). Vervolgens zal ESCRTIII het gevormde vesikel klieven (Figuur 2b). Vacuolar protein sorting 4 (VPS4) zorgt in een finale stap voor de disassemblage en recyclage van ESCRT-III. Om deze pathway te ontrafelen werd en wordt nog steeds de gist Saccharomyces cerevisiae gebruikt als model. De gist vacuole is het equivalent van het lysosoom en zijn biogenese is gelinkt aan deze van MVE’s [11]. De basisfuncties van de ESCRT-0, -I, -II en –III complexen in deze biogenese zijn geconserveerd en dus gelijkaardig voor alle eukaryoten [7], [12]. ESCRTs zijn niet enkel belangrijk bij de sortering van geübiquitinileerde cargo naar het lysosoom en bij de vorming van exosomen, maar spelen ook een rol tijdens de cytokinese, bij knopvorming van virussen ter hoogte van het plasmamembraan en bij enkele andere processen [13]. In de volgende beschrijving worden de benamingen van de humane eiwitten gebruikt. De verschillende componenten worden opgelijst in Tabel 1 waarbij ook hun overeenkomstige benaming in gist wordt gegeven. Figuur 2: (a) ESCRT-I en –II met zijn verschillende componenten. (b) Hoe ESCRT-I en –II als supercomplex gelokaliseerd zijn aan de nek tijdens de vorming van een ILV en hoe ESCRT-III de membranen naar elkaar toe brengt (figuur aangepast uit [11]). 13 Tabel 1: Componenten ESCRT complexen – humaan en gist homologen ESCRT-0 ESCRT-I ESCRT-II ESCRT-III Andere Humane eiwitten HRS STAM TSG101 VPS28 VPS37 MVB12 EAP30 EAP45 EAP20 CHMP6 CHMP4 CHMP3 CHMP2 VPS4 Gist eiwitten Vps27 Hse1 Vps23 Vps28 Vps37 Mvb12 Vps22 Vps36 Vps25 Vps20 Snf7 Vps24 Vps2 Vps4 ESCRT-0 is een complex dat bestaat uit hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (HRS) en signal transducing adaptor molecule (STAM). Beide componenten bevatten ubiquitinebindende domeinen. De affiniteit van HRS voor ubiquitine is groter dan deze van STAM, waaruit kan verondersteld worden dat HRS de belangrijkste rol speelt bij de functie van ESCRT-0 en STAM eerder een accessorisch eiwit is [14]. Zoals eerder aangehaald, zijn er verschillende microdomeinen terug te vinden op het membraan van de vroege endosomen. Zo zijn er in het vacuolaire domein clathrinebevattende microdomeinen aanwezig. HRS bindt en rekruteert geübiquitinileerde eiwitten ter hoogte van deze clathrinebevattende microdomeinen en verhindert zo recyclage van de cargo naar het plasmamembraan [15]. STAM zal naast het binden van ubiquitine, ook deübiquitinilatieenzymen rekruteren, wat een regulerende functie heeft bij sortering [11], [14]. Deübiquitinilasen belangrijk in deze context zijn het associated molecule with the SH3 domain of STAM (AMSH) [16] en ubiquitin specific peptidase 8 (USP8/UBPY) [17] (zie verder). Tumor susceptibility gene 101 (TSG101) is een eiwit behorende tot het ESCRT-I complex. Er werd aangetoond dat interactie tussen TSG101 en HRS nodig is om geübiquitinileerde moleculen te sorteren in de ILV’s van het MVE. HRS rekruteert TSG101 en TSG101 zal vervolgens binden met het ubiquitine label [18]. Het ESCRT-I complex bestaat daarnaast nog uit de subunits VPS28, VPS37 en multivesicular body sorting factor 12 (MVB12) [19]. De mens heeft twee isovormen voor VPS28, vier isovormen voor VPS37 en minstens drie isovormen voor MVB12 [20]. Dit complex vormt samen een structuur met een 13 nm-lange steel en 5 nm-lang hoofd (Figuur 2a, stalk en head, respectievelijk) [19]. ESCRT-II, een volgend complex belangrijk in ILV-vorming, bestaat ook uit vier subunits, meer bepaald ELLassociated protein 30 (EAP30), EAP45 en tweemaal EAP20. Deze vormen samen een Yvormige structuur (Figuur 2a) [21]. ESCRT-I en ESCRT-II zullen samen knopvorming induceren in het membraan van het endosoom en er werd aangetoond dat deze complexen gelokaliseerd zijn aan de nek van de knop [22]. Voor knopvorming zullen ze samen één supercomplex vormen (Figuur 2b). Hierbij zal de C-terminus van VPS28 binden aan ESCRT-II. De N-terminus van EAP45 bevat een zogenaamd GRAM-like ubiquitin-binding motif in EAP45 (GLUE)-domein. In dit domein zijn twee Npl4-type zinc fingers (NZF1 en NZF2) aanwezig. Specifiek gebeurt de binding van de C-terminus van VPS28 met NZF1 (Figuur 2a) [23]. Er werd gezien dat dit supercomplex een evenwicht heeft tussen open en 14 gesloten conformatie. Hieruit werd een model gesuggereerd voor cargo transport. Wanneer het complex van een open naar gesloten conformatie overgaat, zou dit de cargo langs het membraan richting de nek van de knop brengen [24]. Na knopvorming gebeurt afscheiding van het ILV door het ESCRT-III complex. Het complex heeft een kern bestaande uit charged multivesicular body protein 6 (CHMP6), CHMP4, CHMP3 en CHMP2 [25]. De mens heeft drie isovormen voor CHMP4 en twee isovormen voor CHMP2 [11]. Dit is een dynamisch complex, in tegenstelling tot voorgaande complexen, en zal zich pas vormen wanneer nodig in het endosoom [25]. In een eerste stap zal CHMP6 binden aan ESCRT-II, meer bepaald aan de EAP20 subunit [26]. CHMP6 doet dienst als startplaats om oligomerisatie van CHMP4 op endosomen te bewerkstelligen. Oligomerisatie wordt beëindigd door binding van CHMP3. In een laatste assemblagestap zal CHMP2 binden. Deze laatste rekruteert dan VPS4. CHMP4 is het meest aanwezig en het meest noodzakelijk voor de fissie [27]. Een model wordt voorgesteld waarbij CHMP4-eenheden een steeds smaller wordende spiraal vormen rond de nek totdat de membranen dicht genoeg bij elkaar gebracht zijn om fissie te bewerkstelligen [28]. Zoals vermeld, wordt in een laatste stap VPS4, een ATPase associated with diverse cellular activities (AAA) ATPase, gerekruteerd. Door energietoevoer zal disassemblage van het ESCRT-III complex gebeuren en is de vesikelvorming beëindigd [29]. Voordat het vesikel volledig afgesloten wordt, zal de cargo ontdaan worden van zijn ubiquitine label. In de gist Saccharomyces cerevisiae gebeurt dit door het deübiquitinilase Doa4, wat wordt gerekruteerd door Bro1 [30]. Bro1 is geassocieerd met het ESCRT-III complex en is vooral afhankelijk van Snf7 (CHMP4 homoloog in gist). Bij disassemblage van het ESCRT-III complex door Vps4 (VPS4 homoloog in gist), zal ook Bro1 door Vps4 gerecycleerd worden [31]. Het menselijke homoloog voor Bro1 is het apoptosis-linked gene 2-interacting protein X (ALIX). ALIX bindt met CHMP4. In tegenstelling tot voorgaande homologen, zal ALIX niet dezelfde functie uitoefenen bij de mens als Bro1 in gist [12]. ALIX is in staat het ESCRT-III complex te assembleren, onafhankelijk van voorgaande ESCRT complexen en cargo ubiquitinilatie, en werkt zo als een tweede mechanisme voor sortering [32]. De humane tegenhangers van Doa4 zijn de deübiquitinilasen AMSH en UBPY. AMSH interageert met verschillende subunits van het ESCRT-III complex en verwijdert het ubiquitine label van de cargo voordat ze volledig geïsoleerd worden in het ILV. Deübiquitinilatie wordt stopgezet wanneer VPS4 gerekruteerd wordt [16]. UBPY werkt volgens een ander mechanisme [17]. Aangezien ILV’s niet enkel aanleiding geven tot exosomen maar ook een rol spelen in cargo degradatie, werd nagegaan of dit mechanisme effectief leidt tot exosoomvorming. Dit gebeurde door silencing via RNA interference (RNAi) van verschillende componenten van de ESCRT complexen. Wanneer HRS en STAM1 uitgeschakeld werden, resulteerde dit in minder gesecreteerde exosomen. Ook bij het uitschakelen van TSG101 werden minder exosomen gesecreteerd, wat wijst op een ESCRT-afhankelijkheid. Enkele eigenaardigheden werden gezien in de studie, meer bepaald een stijging in exosoomsecretie bij uitschakeling van VPS4 en ALIX [33]. Baietti et al. bewezen eerder nochtans dat ALIX essentieel is in exosoombiogenese. Hierbij zou de connectie tussen ALIX en syndecaan via syntenine een rol spelen. Bovendien toonden ze aan dat VPS4 silencing wel leidt tot een reductie in exosoomsecretie [34]. 15 1.2.3.2 ESCRT-onafhankelijk Naast exosoomvorming via de ESCRT-afhankelijke pathway, werden ook onafhankelijke pathways beschreven. Een eerste onafhankelijke pathway is de inductie van knopvorming door ceramide in oligodendrogliale cellen. Hierbij zal cargo, bestemd voor exosomen, gerekruteerd worden ter hoogte van microdomeinen analoog aan lipid rafts. Een model wordt voorgesteld waarbij sfingolipiden, aanwezig aan een hoge concentratie in deze lipid rafts, worden omgezet naar ceramide door neutraal sfingomyelinase. Ceramide veroorzaakt vervolgens een spontane kromming in het membraan en induceert zo knopvorming [35]. Een tweede pathway waarbij een lipide een rol speelt in de spontane knopvorming werd beschreven door Ghossoub et al.. Het GTPase ADP ribosylation factor 6 (ARF6) activeert fosfolipase D2 (PLD2). Vervolgens metaboliseert PLD2 fosfatidylcholine tot fosfatidezuur (PA). Net zoals ceramide induceert PA een kromming in het membraan, met spontane knopvorming tot gevolg. Bij ARF6-negatieve cellen werden niet alle ESCRT-afhankelijke processen geblokkeerd waardoor onafhankelijkheid van deze pathway werd verondersteld. Er dient echter opgemerkt te worden dat syntenine kan interageren met PA en op genniveau ook interageert met ARF6. Wegens de eerder aangetoonde interactie tussen syntenine en ALIX, kon ESCRT-afhankelijkheid hier niet volledig uitgesloten worden [36]. Een tweede groep van ESCRT-onafhankelijke pathways blijken afhankelijk van tetraspaninen. Zo werd in melanomacellen aangetoond dat, naast de ESCRT-afhankelijke weg, een tweede mechanisme aanwezig is, waarbij de ILV-vorming afhankelijk is van cluster of differentiation 63 (CD63) [37]. CD82 en CD9 zijn twee tetraspaninen die in de context van β-catenine secretie via exosomen vernoemd werden. Deze eiwitten zouden exosoomvrijstelling stimuleren via de ceramide-afhankelijke pathway [38]. Voor de vorming van exosomen afkomstig van tumorcellen (rat adenocarcinoma cellen) werd gezien dat het tetraspanine 8 (Tspan8) instaat voor de sortering van welbepaalde eiwitten en mRNA [39]. Verder werd ook het tetraspanine CD81 gerapporteerd als zijnde belangrijk in de sortering van specifieke componenten in exosomen. Eiwitten die interageren met CD81 werden niet waargenomen in de exosomen van CD81-deficiënte cellen [40]. Een overzicht van exosoomvorming wordt schematisch weergegeven in Figuur 3. 1.2.3.3 Gemengd model Markus Babst stelde een model voor waarbij zowel de ESCRT complexen, als de lipideafhankelijke knopvorming samenwerken in ILV-vorming. ESCRT-0 zou geübiquitinileerde eiwitten binden en clusteren ter hoogte van lipid rafts. De lipid rafts hebben een specifieke lipidesamenstelling die voor vervorming en invaginatie van het membraan zorgt. Door de aanwezigheid van de gerekruteerde geübiquitinileerde eiwitten en de lipiden (bv. ceramide) die voor vervorming van het membraan zorgen, worden ESCRT-I en ESCRT-II gerekruteerd. Deze complexen stabiliseren de nek van de gevormde invaginatie. Verder volgt de ILVvorming de pathway beschreven onder ESCRT-afhankelijke ILV-vorming [41]. 16 Figuur 3: Overzicht exosoomvorming en –secretie. ILV’s worden gevormd door knopvorming in het vroege endosoom. Dit kan via de ESCRT-afhankelijke pathway en/of onafhankelijk hiervan, m.b.v. lipiden (ceramide, fosfatidezuur) en/of tetraspaninen (CD63, CD82, CD9, Tspan8, CD81). Bij exosoomsecretie spelen de RAB GTPasen en de SNARE proteïnen een rol. Daarnaast kan het MVB samensmelten met het lysosoom voor degradatie van de cargo. Ook microvesikels, een tweede EV subtype, wordt hier weergegeven [42]. 1.2.4 Exosoomsecretie Om de exosomen te secreteren, dienen de MVE’s zich eerst naar het plasmamembraan te begeven waar vervolgens fusie plaatsvindt en de ILV’s vrijgesteld worden als exosomen. Twee groepen moleculen worden geassocieerd met dit proces, enerzijds de RAB GTPasen en anderzijds de SNARE proteïnen (Figuur 3). RAS-related in brain (RAB) eiwitten spelen een belangrijke rol in intracellulair vesikeltransport tussen verschillende compartimenten. Elk lid van deze familie zal preferentieel associëren met een bepaald intracellulair compartiment [7]. RAB5 en RAB7 werden eerder ook al aangehaald als zijnde belangrijk in de conversie van een vroeg naar een laat endosoom (sectie 1.2.2). RAB11 werd als eerste geassocieerd met exosomen door Savina et al. [43]. Concreet werd hier aangetoond dat overexpressie van een dominant negatieve mutant van RAB11 resulteerde in de inhibitie van exosoomsecretie in K562 cellen. Later werd een tweede RAB proteïne, namelijk RAB35, een rol toegeschreven in exosoomsecretie. Meer specifiek zou dit een rol hebben in docking van het MVE aan het plasmamembraan [44]. Ook geassocieerd met het docken van het MVE aan het plasmamembraan is RAB27. Twee isovormen werden geïdentificeerd. Silencing van zowel Rab27a als RAB27b leidde tot verminderde exosoomsecretie. Rab27a RNAi induceerde daarenboven een vergroting van het MVE, terwijl RAB27b RNAi leidde tot een herdistributie van MVE’s in de perinucleaire regio [45]. RAB11 en RAB35 zijn vooral terug te vinden bij vroege endosomen en in de recyclage pathway terwijl RAB27 dan weer gelokaliseerd is bij de late endosomen en de secretorische pathway. Een hypothese wordt vooropgesteld waarbij of de ene of de andere RAB pathway gevolgd wordt en zo aanleiding geeft tot verschillende subtypes van exosomen afkomstig van verschillende stadia in de endosoommaturatie [7]. 17 Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion attachment protein receptors (SNARE) proteïnen zijn gekend als mediatoren van membraanfusie [7]. Specifiek voor de fusie tussen het MVE en het plasmamembraan werd gesuggereerd dat het vesicle-associated membrane protein 7 (VAMP7) hierin belangrijk zou zijn. Dit werd aangetoond voor de vrijstelling van acetylcholinesterase-bevattende exosomen in K562 cellen [46]. Een ander SNARE proteïne, meer bepaald de R-SNARE YKT6, werd gerapporteerd als een component nodig voor de secretie van Wnt-bevattende exosomen tijdens de ontwikkeling van Drosophila. Dit werd ook aangetoond in humane cellen (HEK293) [47]. Er wordt gesteld dat verschillende celtypes andere SNARE’s gebruiken voor exosoomsecretie. Anderzijds zou het ook kunnen dat binnen hetzelfde celtype verschillende subtypes van MVE’s andere SNARE’s gebruiken [7]. 1.2.5 De rol van exosomen in kanker Zoals reeds aangehaald, spelen exosomen een rol in intercellulaire communicatie. Bij de ontwikkeling van kanker zullen kankercellen communiceren met hun tumor micro-omgeving, o.a. door middel van exosomen, en vice versa (sectie 1.1). Een eerste celtype zijn de immuuncellen. Immuuncellen, meer bepaald dendritische cellen, produceren exosomen voor antigeenpresentatie. Een cellulaire immuunrespons wordt zo teweeg gebracht tegen de vormig van tumoren. Ook exosomen afkomstig van kankercellen kunnen een dergelijke cellulaire immuunrespons uitlokken. Daarnaast zijn er echter exosomen die net het immuunsysteem zullen onderdrukken. Dit laatste wordt door Hanahan en Weinberg als een essentiële verandering beschouwd in de ontwikkeling van kanker (sectie 1.1). Tumorcel exosomen kunnen ook differentiatie van fibroblast tot myofibroblast stimuleren. Deze myofibroblasten secreteren groeifactoren, matrixcomponenten en proteasen die tumorigenese stimuleren. Endotheelcellen in de micro-omgeving worden geactiveerd door stimulerende angiogenetische factoren afkomstig van kankercel exosomen. Dit geeft aanleiding tot angiogenese, een essentiële verandering in de ontwikkeling van kanker (sectie 1.1). Tussen kankercellen onderling wordt ook gecommuniceerd. Kankercellen binnen eenzelfde tumor zijn namelijk niet homogeen, ze brengen verschillende oncogenen tot expressie. Exosomen zullen een horizontale propagatie van oncogenen mediëren. Als laatste celtype dat wordt beïnvloed door kankercel exosomen worden de beenmergcellen vermeld. Exosomen afkomstig van primaire tumoren stimuleren migratie van deze cellen naar andere organen, waar ze vervolgens de basis zullen vormen voor metastasen (premetastatische niches). Kennis van de rol van exosomen in kankerontwikkeling en hoe deze exosomen tot stand komen kan leiden tot nieuwe diagnostische en therapeutische invalshoeken [48]. 18 1.3 Het actinecytoskelet 1.3.1 Algemeen 1.3.1.1 Inleiding Drie vezelige componenten behoren tot het cytoskelet, meer bepaald actinefilamenten, microtubuli en intermediaire filamenten. Hierbij zijn de microtubuli belangrijk bij celtransport en celdeling en dienen intermediaire filamenten vooral als weerstand tegen mechanische stress. Het actinecytoskelet zorgt voor de celmorfologie en polariteit. Daarnaast is het ook belangrijk bij endocytose, contractiliteit, celbeweging en celdeling [49]–[51]. Op het actinecytoskelet wordt verder ingegaan. 1.3.1.2 Actine Actine is het meest voorkomende eiwit in de eukaryote cel. Enerzijds is actine aanwezig in een monomere globulaire vorm (G-actine), anderzijds in de polymere filamenteuze vorm (F-actine). Er bestaan verschillende actine isovormen, namelijk de α-, β- en γ-isovormen. Actine bevat twee groeven. In de ene groef zal ATP of ADP gebonden zijn en de andere groef bevat een bindingsplaats voor actinebindende proteïnen (ABP’s). Schroefvormige filamenten (F-actine) worden gevormd uit de actinemonomeren. Het actinefilament is gepolariseerd. Hierbij is er sprake van een positief (barbed) en negatief (pointed) uiteinde. Monomeren worden hoofdzakelijk toegevoegd aan het positieve einde waardoor deze zijde veel sneller aangroeit. Nadat het monomeer toegevoegd is, zal hydrolyse van ATP plaatsvinden. De ADP-gebonden vorm is minder stabiel dan de ATP-gebonden vorm en zal aan het negatieve uiteinde dissociëren. Ook aan de positieve zijde kunnen monomeren dissociëren maar additie van een monomeer gebeurt sneller dan hydrolyse. De toevoeging van monomeren aan de negatieve zijde is ook mogelijk maar dit gebeurt hier trager en de hydrolyse haalt de associatie in waardoor netto meer dissociatie gebeurt. Dit steady-state mechanisme van associatie en dissociatie wordt treadmilling genoemd [51], [52]. 