VRIJE CONCENTRATIEMONITORING VAN VANCOMYCINE EN
advertisement
UNIVERSITEIT GENT UNIVERSITAIR ZIEKENHUIS GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN LABORATORIUM VOOR KLINISCHE BIOLOGIE Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie 24 uurslab Academiejaar 2012-2013 VRIJE CONCENTRATIEMONITORING VAN VANCOMYCINE EN TEICOPLANINE: VERGELIJKING VAN EVENWICHTSDIALYSE EN ULTRAFILTRATIE Louise COENE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Dr. V. Stove Commissarissen Prof. C. Stove Prof. W. Lambert UNIVERSITEIT GENT UNIVERSITAIR ZIEKENHUIS GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN LABORATORIUM VOOR KLINISCHE BIOLOGIE Vakgroep Bioanalyse Laboratorium voor Toxicologie 24 uurslab Academiejaar 2012-2013 VRIJE CONCENTRATIEMONITORING VAN VANCOMYCINE EN TEICOPLANINE: VERGELIJKING VAN EVENWICHTSDIALYSE EN ULTRAFILTRATIE Louise COENE Eerste Master in de Farmaceutische Zorg Promotor Dr. V. Stove Commissarissen Prof. C. Stove Prof. W. Lambert AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.” 24 mei 2013 Promotor Auteur Dr. Apr. Veronique Stove Louise Coene SAMENVATTING Therapeutic drug monitoring wordt uitgevoerd voor vancomycine en teicoplanine, twee glycopeptide antibiotica, om therapiefalen, het risico op toxiciteit en resistentieontwikkeling te beperken. Hoewel routinegewijs de totale concentratie in patiëntenstalen gemonitord wordt, is enkel de vrije concentratie verantwoordelijk voor het farmacologisch effect en distributie naar de weefsels en wordt enkel de vrije concentratie glomerulair gefiltreerd. Deze vrije concentratie kan bepaald worden met behulp van evenwichtsdialyse, wat beschouwd wordt als de referentiemethode, of ultrafiltratie. Voor vancomycine wordt evenwichtsdialyse vergeleken met ultrafiltratie bij 37 °C en bij 4°C. Ultrafiltratie bij 37 °C geeft vergelijkbare vrije concentraties met evenwichtsdialyse, met een gemiddelde vrije fractie van 74,4 en 72,0 %, respectievelijk. Ultrafiltratie bij 4 °C resulteert in een gemiddelde vrije fractie van 51,5 %. Bij ultrafiltratie is de gemeten vrije concentratie sterk afhankelijk van de temperatuur waarbij gecentrifugeerd wordt. Ultrafiltratie is eenvoudiger uit te voeren, sneller en goedkoper dan evenwichtsdialyse en geniet de voorkeur in een routinelaboratorium. Voor vancomycine correleert de vrije concentratie sterk met de totale concentratie (r = 0,949). Bij falen van de therapie ondanks adequate totale spiegels, kan de totale eiwitconcentratie bepaald worden, aangezien deze parameter significant van invloed is op de vrije fractie. De gevalideerde methode, ultrafiltratie bij 37 °C, wordt op stalen van kritisch zieke kinderen (ADIC-studie) en continu ambulant peritoneaal dialysevocht toegepast. De gemiddelde vrije fractie vancomycine bij kritisch zieke kinderen bedraagt 66,1 % en de vrije concentratie correleert sterk met de totale concentratie (r = 0,995). Bij deze populatie is de albumine- en totale eiwitconcentratie significant van invloed op de vrije fractie. De vancomycineconcentratie in continu ambulant peritoneaal dialysevocht blijkt in dit beperkt experiment niet overeen te komen met de vrije concentratie in serum. Voordat de vrije teicoplanineconcentratie na ultrafiltratie kan bepaald worden, dient een kalibratiecurve opgesteld te worden in ultrafiltraat aangezien het matrixeffect een grote rol speelt in de analyse. Ultrafiltratie bij 37 °C wordt vergeleken met ultrafiltratie bij 4 °C en dit resulteert in een gemiddelde vrije fractie van 17,1 en 12,9 %, respectievelijk. DANKWOORD Ik dank Dr. Veronique Stove voor het mogelijk maken van de masterproef, haar geduld en begeleiding en het kritisch lezen van dit werk. Daarnaast wil ik Prof. Stove en Prof. Lambert bedanken voor hun opvolging en nazicht van deze masterproef. Ik wil ook Maxime, Karlien en Valerie, assistenten in het klinisch lab, Brigitte, MLT bij Hormonologie en Pieter, ziekenhuisapotheker, bedanken voor hun hulp en begeleiding. Een speciaal woord van dank gaat uit naar alle vrijwillige bloedgevers, die zich spontaan aanboden om bloed af te staan ten gunste van mijn masterproef. Bedankt aan iedereen verbonden met het 24 uurslab en het laboratorium Hormonologie van UZ Gent die mij rechtstreeks of onrechtstreeks hulp hebben geboden en