1.3.1.3 Actinebindende proteïnen Naast het proces van treadmilling zijn ook actinebindende proteïnen (ABP’s) betrokken in de dynamiek van actine. Naast associatie en dissociatie van actine monomeren, helpen ze in de organisatie van actine in hogere-orde netwerken. Polymerisatie is energetisch ongunstig tot wanneer een kern van drie monomeren gevormd wordt. Actin-related protein 2 and 3 vormen samen het Arp2/3 complex en hebben een gelijkaardige structuur als een actine dimeer. Wanneer ze G-actine binden, wordt een kern van drie monomeren nagebootst waardoor polymerisatie geïnitieerd wordt. Dit complex blijft aan het negatieve uiteinde en stimuleert zo aangroei van het filament aan het positieve eind. Het Arp2/3 complex kan bovendien associëren met een reeds gevormd filament en zorgt zo voor een vertakking in een hoek van 70°. Herhaaldelijke vertakking resulteert in dendritische netwerken. In vivo wordt de activiteit van Arp2/3 gestimuleerd door andere eiwitten. Hierbij zijn o.a. de Wiskott–Aldrich syndrome protein (WASP) en de suppressor of cAMP receptor / WASP family verprolin homologous (SCAR/WAVE) proteïnen belangrijk. Een andere activator van Arp2/3 is cortactine (CRN) waar verder op wordt ingegaan (sectie 1.3.2). Een tweede groep eiwitten die een rol spelen in nucleatie zijn de formines. Ze vormen dimeren. Via hun formin homology 2 (FH2) domein blijven ze gebonden aan het positieve uiteinde en verhinderen zo de binding van capping proteïnen (zie verder) [52], [53]. 19 Naast nucleatie zijn er ook andere functies voor ABP’s. Zo zal profiline binden aan G-actine wat o.a. de uitwisseling van ADP voor ATP katalyseert en zo polymerisatie stimuleert. Daarnaast zorgt profiline ervoor dat monomeren enkel toegevoegd worden aan het barbed end. Thymosine bindt eveneens aan G-actine maar zal ervoor zorgen dat dit monomeer niet meer beschikbaar is voor polymerisatie. Capping proteïnen verhinderen actine uitwisseling aan barbed of pointed ends. Gelsoline (GSN) bijvoorbeeld bindt aan het positieve uiteinde om er monomeerbinding te verhinderen. Daarnaast kan GSN het filament ook klieven. ABP’s die zorgen voor depolymerisatie zijn de actin-depolymerizing factor (ADF)/cofiline eiwitten. Actinefilamenten kunnen ook georganiseerd worden in hogere-orde netwerken, waarbij de filamenten parallel aan elkaar gebundeld worden of waarbij vertakkingen gevormd worden tussen de verschillende filamenten. Een voorbeeld van zo’n ABP dat helpt bij bundeling is fascine (FSN). In andere gevallen doet actine dienst als mechanische ondersteuning. Zo gebruikt myosine, een motorproteïne, actinefilamenten als een spoor waarover het beweegt naar zijn doelorganel [53]. 1.3.1.4 Actinerijke protrusies Niet alleen de vorming van individuele filamenten maar ook van hogere-orde netwerken wordt bewerkstelligd door ABP’s, zoals reeds aangehaald in voorgaand onderdeel. Actinefilamenten vormen de basis voor verschillende celprotrusies, elk met hun eigen functies. Figuur 4: Actinerijke protrusies (figuur aangepast uit [52], [54]). Lamellipodia en het lamellum bijvoorbeeld (Figuur 4, links) zijn bladvormige actinestructuren die gevormd worden aan de zijde van de cel waar ze zich voortbeweegt (leading edge). Ze bestaan elk uit een autonoom dendritisch netwerk van vertakte actinefilamenten. De lamellipodia bevinden zich het meest distaal en het lamellum vormt de overgang naar de cel. Een ander voorbeeld zijn de filopodia (Figuur 4, midden). Dit zijn vingervormige actinestructuren die uitsteeksels vormen en zich ook ter hoogte van de leading edge bevinden. Ze zijn vaak te vinden in de lamellipodiaregio. Ze zouden er functioneren als directionele sensoren. Filopodia bestaan uit parallelgebundelde actinefilamenten. Een laatste voorbeeld zijn de podosomen en invadopodia (Figuur 4, rechts). Deze structuren worden samen vermeld omdat deze moeilijk van elkaar te onderscheiden zijn. Beide structuren zorgen voor degradatie van de ECM en komen voor aan de ventrale zijde van de cel. Naast deze zelfde functionaliteit, hebben ze ook een gelijkaardige compositie. Sommigen argumenteren dan ook dat dit eigenlijk één en dezelfde structuren zijn. Podosomen zijn de degraderende protrusies voorkomend in normale cellen (bv. macrofagen, dendritische cellen, endotheelcellen en osteoclasten). Invadopodia zijn protrusies voorkomend in kankercellen (sectie 1.3.3). Verschillen werden waargenomen in hun dynamiek. Podosomen hebben een snelle turnover terwijl invadopodia uren stabiel blijven. Daarnaast zijn invadopodia ook langer dan podosomen. Een lengte beperkt tot 2 µm is geldig voor podosomen terwijl invadopodia langer dan 2 µm zijn. Er werd ook gesuggereerd dat invadopodia deel uitmaken van een superstructuur waarbij vanuit een kern verschillende filamentachtige invadopodia voortkomen. Dit werd niet gezien bij podosomen [52], [54]. 20 1.3.2 Cortactine Cortactine (CRN) is een activator van het Arp2/3 complex, zoals reeds aangehaald in sectie 1.3.1.3, en is o.a. hierdoor een regulator in de vorming van vertakte actinenetwerken. Deze actinenetwerken zijn belangrijk in celbeweging en invasie via de vorming van actinerijke protrusies (sectie 1.3.1.4). Het aminoterminaal uiteinde van CRN (Figuur 5) bestaat uit een aminoterminaal zuur domein (amino-terminal acidic, NTA) gevolgd door een tandem repeat domein, waaraan F-actine zal binden. Aan het NTA domein bindt het Arp2/3 complex. Het carboxyterminaal uiteinde van CRN (Figuur 5) bezit enkele fosforyleringsplaatsen en een Src homoloog 3 (SH3) domein. Aan het SH3 domein binden verschillende cytoskelet eiwitten, membraantransport eiwitten en signalisatie eiwitten. CRN doet zo dienst als scaffold tussen deze SH3 domeinbindende eiwitten en het actinecytoskelet. CRN is een belangrijke regulator bij het vormen van vertakte actinenetwerken. Het scaffold eiwit bindt Arp2/3 en F-actine en brengt zo beide eiwitten samen. CRN kan op zich Arp2/3 activeren, maar er gebeurt ook regulatie door andere actineregulerende eiwitten die aan het CRN SH3 domein binden [55]. Voor het WASP interacting protein (WIP) bijvoorbeeld werd aangetoond dat dit tot een verhoogde activatie van het Arp2/3 complex door CRN leidde wanneer gebonden aan het CRN SH3 domein [56]. In een andere studie werd ook bij binding van neuraal WASP (N-WASP, een lid van de WASP familie) aan het CRN SH3 domein een verhoogde activiteit van het Arp2/3 complex waargenomen. CRN en N-WASP zijn dus op zichzelf activators maar zullen elkaar versterken wanneer N-WASP gebonden is aan CRN [57]. Daarbovenop zorgt CRN voor stabilisatie van actinevertakkingen. CRN heeft dus via meerdere mechanismen een regulerende rol bij het vormen van vertakte actinenetwerken [55]. Figuur 5: Schematische voorstelling van CRN met belangrijke domeinen. Enkele interactiepartners belangrijk bij invadopodia (sectie 1.3.3) worden weergegeven. Opmerking: Y470 en Y486 corresponderen met Y466 en Y482 in de muis. (Figuur aangepast uit [55]). Een voorbeeld van actinerijke protrusies waarin CRN een belangrijke regulator is, zijn de invadopodia. Op twee manieren is CRN essentieel tijdens invadopodiavorming. Enerzijds helpt CRN bij het vormen van de initiële kern en bij actinepolymerisatie. Anderzijds reguleert CRN membraantransport tijdens de rekrutering van proteasen [55]. Dit wordt verder toegelicht in de volgende sectie. 21 1.3.3 Invadopodia 1.3.3.1 Inleiding Invadopodia zijn actinerijke protrusies die gevormd worden door kankercellen. Deze structuren bewerkstelligen metastase door afbraak van de ECM en basale membraan. Hierdoor gebeurt intrede in de bloedvaten, wat intravasatie genoemd wordt. Op die manier kunnen de kankercellen zich over het volledige lichaam verspreiden [58]. 1.3.3.2 Precursorvorming Om de vorming van invadopodia te initiëren is een stimulus nodig. Verschillende stimuli kunnen initiatie bewerkstelligen: - - - Inductie van de epitheel-mesenchym transitie (EMT): EMT is een belangrijk proces tijdens de embryogenese. In dit proces zullen cellen mobieler worden, cel-cel contacten verliezen en veranderen in hun binding met matrix componenten. Deze eigenschappen zijn ook nodig voor invasie en metastase door tumorcellen en transcriptiefactoren die EMT induceren, zijn eveneens belangrijk en actief in de inductie van invasie en metastase. Twist1, een transcriptiefactor die EMT induceert, zal de transcriptie van platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) induceren. Dit op zijn beurt resulteert in Src (non-receptor tyrosine kinase)-activatie, wat leidt tot de vorming van invadopodia [59]. Transforming growth factor (TGF)-β werd gerapporteerd als oncogeen waarbij het EMT induceert en leidt tot een invasiever karakter van kankercellen. Het focaal adhesieproteïne Hic-5 zou hierbij een belangrijke rol spelen en zijn fosforylering zou afhankelijk zijn van Src [60]. Hypoxie: Er werd aangetoond dat hypoxie invadopodiavorming induceert. Hypoxie zou de epidermal growth factor receptor (EGFR)-pathway activeren waardoor op zijn beurt histon deacetylase 6 (HDAC6) geactiveerd wordt. Deze activatie leidt tot hypoxiegeïnduceerde invadopodiavorming [61]. In een andere studie werd aangetoond dat hypoxie Notch-signalisatie induceert. Dit leidt tot heparin binding epidermal growth factor (HB-EGF) vrijstelling via het metalloproteïnase ADAM12, wat op zijn beurt tot invadopodiavorming leidt [62]. Matrix metalloproteïnase (MMP) activiteit: Er is een positieve feedback-loop waarbij afbraakproducten van de ECM de vorming van nieuwe invadopodia stimuleert [63]. Groeifactoren: Uit voorgaande stimuli is duidelijk dat groeifactoren een belangrijke rol spelen in het stimuleren van invadopodiavorming. Deze groeifactoren kunnen evenwel autocrien vrijgesteld worden [64]. De EGFR-liganden zijn de best gekarakteriseerde groeifactoren. Deze induceren precursorvorming en activeren pathways naar actinepolymerisatie en matrixdegradatie. TGF-β en liganden van PDGFR daarentegen induceren invadopodiavorming in normale cellen [65]. Ondanks de verschillende stimuli, lijken alle pathways te convergeren naar Cdc42, een GTPase van de Rho familie. Verschillende guanine exchange factors (GEFs) die Cdc42 activeren werden gerapporteerd in context van invadopodiavorming, meer bepaald Vav1, βPIX en Fgd1. Elk van deze GEFs kan geactiveerd worden door het non-receptor tyrosine kinase Src [65]. Dit en volgende stappen worden schematisch weergegeven in Figuur 6. 22 De initiële kern van het invadopodium bestaat uit actine, CRN, cofiline, N-WASP en het Arp2/3 complex. Actine en CRN arriveren eerst op de plaats van initiatie waarbij CRN dienst doet als scaffold waarop cofiline en N-WASP binden. Na vorming van deze initiële kern, bindt het adaptoreiwit tyrosine kinase substraat met vijf SH3 domeinen Tks5 [66]. Tks5 bevat een phox homoloog (PX) domein en vijf SH3 domeinen. Het derde SH3 domein zal interageren met N-WASP [67]. Het PX domein bindt aan fosfatidylinositol lipiden, meer specifiek fosfatidylinositol 3-fosfaat (PI(3)P) en fosfatidylinositol 3,4-bifosfaat (PI(3,4)P2). Het vijfde SH3 domein interageert met enkele ADAM metalloproteïnasen [68]. 3 tot 4 minuten na initiatie van de precursorvorming, is er een aanrijking van PI(3,4)P2 aan het plasmamembraan. Hieraan zal Tks5 binden met zijn PX domein, wat zorgt voor stabilisatie van de precursor [66], [69]. Er dient opgemerkt te worden dat Tks5 eerst als een scaffold beschouwd werd dat de andere proteïnen, nodig voor precursorvorming, rekruteerde. In plaats van deze rol in initiatie, toonde Sharma et al. echter aan dat Tks5 pas arriveerde na vorming van de initiële kern, zoals hierboven beschreven [66], [70]. De aanrijking in PI(3,4)P2 is ten gevolge van de rekrutering van het fosfatase SH2 domain-containing inositol 5phosphatase 2 (SHIP2) of synaptojanin 2 aan de precursor, wat PI(3,4,5)P3 defosforyleert tot PI(3,4)P2 [66], [69]. PI(3,4,5)P3 op zijn beurt zou het resultaat zijn van de fosforylering van PI(4,5)P2 door fosfatidylinositol 3-kinase (PI-3K). Dit kinase zou geactiveerd worden door groeifactoren [69]. In een volgende stap zal β1-integrine gerekruteerd worden, wat geactiveerd werd doorheen de precursorvorming. Het zorgt voor verdere stabilisatie van de precursor en triggert maturatie [71]. Figuur 6: Schematische voorstelling van de betrokken moleculen in precursorvorming. 1.3.3.3 Actinepolymerisatie Het β1-integrine triggert maturatie via interactie met de nonreceptor tyrosine kinase Arg (Ablrelated gene). Voor de activatie van Arg is cross-talk met de EGFR nodig. Een model wordt voorgesteld waarbij in een eerste stap β1-integrine bindt met Arg, waardoor deze laatste een conformationele verandering ondergaat en een autofosforylering uitvoert van zijn tyrosineresidue 272 (Y272). Arg verbreekt zo zijn inactieve conformatie. In een tweede stap zal EGFR-activatie een Src-gemedieerde fosforylering van Arg op Y439 induceren waardoor Arg volledig actief wordt [71]. Arg fosforyleert CRN op drie tyrosineresiduen (Y421, Y466, Y482). De fosforylering van Y421 en Y466 in CRN leidt tot de rekrutering van het adaptoreiwit non-catalytic region of tyrosine kinase 1 (Nck1), wat op zijn beurt N-WASP bindt en zo helpt bij de activatie van het Arp2/3 complex door N-WASP [72]. Daarnaast zal de fosforylering van CRN ervoor zorgen dat cofiline, gebonden aan CRN, vrijgesteld wordt. Cofiline wordt op die manier geactiveerd en zal door zijn knipactiviteit vrije positieve uiteinden creëren. Hierdoor zal Arp2/3-gemedieerde actinepolymerisatie gefaciliteerd worden. CRN wordt nadien terug gedefosforyleerd zodanig dat cofiline opnieuw inactief 23 wordt, wat nodig is voor de stabilisatie van de invadopodium precursor [73] (Figuur 7). Recenter werd een ander model voorgesteld voor de verbreking van de interactie tussen cofiline en CRN. Het focale adhesieproteïne talin zou actine binden tijdens de vorming van de precursor. Bij de start van de maturatie zal talin ook binden aan β1-integrine, wat leidt tot een bijkomende stabilisatie. Deze binding leidt bovendien tot een sterke interactie tussen talin en moesin. Moesin zal op zijn beurt sodium/hydrogen exchanger 1 (NHE-1) rekruteren. Protonen worden getransporteerd naar buiten wat leidt tot verzuring van de ECM en in het cytoplasma zal de pH stijgen. Deze stijging zorgt voor een verbreking van de inhibitorische interactie tussen cofiline en CRN, waardoor cofiline vrije positieve uiteinden kan creëren [74] (Figuur 7). Een derde mechanisme dat voor de regulatie van cofiline instaat, is via het Rho GTPase RhoC. RhoC activeert LIMK via ROCK, waarbij LIMK cofiline zal fosforyleren. Fosforylering inactiveert cofiline. De gefosforyleerde vorm is niet langer in staat om actine te binden en dus om barbed ends te creëren. RhoC staat op zijn beurt onder de regulatie van p190RhoGEF en p190RhoGAP (GTPase activating protein, GAP), een RhoC activator en inactivator respectievelijk (Figuur 7). p190GEF is terug te vinden rondom het invadopodium, terwijl p190GAP in de kern van het invadopodium aanwezig is. Buiten het invadopodium zal RhoC dus geactiveerd worden waardoor cofiline hier niet actief zal zijn. In de kern van het invadopodium daarentegen, is RhoC niet actief [75]. Aangezien in bepaalde cellijnen gezien werd dat Arg p190RhoGAP kan fosforyleren/activeren onder de regulatie van β1-integrine, wordt gesuggereerd dat β1-integrine een master regulator is van cofiline activiteit [65]. Figuur 7: Schematische voorstelling van de betrokken moleculen in actinepolymerisatie. Naast het Arp2/3 complex, zijn ook eiwitten van de formine familie belangrijk in actinepolymerisatie. Diaphanous-related formins (DRFs) werden gerapporteerd als zijnde essentieel in de invadopodiavorming. Er wordt gesteld dat deze instaan voor de elongatie van invadopodia [76]. Het actinebundelend eiwit fascine (FSN) is ook aanwezig in invadopodia en heeft er o.a. een stabiliserende rol [77], [78]. Mena, een lid van de enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) eiwitten, is een ander eiwit dat met regulatie van actinepolymerisatie geassocieerd wordt. Een opregulatie van Mena werd gezien bij invasieve kankercellen. Ook een splice isovorm van Mena (MenaINV) werd teruggevonden bij een invasief karakter. Uit de studie blijkt dat vooral MenaINV een belangrijke regulator is in invadopodiavorming. Het zorgt voor stabilisering van invadopodia, reguleert de respons op EGF signalisatie en verhoogt beweeglijkheid [79]. 24 Vanaf dat invadopodia een bepaalde lengte bereiken door actinepolymerisatie, werd gezien dat ook microtubuli aanwezig zijn in invadopodia. Door hun rol in intracellulair transport en ook door de aanwezigheid van vesikels in mature invadopodia, wordt gesteld dat deze microtubuli specifieke eiwitten aanbrengen, zoals de MMP’s. In de latere stadia van mature invadopodia werden ook intermediaire filamenten waargenomen. Deze zouden mechanische stabiliteit verlenen [80]. 1.3.3.4 Rekrutering proteasen Een eerste groep belangrijk in invadopodiagemedieerde ECM degradatie zijn de matrix metalloproteïnasen (MMP’s). Hierbij speelt het membrane type 1 matrix metalloproteinase (MT1-MMP), ook wel aangeduid als MMP14, een centrale rol [81]. Enerzijds staat dit protease zelf in voor degradatie van de ECM [82], anderzijds zal MT1-MMP twee andere leden van de MMP’s activeren, namelijk MMP2 [83] en MMP9 [84]. Het is een membraangebonden eiwit (cfr. membrane type) in tegenstelling tot MMP2 en MMP9, die gesecreteerd worden in het extracellulaire milieu [81]. In de literatuur worden verschillende routes beschreven waarlangs MT1-MMP wordt aangebracht. Bij een eerste route zal interactie tussen IQGAP en het membraangebonden exocyst complex leiden tot rekrutering van MT1-MMP vesikels. Deze interactie staat onder de controle van de Rho GTPasen Cdc42 en RhoA [85] (Figuur 8a). Het exocyst complex interageert ook met het Wiskott-Aldrich syndrome protein and Scar homolog (WASH) eiwit, behorend tot de familie van Arp2/3 activators. WASH is aanwezig in welbepaalde subdomeinen van MT1-MMP-bevattende late endosomen. WASH en het exocyst complex zouden samenwerken in de controle van de verbinding tussen late endosomen en het plasmamembraan. Op die manier zou MT1-MMP getarget worden naar het plasmamembraan ter hoogte van de invadopodia [86] (Figuur 8b). Vervolgens zou het SNARE eiwit VAMP7 nodig zijn voor de fusie tussen de membranen [86], [87]. CRN is ook betrokken in de regulatie en lokalisatie van MT1-MMP secretie ter hoogte van invadopodia. Het eiwit is dus niet enkel belangrijk tijdens de vorming van invadopodia maar ook voor hun functionaliteit. Bovendien speelt CRN een rol in de secretie van MMP2 en MMP9 [63], [78] (Figuur 8c). Daarnaast wordt MT1-MMP activiteit geregeld door endocytose. Cdc42 interacting protein 4 (CIP4) stimuleert endocytose en zal dus zorgen voor verminderde ECM degradatie. CIP4 (en bijgevolg ook endocytose) wordt geïnhibeerd door Src-gemedieerde fosforylering van CIP4 [88]. Endocytose van MT1-MMP wordt ook verhinderd door β1-integrine [89]. Integrinen spelen eveneens mee in een laatste route voor rekrutering van MT1-MMP. Door adhesie van integrinen aan collageen zou MT1-MMP gemobiliseerd worden via een RAB8-afhankelijke secretorische pathway [90] (Figuur 8d). Naast de MMP’s spelen ook andere proteasen mee in ECM degradatie. A disintegrin and metalloproteinase (ADAM) familie proteasen dragen hiertoe bij [82]. Naast de protease activiteit, kan ADAM binden aan Tks5 en werd ADAM12 reeds vermeld met een rol in precursorvorming onder invloed van hypoxie (sectie 1.3.3.2). Een laatste groep die bijdraagt tot ECM degradatie zijn de serine proteasen, waaronder seprase [82]. 25 Figuur 8: Schematische voorstelling van de betrokken moleculen in rekrutering proteasen. 1.3.3.5 Verband tussen invadopodia en exosomen Hoshino et al. suggereerde een nauw verband tussen invadopodia en exosomen. Eerst werd aangetoond dat MVE’s dynamisch associëren met invadopodia [91]. Dat MVE’s (of anders late endosomen) associëren met invadopodia, werd terzelfdertijd ook aangetoond door Monteiro et al. [86] (sectie 1.3.3.4). Vervolgens werd de invloed van exosomen op invadopodia bekeken. Hierbij werd aangetoond dat exosoomsecretie essentieel is voor zowel vorming als functie van de invadopodia. Er werd gepostuleerd dat invadopodiamaturatie en ECM degradatie afhankelijk zijn van de aanvoer van MT1-MMP (en mogelijks ook andere proteasen) via exosomen, waarbij het MT1-MMP zich in het membraan van het exosoom bevindt. Bovendien werd waargenomen dat toevoeging van opgezuiverde exosomen de vorming van invadopodia kan induceren. Daarnaast werd de invloed van invadopodia op exosoomsecretie bestudeerd. Hierbij werd verondersteld dat invadopodia essentiële docking sites zijn voor MVE’s en dat de aanwezigheid van invadopodia nodig is voor exosoomsecretie [91]. Dit alles leidde tot de conclusie dat er een mogelijk verband bestaat tussen invadopodia en exosomen. 26 1.4 Nanobodies Figuur 9: Conventioneel antilichaam (links), zware keten antilichaam (midden) en nanobody met bijhorende eigenschappen (rechts) (figuur aangepast uit [92]). Leden van de Camelidae-familie (bv. kamelen, lama’s en alpaca’s) bezitten naast conventionele antilichamen, zoals ook bij de mens aanwezig, antilichamen zonder een lichte keten (of zware keten antilichamen). Conventionele antilichamen (Figuur 9, links) bestaan enerzijds uit een zware keten met vier domeinen waarvan één domein (N-terminus) variabel is (VH) en de drie andere constant zijn (CH). Anderzijds bezit het antilichaam ook een lichte keten bestaande uit twee domeinen, waarvan één variabel (VL) en één constant domein (CL). De variabele domeinen van beide ketens samen met het eerste constante domein van de zware keten en het constante domein van de lichte keten vormen samen het antigeenbindend fragment (Fab-fragment). De twee overige constante domeinen van de zware keten zijn belangrijk in het rekruteren van de immuuncellen en voor effector functies (FC-fragment). Zware keten antilichamen (Figuur 9, midden) bestaan uit tweemaal één variabel (variable domain of heavy chain of heavy chain antibodies, VHH) en twee constante domeinen (CH). Deze eenvoudigere structuren zijn ook volledig functioneel waarbij het variabele domein equivalent is aan Fab in het conventionele antilichaam. Wanneer deze variabele domeinen geïsoleerd worden, blijven ze stabiel en behouden ze hun antigeenbindend vermogen. Deze geïsoleerde variabele domeinen worden nanobodies (Nbs) (Figuur 9, rechts) genoemd. Ablynx is een biofarmaceutisch bedrijf dat deze Nbs ontwikkelt [92], [93]. Het screeningsproces start met het immuniseren van kamelen of lama’s met antigenen. Bloed wordt afgenomen en de lymfocyten worden hieruit geïsoleerd. Hierna wordt het mRNA uit de lymfocyten geëxtraheerd om te vermenigvuldigen en om te zetten naar cDNA via RTPCR. Dit cDNA wordt dan gekloneerd in een faagdisplay vector om hiermee E. coli te transformeren en een bank aan te maken (tot ca. 107 transformanten). Deze bank wordt vervolgens gescreend op binding tussen Nb en zijn ligand (antigeen) via panning. Na twee of drie rondes van panning zijn de antigeenspecifieke klonen voldoende aangerijkt om hieropvolgend een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) uit te voeren. Met behulp van ELISA worden de individuele klonen gescreend op de productie van antigeenspecifieke Nbs. Op dit punt kan overgegaan worden tot productie van de Nbs. Hiervoor worden de Nbs gekloneerd in een microbieel systeem voor fermentatie [93], [94]. 27 Nbs kunnen gemakkelijk in microbiële systemen geproduceerd worden (milligram hoeveelheden). Andere voordelen zijn de kleine omvang die ervoor zorgt dat ze op moeilijk bereikbare plaatsen kunnen raken en hun hoge affiniteit en specificiteit voor hun doelwit. Ze zijn robuust en kunnen lange tijd bewaard worden zonder hun antigeenbindend vermogen te verliezen (enkele weken bij 37°C, enkele maanden bij 4°C en langer bij -20°C). Daarnaast zijn ze niet-immunogeen o.a. door homologie met het variabele domein van de zware keten van het humane antilichaam [92]–[94]. Eigenschappen van Nbs kunnen aangepast worden naar wens. Zo kunnen bijvoorbeeld meerdere Nbs gecrosslinked worden om de specificiteit te verhogen of de kritieke concentratie, nodig voor het gewenste effect, te verlagen. Deze samenvoeging gebeurt via glycine-serine linkers van de C-terminus naar de N-terminus [95]. Ook kunnen aanpassingen gemaakt worden om de halfwaardetijd te veranderen. Zo kunnen Nbs bijvoorbeeld gebonden worden aan albumine [96]. Nbs vinden toepassingen als geneesmiddel maar kunnen ook gebruikt worden in diagnostiek en onderzoek. Als geneesmiddel vinden Nbs toepassingen in heel wat verschillende takken zoals hematologie, ademhalingsziekten, immunologie, oncologie en botziekten. Reeds in klinische trial is Caplacizumab (anti-vWF Nanobody), dat een toepassing heeft in trombotische trombocytopenische purpura (TTP) [94]. TTP is een zeldzame bloedziekte waarbij microthrombie gevormd worden, wat kan leiden tot verstopping van kleine bloedvaten en onvoldoende bloedtoevoer naar organen. De von Willebrand factor (vWF) speelt hierin een belangrijke rol. Deze vormt multimeren (Ultra-Large vWF) en zal vervolgens bloedplaatjes binden aan zijn A1-domein, wat leidt tot bloedklontervorming. In gezonde individuen worden deze multimeren geknipt door het enzym ADAMTS13. Bij individuen die leiden aan TTP is dit enzym defect. Caplacizumab bindt aan het A1-domein waardoor binding van bloedplaatjes en aggregaatvorming verhinderd wordt [97]. Een toepassing van Nbs binnen de diagnostiek is radiolabeling van een Nb voor gebruik in positron emissie tomografie (PET). Dit werd onderzocht voor de niet-invasieve detectie van aderverkalking [98]. Ook als biosensor of koppeling aan magnetische nanopartikels zijn toepassingen bekend [93]. Als laatste kunnen Nbs een handige tool zijn in fundamenteel onderzoek. Zo kunnen Nbs aangewend worden om functies van structurele eiwitten te onderzoeken, een techniek complementair met RNAi [99]. Zo werden recent Nbs gebruikt om de functie van actinebindende eiwitten te onderzoeken [78], [100]. In deze thesis worden gekarakteriseerde CRN Nbs aangewend om de rol van CRN in exosoomvorming te bestuderen. 28 2 Materialen en methoden 2.1 Verband tussen cortactine en exosomen 2.1.1 Exosoomsecretie na inhibitie cortactine met nanobodies 2.1.1.1 Celcultuur MDA-MB-231 parentale humane borstkankercellen werden gebruikt. Daarnaast werd ook gebruikgemaakt van stabiele CRN NTA Nb2-EGFP en CRN SH3 Nb2-EGFP MDA-MB-231 borstkankercellen. De genen, coderend voor deze EGFP-getaggeerde Nbs, werden binnengebracht in MDA cellen via transductie. Expressie van de Nbs wordt geïnduceerd door toevoeging van doxycycline (dox, Addendum Figuur 1). Alle cellijnen werden opgegroeid in DMEM waaraan 10% foetal bovine serum (FBS), 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine werd toegevoegd. De cellen werden geïncubeerd bij 37 °C en 10% CO2. 2.1.1.2 Antilichamen Voor Western blot werd gebruikgemaakt van de volgende primaire antilichamen: konijn monoklonaal anti-CD63 (1:1000, ab134045, Abcam), konijn polyklonaal anti-golgin 245 (1:1000, sc-102565, Santa Cruz), muis monoklonaal anti-cytochroom C (1:1000, ab13575, Abcam), konijn polyklonaal anti-calnexine (1:1000, sc-11397, Santa Cruz) en konijn polyklonaal anti-PMP70 (1:1000, ab85550, Abcam). Als secundaire antilichamen werden horseradish peroxidase-linked anti-muis en anti-konijn van GE Healthcare aan een verdunning van 1:2000 gebruikt. Alle verdunningen gebeurden in 5% melkoplossing (5% mager melkpoeder in Tris buffered saline met 1% Tween20, afgekort TBS-T). 2.1.1.3 OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie Ter voorbereiding werd een grote hoeveelheid cellen opgegroeid. Hiervoor werden vijf T175 celcultuurflessen per conditie aangelegd. - Dag 1: Exosomen afkomstig van FBS werden weggewassen. Hiervoor werden de T175 celcultuurflessen driemaal gewassen met serumvrij medium (DMEM met 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine). Vervolgens werd 10 mL serumvrij medium toegevoegd aan elke cultuurfles. Twee condities werden meegenomen. Enerzijds bleven vijf T175 celcultuurflessen onbehandeld (- dox). Anderzijds werd er aan vijf andere doxycycline toegevoegd aan een verdunning van 1:4000 (+ dox). De cellen werden daarna gedurende 24 h geïncubeerd bij 37 °C en 10% CO2. - Dag 2: Na 24 h werd het medium, dat de exosomen bevat, afgenomen en verzameld per conditie (- dox, + dox). Vers serumvrij medium (- dox of + dox) werd toegevoegd. Het afgenomen medium werd gecentrifugeerd gedurende 4 min aan 800 rpm ter verwijdering van cellen en debris. Daarna werd het medium achtereenvolgens gefilterd doorheen een 0,45 µm en 0,22 µm filtermembraan, ter verwijdering van grotere vesikels en het overige debris. - Dag 3: Na 48 h werd het medium met de exosomen een tweede maal afgenomen waarna dezelfde centrifugatie en tweevoudige filtratie werd uitgevoerd. Na het medium afgenomen te hebben, werden de cellen getrypsiniseerd en geteld met een Bürker telkamer. De exosomen werden na filtratie opgeconcentreerd waarvoor de Amicon Ultra15 Centrifugal Filter Unit (Millipore) met een nominaal moleculair gewicht limiet van 10 kDa gebruikt werd. Het gefilterde medium werd gediafiltreerd (4000 x g bij 4 °C) tot een volume kleiner dan 500 µL bekomen werd. Deze opgeconcentreerde exosomen werden 29 vervolgens geladen op een discontinue iodixanolgradiënt. Deze gradiënt bestond uit 3 mL 40% iodixanoloplossing, 3 mL 20% iodixanoloplossing, 3 mL 10% iodixanoloplossing en 2,5 mL 5% iodixanoloplossing aangebracht in een 12 mL polyallomeer tube (Beckman Coulter). Deze oplossingen werden bekomen door het mengen van een iodixanol working solution met een homogenization buffer (0,25 M sucrose, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCL pH 7,4). De working solution bestond uit een working buffer (0,25 M sucrose, 6 mM, EDTA, 60 mM Tris-HCl pH 7,4) en een stockoplossing OptiPrep (60% (w/v) iodixanol oplossing). Na het laden van de exosomen op de gradiënt werd dit gecentrifugeerd gedurende 18 h aan 100 000 x g bij 4 °C (SW41Ti rotor, Beckman Coulter). - Dag 4: Fracties van 1 mL werden afgenomen en opgelost in 10 mL phosphate buffered saline (PBS, zonder Ca2+ en Mg2+) in een 12 mL polyallomeer tube (Beckman Coulter). De fracties werden daarna gedurende 3 h gecentrifugeerd aan 100 000 x g bij 4 °C (SW41Ti rotor, Beckman Coulter). De verkregen pellet werd geresuspendeerd in 50 µL PBS en uitverdeeld over drie volumes, meer bepaald 5 µL, 20 µL en 25 µL. Dit werd bewaard bij - 80 °C. 2.1.1.4 Western blot Om te weten in welke fracties, verkregen na de OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie, exosomen aanwezig waren, werd aan de 5 µL fracties 1,5 µL 5x sample buffer (5% SDS, 20% glycerol, 0,2% broomfenolblauw, 5% -mercapto-ethanol, 65 mM Tris-HCl) toegevoegd. De fracties werden geladen op een 10% polyacrylamidegel. Ook werd er 60 µg ruw extract (gelyseerde parentale MDA cellen) waaraan 5x sample buffer werd toegevoegd, geladen. Vervolgens werd SDS-PAGE (40 mA) uitgevoerd waarbij gebruikgemaakt werd van een Trisglycine running buffer. Na scheiding werden de eiwitten getransfereerd naar een nitrocellulosemembraan. Het blotten werd gedurende 3 h aan 45 V of overnacht aan 25 V uitgevoerd. Dan werden de membranen gedurende 1 h geblokkeerd in 5% melkoplossing waarna overnacht geïncubeerd werd met het primair antilichaam (anti-CD63) op een rotor bij 4 °C. Incubatie met het secundaire antilichaam gebeurde gedurende 1 h op een rotor bij kamertemperatuur nadat de membranen eerst gewassen werden met TBS-T (3 x 4 min). Na de incubatie werd opnieuw een wasstap met TBS-T (3 x 4 min) uitgevoerd en werden de membranen ontwikkeld. Hiervoor werden de membranen gedurende 1 min geïncubeerd met een oplossing van 50% peroxide solution (detection reagent 1, Thermo Scientific) en 50% luminol enhancer solution (detection reagent 2, Thermo Scientific). De detectiereagentia reageren met behulp van het horseradish peroxidase gelinkt aan het secundaire antilichaam en geven daarbij licht vrij. Dit lichtsignaal werd vastgelegd op een chemiluminescentie detectiefilm (Amersham Hyperfilm ECL). Voor het nagaan van de zuiverheid van de exosoombevattende fracties, werden alle 25 µL fracties van één OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie-reeks onderworpen aan badsonicatie gedurende 1 h voorafgaand aan SDS-PAGE. Aan de fracties werd 7 µL 5x sample buffer toegevoegd. Ook hier werd ruw extract meegenomen. Voor het blotten werd het programma van 3 h (45 V) gebruikt. Het nitrocellulosemembraan werd geknipt ter hoogte van 25 kDa alvorens te incuberen met de primaire antilichamen. Incubatie van de bovenste helft (>25 kDa) gebeurde met anti-golgin 245 en incubatie van de onderste helft (<25 kDa) met anti-cytochroom C. Na het ontwikkelen van de membranen, werd een incubatie van de bovenste helft met het primaire antilichaam anti-calnexine uitgevoerd. Een derde incubatie werd uitgevoerd met anti-PMP70 na het ontwikkelen van de membranen voor anti-calnexine. 30 2.1.1.5 Exosoomkwantificatie via nanoparticle tracking analysis Aan de hand van een Western blot werd bepaald in welke fracties exosomen aanwezig waren. In deze fracties werd het aantal exosomen bepaald via nanoparticle tracking analysis (NTA). NTA werd uitgevoerd gebruikmakend van de NanoSight LM10-HS met een violet (405 nm) lasersysteem. De exosoomfracties werden verdund in PBS opdat de concentratie binnen het lineaire gebied van de standaardcurve zou vallen (3 x 108 – 1 x 109 partikels/mL). Per staal werden drie video’s van 30 s opgenomen waarbij de temperatuur telkens bijgehouden werd. De video’s werden vervolgens geanalyseerd (concentratie partikels per ml en grootte) met de NTA software. Uit de concentratie partikels per ml kon dan het aantal exosomen per cel berekend worden. 2.1.1.6 Statistische analyse Voor elke cellijn werden drie herhalingen uitgevoerd. Normaliteit werd nagegaan met de Kolmogorov-Smirnovtoets. De verschillen tussen de onbehandelde (- dox) en behandelde (+ dox) cellen werden geanalyseerd met een éénzijdige ratio gepaarde t-test (5% significantieniveau). De statistische analyse werd uitgevoerd met de GraphPad Prism software. 2.1.2 Exosoomsecretie na expressie neerregulatie cortactine met shRNA 2.1.2.1 Celcultuur Er werd gewerkt met MDA-MB-231 parentale humane borstkankercellen (voor cultuurcondities, zie sectie 2.1.1.1). 2.1.2.2 Transfectie De shRNA-constructen werden transiënt tot expressie gebracht in parentale MDA cellen met behulp van jetPRIME transfectie. Het protocol werd gevolgd zoals beschreven door de producent Polyplus-transfection. De cellen werden uitgezaaid in een 6-well plaat voor Western blot en in een 12-well plaat op collageengecoate coverslips voor immunostaining. De shRNA-constructen waren aanwezig in een plasmide, meer bepaald de pLKO.1 vector. Er waren shRNA’s gericht tegen drie verschillende ABP’s (CRN, FSN en GSN) beschikbaar met vijf verschillende constructen per ABP (Addendum Tabel 1). Daarnaast was ook een controle shRNA-construct ter beschikking. Dit construct is gericht tegen tGFP en heeft dus geen zoogdiergen als target (Addendum Tabel 1). Voor Western blot werd enerzijds een cotransfectie uitgevoerd samen met EGFP (pEGFP-N1 vector) om de transfectie-efficiëntie te bepalen. Transfectie-efficiëntie werd bepaald met de Olympus IX71 fase-contrast fluorescentiemicroscoop en de cell^B software. Anderzijds werd een enkele transfectie uitgevoerd wegens lage transfectie-efficiëntie bij de cotransfectie met EGFP. Voor immunostaining werd een cotransfectie uitgevoerd. 