zorgden voor een aangename sfeer in het lab. Bedankt aan alle Professoren en doctoraatsstudenten die mij tot dusver hebben begeleid tijdens mijn studie. Tenslotte wens ik mijn ouders en vriend te bedanken voor hun interesse en steun bij het realiseren van deze masterproef. INHOUDSOPGAVE 1. Inleiding ..........................................................................................................................1 1.1. Algemeen .................................................................................................................1 1.2. Vancomycine ............................................................................................................1 1.2.1. Toepassing en farmacokinetiek .........................................................................1 1.2.2. Toxiciteit ...........................................................................................................3 1.2.3. Therapeutic drug monitoring .............................................................................3 1.3. Teicoplanine .............................................................................................................5 1.3.1. Toepassing en farmacokinetiek .........................................................................5 1.3.2. Toxiciteit ...........................................................................................................6 1.3.3. Therapeutic drug monitoring .............................................................................6 1.4. Vrije concentratie monitoring ...................................................................................7 1.5. Evenwichtsdialyse ....................................................................................................9 1.6. Ultrafiltratie ...........................................................................................................11 2. Objectieven ..................................................................................................................14 3. Materiaal en methoden ................................................................................................16 3.1. 3.1.1. Evenwichtsdialyse ...........................................................................................16 3.1.2. Ultrafiltratie ....................................................................................................17 3.1.3. Vancomycinebepaling .....................................................................................17 3.1.4. Teicoplaninebepaling ......................................................................................18 3.1.5. Albuminebepaling ...........................................................................................20 3.1.6. Immunoglobuline A-bepaling ..........................................................................21 3.1.7. α1-zure glycoproteïnebepaling ........................................................................21 3.1.8. Totaal eiwitbepaling ........................................................................................21 3.2. Statistische testen ..................................................................................................22 3.2.1. Mixed model ...................................................................................................22 3.2.2. Passing and Bablok regressie en Bland-Altman plot .........................................23 3.3. 4. Laboratoriumonderzoek .........................................................................................16 ADIC-protocol .........................................................................................................23 Resultaten ....................................................................................................................25 4.1. Ultrafiltratie ...........................................................................................................25 4.1.1. Spoelen ...........................................................................................................25 4.1.2. Herhaalbaarheid..............................................................................................26 4.1.3. Reproduceerbaarheid ......................................................................................27 4.1.4. Niet-specifieke adsorptie .................................................................................28 4.2. 