2.1.2.3 Cellen lyseren en eiwitconcentratie bepalen Voor Western blot werden cellen uitgezaaid in een 6-well plaat aan een hoeveelheid van 220 000 cellen per mL. Na 24 h werden de cellen getransfecteerd zoals beschreven in sectie 2.1.2.2. Na een tweede incubatie (48 h) werden de cellen geschraapt, geresuspendeerd in 1 mL PBS (zonder Ca2+ en Mg2+) per well en gecentrifugeerd gedurende 10 min aan 800 rpm. De celpellet, verkregen na cotransfectie, werd dan geresuspendeerd in 15 µL lysisbuffer bestaande uit 1% TRITON X-100 (verdund in PBS zonder Ca2+ en Mg2+) en enkele protease inhibitoren (PMSF, bezamidine, leupeptine en aprotinine). Na enkele transfectie werd er geresuspendeerd in 20 µL lysisbuffer. Daarna vond een incubatie van 31 10 min op ijs plaats. Centrifugatie gedurende 10 min aan 20 800 x g bij 4 °C werd vervolgens uitgevoerd en het supernatans werd behouden. Hiervan werd de eiwitconcentratie bepaald met de Bio-Rad Protein Assay. Voor het ruw extract werden de cellen, uitgezaaid in een T25 celcultuurfles, geschraapt en geresuspendeerd in 3 mL PBS (zonder Ca2+ en Mg2+). Resuspensie van de celpellet na centrifugatie gebeurde in 200 µL lysisbuffer. Overige stappen werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven. 2.1.2.4 Antilichamen Voor Western blot werd gebruikgemaakt van de volgende primaire antilichamen: muis monoklonaal anti-cortactine (1:1000, 05-180, Millipore), muis monoklonaal anti-fascine (1:1000, M3567, DAKO), muis monoklonaal anti-gelsoline (1:2000, G4896, Sigma-Aldrich), konijn polyklonaal anti-GFP (1:2000, #2555, Cell Signaling) en muis monoklonaal anti-actine (1:500, MAB1501, Millipore). Als secundaire antilichamen werden horseradish peroxidaselinked anti-muis en anti-konijn van GE Healthcare aan een verdunning van 1:2000 gebruikt. Alle verdunningen gebeurden in 5% melkoplossing (5% mager melkpoeder in TBS-T). Voor immunostaining werden de primaire antilichamen anti-cortactine en anti-gelsoline gebruikt die reeds vermeld werden bij Western blot maar nu aan een verdunning van 1:100 en 1:200 respectievelijk. Daarnaast werd het primaire antilichaam konijn polyklonaal anti-fascine (1:100, HPA005723, Sigma-Aldrich) gebruikt. Als secundaire antilichamen werd Alexa Fluor 594-geconjugeerd geit anti-muis (1:200, A-11005, Invitrogen) en Alexa Fluor 594-geconjugeerd geit anti-konijn gebruikt (1:200, A-11037, Invitrogen). De verdunningen gebeurden in 1% bovine serum albumin (1% BSA in PBS met Ca2+ en Mg2+). 2.1.2.5 Western blot Een gelijke hoeveelheid van de lysaten werd geladen op een 10% polyacrylamidegel nadat 5x sample buffer werd toegevoegd. Alles werd uitgevoerd zoals beschreven in sectie 2.1.1.4. Bij de cotransfectie werd 3 h geblot, bij de enkele transfectie gebeurde dit overnacht. In beide gevallen werd het nitrocellulosemembraan geknipt zodanig dat de incubatie met de verschillende primaire antilichamen gelijktijdig en gescheiden van elkaar uitgevoerd kon worden. Bij zowel cotransfectie als enkele transfectie werd geïncubeerd met anti-cortactine, anti-fascine en anti-gelsoline. Alleen na de enkele transfectie werd bijkomstig geïncubeerd met anti-actine. Na enkele transfectie werden de intensiteiten van de bandjes gekwantificeerd met ImageJ. 2.1.2.6 Immunostaining en fluorescentiemicroscopie Cellen werden uitgezaaid op een coverslip, gecoat met collageen (50 µg/mL), aan een hoeveelheid van 80 000 cellen per well. Na een incubatie van 24 h werd de cotransfectie uitgevoerd (sectie 2.1.2.2). Na een tweede incubatie (48 h) werden de cellen kort gewassen in PBS (met Ca2+ en Mg2+) en gedurende 25 min gefixeerd in 3% paraformaldehyde (3% PFA verdund in PBS met Ca2+ en Mg2+). Vervolgens werd een wasstap van 3 x 3 min in PBS (met Ca2+ en Mg2+) en permeabilisatie gedurende 5 min in 0,2% TRITON X-100 (verdund in PBS met Ca2+ en Mg2+) uitgevoerd. Na een wasstap van 2 x 3 min in PBS (met Ca2+ en Mg2+) werden de coverslips 20 min geïncubeerd met 0,75% glycine (verdund in PBS met Ca2+ en Mg2+). Eénmaal kort wassen in PBS (met Ca2+ en Mg2+) werd gevolgd door een blokkering van 10 min met 1% BSA (verdund in PBS met Ca2+ en Mg2+). Daarna kwam de incubatie met het primaire antilichaam gedurende 1 h bij 37 °C. Nadien werd 4 x 4 min gewassen in 1% BSA waarna incubatie met het secundaire antilichaam plaatsvond voor 30 min bij kamertemperatuur. Samen met het secundaire antilichaam werd ook DAPI 32 (1:1000, D9542, Sigma-Aldrich) toegevoegd. Na de laatste wasstap (1 x 4 min in 1% BSA en 3 x 4 min in PBS met Ca2+ en Mg2+) werden de coverslips gemonteerd op een draagglaasje. Hierbij werd eerst een druppeltje Vectashield aangebracht en erna de coverslip omgekeerd op het draagglaasje geplaatst. De coverslip werd vastgemaakt met nagellak en bewaard bij 4 °C. Opnames werden gemaakt met de Zeiss Axiovert 200M Apotome fluorescentiemicroscoop en de Axiovision software. Het anti-fascine antilichaam vraagt een fixatie met methanol. Deze fixatie gebeurde met 100% methanol gedurende 5 min bij -20 °C. Permeabilisatie met TRITON X-100 en incubatie met glycine werden hierbij overgeslagen en er werd meteen overgegaan naar de blokkering met 1% BSA. 2.2 Verband tussen invadopodia en exosomen 2.2.1 Celcultuur Dezelfde cellijnen en zelfde cultuurcondities zoals beschreven in sectie 2.1.1.1, werden gebruikt. 2.2.2 Antilichamen Voor immunostaining werden de volgende primaire antilichamen gebruikt: muis monoklonaal anti-CD63 (1:100, ab8219, Abcam), konijn monoklonaal anti-MT1-MMP (1:100, ab51074, Abcam), muis monoklonaal anti-cortactine (1:100, 05-180, Millipore), konijn polyklonaal antigolgin 245 (1:200, sc-102565, Santa Cruz), konijn polyklonaal anti-Tks5 (1:100, sc-30122, Santa Cruz). Als secundaire antilichamen werd Alexa Fluor 488-geconjugeerd geit anti-muis (1:200, A-11001, Invitrogen), Alexa Fluor 594-geconjugeerd geit anti-muis (1:200, A-11005, Invitrogen), Alexa Fluor 488-geconjugeerd geit anti-konijn (1:200, A-11034, Invitrogen) en Alexa Fluor 594-geconjugeerd geit anti-konijn gebruikt (1:200, A-11037, Invitrogen). De verdunningen gebeurden in 1% BSA. 2.2.3 Immunostaining en fluorescentiemicroscopie Voor invadopodiavorming werden coverslips gecoat met 0,01% gelatine gedurende 30 min à 1 h en gefixeerd met 0,5% glutaaraldehyde voor 10 min. Na een wasstap (6 x 3 min) in PBS (met Ca2+ en Mg2+), werd quenching met medium voor celcultuur (zoals beschreven in sectie 2.1.1.1) gedurende 1 h bij 37 °C en 10% CO2 uitgevoerd. Cellen werden dan uitgezaaid aan een hoeveelheid van 80 000 cellen per well. Wanneer gewerkt werd met de CRN NTA Nb2EGFP en CRN SH3 Nb2-EGFP cellen, werd 3 à 4 h na uitzaaien doxycycline (1:4000) toegevoegd. Na een incubatie van 24 h werd kort gewassen in PBS (met Ca2+ en Mg2+) en 25 min gefixeerd in 3% PFA. Dit en volgende stappen werden uitgevoerd zoals beschreven in sectie 2.1.2.6. Visualisatie van gepolymeriseerd actine gebeurde met Alexa Fluor 594 phalloidin (1:100, A12381, Invitrogen) of Acti-stain 670 phalloidin (1:100, # PHDN1-A, Cytoskeleton). Dit werd samen met het secundaire antilichaam en DAPI (1:1000, D9542, Sigma-Aldrich) toegevoegd. Opnames werden gemaakt met de Zeiss Axiovert 200M Apotome fluorescentiemicroscoop en de Axiovision software of met de Olympus IX81 confocale microscoop en de FluoView FV1000 software. 33 De staining op polystyreen gebeurde volgens een afwijkend protocol. Voor de staining met falloïdine werden de cellen uitgezaaid in een 96-well plaat aan een hoeveelheid van 9000 cellen per well. Een incubatie van 24 h volgde hierop. Er werd dan 20 min gefixeerd in 3% PFA waarna meteen overgegaan werd naar permeabilisatie met 0,2% TRITON X-100 gedurende 5 min. Na 1 x 1min wassen in PBS (met Ca2+ en Mg2+) werd een incubatie met 0,75% glycine gedurende 30 min uitgevoerd. Staining met Alexa Fluor 594 phalloidin (A12381, Invitrogen) aan een verdunning van 1:75 in 2% BSA gebeurde gedurende 30 min bij 37 °C. Na een wasstap van 2 x 10 min in 2% BSA, werd de staining met DAPI (D9542, Sigma-Aldrich) aan een verdunning van 1:1000 in 2% BSA uitgevoerd gedurende 1 min. Er werd nog 1 x 10 min in 2% BSA en 2 x 10 min in PBS (met Ca2+ en Mg2+) gewassen waarna de 96-well plaat bij 4 °C bewaard werd. Opnames gebeurden met de Olympus IX81 fluorescentiemicroscoop en de TeamViewer software. Voor de staining met de antilichamen anti-Tks5 en anti-cortactine werden de cellen uitgezaaid in een 24-well plaat aan een hoeveelheid van 65 000 cellen per well. Voor deze staining werd gewerkt met de CRN NTA Nb2-EGFP en CRN SH3 Nb2-EGFP cellen en werd er na 3 à 4 h doxycycline (1:4000) toegevoegd. Na een tweede incubatie van 24 h werden de cellen 1 x gewassen met PBS (met Ca2+ en Mg2+) en dan 20 min gefixeerd in 3% PFA. 2 x 2 min wassen in PBS (met Ca2+ en Mg2+) werd gevolgd door een permeabilisatiestap van 5 min met 0,2% TRITON X-100. Na opnieuw een wasstap van 2 x 2 min in PBS (met Ca2+ en Mg2+), werden de cellen geïncubeerd met 0,75% glycine gedurende 20 min. Alvorens 30 min te blokkeren in 1% BSA, werd nog 1 x kort gewassen in PBS (met Ca2+ en Mg2+). Incubatie met het primaire antilichaam volgde op blokkering gedurende 1 h bij kamertemperatuur. Er werd dan 2 x kort en 2 x 5 min gewassen in 1% BSA. Vervolgens werd de incubatie met het secundaire antilichaam uitgevoerd voor 1 h bij kamertemperatuur. Samen met het secundair antilichaam werd ook DAPI (1:1000, D9542, Sigma-Aldrich) toegevoegd. Er werd geëindigd met een wasstap van 1 x 10 min in 1% BSA en 2 x 10 min in PBS (met Ca2+ en Mg2+). De 24-well plaat werd bewaard bij 4 °C. Opnames werden gemaakt met de Olympus IX71 fase-contrast fluorescentiemicroscoop en de cell^B software. Voor het coaten van coverslips met de fluorescente matrix voor de degradatie assay werd de QCM Gelatin Invadopodia Assay (Red) gebruikt. Daarbij werden de instructies van de producent Millipore gevolgd t.e.m. quenching. I.p.v. cellen, werden na quenching exosomen aangebracht op de fluorescente matrix (1 x 109 exosomen per mL). De matrix werd gedurende 16 h geïncubeerd met de exosomen. Erna gebeurde fixatie met 3% PFA gedurende 30 min. Het vervolg gebeurde analoog aan het protocol beschreven in sectie 2.1.2.6. De incubatie met het primaire antilichaam gebeurde echter bij kamertemperatuur, er werd geen DAPI toegevoegd en bij de laatste wasstap werd enkel 3 x 4 min gewassen in PBS (met Ca2+ en Mg2+). 2.2.4 Kwantificatie en statistische analyse Kwantificatie gebeurde met ImageJ. Voor de statistische analyse werd gebruikgemaakt van de GraphPad Prism software. Normaliteit werd nagegaan met de Kolmogorov-Smirnovtoets. Voor de analyse van de resultaten omtrent nabijheid van invadopodia en exosomen werd de Mann-Whitneytoets (5% significantieniveau) gebruikt. De resultaten van de degradatie assay werden geanalyseerd met een éénzijdige t-test (5% significantieniveau). 34 3 Resultaten 3.1 Verband tussen cortactine en exosomen 3.1.1 Exosoomsecretie na inhibitie cortactine met nanobodies 3.1.1.1 OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie CRN is een belangrijk eiwit in de vorming en functie van invadopodia. Om een mogelijk verband tussen invadopodia en exosomen te onderzoeken, werd via Nbs de functionaliteit van CRN verstoord en werd nagegaan of er een verandering optrad in het aantal exosomen dat werd vrijgesteld als gevolg van deze verstoring. Hiertoe werden Nbs gericht tegen zowel het NTA domein als het SH3 domein gebruikt. De Nbs werden voorafgaand aan de thesis reeds stabiel binnengebracht in MDA-MB-231 cellen (Figuur 10). Een EGFP-getaggeerd Nb-construct werd gekloneerd in een gepaste vector om vervolgens getransfecteerd te worden in een packaging cellijn. Deze getransfecteerde cellen produceren lentivirus partikels. Met deze lentivirus partikels werden MDA cellen getransduceerd. Stabiele cellijnen werden zo verkregen die door toevoeging van doxycycline het Nb tot expressie brengen. Voor meer details omtrent het gebruikte transductiesysteem wordt verwezen naar Addendum Figuur 1. Beide CRN Nbs werden voorafgaand ook al éénmaal getest en resulteerden in een daling van vrijgestelde exosomen per cel. Deze Nbs werden elk tweemaal opnieuw getest om na te gaan of deze daling reproduceerbaar is. Figuur 10: Schematische voorstelling aanmaak stabiele cellijn. Omdat gewerkt werd met een stabiele cellijn waarbij de expressie van de Nbs geïnduceerd wordt door doxycycline, werd nagegaan of de additie van doxycycline op zich niet resulteerde in een reductie van het aantal exosomen. Dit werd reeds tweemaal getest op voorhand. Een derde herhaling werd uitgevoerd om een effect te kunnen uitsluiten. Ook de EGFP tag zou een aspecifiek resultaat kunnen opleveren waardoor ook dit werd bekeken. Drie herhalingen werden hier al voor uitgevoerd en leidde tot de conclusie dat dit geen significant resultaat had op het aantal vrijgestelde exosomen per cel (Figuur 11). Ook Nbs gericht tegen andere ABP’s werden getest. Zo werd het effect van GSN Nb11 nagegaan. Dit Nb verhindert de binding van GSN aan G-actine maar heeft geen effect op het knippen van F-actine [100]. Ook dit werd voorafgaand aan de thesis al driemaal getest. Er werd hier geen significant effect gezien en deze cellijn werd dan ook als negatieve controle meegenomen (Figuur 11). 35 Figuur 11: Nbs gericht tegen zowel het CRN NTA domein als het CRN SH3 domein leiden tot een significante vermindering van het aantal vrijgestelde exosomen per cel. Doxycycline, EGFP en de negatieve controle met een Nb gericht tegen GSN, hebben geen significant effect. Het verschil tussen de log-getransformeerde waarden voor vrijgestelde exosomen per cel van de + dox en van de - dox condities worden getoond voor de drie herhalingen (samen met de standaarddeviatie). * p<0,05; ** p<0,01. (De ruwe data zijn terug te vinden in Addendum Tabel 2.) Tijdens de thesis werd gestart met de derde herhaling om een aspecifiek effect door doxycycline op de parentale MDA cellen te kunnen uitsluiten. Samen met de twee voorafgaande herhalingen kon statistisch aangetoond worden dat doxycycline geen effect had op het aantal vrijgestelde exosomen per cel (Figuur 11). Er kon dus gesteld worden dat significante veranderingen in het aantal vrijgestelde exosomen per cel een gevolg zouden zijn van de verstoorde functies door het tot expressie gebrachte Nb. Vervolgens werden twee herhalingen met CRN NTA Nb2 uitgevoerd. Een significante vermindering in het aantal vrijgestelde exosomen werd vastgesteld. Dit geeft een indicatie dat het NTA domein een rol heeft in exosoomvorming en/of -secretie (Figuur 11). Daarna werd ook voor CRN SH3 Nb2 twee herhalingen uitgevoerd. Opnieuw werd een significante vermindering in het aantal vrijgestelde exosomen per cel waargenomen. Het SH3 domein schijnt dus ook een rol te spelen in exosoomvorming en/of -secretie (Figuur 11). Wanneer het NTA domein zijn functionaliteit verliest door expressie van CRN NTA Nb2, blijkt uit de resultaten dat de reductie van het aantal vrijgestelde exosomen per cel groter is dan wanneer het SH3 domein niet meer functioneel is door expressie van CRN SH3 Nb2. 36 3.1.1.2 Western blot ter detectie zuiverheid OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie Om na te gaan of de exosoombevattende fracties, verkregen na OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie, voldoende zuiver waren, werd een Western blot analyse uitgevoerd. Er werd nagegaan of er contaminerende celorganellen aanwezig waren. Hiervoor werd golgin 245 gebruikt als merker voor het Golgi-apparaat, calnexine als merker voor het endoplasmatisch reticulum (ER), cytochroom C als merker voor de mitochondriën en apoptotic blebs en PMP70 als merker voor peroxisomen. Als positieve controle werden gelyseerde parentale MDA cellen meegenomen. Figuur 12: Western blot analyse (a) om na te gaan in welke fracties de exosomen aanwezig zijn, met CD63 als merker, en (b) om na te gaan of er contaminerende celorganellen aanwezig zijn in de exosoombevattende fracties. Golgin 245 is een merker voor het Golgi-apparaat, calnexine een merker voor het endoplasmatisch reticulum (ER), cytochroom C een merker voor de mitochondriën en apoptotic blebs en PMP70 een merker voor peroxisomen. Gebruikte afkortingen: RE = ruw extract (gelyseerde parentale MDA cellen), MW = molecular weight. Figuur 12a toont aan dat exosomen aanwezig zijn in fracties vier t.e.m. acht. In Figuur 12b is geen signaal waar te nemen voor de merkers van de verschillende celorganellen in die fracties, terwijl wel een signaal te zien was voor de positieve controle. Dit duidt erop dat de exosoomfracties vrij zijn van contaminerende celorganellen en apoptotic blebs. 37 3.1.2 Exosoomsecretie na expressie neerregulatie cortactine met shRNA 3.1.2.1 Western blot na cotransfectie De shRNA-constructen, gericht tegen verschillende ABP’s (CRN, FSN, GSN), werden transiënt tot expressie gebracht in parentale MDA cellen. Met het respectievelijke shRNA, werd EGFP gecotransfecteerd om de transfectie-efficiëntie te kunnen nagaan. Zo konden de getransfecteerde cellen waargenomen worden via fluorescentiemicroscopie. Door de fluorescente cellen te vergelijken met het totaal aantal cellen, zichtbaar via fase-contrast microscopie, kon transfectie-efficiëntie geëvalueerd worden (Addendum Figuur 3). Er werden ook enkele controles meegenomen, namelijk niet-getransfecteerde MDA cellen (ruw extract), een enkele transfectie met EGFP, een enkele transfectie met het controle shRNA-construct en een cotransfectie met het controle shRNA-construct en EGFP. Algemeen kan gesteld worden dat de transfectie-efficiëntie laag lag, vooral wanneer een hogere celdensiteit waargenomen werd (Addendum Figuur 3). Het tweede en vijfde construct gericht tegen CRN, het vierde construct gericht tegen FSN, het vierde construct gericht tegen GSN en de controle cotransfectie vertoonden veel celsterfte (Addendum Figuur 3). Na eiwitconcentratie bepaling van de cellysaten werd dan ook vastgesteld dat deze slechts aan een hoeveelheid van 6 µg geladen konden worden op de polyacrylamidegel voor Western blot analyse. Wat ook opviel, is dat de efficiëntie heel wat hoger was bij de enkele transfectie met EGFP (Addendum Figuur 3). (b) (a) Figuur 13: Western blot analyse na cotransfectie met de shRNA-constructen en EGFP. (a) 20 µg cellysaat en (b) 6 µg cellysaat. Gebruikte afkortingen: MW = molecular weight. De cellen werden gelyseerd en geanalyseerd via Western blot. De intensiteit van de bandjes na transfectie werd hierbij vergeleken met de intensiteit van de bandjes in de controles (Figuur 13). Eerst en vooral valt op dat EGFP niet waargenomen werd na cotransfectie met een shRNA-construct. Enkele transfectie van EGFP resulteert wel in een duidelijk EGFPbandje wanneer 20 µg cellysaat geladen werd (Figuur 13a), maar niet wanneer 6 µg geladen werd (Figuur 13b). Bij een lading van 20 µg cellysaat, is geen verschil in intensiteit waar te 38 nemen tussen de verschillende bandjes en t.o.v. de controles (Figuur 13a). In het ruw extract echter zijn FSN en GSN amper waar te nemen. De lysaten van de cellen gecotransfecteerd met shRNA 2 en 5 gericht tegen CRN, met shRNA 4 gericht tegen FSN en met shRNA 4 gericht tegen GSN, dus diegene waarvan 6 µg geladen werd (Figuur 13b), vertonen allen een lagere intensiteit t.o.v. de controle. Ook voor de cotransfectie van het controle shRNA en EGFP is een lichtere intensiteit waar te nemen van de ABP-bandjes, vooral voor FSN en GSN (Figuur 13b). Bij de lage ladingshoeveelheid is het signaal voor FSN en GSN in het ruw extract opnieuw ondermaats. 