4.2.1. Stabiliteit .........................................................................................................28 4.2.2. Herhaalbaarheid..............................................................................................29 4.2.3. Niet-specifieke adsorptie .................................................................................30 4.2.4. Effect van dilutie .............................................................................................30 4.3. Vancomycine ..........................................................................................................31 4.3.1. Matrixeffect ....................................................................................................31 4.3.2. Invloed van een vries-dooi cyclus op de vrije fractie ........................................33 4.3.3. Methodevergelijking .......................................................................................33 4.3.4. Resultaten ADIC-studie....................................................................................37 4.3.5. Peritoneaal dialysevocht .................................................................................42 4.4. 5. Evenwichtsdialyse ..................................................................................................28 Teicoplanine ...........................................................................................................42 4.4.1. Kalibratiecurve voor vrij teicoplanine ..............................................................42 4.4.2. Matrixeffect ....................................................................................................43 4.4.3. Methodevergelijking .......................................................................................44 Discussie .......................................................................................................................48 5.1. Vancomycine ..........................................................................................................48 5.2. Teicoplanine ...........................................................................................................51 6. Conclusies .....................................................................................................................53 7. Literatuurlijst ................................................................................................................54 Bijlagen Lijst met gebruikte afkortingen ADIC Antibiotic Dosing in pediatric Intensive Care AIC Akaike Information Criterium AUC Area Under the Curve CAPD Continu Ambulant Peritoneaal Dialyse CMIA Chemiluminescent Microparticle Immunoassay CV Coefficient of variation FPIA Fluorescentie Polarisatie Immunoassay HPLC High Perfomance Liquid Chromatography IgA Immunoglobuline A MIC Minimale Inhibitoire Concentratie MRSA Methicilline-resistente Staphylococcus aureus MWCO Molecular Weight Cut-Off QC Quality Control QMS Quantitative Microsphere System RLU Relative Light Units TDM Therapeutic Drug Monitoring 1. INLEIDING 1.1. ALGEMEEN Bij therapeutic drug monitoring (TDM) wordt de concentratie van een geneesmiddel in een lichaamsvloeistof bepaald als hulp bij de farmacotherapie. TDM is nuttig voor die geneesmiddelen met een nauwe therapeutisch-toxische marge, waarvan het effect gerelateerd is aan de concentratie geneesmiddel in het bloed en het farmacodynamische effect niet eenvoudig te bepalen is. Een geschikte analytische techniek is hiervoor noodzakelijk. Concentraties worden gemonitord wanneer er een vermoeden van toxiciteit of onvoldoende therapietrouw bestaat, de dosis verandert, de gezondheidstoestand van de patiënt niet stabiel is, andere co-medicatie wordt toegediend, onvoldoende of geen effect vastgesteld wordt en de dosering moeilijk in te stellen is (Siemens Healthcare Diagnostics, 2009). 1.2. 