3.1.2.2 Immunostaining na cotransfectie Wegens de lage transfectie-efficiëntie na cotransfectie, werd er gekeken naar de silencing in individuele cellen via immunostaining. Opnieuw werd er telkens gecotransfecteerd met EGFP om de getransfecteerde cellen te kunnen identificeren. De methanolfixatie die het antifascine antilichaam vereiste was niet geslaagd. Het anti-gelsoline antilichaam resulteerde in veel achtergrond en er werd geen reductie in GSN fluorescentie waargenomen ten gevolge van silencing in de getransfecteerde cellen. Deze resultaten werden daarom ook niet geïncludeerd. Figuur 14: MDA cellen gecotransfecteerd met EGFP en shRNA gericht tegen CRN. Voor één controle shRNA-construct en vijf verschillende shRNA-constructen gericht tegen CRN werd naar afname in CRN signaal gezocht. De resultaten voor CRN zijn weergegeven in Figuur 14. Transfectie met het controle shRNA resulteerde niet in een afname van het CRN signaal. Nog steeds waren perinucleaire zones van CRN dots te onderscheiden en werd een helder rode rand ter hoogte van het celmembraan gezien. Hierdoor kan ervan uitgegaan worden dat een afname van het CRN signaal ten gevolge van silencing is. Voor shRNA 1 gericht tegen CRN werd het duidelijkst een afname in CRN signaal waargenomen. Niet alleen ontbraken de perinucleaire zones en de helder rode rand, maar ook een algemene daling van de rode fluorescentie werd gedetecteerd. Ook bij transfectie met shRNA 3 en 4 waren de perinucleaire zones en de helder rode rand weinig tot niet aanwezig. De algemene daling van rode fluorescentie was hier echter niet terug te vinden. Transfectie met shRNA 2 en 5 resulteerde niet in een afname van het CRN signaal. Uit de immunostaining blijkt het eerste construct het meest efficiënt te zijn. Daarnaast kunnen het derde en vierde construct ook gebruikt worden om silencing te bewerkstelligen. 39 3.1.2.3 Western blot na enkele transfectie Doordat de enkele transfectie met EGFP in een hogere transfectie-efficiëntie resulteerde dan de cotransfectie, werd een tweede Western blot analyse uitgevoerd na een enkele transfectie met de verschillende shRNA’s. Ter controle werden niet-getransfecteerde MDA cellen (ruw extract) en cellen getransfecteerd met het controle shRNA meegenomen. Als interne controle werd ook actine gevisualiseerd in de cellysaten. Figuur 15: Western blot analyse na enkele transfectie met de shRNA-constructen. Gebruikte afkortingen: MW = molecular weight. In eerste instantie werd gekeken naar de resultaten na Western blot (Figuur 15). Het controle shRNA werd niet meegenomen als controle bij de blots voor de drie verschillende ABP’s omdat hiervan niet voldoende cellysaat verkregen werd. Daarom werd dit controle shRNA vergeleken t.o.v. het ruw extract voor het nagaan van een aspecifiek effect en werd het ruw extract meegenomen als controle bij de blots voor de drie verschillende ABP’s. Wanneer getransfecteerd werd met het controle shRNA (Figuur 15, links), werd gezien dat de bandjes algemeen een lagere intensiteit hadden t.o.v. het ruw extract. Er werd gekozen om voor kwantificatie de intensiteit van het ABP te vergelijken t.o.v. de intensiteit van actine binnen elk laantje (interne controle). Dezelfde verhouding van intensiteiten werd berekend in het ruw extract. De intensiteitsafname als gevolg van silencing kon dan berekend worden als de ratio van intensiteitsverhoudingen van enerzijds de getransfecteerde cellysaten en anderzijds het ruw extract (Tabel 2). Uit deze berekening werd vastgesteld dat er, naast een algemeen lagere intenstiteit, ook een aspecifieke intensiteitsafname is wanneer getransfecteerd werd met het controle shRNA. 40 Tabel 2: Kwantificatie intensiteit bandjes verkregen na Western blot. Per conditie werd de ABP intensiteit genormaliseerd t.o.v. de actine intensiteit. Intensiteitsafname werd vervolgens berekend door de ratio van de intensiteitsverhouding van enerzijds de getransfecteerde cellysaten en anderzijds het ruw extract te nemen. Lysis van CRN shRNA 2 en 5 getransfecteerde cellen resulteerde in een lage eiwitopbrengst. De hoeveelheid van het vijfde construct was zodanig laag dat hiervoor geen signaal werd waargenomen na Western blot. Aangezien bij de immunostaining hier geen silencing werd gezien, werd dit construct dan ook geëlimineerd. Voor het tweede construct werd de grootste intensiteitsafname waargenomen. Er dient opgemerkt te worden dat het ruw extract op diezelfde blot een algemeen lagere intensiteit had voor zowel CRN als actine. Deze resultaten werden daarom als minder betrouwbaar beschouwd. Opmerkelijk was dat er een intensiteitstoename geobserveerd werd voor CRN shRNA 3. Het eerste en vierde construct leidden tot een matige intensiteitsafname (Figuur 15, Tabel 2). Voor FSN werd vastgesteld via Western blot analyse en kwantificatie (Figuur 15, Tabel 2) dat alle constructen tot silencing leidden waarbij de intensiteitsafname het grootst was voor het tweede en vijfde construct. Voor GSN werd silencing gezien bij constructen één tot vier. Hiervan was de intensiteitsafname het grootst voor constructen één tot drie. Voor het vijfde shRNA werd een grote intensiteitstoename gezien na kwantificatie. Hiervoor werd echter een beduidend lagere intensiteit gezien voor actine, waardoor dit resultaat als niet betrouwbaar werd beschouwd (Figuur 15, Tabel 2). 41 3.2 Verband tussen invadopodia en exosomen 3.2.1 Nabijheid invadopodia en exosomen na immunostaining 3.2.1.1 Parentale MDA cellen Naast het verband tussen CRN en exosomen werd ook rechtstreeks naar het verband tussen invadopodia en exosomen gekeken. Eerst werd in parentale MDA cellen onderzocht of invadopodia en exosomen in elkaars nabijheid terug te vinden waren. Een immunostaining werd uitgevoerd met cellen, uitgezaaid op gelatinegecoate coverslips. Daarna vond kwantificatie plaats. Hiervoor werd m.b.v. ImageJ de zone afgebakend waarin de invadopodia, gemerkt met falloïdine, zich bevonden. Vervolgens werd het aantal CD63positieve exosomen in deze zone vergeleken met het totaal aantal CD63-positieve exosomen in de cel. Dit aantal werd genormaliseerd t.o.v. het oppervlak van de invadopodiazone en het totaal celoppervlak, respectievelijk. Er werden 100 cellen per conditie (- dox, + dox), gespreid over drie herhalingen, gekwantificeerd. Figuur 16: (a) Illustratie clustering CD63-positieve exosomen in de perinucleaire invadopodiazone (zichtbaar als falloïdine dots). (b) Kwantificatie aantal CD63-positieve exosomen per oppervlakte-eenheid overheen de volledige cel en in de perinucleaire invadopodiazone, respectievelijk. De densiteit van de CD63-positieve exosomen is significant hoger in de invadopodiazone. De genormaliseerde data worden weergegeven in een boxplot opgesteld volgens de methode van Tukey. *** p<0,0005. In de opnames, waarvan een cel weergegeven is in Figuur 16a, werd een clustering waargenomen van de CD63-positieve exosomen ter hoogte van de invadopodia. Deze invadopodia zijn te zien als falloïdine dots, geconcentreerd in een perinucleaire zone rond de kern. Aan de hand van de opnames werd een positief verband vermoed tussen deze exosomen en invadopodia. Dit vermoeden werd bevestigd door de kwantificatie, waarvan de data weergegeven worden in Figuur 16b. De exosoomdensiteit in de invadopodiazone was significant hoger dan deze in het totaal celoppervlak. 3.2.1.2 CRN Nb expressie In een volgende stap werd gewerkt met de stabiele CRN NTA Nb2-EFGP en CRN SH3 Nb2EFGP MDA cellen. Hiervoor werd eerder reeds aangetoond dat, bij expressie van het CRN NTA Nb2 of CRN SH3 Nb2, invadopodia niet ingeperkt bleven in een perinucleaire zone, maar zich uitspreidden over een groter oppervlak in de cel [ongepubliceerde resultaten], [78]. Er werd nagegaan of de CD63-positieve exosomen dezelfde spreiding ondergaan wanneer Nb geëxpresseerd wordt, m.a.w. of het CD63 signaal het Nb signaal ‘volgt’. Hiervoor werd het spreidingsoppervlak van zowel invadopodia, gemerkt met falloïdine, als van CD63positieve exosomen bepaald en genormaliseerd t.o.v. het totaal celoppervlak. Dit werd bepaald voor cellen die het respectievelijke Nb niet tot expressie brachten (- dox) en voor de cellen die dit wel tot expressie brachten (+ dox). Bijkomend werd onderzocht of de CD63positieve exosomen zich blijvend in de nabijheid van de invadopodia bevonden. Dit werd op dezelfde manier gekwantificeerd als beschreven voor de parentale MDA cellen. 42 Figuur 17: Illustratie van de spreiding van zowel invadopodia (zichtbaar als falloïdine dots) als CD63positieve exosomen wanneer (a) het CRN NTA Nb2 of (b) het CRN SH3 Nb2 tot expressie wordt gebracht door toevoeging van doxycycline (+ dox, onder) vergeleken met niet-expresserende cellen (- dox, boven). Figuur 18: (a) Kwantificatie spreidingsoppervlak invadopodia (links) en CD63-positieve exosomen (rechts). Beide zijn significant groter bij expressie van CRN NTA Nb2 of CRN SH3 Nb2 (+ dox) vergeleken met niet-expresserende cellen (- dox). (b) Toenamefactor spreidingsoppervlak invadopodia en CD63positieve exosomen, respectievelijk. Bij CRN NTA Nb2 expressie is de toename van het spreidingsoppervlak voor invadopodia en CD63-positieve exosomen vergelijkbaar. Bij CRN SH3 Nb2 expressie verschillen deze significant van elkaar. De genormaliseerde data worden weergegeven in een boxplot opgesteld volgens de methode van Tukey. *** p<0,0005. De kwantificatie bevestigde de eerder aangetoonde spreiding van invadopodia, te zien als falloïdine dots, bij expressie van CRN NTA Nb2 of CRN SH3 Nb2, respectievelijk (Figuur 18a). Dit wordt ook geïllustreerd a.d.h.v. de opname in Figuur 17. Wanneer diezelfde kwantificatie uitgevoerd werd voor de CD63 dots, werd opnieuw een grotere spreiding vastgesteld. Dit is terug te zien in de opname, weergegeven in Figuur 17. Vervolgens werd de vraag gesteld of deze toename voor beide spreidingsoppervlakken gelijkaardig was. De toenamefactor werd berekend door de verhouding van de genormaliseerde waarden van de + dox t.o.v. de – dox conditie te berekenen (Figuur 18b). Voor CRN NTA Nb2 werd vastgesteld dat het spreidingsoppervlak van CD63-positieve exosomen een gelijkaardige 43 toename kent als het spreidingsoppervlak van de invadopodia. Voor CRN SH3 Nb2 bleek dit niet het geval te zijn. De toename van het spreidingsoppervlak voor de CD63-positieve exosomen was significant lager dan deze voor de invadopodia. Dit wil zeggen dat het spreidingsoppervlak van de CD63-positieve exosomen kleiner was bij Nb expressie of groter was zonder Nb expressie vergeleken met het invadopodia spreidingsoppervlak onder dezelfde condities. Uit Figuur 18a kan afgeleid worden dat dit eerder te wijten is aan een kleiner spreidingsoppervlak van de CD63-positieve exosomen met Nb expressie. Statistische verificatie bevestigde dit. Een p-waarde >0,05 duidde op een niet-significant verschil tussen de spreidingsoppervlaktes van invadopodia en CD63-positieve exosomen bij nietexpresserende cellen. Een p-waarde <0,0005 gaf aan dat het spreidingsoppervlak van de CD63-positieve exosomen significant kleiner is dan het invadopodia spreidingsoppervlak bij expressie van CRN SH3 Nb2. Figuur 19: Kwantificatie aantal CD63-positieve exosomen per oppervlakte-eenheid overheen de volledige cel en in de perinucleaire invadopodiazone, respectievelijk. (a) – dox en (b) + dox. De densiteit van de CD63-positieve exosomen is significant hoger in de invadopodiazone voor zowel CRN NTA Nb2 (boven) als CRN SH3 Nb2 (onder) en dit zowel (a) zonder als (b) met toevoeging van dox. De genormaliseerde data worden weergegeven in een boxplot opgesteld volgens de methode van Tukey. *** p<0,0005. In een volgende stap werd gekeken of invadopodia en CD63-positieve exosomen nog steeds in elkaars nabijheid terug te vinden waren voor de CRN NTA Nb2 en CRN SH3 Nb2 cellen. Zowel voor de – dox als voor de + dox reeks van beide cellijnen werd gezien in de opnames (Figuur 17) dat de CD63 dots terug te vinden waren in de nabijheid van de falloïdine dots. Dit werd geverifieerd door eenzelfde kwantificatie uit te voeren zoals voor de parentale MDA cellen. Deze kwantificatie (Figuur 19) geeft aan dat CD63-positieve exosomen steeds in de nabijheid van de invadopodia terug te vinden zijn, ook bij expressie van de Nbs. Het positieve verband tussen beide blijft dus behouden. 44 3.2.2 MT1-MMP, invadopodia en exosomen 3.2.2.1 Nabijheid MT1-MMP, invadopodia en exosomen In kader van het onderzoek naar de functie van exosomen in verband met invadopodia werd dieper ingegaan op het protease MT1-MMP en zijn aanwezigheid in exosomen. Een immunostaining werd uitgevoerd met cellen, uitgezaaid op gelatinegecoate coverslips, om de lokalisatie van MT1-MMP t.o.v. CD63-positieve exosomen na te gaan binnen de cel. Daarnaast werd de lokalisatie van MT1-MMP t.o.v. invadopodia nagegaan. Twee merkers, meer bepaald falloïdine en cortactine, werden hiervoor gebruikt. Figuur 20: (a) Immunostaining ter detectie lokalisatie MT1-MMP t.o.v. invadopodia. Twee invadopodiamerkers, meer bepaald falloïdine (boven) en cortactine (onder), werden gebruikt. (b) Immunostaining ter detectie lokalisatie MT1-MMP t.o.v. CD63-positieve exosomen. Bij de immunostaining met de invadopodiamerkers, respectievelijk falloïdine en CRN, werd duidelijk waargenomen dat MT1-MMP zich in de buurt van de invadopodia bevindt. Dit is te zien in Figuur 20a. Beide invadopodiamerkers vertonen eenzelfde patroon (en colokaliseren, zie Addendum Figuur 4) en MT1-MMP vertoont eenzelfde lokalisatie rond beide merkers. Figuur 20b geeft de immunostaining weer waarbij de CD63-positieve exosomen getoond worden samen met MT1-MMP. Hier is een gelijkaardig patroon te zien als voor de invadopodia in Figuur 20a. In beide gevallen kon vaak ook effectieve colokalisatie, te zien als gele dots, waargenomen worden. Enkele colokalisaties worden aangeduid in Figuur 20 (witte pijlen). Doordat de groene dots intenser van kleur zijn, was dit niet altijd even goed waarneembaar. Bovendien zijn de groene dots dikker waardoor een gele dot vaak omgeven wordt door een groene kleur en bijgevolg moeilijker te onderscheiden is. 45 3.2.2.2 Degradatie assay De functionaliteit van exosomen werd op een tweede manier benaderd door opgezuiverde exosomen aan te brengen op een fluorescente matrix. Degradatie ten gevolge van de aangebrachte exosomen kon via verminderde fluorescentie waargenomen en gekwantificeerd worden. Per conditie (zonder en met exosomen) werden zes herhalingen meegenomen. Per herhaling werden tien willekeurige opnames gemaakt en voor elke herhaling werd het gedegradeerd oppervlak overheen de tien opnames bepaald in ImageJ. Figuur 21: (a) Illustratie degradatie fluorescente matrix ten gevolge van exosomen. (b) Kwantificatie gedegradeerd oppervlak. Er was een significante toename in gedegradeerd oppervlak nadat exosomen werden aangebracht. Het totaal gemeten gedegradeerd oppervlak per herhaling wordt weergegeven (samen met de standaarddeviatie). * p<0,05. De kwantificatie, weergegeven in Figuur 21, toonde aan dat er significant meer matrixdegradatie plaatsvond bij het toevoegen van exosomen, wat impliceert dat exosomen proteasen aanbrengen. Er dient opgemerkt te worden dat ook degradatie waar te nemen was wanneer geen exosomen werden toegevoegd. FBS, aanwezig in het medium waarmee quenching gebeurde, kan ook exosomen bevatten, wat een mogelijke verklaring zou kunnen zijn. Er werd toch met dit medium gewerkt i.p.v. serumvrij medium omdat dit tot een stabielere en meer egale matrix leidde. 3.2.3 Controles 3.2.3.1 Andere merkers Ter controle werden ook andere merkers gebruikt om deze voorgaande patronen na te gaan. Voorafgaand aan de thesis werd zo CRN als alternatieve merker getest voor invadopodia (Addendum Figuur 4). Andere merkers voor exosomen die getest werden, zijn CD9 en TSG101. Door problemen met de antilichamen in de immunostaining werden hiervoor echter geen resultaten verkregen. 3.2.3.2 CD63 en het Golgi-apparaat Een controle werd uitgevoerd waarbij nagegaan werd of het anti-CD63 antilichaam niet aspecifiek met het Golgi-apparaat interageerde, gezien het perinucleaire CD63 patroon doet denken aan het Golgi-apparaat dat zich ook ter hoogte van de kern bevindt. 46 Figuur 22: Immunostaining ter controle colokalisatie CD63 en het Golgi-apparaat. De resulterende beelden na immunostaining, waarvan een opname wordt getoond in Figuur 22, tonen aan dat het CD63 signaal terug te vinden is in de nabijheid van het Golgi-apparaat. Een echte colokalisatie, te zien als gele dots, werd minder waargenomen. Overheen de verschillende cellen werd meestal een grotere zone voor het CD63 signaal dan voor het Golgi-apparaat geobserveerd. 3.2.3.3 Immunostaining met secundair antilichaam In een laatste controle werd een immunostaining uitgevoerd waarbij enkel het secundaire anti-muis antilichaam werd gebruikt om aspecifieke binding van dit antilichaam te kunnen excluderen. Figuur 23: Immunostaining ter controle aspecifieke binding van het secundaire anti-muis antilichaam. Voor zowel het anti-muis antilichaam gelinkt aan een groene fluorofoor (488 nm), als gelinkt aan een rode fluorofoor (594 nm), resulteerde de immunostaining in opnames met een aanzienlijk achtergrondsignaal. Een aanrijking werd waargenomen in de cel t.o.v. de extracellulaire omgeving. In een ring rondom de kern werd een bijkomende aanrijking geobserveerd t.o.v. de rest van de cel. Dit alles is te zien in Figuur 23. 