1.2.1. VANCOMYCINE Toepassing en farmacokinetiek Vancomycine (figuur 1.1) is een antibioticum, behorend tot de groep van de glycopeptiden. Vancomycine inhibeert de celwandsynthese van gram-positieve microorganismen door D-Alanine-D-Alanine te binden van de precursormolecule. Figuur 1.1: Structuurformule van vancomycine hydrochloride (Europese Farmacopee, 2008) 1 Vancomycine wordt toegediend bij ernstige infecties met bewezen resistentie tegen β-lactamantibiotica of wanneer een contra-indicatie bestaat voor β-lactamantibiotica. Dit is voornamelijk bij infectie met methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA), Streptococcus viridans en Enterococcen. Omdat β-lactamantibiotica op een andere manier de celwandsynthese inhiberen dan glycopeptiden, komt geen kruisresistentie voor (Nailor and Sobel, 2011). Vancomycine kan ook peroraal toegediend worden als therapie bij membraneuze colitis door Clostridium difficile, na falen van het eerste keuze geneesmiddel metronidazol. Bij orale inname wordt slechts een minimale fractie geresorbeerd (Belgisch Centrum voor Farmacotherapeutische Informatie). Continu ambulant peritoneaal dialyse (CAPD) is een vorm van peritoneaal dialyse of buikspoeling. Hierbij wordt spoelvloeistof in de buikholte gebracht, wat er enkele uren blijft zitten terwijl de uitwisseling van stoffen met het bloed doorgaat via het buikvlies. Daarna wordt de vloeistof verwijderd en de procedure herhaald. In geval van een peritonitis kan vancomycine intraperitoneaal toegediend worden. Monitoring van de spiegels gebeurt in serum en niet in dialysaat (Fish et al., 2012). Het bactericide effect van vancomycine is tijdsafhankelijk, wat betekent dat de effectiviteit gecorreleerd is met de tijdsduur dat de plasmaspiegels zich boven de minimale inhibitorische concentratie (MIC) bevinden. Vancomycine kan intermittent intraveneus toegediend worden of via een continu intraveneus infuus. Het continu infuus vereenvoudigt TDM omdat het tijdstip van afname geen rol speelt, terwijl bij intermittente therapie moet rekening gehouden worden met piek- en dalspiegels. Een meta-analyse kon geen significant verschil in mortaliteit aantonen tussen beide toedieningsmethoden, maar bij continu infuus werden significant minder gevallen van nefrotoxiciteit vastgesteld. Dit kan verklaard worden doordat bij continue toediening lager gedoseerd kan worden om de doelconcentraties te bereiken (Cataldo et al., 2012). Om snel de doelconcentratie te bereiken, wordt bij ernstige infecties het gebruik van een oplaaddosis aanbevolen. Verdeling van vancomycine na toediening gebeurt naar bijna alle weefsels. Vancomycine wordt op plasma-eiwitten voor 30 tot 60 % en zelfs meer gebonden. Excretie van de onveranderde actieve stof gebeurt door de nieren door middel van glomerulaire filtratie. Bij een verstoorde nierfunctie wordt de halfwaardetijd aanzienlijk verlengd (Rybak et al., 2009) (Truong et al., 2012). 2 1.2.2. Toxiciteit Bij vancomycine worden nefrotoxiciteit, ototoxiciteit en red man-syndroom meest vastgesteld als ongewenste effecten. Minder gerapporteerd is tromboflebitis, koorts, rash en neutropenie. Tot 47 % van de patiënten ontwikkelen red man- of red neck-syndroom, meestal niet lang na de infusie. Dit lijkt niet afhankelijk van de serumconcentratie, maar wel van de infusiesnelheid. Nierfunctiestoornissen worden vastgesteld bij 5 tot 7 % van de patiënten die enkel behandeld worden met vancomycine. In combinatie met andere nefrotoxische middelen, stellen studies een stijging vast van de nefrotoxiciteit (Elyasi et al., 2012). Bij dalspiegels hoger dan 10 mg/l bestaat evidentie dat nefrotoxiciteit frequenter optreedt. Ototoxiciteit komt voor bij 2 tot 5,5 % van de patiënten en komt vaker voor bij patiënten met gedaalde nierfunctie en serumspiegels hoger dan 80 mg/l. Diermodellen konden de relatie tussen ototoxiciteit en vancomycine niet aantonen (Rybak, 2006). Er is geen consensus tussen verschillende studies in verband met hoe sterk andere ototoxische of nefrotoxische geneesmiddelen de toxiciteit beïnvloeden (Hammett-Stabler and Johns, 1998). 1.2.3. Therapeutic drug monitoring Vancomycine heeft een nauwe therapeutisch-toxische marge en via TDM kan men zich ervan verzekeren dat therapeutische concentraties gehaald worden, zonder het risico op toxiciteit en resistentieontwikkeling nodeloos te verhogen. TDM wordt uitgevoerd voor vancomycine om het risico op nefrotoxiciteit te verlagen. Red man-syndroom kan er niet mee voorkomen worden, omdat dit waarschijnlijk infusiegerelateerd is. Preventie van ototoxiciteit via TDM is eveneens niet kosten-effectief, omdat deze toxiciteit zeldzaam geassocieerd is met monotherapie en niet correleert met de serumspiegels (Elyasi et al., 2012). De initiële dosering van vancomycine moet berekend worden op basis van het lichaamsgewicht. Met behulp van de informatie over de bereikte serumconcentratie kan het doseringsregime eventueel aangepast worden bij het niet bereiken van doelconcentraties. De meest voorspellende farmacokinetische parameter is de oppervlakte onder de curve of area under the curve (AUC) over 24 uur, gedeeld door de MIC. Doelwaarde voor AUC0-24/MIC 3 is 400. Omdat meerdere stalen op verschillende tijdstippen nodig zijn om een AUC-waarde te bepalen, wordt dit in de praktijk niet gebruikt. Er is immers aangetoond dat dalconcentraties sterk correleren met AUC0-24 en deze zijn praktisch eenvoudiger te monitoren (Roberts et al., 2012). Hoge plasmaspiegels die vier of vijf keer de MIC overschrijden zijn niet nodig, omdat het effect van vancomycine tijdsafhankelijk is. Wel is het behouden van de spiegel gedurende het volledige dosisinterval noodzakelijk, dus worden best de dalspiegels en niet piekspiegels, gemonitord bij intermittente toediening. De te monitoren stalen worden afgenomen net voor de vierde dosis wordt toegediend, omdat dan verwacht wordt dat de steady-state condities bereikt zijn. Dalspiegels van 10 tot 15 mg/l worden nagestreefd. Concentraties lager dan 10 mg/l moeten vermeden worden om het risico op resistentieontwikkeling te beperken (Rybak et al., 2009). Bij een continu infuus is er geen sprake van piek- en dalspiegels en worden doelspiegels van 20 tot 25 mg/l beoogd (Elyasi et al., 2012). Uit onderzoek is gebleken dat TDM, bestaande uit voorschrift controle, metingen van serumspiegels en dosisaanpassingen, de incidentie van nefrotoxiciteit kan verminderen en een kosten-effectieve interventie is (Welty and Copa, 1994). Het is moeilijk om conclusies te maken in verband met vancomycineconcentraties en toxiciteit, omdat de studies vaak observationeel zijn en patiënten met verschillende comorbiditeit geïncludeerd worden. Volgens de beschikbare studies zijn patiënten met hogere plasmaspiegels van vancomycine gevoeliger aan nefrotoxiciteit, zeker bij aanwezigheid van verschillende risicofactoren zoals verlengde therapie en andere nefrotoxische geneesmiddelen (Elyasi et al., 2012). Omdat de incidentie van oto- en nefrotoxiciteit relatief laag is, wordt geen standaard monitoring van elke patiënt aanbevolen. Tot het tegendeel bewezen is, is TDM van vancomycine wel aanbevolen bij patiënten met afwijkende of snel veranderende nierfunctie, zeker bij combinatietherapie met aminoglycosiden of andere nefrotoxische geneesmiddelen. Ook bij patiënten die nierdialyse ondergaan of patiënten met een veranderd verdelingsvolume, maligniteiten, zwangerschap, verlengde therapie en verhoogde dosering wordt TDM aangeraden (Rybak et al., 2009). 4 1.3. 1.3.1. TEICOPLANINE Toepassing en farmacokinetiek Teicoplanine behoort net als vancomycine tot de glycopeptide antibiotica en heeft hetzelfde werkingsmechanisme. Teicoplanine bestaat uit een mengsel van verschillende componenten, waarvan A2 (van A2-1 tot A2-5) de meest abundante (90-95 %) is (figuur 1.2). Component A2-2 is de meest actieve stof (Dailly et al., 2013). Net als vancomycine wordt teicoplanine toegediend bij ernstige infecties met bewezen resistentie tegen β-lactamantibiotica of wanneer er een contra-indicatie is voor βlactamantibiotica, zoals allergie. Ook profylactisch kan teicoplanine toegediend worden wanneer er risico is op infectie met gram-positieve kiemen (Belgisch Centrum voor Farmacotherapeutische Informatie). Figuur 1.2: Structuurformules van de hoofdcomponenten van teicoplanine (Europese Farmacopee, 2009) Absorptie na orale toediening van teicoplanine is minimaal, maar zowel intraveneuze als intramusculaire toediening wordt goed verdragen. De steady state wordt slechts zeer langzaam bereikt (93 % van de steady state concentratie bereikt na 14 dagen met herhaalde toedieningen) en een oplaaddosis is aanbevolen om therapeutische concentraties te 5 bereiken (Wilson, 2000). Teicoplanine wordt voor 90 tot 95 % gebonden aan plasmaproteïnen. Verdeling naar de weefsels van teicoplanine gebeurt snel, maar de eliminatie in de urine in onveranderde vorm gebeurt langzaam. Eliminatie gebeurt voornamelijk door glomerulaire filtratie en metabolisatie is minimaal. Er bestaat een grote interindividuele variabiliteit in klaring en een veranderende nierfunctie zal de eliminatie beïnvloeden. Deze hoge variabiliteit uit zich in een grote intra- en interindividuele variatie van de halfwaardetijd, variërend van 33 tot 190 uur (Urakami et al., 2008). 