3.2.4 Invadopodiavorming op polystyreen Aangezien de cellen voor OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie opgegroeid werden in T175 celcultuurflessen die uit polystyreen bestaan, werd nagegaan of hierop weldegelijk invadopodia gevormd worden. Dit werd getest bij de drie gebruikte cellijnen en met drie verschillende merkers voor invadopodia, namelijk falloïdine, CRN en Tks5. Figuur 24: Falloïdine staining van parentale MDA cellen ter detectie invadopodiavorming op polystyreen. Figuur 24 toont aan dat de parentale MDA cellen invadopodia vormen. Karakteristieke falloïdine dots, aangeduid met de witte pijl, werden geobserveerd. 47 Figuur 25: Immunostaining met twee verschillende merkers voor invadopodia van (a) CRN NTA Nb2-EGFP MDA cellen (- dox) en (b) CRN SH3 Nb2-EGFP MDA cellen (- dox) ter detectie invadopodiavorming op polystyreen. 48 Figuur 25 toont de cellen waaraan geen doxycycline werd toegevoegd en die bijgevolg geen Nb tot expressie brengen. Deze kunnen als equivalent van de parentale MDA cellen beschouwd worden. Hier werd ook invadopodiavorming waargenomen. Vooral bij de immunostaining met anti-cortactine zijn opnieuw karakteristieke dots, aangeduid met de witte pijlen, waar te nemen. Het anti-Tks5 antilichaam gaf een minder goed resultaat. Voor CRN SH3 Nb2 konden wel nog enigzins invadopodia dots onderscheiden worden (Figuur 25b), maar deze zijn niet terug te vinden voor CRN NTA Nb2 (Figuur 25a). Aangezien met anticortactine wel invadopodia werden waargenomen en ook voor CRN SH3 Nb2 de dots minder duidelijk waren met anti-Tks5, kan gesteld worden dat het gebrek aan waarneembare dots te wijten is aan het anti-Tks5 antilichaam en niet aan het afwezig zijn van invadopodia. Figuur 26: Immunostaining van (a) CRN NTA Nb2-EGFP MDA cellen (+ dox) en (b) CRN SH3 Nb2 EGFP MDA-cellen (+ dox) ter detectie invadopodiavorming op polystyreen. In een laatste stap werden de Nb-expresserende cellen bekeken en werd gecontroleerd op invadopodiavorming. Figuur 26 toont aan dat bij de Nb-expresserende cellen CRN dots kunnen worden geobserveerd (witte pijlen). Invadopodiavorming werd zo ook bevestigd voor de Nb-expresserende cellen. Opnames met anti-Tks5 zijn hier niet weergegeven omdat hierop geen duidelijke dots terug te vinden waren. Voor de reeks zonder doxycycline werd al aangehaald dat dit antilichaam minder goede resultaten gaf. Een andere verklaring zou kunnen zijn dat het fluorofoor gekoppeld aan het secundaire anti-konijn antilichaam gevoeliger is aan photobleaching dan het fluorofoor gekoppeld aan het secundaire anti-muis antilichaam. Al de cellen voor deze immunostaining bevonden zich namelijk in dezelfde 24-well plaat en de opnames werden het eerst uitgevoerd voor CRN SH3 Nb2 zonder toevoeging van doxycycline, waarvoor de beste opnames verkregen werden. 49 4 Discussie 4.1 Verband tussen cortactine en exosomen 4.1.1 Exosoomsecretie na inhibitie cortactine met nanobodies In de literatuur werd een verband gesuggereerd tussen het actinecytoskelet en exosomen [101]. Zo werd door Hoshino et al. een mogelijk verband voorgesteld tussen invadopodia en exosomen (sectie 1.3.3.5). CRN speelt een essentiële rol in de vorming en functie van deze invadopodia. Uit de resultaten van de OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie (Figuur 11) blijkt interferentie met de functionaliteit van CRN via Nbs te leiden tot een daling van het aantal vrijgestelde exosomen. Voor de Nbs die hier werden gebruikt, werd de invloed op invadopodiavorming en –functie eerder al aangetoond. De expressie van CRN NTA Nb2 in MDA cellen resulteert in een afname van Arp2/3-gemedieerde actinepolymerisatie maar dit zonder de interactie tussen Arp2/3 en CRN te beïnvloeden. Een verstoring in de vorming van invadopodia, namelijk een toenemend spreidingsoppervlak van de invadopodia, werd waargenomen. Daarnaast werden ook effecten op invadopodiamaturatie waargenomen, namelijk reductie in matrixdegradatie en een verstoorde invasie [ongepubliceerde resultaten]. Afname van actinepolymerisatie resulteerde echter niet in een daling van het aantal gevormde invadopodia. Effecten bekomen met CRN NTA Nb2 zijn gelijkaardig aan degene bekomen met CK666, een Arp2/3 inhibitor [ongepubliceerde resultaten]. Arp2/3 inhibitie door CK666 wordt bewerkstelligd door het behoud van Arp2/3 in een geïnactiveerde conformatie [102]. Als dit Nb dus op eenzelfde manier werkt, zullen precursoren van invadopodia zich wel nog kunnen vormen maar zal geen maturatie plaatsvinden. Bij telling van invadopodia werd geen onderscheid gemaakt tussen precursoren en gematureerde invadopodia waardoor een daling van gematureerde invadopodia (door inhibitie van actinepolymerisatie) niet kon waargenomen worden. Aangezien weldegelijk een verstoring in invadopodiavorming waargenomen werd (in termen van spreidingsoppervlak), duidt dit er misschien op dat er wel een daling in gematureerde invadopodia plaatsvond maar gemist werd. Indien dit het geval is, kan dit verklaren waarom een daling waargenomen werd in het aantal vrijgestelde exosomen na expressie van CRN NTA Nb2. Exosomen bevatten namelijk MT1-MMP (Addendum Figuur 5b) en matrixdegradatie wordt enkel waargenomen bij mature invadopodia [65]. CRN SH3 Nb2 zal specifiek de rekrutering van WIP inhiberen. Dit zorgt voor een verstoring in de vorming van invadopodia. Minder invadopodia worden gevormd en ook hier is een toenemend spreidingsoppervlak van de invadopodia aangetoond. Daarnaast zorgt het Nb voor een daling van MMP9 secretie, gereduceerde matrixdegradatie en verstoorde invasie [77]. De waargenomen daling van gevormde invadopodia zou ook hier kunnen verklaren waarom minder exosomen vrijgesteld werden, in dit geval na CRN SH3 Nb2 expressie. Dat verstoring van invadopodiavorming leidt tot een daling in het aantal vrijgestelde exosomen, stemt overeen met de bevindingen van Hoshino et al. (sectie 1.3.3.5). Door uitschakeling van Tks5 met shRNA of uitschakeling van N-WASP met een inhibitor, toonden ze aan dat zowel het aantal invadopodia als het aantal vrijgestelde exosomen daalde [91]. Hetzelfde werd hier bewerkstelligd door uitschakeling van bepaalde domeinen van CRN met Nbs. Nbs leveren zo een alternatieve manier om functies van eiwitten, of beter, van hun functionele domeinen te bestuderen. Een grotere daling in vrijgestelde exosomen werd gezien bij expressie van CRN NTA Nb2 dan bij expressie van CRN SH3 Nb2. Op basis van het expressieniveau en de affiniteit van beide Nbs werd dit niet meteen verwacht. CRN SH3 Nb2 vertoont namelijk een hoger 50 expressieniveau dan CRN NTA Nb2 [ongepubliceerde resultaten]. In eerste instantie zou dus verwacht kunnen worden dat dit resulteert in een groter effect. Ook de affiniteit van CRN SH3 Nb2 (Kd = 74,6 nM) is hoger dan deze van CRN NTA Nb2 (Kd = 2,85 µM) [78], [ongepubliceerde resultaten]. Opnieuw zou dit tot de verwachting leiden dat CRN SH3 Nb2 een hoger effect uitoefent. Dat de grotere daling in exosoomvrijstelling geobserveerd werd voor CRN NTA Nb2 dient dus een gevolg te zijn van zijn functionaliteit, of eerder het inhiberen van de functionaliteit van het overeenkomstige CRN domein. CRN NTA Nb2 inhibeert rechtstreeks de actinepolymerisatie [ongepubliceerde resultaten]. CRN SH3 Nb2 inhibeert WIP rekrutering [78] en WIP reguleert Arp2/3 activatie via CRN [56]. CRN kan echter als dusdanig Arp2/3 activeren. WIP dient hierbij als een extra regulator die deze activatie verhoogt [56]. CRN NTA Nb2 zou op deze manier directer ingrijpen op het Arp2/3 activatieproces dan CRN SH3 Nb2. Dit zou een mogelijke verklaring kunnen zijn voor het observeren van de grotere daling in exosoomvrijstelling bij expressie van CRN NTA Nb2. Er dient opgemerkt te worden dat de NanoSight partikels meet en geen effectieve exosomen. Er wordt hier toch over exosomen gesproken omdat eerder werd aangetoond dat opzuivering via OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie tot een hoge zuiverheidsgraad leidt [103]. Tijdens de thesis werd ook nagegaan voor een willekeurig opgezuiverde reeks of er contaminerende celorganellen terug te vinden waren in de exosoombevattende fracties (Figuur 12). Dit was niet het geval. Bovendien stemt de grootte, bepaald via NTA, overeen met de grootte van exosomen (Addendum Figuur 2). Er moet hierbij vermeld worden dat de NanoSight de grootte van partikels licht overschat. Indien er toch nog contaminatie zou zijn van andere partikels, kan verondersteld worden dat de fout door deze contaminerende partikels even groot zal zijn voor alle metingen. Voor alle opzuiveringen werden namelijk exact dezelfde handelingen uitgevoerd. Bovendien werden – dox en + dox condities telkens parallel aan elkaar uitgevoerd. Om na te gaan in welke fracties de exosomen aanwezig zijn, werd enkel de merker CD63 gebruikt. Toch wordt veralgemeend gesproken over exosomen i.p.v. CD63-positieve exosomen. Eerder werd namelijk aangetoond dat deze fracties overeenkomen met CD9-positieve en TSG101-positieve fracties (Addendum Figuur 6). Ook mede door deze overlapping kan met meer zekerheid gesteld worden dat het bij de partikels, gemeten via NTA, exosomen betreft. Bij het bestuderen van invadopodia wordt vaak gebruikgemaakt van een coating, bijvoorbeeld bestaande uit gelatine (sectie 2.2.3). De vraag werd gesteld of invadopodiavorming ook plaatsvond op polystyreen aangezien de cellen voor OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie opgegroeid werden in T175 celcultuurflessen, bestaande uit polystyreen. Indien dit niet het geval zou zijn, zou de exosoomdaling namelijk een gevolg zijn van CRN effect, onafhankelijk van zijn functie in invadopodia. De verschillende cellijnen werden getest op invadopodiavorming op polystyreen en dit met verschillende merkers (falloïdine, CRN en Tks5). Er kon invadopodiavorming waargenomen worden (Figuur 24, Figuur 25, Figuur 26). Samen met het eerder aangetoonde effect van de gebruikte Nbs op invadopodiavorming en –functionaliteit en het reeds gesuggereerde verband tussen invadopodia en exosomen door Hoshino et al. [91], kan met meer zekerheid gesteld worden dat de waargenomen daling in exosoomvrijstelling mogelijk gelinkt is aan de verstoring van invadopodiavorming. Een functie voor CRN binnen exosoomsecretie, onafhankelijk van invadopodia, is echter niet uitgesloten. 51 4.1.2 Exosoomsecretie na expressie neerregulatie cortactine met shRNA De resultaten die verkregen werden met behulp van de CRN Nbs, zullen worden vergeleken met effecten bekomen na RNAi. Eerder werd reeds aangetoond dat een proteïne domein knock out via Nbs tot andere uitkomsten kan leiden dan via RNAi en deze technieken op die manier complementair aan elkaar zijn [99]. Voor het shRNA experiment waren vijf verschillende shRNA-constructen gericht tegen CRN ter beschikking. Initieel werd een transfectie uitgevoerd om transiënte expressie te verkrijgen en op die manier het meest efficiënte shRNA-construct te selecteren. Dit construct zal later via transductie binnengebracht worden in parentale MDA cellen om een stabiele cellijn te verkrijgen. OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie experimenten kunnen daarna uitgevoerd worden om de effecten van de shRNA’s op exosoomvrijstelling na te gaan. Naast de shRNAconstructen gericht tegen CRN, waren ook vijf verschillende shRNA’s gericht tegen FSN en GSN beschikbaar. Ook hiervan werd het meest efficiënte construct geselecteerd. Bij de Western blot analyse na cotransfectie (Figuur 13) werd geen verschil in intensiteit gezien tussen de verschillende ABP-bandjes met een lading van 20 µg cellysaat. Er werd echter geen EGFP signaal gedetecteerd voor deze cellysaten. Dit duidt erop dat onvoldoende cellen getransfecteerd werden. Dit bevestigt wat eerder gezien werd via fasecontrast fluorescentiemicroscopie. Het gebrek aan intensiteitsverschillen is dus geen indicatie dat de shRNA’s niet tot RNAi leidden. Aangezien het EGFP signaal wel te zien was bij de enkele transfectie met EGFP, lijkt dit dus efficiënter te gebeuren. Opnieuw bevestigt dit wat werd waargenomen met de fase-contrast fluorescentiemicroscoop. Wanneer slechts 6 µg cellysaat geladen werd, is EGFP dan weer niet waar te nemen bij de enkele transfectie. Deze hoeveelheid cellysaat schijnt dus te laag te zijn om EGFP te detecteren, aangezien hetzelfde cellysaat als voor de lading van 20 µg werd gebruikt. Bij een lading van 6 µg werden wel intensiteitsverschillen waargenomen t.o.v. de controles. Door de aangetoonde lage transfectie-efficiëntie kan hier echter niet met zekerheid gesteld worden dat dit ten gevolge van RNAi is. Deze transfectie-efficiëntie kan niet nagegaan worden bij de blots aangezien ook hier het EGFP signaal niet waar te nemen is. Dit kan zijn door de lage ladingshoeveelheid zoals gesteld bij enkele transfectie met EGFP. Gezien de lage transfectie-efficiëntie en het ontbreken van het EGFP signaal bij de hogere ladingshoeveelheid na cotransfectie, is het meer waarschijnlijk dat het EGFP signaal ook door deze lage transfectie-efficiëntie niet aanwezig is. T.o.v. het ruw extract kon hier niet vergeleken worden door het slechte signaal voor FSN en GSN in dit lysaat. Er werd hiervoor een ouder staal gebruikt wat een mogelijke oorzaak zou kunnen zijn. Uit de Western blot analyse na enkele transfectie (Figuur 15, Tabel 2) blijkt het tweede construct gericht tegen CRN het meest effectief te zijn, maar deze resultaten werden als minder betrouwbaar beschouwd wegens de algemeen afgenomen intensiteit van het ruw extract waartegen vergeleken werd. Bij de immunostaining (Figuur 14) resulteerde transfectie met dit construct ook niet in silencing. Bij het derde construct waren de resultaten evenwel niet conform de immunostaining. Een intensiteitstoename werd waargenomen terwijl de immunostaining aantoonde dat dit construct leidde tot silencing. Dit kan te wijten zijn aan een slechte transfectie-efficiëntie waardoor silencing niet waar te nemen is via Western blot analyse. Het eerste en vierde construct leidden wel tot een intensiteitsafname ten gevolge van silencing, wat conform de resultaten na immunostaining is. Voor het eerste construct werd echter een grotere afname in intensiteit verwacht aangezien dit construct het grootste effect had bij immunostaining. Ook hier dient opgemerkt te worden dat een lage 52 transfectie-efficiëntie de oorzaak kan zijn van een minder tot niet zichtbare silencing na Western blot. Uit deze resultaten werd beslist shRNA 1 en 4 te gebruiken om verder mee te gaan. Voor FSN werd shRNA 2 en 5 geselecteerd op basis van de laatste Western blot analyse en bijhorende kwantificatie (Figuur 15, Tabel 2). De shRNA’s 2 en 3 werden gekozen voor GSN. Uit de vergelijking van de immunostaining en de laatste Western blot analyse voor de shRNA constructen gericht tegen CRN blijkt dat potentieel goede contructen gemist kunnen worden wanneer voortgegaan wordt op deze laatste Western blot analyse. Voor FSN was verificatie via immunostaining echter niet mogelijk door problemen met de methanolfixatie. Bij GSN was deze verificatie niet mogelijk door de grote mate van achtergrond bij immunostaining. Meer correct zou zijn dat de intensiteitsverhoudingen van het ABP t.o.v. actine vergeleken wordt met deze verhouding voor het controle shRNA-construct i.p.v. het ruw extract bij Western blot analyse na enkele transfectie (Figuur 15, Tabel 2). Dit cellysaat heeft namelijk exact dezelfde handelingen ondergaan als de lysaten afkomstig van de cellen, getransfecteerd met een shRNA gericht tegen de respectievelijke ABP’s. Zoals reeds werd vermeld, was het hier echter niet mogelijk om het lysaat, afkomstig van de cellen getransfecteerd met het controle shRNA, op elke blot mee te nemen door de beperkte hoeveelheid van dit cellysaat. De controle dient op dezelfde blot geladen te worden aangezien tussen verschillende blots variaties kunnen optreden. Uit de laatste Western blot schijnt er een aspecifiek effect te zijn door het transfectieprotocol. Dit dient in rekening gebracht te worden wanneer de verschillende shRNA-constructen geanalyseerd worden. Daar er ook een intensiteitsafname van de interne controle actine te zien was voor het controle shRNA, kan de betrouwbaarheid hiervan in twijfel getrokken worden. De interne controle dient namelijk dezelfde intensiteit te vertonen voor alle lanen binnen dezelfde blot. 53 4.2 Verband tussen invadopodia en exosomen In eerste instantie werd een mogelijk verband tussen CRN en exosomen onderzocht. Een verband tussen invadopodia en exosomen kon hieruit reeds vermoed worden (sectie 4.1.1). In een volgende stap werd dit verband meer rechtstreeks benaderd. Er werd hierbij van start gegaan met het onderzoeken van de nabijheid van invadopodia en exosomen binnen de cel. Bij de parentale MDA cellen werd aangetoond dat CD63-positieve exosomen zich concentreerden rond de invadopodia (Figuur 16). De CRN NTA Nb2 en CRN SH3 Nb2 cellen waar geen doxycycline werd toegevoegd, kunnen als equivalenten van de parentale MDA cellen beschouwd worden. Hier werd de clustering van de CD63-positieve exosomen in de invadopodiazone bevestigd (Figuur 17, Figuur 19a). Voorafgaand aan de thesis werd in cellen die geen invadopodia vormen, gezien dat het CD63 signaal veel homogener verspreid was overheen de cel. Een clustering was er niet waar te nemen en dient zo als extra verificatie (Addendum Figuur 7). Wanneer de CRN Nbs tot expressie werden gebracht, toonden de invadopodia een significante toename in hun spreidingsoppervlak, wat eerdere resultaten bevestigde (Figuur 17, Figuur 18a). Interessant hier was dat ook de spreiding van de CD63-positieve exosomen significant toenam en dat deze nog steeds rond de invadopodia terug te vinden waren (Figuur 17, Figuur 18a, Figuur 19b). Hoshino et al. suggereerden reeds dat invadopodia docking faciliteren van exosoombevattende MVE’s. Deze hypothese wordt via de verkregen resultaten bevestigd. Over hoe invadopodia voor gefaciliteerde docking zorgen, is nog niet veel geweten. Er is reeds vastgesteld dat Rab11, Rab35 en/of Rab27 betrokken zijn bij docking van exosoombevattende MVE’s (sectie 1.2.4). Voor gepolariseerde docking ter hoogte van invadopodia werd gesuggereerd dat dit door interactie van fosfoinositiden en Rab27a bewerkstelligd zou worden [91], [101]. Als gevolg van CRN NTA Nb2 expressie werden heel wat minder exosomen gesecreteerd, wat mogelijks een gevolg is van het kleiner aantal gematureerde invadopodia die gevormd werden (sectie 4.1.1). Door een aanhoudend verband tussen invadopodia en CD63-positieve exosomen na CRN NTA Nb2 expressie, schijnt de vorming van precursoren voldoende voor docking van exosoombevattende MVE’s ter hoogte van invadopodia. Er dient opgemerkt te worden dat de oppervlaktetoename van CD63-positieve exosomen na CRN SH3 Nb2 expressie minder groot was dan de oppervlaktetoename van invadopodia (Figuur 18b). Interferentie met de functionaliteit van het CRN SH3 domein schijnt dus wel ergens een effect te hebben op docking. Om duidelijkheid te scheppen, wordt even stilgestaan bij de gebruikte benamingen in voorgaande alinea. In tegenstelling tot sectie 4.1.1 wordt hier niet gesproken over exosomen maar over CD63-positieve exosomen. De kwantificaties, hier besproken, werden namelijk enkel met de exosoommerker CD63 uitgevoerd en konden niet geverifieerd worden met andere exosoommerkers, wegens problemen met de antilichamen. Als invadopodiamerker werd, naast falloïdine, reeds CRN als alternatieve invadopodiamerker gebruikt (Addendum Figuur 4). Daarbij kon clustering van het CD63 signaal ter hoogte van de invadopodia bevestigd worden. Aangezien de exosomen nog niet gesecreteerd zijn, en zich bijgevolg nog in het MVE bevinden, wordt in context van docking gesproken over de exosoombevattende MVE’s. Het zijn namelijk niet de exosomen maar de MVE’s die docking ondergaan. 54 Niet alleen een mogelijke link tussen invadopodia en exosomen, maar ook de functie van deze exosomen in context van invadopodia werd onderzocht. Hoshino et al. suggereerden dat exosomen MT1-MMP bevatten en dat dit bijdraagt tot invadopodiamaturatie en ECM degradatie (sectie 1.3.3.5). Bovendien werd in het verleden reeds aangetoond dat exosomen actief MT1-MMP bevatten in hun membraan en dat dit degradatie van de ECM kan bewerkstelligen [104]. Dit werd geverifieerd voor de exosoomfracties, opgezuiverd m.b.v. OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie. Voorafgaand aan de thesis werd een Western blot analyse uitgevoerd met deze exosoomfracties. Hiermee werd nagegaan of ook deze fracties actief MT1-MMP bevatten, wat het geval was (Addendum Figuur 5). Hierop verdergaand, werd een immunostaining uitgevoerd om te onderzoeken of MT1-MMP terug te vinden was rond invadopodia enerzijds en in CD63-positieve exosomen anderzijds (Figuur 20). Voor twee invadopodiamerkers, falloïdine en CRN, kon vastgesteld worden dat MT1-MMP met invadopodia colokaliseerde. Ook voor CD63-positieve exosomen kon colokalisatie waargenomen worden, al was dat niet altijd het geval. Niet alle CD63-positieve exosomen lijken dus MT1-MMP te bevatten. Er moet hier opnieuw vermeld worden dat het eigenlijk exosoombevattende MVE’s betreft. Binnen eenzelfde cel kunnen verschillende MVE subpopulaties voorkomen [7] dus het lijkt acceptabel dat niet alle MVE’s ook positief zijn voor MT1-MMP. Aangezien het hier eigenlijk om MVE’s gaat, dient opgemerkt te worden dat er reeds een andere route beschreven werd voor de rekrutering van MT1-MMP naar invadopodia waarin MVE’s betrokken zijn. In sectie 1.3.3.4 werd beschreven dat interactie tussen het exocyst complex en WASH leidt tot een connectie tussen het MVE en het plasmamembraan ter hoogte van invadopodia. WASH, een Arp2/3 activator, is aanwezig op het membraan van MVE’s en zou instaan voor reorganisatie van het actinecytoskelet, nodig voor het vormen van een tubulaire verbinding van het MVE met het plasmamembraan. Fine tuning van deze reorganisatie zou via interactie met het exocyst complex gebeuren [86]. In context van het afscheiden van vesikels van endosomen werd gezien dat WASH instond voor rekrutering van CRN [105]. Ook bij het onderzoeken van exosoomsecretie, werden connecties gemaakt tussen het actinecytoskelet en de rekrutering van MVE’s naar het plasmamembraan [101]. Hoe al deze zaken in één geheel samen passen, is echter nog niet duidelijk, maar dat er een effect schijnt te zijn van CRN SH3 Nb2 expressie op docking van exosoombevattende MVE’s ter hoogte van invadopodia lijkt te kloppen in deze reeks van waarnemingen. Daartegenover staat dat geen interferentie met docking geobserveerd werd na expressie van CRN NTA Nb2, het spreidingsoppervlak van CD63-positieve exosomen significant toenam en een hogere exosoomdensiteit in de invadopodiazone t.o.v. het totaal celoppervlak aangehouden werd. Dit effect op docking lijkt hierdoor minder waarschijnlijk en de oorzaak lijkt dus eerder ergens anders gezocht te moeten worden. Bij het aanleveren van MT1-MMP via de connectie tussen MVE’s en het plasmamembraan m.b.v. WASH en het exocyst complex wordt MT1-MMP niet vrijgesteld in exosomen maar komt dit terecht in het plasmamembraan van de invadopodia. Om te staven dat MT1-MMP aanwezig in exosomen ook bijdragen aan matrixdegradatie, werden opgezuiverde exosomen toegevoegd aan een fluorescente matrix (Figuur 21). Een significante toename in matrixdegradatie werd waargenomen. Er werd getracht de exosomen te visualeren ter hoogte van deze degradatieoppervlaktes. Bij een gelijkaardig experiment waar MV’s op een fluorescente matrix gebracht werden, bleven deze gebonden aan de matrix via aanwezigheid van integrinen in hun membraan [106]. Ook exosomen bevatten integrinen, naast andere 55 adhesiemoleculen (sectie 1.2.1). De resultaten (niet weergegeven) toonden echter geen signaal voor de gebruikte exosoommerker CD63, wat erop duidde dat exosomen niet gebonden bleven aan de matrix maar werden weggewassen tijdens het staining protocol. De vraag werd gesteld of de antilichamen die gebruikt werden in voorgaande experimenten, meer bepaald anti-MT1-MMP en anti-CD63, niet aspecifiek reageerden met het Golgiapparaat. Het CD63 patroon situeert zich perinucleair, wat doet denken aan de lokalisatie van het Golgi-apparaat. Voor het anti-MT1-MMP antilichaam werd dit niet nagegaan omdat eerder reeds aangetoond werd dat dit antilichaam colokaliseerde met degradatie spots [ongepubliceerde resultaten]. Aangezien invadopodia gelokaliseerd zijn rond het Golgiapparaat [107], werd verwacht dat er een positieve relatie zou zijn tussen de lokalisatie van het Golgi-apparaat en CD63. Bovendien treedt er uitwisseling op tussen het MVE en het Golgi-apparaat [9] en gebeurt er tetraspaninemodificatie in het Golgi-apparaat [108]. Het CD63 signaal werd dan ook steeds in de buurt van het Golgi-apparaat waargenomen na immunostaining (Figuur 22). Door later aangetoond te hebben dat CD63-positieve exosomen mee spreiding ondergaan met de invadopodia na expressie van de respectievelijke CRN Nbs, werd deze controle echter overbodig. Een controle met enkel het secundaire antilichaam toonde aan dat ook dit antilichaam niet aspecifiek interageerde. Deze staining vraagt een veel grotere belichtingstijd voor visualisatie en bovendien situeert het patroon zich als een volledige ringstructuur rondom de kern, in tegenstelling tot een staining waar het CD63 en secundair antilichaam gebruikt werden. 5 Algemene conclusie Uit de resultaten verkregen met OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie na expressie van de respectievelijke CRN Nbs, blijkt dat CRN een rol speelt in de exosomale pathway. Ter bevestiging van deze experimenten, zullen ze herhaald worden met gebruik van shRNA gericht tegen CRN, waarvoor gepaste constructen reeds geselecteerd werden. CRN heeft een centrale rol in de vorming en functie van invadopodia. Dit en bijkomende aanwijzingen doen vermoeden dat de waargenomen daling in vrijgestelde exosomen na CRN Nb expressie gelinkt is aan interferentie met invadopodiavorming. Bijkomende aanwijzingen zijn dat een effect van de CRN Nbs op invadopodia reeds werd aangetoond. Ook kon de link tussen exosomen en invadopodia niet uitgesloten worden aangezien invadopodia zich vormden op polystyreen, voorafgaand aan OptiPrep densiteitsgradiënt ultracentrifugatie. Bovendien werd een significant verband vastgesteld tussen de lokalisatie van invadopodia en exosoombevattende MVE’s. Daarnaast werd een mogelijk verband tussen invadopodia en exosomen reeds gesuggereerd door Hoshino et al.. Nbs leverden een alternatieve manier om het vermoeden van dit verband te versterken. Ook een mogelijke functie werd door Hoshino et al. toegeschreven aan exosomen. Exosomen bevatten MT1-MMP wat zou bijdragen aan invadopodiamaturatie en ECM degradatie. Hier werd het vermoeden van deze functionaliteit evenwel versterkt. 56 6 Ideeën voor verder onderzoek Ondanks de verschillende aanwijzingen kan niet met zekerheid gesteld worden dat de daling in het aantal vrijgestelde exosomen na expressie van de respectievelijke CRN Nbs geen gevolg is van een CRN effect, onafhankelijk van invadopodia. MCF-7 cellen zijn humane borstkankercellen, zoals ook MDA-MB-231 cellen. In tegenstelling tot laatsvernoemde zijn ze niet invasief en vormen ze geen invadopodia. Indien na het uitvoeren van eenzelfde reeks OptiPrep densiteitgradiënt ultracentrifugatie experimenten ook een daling in vrijgestelde exosomen waargenomen zou worden, zou dit erop duiden dat CRN ook op andere momenten tijdens de exosomale pathway een rol speelt. Indien dit niet het geval zou zijn, zou met meer zekerheid gesteld kunnen worden dat de daling in (gematureerde) invadopodia de oorzaak is van de exosoomdaling. Er werd eerder aangetoond dat CRN in de context van invadopodia niet enkel belangrijk was in de vorming van invadopodia maar ook in zijn functionaliteit, onder andere rekrutering van MT1-MMP [63]. In de literatuur is aangetoond dat CRN helpt bij vesikelafscheiding van het late endosoom wat een mogelijke pathway kan zijn voor de rekrutering van MT1-MMP [105], [109]. Dit geeft drie routes van MT1-MMP rekrutering via MVE’s. De eerste route stelt voor dat zich tubulaire extensies vormen die MVE’s connecteren met invadopodia m.b.v. interactie tussen WASH en het exocyst complex. De tweede suggereert dat exosomen vrijgesteld worden in het extracellulair milieu en zo bijdragen tot matrixdegradatie. Een derde en laatste mechanisme zou, zoals voorgaande beschrijving, plaatsvinden via CRN. Hoe wordt beslist op welke manier geëndocyteerd MT1-MMP getarget wordt naar invadopodia? Komen deze mechanismen samen voor of sluit de ene de andere uit? Behoren deze routes eigenlijk tot één en dezelfde pathway? Vele vragen dienen hierrond nog opgelost te worden. Het is nog niet duidelijk hoe docking van het MVE ter hoogte van invadopodia gebeurt. RAB GTPasen (RAB11, RAB35, RAB27) werden reeds gerapporteerd bij MVE docking (sectie 1.2.4). Een voorstel werd gedaan voor een rol van het actinecytoskelet waarbij actomyosine contractiliteit ervoor zou zorgen dat het MVE naar het plasmamembraan getrokken wordt [101]. Voor de rekrutering van MVE’s naar de invadopodia werd gesuggereerd dat een interactie tussen fosfoinositiden en RAB27a hiervoor zorgde [91], [101]. Uit de verkregen resultaten blijkt Arp2/3-gemedieerde actinepolymerisatie, geactiveerd door CRN, geen rol te hebben in docking. Over de bijdrage van WIP rekrutering door CRN is er geen eenduidigheid. Het is dus nog een groot vraagteken hoe de lokalisatie van MVE’s aan invadopodia in zijn werk gaat. Indien verdergegaan wordt op de hypothese dat precursorvorming voldoende is voor docking, maar Arp2/3-gemedieerde actinepolymerisatie door moet kunnen gaan voor de vrijstelling van exosomen, hoe gaat dit dat dan in zijn werk? SNARE’s, waaronder VAMP7, werden reeds vermeld bij de fusie van MVE’s en het plasmamembraan (sectie 1.2.4). Hoe zijn Arp2/3-gemedieerde actinepolymerisatie en VAMP7 aan elkaar gelinkt in de secretie van exosomen? Of betreft het hier twee aparte routes? Bij de interconnectie tussen exosomen en invadopodia blijven nog heel wat vragen onbeantwoord en valt er nog heel wat te ontdekken. 57 Referenties [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] WHO, “Global status report on noncommunicable diseases 2014,” 2014. “Wat is kanker? | Stichting tegen Kanker.” [Online]. Beschikbaar via: http://www.kanker.be/alles-over-kanker/wat-kanker. [Geraadpleegd: 21-Nov-2015]. “IARC MonographsClassifications.” [Online]. Beschikbaar via: http://monographs.iarc.fr/ENG/Classification/. [Geraadpleegd: 21-Nov-2015]. D. Hanahan and R. A. Weinberg, “The Hallmarks of Cancer,” Cell, vol. 100, no. 1, pp. 57–70, 2000. D. Hanahan and R. A. Weinberg, “Hallmarks of cancer: the next generation.,” Cell, vol. 144, no. 5, pp. 646–74, 2011. B. György, T. G. Szabó, M. Pásztói, Z. Pál, P. Misják, B. Aradi, V. László, É. Pállinger, E. Pap, Á. Kittel, G. Nagy, A. Falus, and E. I. Buzás, “Membrane vesicles, current state-of-the-art: Emerging role of extracellular vesicles,” Cell. Mol. Life Sci., vol. 68, no. 16, pp. 2667–2688, 2011. M. Colombo, G. Raposo, and C. Théry, “Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles,” Annu. Rev. Cell Dev. Biol, vol. 30, pp. 255–289, 2014. G. J. Doherty and H. T. McMahon, “Mechanisms of endocytosis.,” Annu. Rev. Biochem., vol. 78, pp. 857–902, 2009. J. Huotari and A. Helenius, “Endosome maturation.,” EMBO J., vol. 30, no. 17, pp. 3481–3500, 2011. M. Jovic, M. Sharma, J. Rahajeng, and S. Caplan, “The early endosome: A busy sorting station for proteins at the crossroads,” Histol. Histopathol., vol. 25, no. 1, pp. 99–112, 2010. J. H. Hurley and P. I. Hanson, “Membrane budding and scission by the ESCRT machinery: it’s all in the neck,” Nat. Rev. Mol. cell Biol., vol. 11, no. 8, pp. 556–566, 2010. C. Bissig and J. Gruenberg, “ALIX and the multivesicular endosome: ALIX in Wonderland,” Trends Cell Biol., vol. 24, no. 1, pp. 19–25, 2014. J. H. Hurley, “ESCRTs are everywhere.,” EMBO J., vol. 34, no. 19, pp. 2398–2407, 2015. J. R. Mayers, I. Fyfe, A. L. Schuh, E. R. Chapman, J. M. Edwardson, and A. Audhya, “ESCRT-0 assembles as a heterotetrameric complex on membranes and binds multiple ubiquitinylated cargoes simultaneously,” J. Biol. Chem., vol. 286, no. 11, pp. 9636–9645, 2011. C. Raiborg, K. G. Bache, D. J. Gillooly, I. H. Madshus, E. Stang, and H. Stenmark, “Hrs sorts ubiquitinated proteins into clathrin-coated microdomains of early endosomes,” Nat. Cell Biol., vol. 4, no. 5, pp. 394–398, 2002. M. Agromayor and J. Martin-Serrano, “Interaction of AMSH with ESCRT-III and deubiquitination of endosomal cargo,” J. Biol. Chem., vol. 281, no. 32, pp. 23083– 23091, 2006. N. Ali, L. Zhang, S. Taylor, A. Mironov, S. Urbé, and P. Woodman, “Recruitment of UBPY and ESCRT exchange drive hd-ptp-dependent sorting of egfr to the mvb,” Curr. Biol., vol. 23, no. 6, pp. 453–461, 2013. Q. Lu, L. W. Hope, M. Brasch, C. Reinhard, and S. N. Cohen, “TSG101 interaction with HRS mediates endosomal trafficking and receptor down-regulation.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 100, no. 13, pp. 7626–7631, 2003. M. S. Kostelansky, C. Schluter, Y. Y. C. Tam, S. Lee, R. Ghirlando, B. Beach, E. Conibear, and J. H. Hurley, “Molecular Architecture and Functional Model of the Complete Yeast ESCRT-I Heterotetramer,” Cell, vol. 129, no. 3, pp. 485–498, 2007. J. McCullough, L. A. Colf, and W. I. Sundquist, “Membrane Fission Reactions of the Mammalian ESCRT Pathway,” Annu. Rev. Biochem, vol. 82, no. 9, pp. 663–692, 2013. 58 [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] Y. J. Im and J. H. Hurley, “Integrated Structural Model and Membrane Targeting Mechanism of the Human ESCRT-II Complex,” Dev. Cell, vol. 14, no. 6, pp. 902–913, 2008. T. Wollert and J. H. Hurley, “Molecular mechanism of multivesicular body biogenesis by ESCRT complexes,” Nature, vol. 464, no. 7290, pp. 864–869, 2010. H. Teo, D. J. Gill, J. Sun, O. Perisic, D. B. Veprintsev, Y. Vallis, S. D. Emr, and R. L. Williams, “ESCRT-I Core and ESCRT-II GLUE Domain Structures Reveal Role for GLUE in Linking to ESCRT-I and Membranes,” Cell, vol. 125, no. 1, pp. 99–111, 2006. E. Boura, B. Rozycki, H. S. Chung, D. Z. Herrick, B. Canagarajah, D. S. Cafiso, W. a Eaton, G. Hummer, and J. H. Hurley, “Solution structure of the ESCRT-I and -II supercomplex: implications for membrane budding and scission.,” Structure, vol. 20, no. 5, pp. 874–886, 2012. M. Babst, D. J. Katzmann, E. J. Estepa-Sabal, T. Meerloo, and S. D. Emr, “ESCRT-III: An Endosome-Associated Heterooligomeric Protein Complex Required for MVB Sorting,” Dev. Cell, vol. 3, pp. 271–281, 2002. H. Teo, O. Perisic, B. González, and R. L. Williams, “ESCRT-II, an endosomeassociated complex required for protein sorting: Crystal structure and interactions with ESCRT-III and membranes,” Dev. Cell, vol. 7, pp. 559–569, 2004. D. Teis, S. Saksena, and S. D. Emr, “Ordered Assembly of the ESCRT-III Complex on Endosomes Is Required to Sequester Cargo during MVB Formation,” Dev. Cell, vol. 15, no. 4, pp. 578–589, 2008. T. Wollert, C. Wunder, J. Lippincott-schwartz, and H. James, “Membrane Scission by the ESCRT-III Complex,” Nature, vol. 458, no. 7235, pp. 172–177, 2009. S. Saksena, J. Wahlman, D. Teis, A. E. Johnson, and S. D. Emr, “Functional Reconstitution of ESCRT-III Assembly and Disassembly,” Cell, vol. 136, no. 1, pp. 97– 109, 2009. N. Luhtala and G. Odorizzi, “Bro1 coordinates deubiquitination in the multivesicular body pathway by recruiting Doa4 to endosomes,” J. Cell Biol., vol. 166, no. 5, pp. 717– 729, 2004. G. Odorizzi, D. J. Katzmann, M. Babst, A. Audhya, and S. D. Emr, “Bro1 is an endosome-associated protein that functions in the MVB pathway in Saccharomyces cerevisiae.,” J. Cell Sci., vol. 116, pp. 1893–1903, 2003. M. R. Dores, B. Chen, H. Lin, U. J. K. Soh, M. M. Paing, W. a. Montagne, T. Meerloo, and J. Trejo, “ALIX binds a YPX 3L motif of the GPCR PAR1 and mediates ubiquitinindependent ESCRT-III/MVB sorting,” J. Cell Biol., vol. 197, pp. 407–419, 2012. M. Colombo, C. Moita, G. van Niel, J. Kowal, J. Vigneron, P. Benaroch, N. Manel, L. F. Moita, C. Théry, and G. Raposo, “Analysis of ESCRT functions in exosome biogenesis, composition and secretion highlights the heterogeneity of extracellular vesicles.,” J. Cell Sci., vol. 126, no. 24, pp. 5553–5565, 2013. M. F. Baietti, Z. Zhang, E. Mortier, A. Melchior, G. Degeest, A. Geeraerts, Y. Ivarsson, F. Depoortere, C. Coomans, E. Vermeiren, P. Zimmermann, and G. David, “Syndecan–syntenin–ALIX regulates the biogenesis of exosomes,” Nat. Cell Biol., vol. 14, no. 7, pp. 677–685, 2012. K. Trajkovic, C. Hsu, S. Chiantia, L. Rajendran, D. Wenzel, F. Wieland, P. Schwille, B. Brügger, and M. Simons, “Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endosomes.,” Science, vol. 319, pp. 1244–1247, 2008. R. Ghossoub, F. Lembo, A. Rubio, C. B. Gaillard, J. Bouchet, N. Vitale, J. Slavík, M. Machala, and P. Zimmermann, “Syntenin-ALIX exosome biogenesis and budding into multivesicular bodies are controlled by ARF6 and PLD2,” Nat. Commun., vol. 5, 2014. G. van Niel, S. Charrin, S. Simoes, M. Romao, L. Rochin, P. Saftig, M. S. Marks, E. Rubinstein, and G. Raposo, “The Tetraspanin CD63 Regulates ESCRT-Independent and -Dependent Endosomal Sorting during Melanogenesis,” Dev. Cell, vol. 21, pp. 708–721, 2011. 