1.3.2. Toxiciteit Nefro- en ototoxiciteit ten gevolge van blootstelling aan een hoge dosis teicoplanine blijken minder voor te komen dan bij vancomycine en zijn aldus geen indicatie voor TDM. Ook red man-syndroom ten gevolgde van te snelle infusie wordt veel minder vastgesteld (Begg et al., 2001). Overgevoeligheid, koorts, roodheid, diarree, nefrotoxiciteit en trombocytopenie zijn de meest voorkomende ongewenste effecten. Deze worden voornamelijk vastgesteld bij patiënten die blootgesteld zijn aan een verlengde therapie of hoge dosis (Wilson, 2000). 1.3.3. Therapeutic drug monitoring Suboptimale plasmaspiegels geven aanleiding tot therapiefalen en brengen het risico van resistentieontwikkeling met zich mee. Net zoals bij vancomycine is AUC0-24/MIC de meest voorspellende farmacokinetische parameter en bestaat er een goede correlatie tussen AUC0-24 en de dalconcentratie. Voor een effectieve therapie tegen Staphylococcus aureus worden dalspiegels van 10 tot 20 mg/l aanbevolen. Voor meer ernstige infecties stellen de richtlijnen dat een dalspiegel van 20 tot 30 mg/l moet bereikt worden. Vanaf concentraties in plasma hoger dan 60 mg/l wordt een verhoogd risico op toxiciteit vastgesteld (Tobin et al., 2010). Ondanks de vrij brede therapeutische range wordt TDM ook uitgevoerd voor teicoplanine omwille van de grote interindividuele variabiliteit in halfwaardetijd. TDM is hier niet noodzakelijk om toxiciteit te voorkomen, maar wel om te garanderen dat 6 therapeutische spiegels bereikt worden. Voornamelijk bij patiënten met renale dysfunctie of verhoogde klaring wordt TDM aanbevolen, vermits geen goede correlatie bestaat tussen de nierfunctieparameters en de kinetiek. De eliminatie uitgedrukt per lichaamsgewicht is hoger bij kinderen dan bij volwassenen omdat de glomerulaire filtratie na 2,5 tot 5 maanden volwassen waarden bereikt (Taminiau, 1989). Zeker bij patiënten die geen respons tonen op de therapie is TDM nuttig, aangezien zo kan gecontroleerd worden of de doelwaarde bereikt wordt (Wilson, 2000) (Tobin et al., 2010). 1.4. VRIJE CONCENTRATIE MONITORING De meeste geneesmiddelen zijn in het bloed in meer of mindere mate gebonden aan plasmaproteïnen, waarvan albumine, α1-zure glycoproteïne en lipoproteïnen de belangrijkste zijn. Geneesmiddelen kunnen niet, zwak, gemiddeld of sterk (meer dan 80 %) gebonden zijn. Enkel het vrije geneesmiddel kan diffunderen uit de bloedbaan en zich verdelen over de weefsels (Dasgupta, 2002). Voldoende diffusie uit de bloedbaan is voor antibiotica essentieel, aangezien de meeste infecties voorkomen in de interstitiële vloeistof en niet in het bloed. Ook kan waarschijnlijk enkel de vrije fractie antibiotica binden op zijn target (Berthoin et al., 2009). Daarnaast bepaalt de proteïnebinding de klaring van het geneesmiddel. Zo worden vancomycine en teicoplanine geëlimineerd door glomerulaire filtratie, waarbij enkel de vrije fractie wordt gefiltreerd (Beer et al., 2009). Door een daling in eiwitbinding, bijvoorbeeld door hypoalbuminemie, zal de kinetiek van het geneesmiddel veranderen: het verdelingsvolume en de klaring zullen stijgen (Ulldemolins et al., 2011). Onder andere door leverfalen, uremie en hypoalbuminemie kan de vrije concentratie van een geneesmiddel verhogen. Ook fysiologische parameters zoals leeftijd, lichaamstemperatuur of pH kunnen zorgen voor een aanpassing in proteïnebinding. Bij polyfarmacie kan het voorkomen dat een geneesmiddel, al dan niet competitief, de binding van een ander geneesmiddel op een bindingsplaats op plasmaproteïnen inhibeert, waardoor de vrije concentratie varieert. Voor de meeste geneesmiddelen is de variabiliteit in proteïnebinding niet klinisch significant, tenzij bij geneesmiddelen met een nauwe therapeutisch-toxische range en een hoge proteïnebinding. Daarom kan het nuttig zijn