59 [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] A. Chairoungdua, D. L. Smith, P. Pochard, M. Hull, and M. J. Caplan, “Exosome release of β-catenin: A novel mechanism that antagonizes Wnt signaling,” J. Cell Biol., vol. 190, no. 6, pp. 1079–1091, 2010. I. Nazarenko, S. Rana, A. Baumann, J. McAlear, A. Hellwig, M. Trendelenburg, G. Lochnit, K. T. Preissner, and M. Zöller, “Cell surface tetraspanin Tspan8 contributes to molecular pathways of exosome-induced endothelial cell activation,” Cancer Res., vol. 70, no. 4, pp. 1668–1678, 2010. D. Perez-Hernandez, C. Gutiérrez-Vázquez, I. Jorge, S. López-Martín, A. Ursa, F. Sánchez-Madrid, J. Vázquez, and M. Yañez-Mó, “The intracellular interactome of tetraspanin-enriched microdomains reveals their function as sorting machineries toward exosomes,” J. Biol. Chem., vol. 288, no. 17, pp. 11649–11661, 2013. M. Babst, “MVB vesicle formation: ESCRT-dependent, ESCRT-independent and everything in between,” Curr. Opin. Cell Biol., vol. 23, no. 4, pp. 452–457, 2011. J. Kowal, M. Tkach, and C. Théry, “Biogenesis and secretion of exosomes,” Curr. Opin. Cell Biol., vol. 29, no. 1, pp. 116–125, 2014. A. Savina, M. Vidal, and M. I. Colombo, “The exosome pathway in K562 cells is regulated by Rab11.,” J. Cell Sci., vol. 115, no. 12, pp. 2505–2515, 2002. C. Hsu, Y. Morohashi, S. I. Yoshimura, N. Manrique-Hoyos, S. Jung, M. A. Lauterbach, M. Bakhti, M. Gronborg, W. Möbius, J. Rhee, F. A. Barr, and M. Simons, “Regulation of exosome secretion by Rab35 and its GTPase-activating proteins TBC1D10A-C,” J. Cell Biol., vol. 189, no. 2, pp. 223–232, 2010. M. Ostrowski, N. B. Carmo, S. Krumeich, I. Fanget, G. Raposo, A. Savina, C. F. Moita, K. Schauer, A. N. Hume, R. P. Freitas, B. Goud, P. Benaroch, N. Hacohen, M. Fukuda, C. Desnos, M. C. Seabra, F. Darchen, S. Amigorena, L. F. Moita, and C. Thery, “Rab27a and Rab27b control different steps of the exosome secretion pathway.,” Nat. Cell Biol., vol. 12, no. 1, pp. 19–30, 2010. C. M. Fader, D. G. Sánchez, M. B. Mestre, and M. I. Colombo, “TI-VAMP/VAMP7 and VAMP3/cellubrevin: two v-SNARE proteins involved in specific steps of the autophagy/multivesicular body pathways,” Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res., vol. 1793, no. 12, pp. 1901–1916, 2009. J. C. Gross, V. Chaudhary, K. Bartscherer, and M. Boutros, “Active Wnt proteins are secreted on exosomes,” Nat. Cell Biol., vol. 14, no. 10, pp. 1036–1045, 2012. N. Kosaka, Y. Yoshioka, N. Tominaga, K. Hagiwara, T. Katsuda, and T. Ochiya, “Dark side of the exosome: the role of the exosome in cancer metastasis and targeting the exosome as a strategy for cancer therapy.,” Futur. Oncol., vol. 10, no. 4, pp. 671–81, 2014. E. Nogales, “Structural Insights Into Microtubule Function,” Annu. Rev. Biochem, vol. 69, pp. 277–302, 2001. H. Herrmann, H. Bär, L. Kreplak, S. V. Strelkov, and U. Aebi, “Intermediate filaments: from cell architecture to nanomechanics,” Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 8, no. 7, pp. 562–573, 2007. R. Dominguez and K. C. Holmes, “Actin Structure and Function,” Annu Rev Biophys., vol. 40, no. 3, pp. 169–186, 2011. E. S. Chhabra and H. N. Higgs, “The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.,” Nat. Cell Biol., vol. 9, no. 10, pp. 1110–1121, 2007. S. J. Winder, “Actin-binding proteins,” J. Cell Sci., vol. 118, no. 4, pp. 651–654, 2005. D. A. Murphy and S. A. Courtneidge, “The ‘ins’ and ‘outs’ of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function,” Nat. Rev. Mol. Cell Biol., vol. 12, no. 7, pp. 413–426, 2011. K. C. Kirkbride, B. H. Sung, S. Sinha, and A. M. Weaver, “Cortactin: A multifunctional regulator of cellular invasiveness,” Cell Adhes. Migr., vol. 5, no. 2, pp. 187–198, 2011. A. W. Kinley, S. A. Weed, A. M. Weaver, A. V. Karginov, E. Bissonette, J. A. Cooper, and J. T. Parsons, “Cortactin Interacts with WIP in Regulating Arp2/3 Activation and Membrane Protrusion,” Curr. Biol., vol. 13, pp. 384–393, 2003. 60 [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] J. R. Kowalski, C. Egile, S. Gil, S. B. Snapper, R. Li, and S. M. Thomas, “Cortactin regulates cell migration through activation of N-WASP.,” J. Cell Sci., vol. 118, pp. 79– 87, 2005. H. Yamaguchi, “Pathological roles of invadopodia in cancer invasion and metastasis,” Eur. J. Cell Biol., vol. 91, pp. 902–907, 2012. M. A. Eckert, T. M. Lwin, A. T. Chang, J. K. Kim, E. Danis, L. Ohno-Machado, and J. Yang, “Twist1-Induced Invadopodia Formation Promotes Tumor Metastasis,” Cancer Cell, vol. 19, pp. 372–386, 2011. J. Pignatelli, D. a. Tumbarello, R. P. Schmidt, and C. E. Turner, “Hic-5 promotes invadopodia formation and invasion during TGF- -induced epithelial-mesenchymal transition,” J. Cell Biol., vol. 197, no. 3, pp. 421–437, 2012. D. Arsenault, K. Brochu-Gaudreau, M. Charbonneau, and C. M. Dubois, “HDAC6 Deacetylase Activity Is Required for Hypoxia-Induced Invadopodia Formation and Cell Invasion,” PLoS One, vol. 8, no. 2, pp. 1-13, 2013. B. Díaz, A. Yuen, S. Iizuka, S. Higashiyama, and S. a. Courtneidge, “Notch increases the shedding of HB-EGF by ADAM12 to potentiate invadopodia formation in hypoxia,” J. Cell Biol., vol. 201, no. 2, pp. 279–292, 2013. E. S. Clark, a. S. Whigham, W. G. Yarbrough, and a. M. Weaver, “Cortactin Is an Essential Regulator of Matrix Metalloproteinase Secretion and Extracellular Matrix Degradation in Invadopodia,” Cancer Res., vol. 67, no. 9, pp. 4227–4235, 2007. Z. N. Zhou, V. P. Sharma, B. T. Beaty, M. Roh-Johnson, E. a Peterson, N. Van Rooijen, P. a Kenny, H. S. Wiley, J. S. Condeelis, and J. E. Segall, “Autocrine HBEGF expression promotes breast cancer intravasation, metastasis and macrophageindependent invasion in vivo.,” Oncogene, vol. 33, no. 29, pp. 3784–93, 2014. B. T. Beaty and J. Condeelis, “Digging a little deeper: The stages of invadopodium formation and maturation,” Eur. J. Cell Biol., vol. 93, pp. 438–444, 2014. V. P. Sharma, R. Eddy, D. Entenberg, M. Kai, F. B. Gertler, and J. Condeelis, “Tks5 and SHIP2 regulate invadopodium maturation, but not initiation, in breast carcinoma cells,” Curr. Biol., vol. 23, no. 21, pp. 2079–2089, 2013. D. F. Seals, E. F. Azucena, I. Pass, L. Tesfay, R. Gordon, M. Woodrow, J. H. Resau, and S. a. Courtneidge, “The adaptor protein Tks5/Fish is required for podosome formation and function, and for the protease-driven invasion of cancer cells,” Cancer Cell, vol. 7, no. 2, pp. 155–165, 2005. C. L. Abram, D. F. Seals, I. Pass, D. Salinsky, L. Maurer, T. M. Roth, and S. a. Courtneidge, “The Adaptor Protein Fish Associates with Members of the ADAMs Family and Localizes to Podosomes of Src-transformed Cells,” J. Biol. Chem., vol. 278, no. 19, pp. 16844–16851, 2003. H. Yamaguchi, S. Yoshida, E. Muroi, N. Yoshida, M. Kawamura, Z. Kouchi, Y. Nakamura, R. Sakai, and K. Fukami, “Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110α regulates invadopodia formation,” J. Cell Biol., vol. 193, no. 7, pp. 1275–1288, 2011. A. Jacob and R. Prekeris, “The regulation of MMP targeting to invadopodia during cancer metastasis.,” Front. cell Dev. Biol., vol. 3, pp. 1-9, 2015. B. T. Beaty, V. P. Sharma, J. J. Bravo-Cordero, M. a Simpson, R. J. Eddy, A. J. Koleske, and J. Condeelis, “β1 integrin regulates Arg to promote invadopodial maturation and matrix degradation.,” Mol. Biol. Cell, vol. 24, no. 11, pp. 1661–1675, 2013. M. Oser, C. C. Mader, H. Gil-Henn, M. Magalhaes, J. J. Bravo-Cordero, A. J. Koleske, and J. Condeelis, “Specific tyrosine phosphorylation sites on cortactin regulate Nck1dependent actin polymerization in invadopodia.,” J. Cell Sci., vol. 123, no. 21, pp. 3662–3673, 2010. M. Oser, H. Yamaguchi, C. C. Mader, J. J. Bravo-Cordero, M. Arias, X. Chen, V. Desmarais, J. van Rheenen, A. J. Koleske, and J. Condeelis, “Cortactin regulates cofilin and N-WASp activities to control the stages of invadopodium assembly and maturation.,” J. Cell Biol., vol. 186, no. 4, pp. 571–587, 2009. 61 [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] B. T. Beaty, Y. Wang, J. J. Bravo-Cordero, V. P. Sharma, V. Miskolci, L. Hodgson, and J. Condeelis, “Talin regulates moesin-NHE-1 recruitment to invadopodia and promotes mammary tumor metastasis,” J. Cell Biol., vol. 205, no. 5, pp. 737–751, 2014. J. J. Bravo-Cordero, M. Oser, X. Chen, R. Eddy, L. Hodgons, and J. Condeelis, “A Novel Spatiotemporal RhoC Activation Pathway Locally Regulates Cofilin Activity at Invadopodia,” Curr. Biol., vol. 21, no. 8, pp. 635–644, 2011. F. Lizárraga, R. Poincloux, M. Romão, G. Montagnac, G. Le Dez, I. Bonne, G. Rigaill, G. Raposo, and P. Chavrier, “Diaphanous-related formins are required for invadopodia formation and invasion of breast tumor cells,” Cancer Res., vol. 69, no. 7, pp. 2792– 2800, 2009. A. Li, J. C. Dawson, M. Forero-Vargas, H. J. Spence, X. Yu, I. König, K. Anderson, and L. M. Machesky, “The Actin-Bundling Protein Fascin Stabilizes Actin in Invadopodia and Potentiates Protrusive Invasion,” Curr. Biol., vol. 20, no. 4, pp. 339– 345, 2010. I. Van Audenhove, C. Boucherie, L. Pieters, O. Zwaenepoel, B. Vanloo, E. Martens, C. Verbrugge, G. Hassanzadeh-Ghassabeh, J. Vandekerckhove, M. Cornelissen, A. De Ganck, and J. Gettemans, “Stratifying fascin and cortactin function in invadopodium formation using inhibitory nanobodies and targeted subcellular delocalization,” FASEB J., vol. 28, no. 4, pp. 1805–1818, 2014. U. Philippar, E. T. Roussos, M. Oser, H. Yamaguchi, H.-D. Kim, S. Giampieri, Y. Wang, S. Goswami, J. B. Wyckoff, D. A. Lauffenburger, E. Sahai, J. S. Condeelis, and F. B. Gertler, “A Mena invasion isoform potentiates EGF-induced carcinoma cell invasion and metastasis.,” Dev. Cell, vol. 15, no. 6, pp. 813–828, Dec. 2008. M. Schoumacher, R. D. Goldman, D. Louvard, and D. M. Vignjevic, “Actin, microtubules, and vimentin intermediate filaments cooperate for elongation of invadopodia,” J. Cell Biol., vol. 189, no. 3, pp. 541–556, 2010. R. Poincloux, F. Lizárraga, and P. Chavrier, “Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia.,” J. Cell Sci., vol. 122, no. 17, pp. 3015–3024, 2009. H. Paz, N. Pathak, and J. Yang, “Invading one step at a time: the role of invadopodia in tumor metastasis,” Oncogene, vol. 33, no. 33, pp. 4193–4202, 2014. E. I. Deryugina, B. Ratnikov, E. Monosov, T. I. Postnova, R. DiScipio, J. W. Smith, and a Y. Strongin, “MT1-MMP initiates activation of pro-MMP-2 and integrin alphavbeta3 promotes maturation of MMP-2 in breast carcinoma cells.,” Exp. Cell Res., vol. 263, no. 2, pp. 209–223, 2001. M. Toth, I. Chvyrkova, M. M. Bernardo, S. Hernandez-Barrantes, and R. Fridman, “Pro-MMP-9 activation by the MT1-MMP/MMP-2 axis and MMP-3: Role of TIMP-2 and plasma membranes,” Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 308, no. 2, pp. 386–395, 2003. M. Sakurai-Yageta, C. Recchi, G. Le Dez, J. B. Sibarita, L. Daviet, J. Camonis, C. D’Souza-Schorey, and P. Chavrier, “The interaction of IQGAP1 with the exocyst complex is required for tumor cell invasion downstream of Cdc42 and RhoA,” J. Cell Biol., vol. 181, no. 6, pp. 985–998, 2008. P. Monteiro, C. Rosse, a. Castro-Castro, M. Irondelle, E. Lagoutte, P. Paul-Gilloteaux, C. Desnos, E. Formstecher, F. Darchen, D. Perrais, a. Gautreau, M. Hertzog, and P. Chavrier, “Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia,” J. Cell Biol., vol. 203, no. 6, pp. 1063–1079, 2013. A. Steffen, G. Le Dez, R. Poincloux, C. Recchi, P. Nassoy, K. Rottner, T. Galli, and P. Chavrier, “MT1-MMP-Dependent Invasion Is Regulated by TI-VAMP/VAMP7,” Curr. Biol., vol. 18, no. 12, pp. 926–931, 2008. J. Hu, A. Mukhopadhyay, P. Truesdell, H. Chander, U. K. Mukhopadhyay, A. S. Mak, and A. W. B. Craig, “Cdc42-interacting protein 4 is a Src substrate that regulates invadopodia and invasiveness of breast tumors by promoting MT1-MMP endocytosis.,” J. Cell Sci., vol. 124, no. 10, pp. 1739–1751, 2011. 62 [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102] [103] [104] B. G. Gálvez, S. Matías-Román, M. Yáñez-Mó, F. Sánchez-Madrid, and A. G. Arroyo, “ECM regulates MT1-MMP localization with β1 or αvβ3 integrins at distinct cell compartments modulating its internalization and activity on human endothelial cells,” J. Cell Biol., vol. 159, no. 3, pp. 509–521, 2002. J. J. Bravo-Cordero, R. Marrero-Diaz, D. Megías, L. Genís, A. García-Grande, M. a García, A. G. Arroyo, and M. C. Montoya, “MT1-MMP proinvasive activity is regulated by a novel Rab8-dependent exocytic pathway.,” EMBO J., vol. 26, no. 6, pp. 1499– 1510, 2007. D. Hoshino, K. C. Kirkbride, K. Costello, E. S. Clark, S. Sinha, N. Grega-Larson, M. J. Tyska, and A. M. Weaver, “Exosome secretion is enhanced by invadopodia and drives invasive behavior,” Cell Rep., vol. 5, no. 5, pp. 1159–1168, 2013. “Wat zijn Nanobodies.” [Online]. Beschikbaar via: http://ablynx.com/technologyinnovation/understanding-nanobodies/. [Geraadpleegd: 13-Dec-2015]. S. Muyldermans, “Nanobodies: natural single-domain antibodies.,” Annu. Rev. Biochem., vol. 82, pp. 775–797, 2013. Ablynx, “Corporate presentation.” 2015. L. I. Ibañez, M. De Filette, A. Hultberg, T. Verrips, N. Temperton, R. A. Weiss, W. Vandevelde, B. Schepens, P. Vanlandschoot, and X. Saelens, “Nanobodies with in vitro neutralizing activity protect mice against H5N1 influenza virus infection,” J. Infect. Dis., vol. 203, no. 8, pp. 1063–1072, 2011. W. Van Overbeke, A. Verhelle, I. Everaert, O. Zwaenepoel, J. Vandekerckhove, C. Cuvelier, W. Derave, and J. Gettemans, “Chaperone Nanobodies Protect Gelsolin Against MT1-MMP Degradation and Alleviate Amyloid Burden in the Gelsolin Amyloidosis Mouse Model,” Mol. Ther., vol. 22, no. 10, pp. 1768–1778, 2014. J. B. Holz, “The TITAN trial - Assessing the efficacy and safety of an anti-von Willebrand factor Nanobody in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura,” Transfus. Apher. Sci., vol. 46, no. 3, pp. 343–346, 2012. A. Broisat, S. Hernot, J. Toczek, J. De Vos, L. M. Riou, S. Martin, M. Ahmadi, N. Thielens, U. Wernery, V. Caveliers, S. Muyldermans, T. Lahoutte, D. Fagret, C. Ghezzi, and N. Devoogdt, “Nanobodies targeting mouse/human VCAM1 for the nuclear imaging of atherosclerotic lesions.,” Circ. Res., vol. 110, no. 7, pp. 927–937, 2012. V. Delanote, B. Vanloo, M. Catillon, E. Friederich, J. Vandekerckhove, and J. Gettemans, “An alpaca single-domain antibody blocks filopodia formation by obstructing L-plastin-mediated F-actin bundling.,” FASEB J., vol. 24, no. 1, pp. 105– 118, 2010. A. Van Den Abbeele, S. De Clercq, A. De Ganck, V. De Corte, B. Van Loo, S. H. Soror, V. Srinivasan, J. Steyaert, J. Vandekerckhove, and J. Gettemans, “A llamaderived gelsolin single-domain antibody blocks gelsolin-G-actin interaction,” Cell. Mol. Life Sci., vol. 67, no. 9, pp. 1519–1535, 2010. M. Mittelbrunn, M. Vicente-Manzanares, and F. Sánchez-Madrid, “Organizing Polarized Delivery of Exosomes at Synapses,” Traffic, vol. 16, no. 4, pp. 327–337, 2015. B. Hetrick, M. S. Han, L. A. Helgeson, and B. J. Nolen, “Small molecules CK-666 and CK-869 inhibit Arp2/3 complex by blocking an activating conformational change,” vol. 20, no. 5, pp. 701–712, 2013. J. Van Deun, P. Mestdagh, R. Sormunen, V. Cocquyt, K. Vermaelen, J. Vandesompele, M. Bracke, O. De Wever, and A. Hendrix, “The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling.,” J. Extracell. vesicles, vol. 3, pp. 1–14, 2014. J. Hakulinen, L. Sankkila, N. Sugiyama, K. Lehti, and J. Keski-Oja, “Secretion of active membrane type 1 matrix metalloproteinase (MMP-14) into extracellular space in microvesicular exosomes,” J. Cell. Biochem., vol. 105, no. 5, pp. 1211–1218, 2008. 63 [105] E. Derivery, C. Sousa, J. J. Gautier, B. Lombard, D. Loew, and A. Gautreau, “The Arp2/3 Activator WASH Controls the Fission of Endosomes through a Large Multiprotein Complex,” Dev. Cell, vol. 17, no. 5, pp. 712–723, 2009. [106] J. W. Clancy, A. Sedgwick, C. Rosse, V. Muralidharan-Chari, G. Raposo, M. Method, P. Chavrier, and C. D’Souza-Schorey, “Regulated delivery of molecular cargo to invasive tumour-derived microvesicles.,” Nat. Commun., vol. 6, pp. 1-11, 2015. [107] M. Baldassarre, A. Pompeo, G. Besnoussenko, C. Castaldi, S. Cortellino, M. A. McNiven, A. Luini, and R. Buccione, “Dynamin Participates in Focal Extracellular Matrix Degradation by Invasive Cells,” Mol. Biol. Cell, vol. 14, pp. 1074–1084, 2003. [108] M. S. Pols and J. Klumperman, “Trafficking and function of the tetraspanin CD63,” Exp. Cell Res., vol. 315, no. 9, pp. 1584–1592, 2009. [109] C. Rossé, C. Lodillinsky, L. Fuhrmann, M. Nourieh, P. Monteiro, M. Irondelle, E. Lagoutte, S. Vacher, F. Waharte, P. Paul-Gilloteaux, M. Romao, L. Sengmanivong, M. Linch, J. van Lint, G. Raposo, A. Vincent-Salomon, I. Bièche, P. J. Parker, and P. Chavrier, “Control of MT1-MMP transport by atypical PKC during breast-cancer progression.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 111, no. 18, pp. 1872–1879, 2014. 64