om bij die geneesmiddelen in sommige gevallen 7 vrije concentraties te bepalen in plaats van de totale concentratie (Beer et al., 2009). Vrije concentratiebepaling is geen routinetechniek omwille van analytische problemen en een gebrek aan een vastgelegd therapeutisch bereik voor vrije concentraties (Dasgupta, 2002). Voor sommige geneesmiddelen wordt bij voorkeur een vrije concentratie gemonitord op een serumstaal, omdat anticoagulantia mogelijks kunnen interfereren met de vrije fractie of de totale concentratie. Zo wordt fenytoïne bijvoorbeeld sneller afgebroken door citraat en oxalaat. Wanneer het anticoagulans niet interfereert met de bepalingsmethode of de eiwitbinding, kunnen plasmastalen gebruikt worden (Warner et al., 1998). Voor de analyse van vancomycine (zie 3.1.3) en teicoplanine (zie 3.1.4) kunnen zowel serum- als plasmastalen gebruikt worden. Daarnaast is aangetoond dat heparine geen invloed heeft op de proteïnebinding van vancomycine (Shin et al., 1991). In de dagelijkse klinische praktijk worden zowel van vancomycine als van teicoplanine de totale (vrije en gebonden) geneesmiddelconcentraties in serum en plasma geëvalueerd bij therapie opvolging. Vancomycine en teicoplanine zijn respectievelijk voor 30-60 % en 9095 % gebonden in plasma (Ulldemolins et al., 2011). Door bepaalde veranderingen in het lichaam kan de vrije concentratie van het geneesmiddel veranderen, zonder dat dit reflecteert in een veranderde totale concentratie. Hierdoor kan de patiënt toxiciteit ervaren of kan de therapie falen (Beer et al., 2009). Het effect van hypoalbuminemie op de vrije teicoplanineconcentratie werd nagegaan (mediaan van de albumineconcentratie was 16,1 g/l met een variabiliteit van 14,2 tot 28,4 g/l) en een hoge variabiliteit van vrije fractie van 8 tot 42 %, afhankelijk van de albumineconcentratie, werd vastgesteld (Ulldemolins et al., 2011). Zowel de inter- als intrapatiënt variabiliteit is hoog en de vrije concentratie blijkt voornamelijk afhankelijk van de totale concentratie aan teicoplanine en de albumineconcentratie (Yano et al., 2007). In een recente studie werd nagegaan of de totale vancomycineconcentratie in serum correleert met de vrije concentratie. Hierbij werd bevestigd dat er een zeer groot bereik is aan gebonden fractie, die varieerde van 12 tot 100 %. Ook stelde men vast dat de totale concentratie in serum geen voorspelling geeft van de vrije concentratie. Zowel de variabiliteit binnen eenzelfde patiënt als tussen patiënten onderling was groot. Als besluit van de studie wordt routine vrije concentratie monitoring aanbevolen (Berthoin et al., 2009). 8 De vrije concentratie kan bepaald worden met evenwichtsdialyse en ultrafiltratie. Evenwichtsdialyse (zie 1.5) wordt vaak als referentiemethode beschouwd, terwijl ultrafiltratie (zie 1.6) eenvoudiger en sneller uit te voeren is (Beer et al., 2009). Bij het rapporteren moet men ermee rekening houden dat men voor onderzoeksdoeleinden vaak in de vrije fractie geïnteresseerd is, terwijl het farmacologisch effect bepaald wordt door vrije concentratie (Roberts et al., 2013). 1.5. EVENWICHTSDIALYSE Naast ultrafiltratie (zie 1.6) is evenwichtsdialyse één van de meest gebruikte methoden om het bindingspercentage van een geneesmiddel aan plasmaproteïnen te bepalen. Bij de dialyse wordt een buffer in contact gebracht met het serum dat het geneesmiddel bevat, gescheiden door een membraan (figuur 1.3). Dit membraan heeft een bepaalde molecular weight cut-off-waarde (MWCO), waardoor moleculen met een hoger moleculair gewicht dan deze waarde niet doorheen het membraan kunnen diffunderen. Dit betekent dat het glycopeptide dat gebonden zit op plasmaproteïnen niet doorheen het membraan kan, maar de ongebonden fractie wel. De vrije fractie zal zolang door het membraan diffunderen tot zich een evenwicht instelt en de vrije concentratie aan beide zijden van het membraan gelijk is. De glycopeptideconcentratie in de buffer kan na evenwichtsinstelling bepaald worden en geeft een indicatie van de vrije serumconcentratie (Eriksson et al., 2005). Figuur 1.3: Schematische weergave van evenwichtsdialyse. D, P en N stellen respectievelijk geneesmiddel, proteïne en niet-specifieke bindingsplaatsen voor. PSA is het oppervlaktepermeabiliteitsproduct (Di et al., 2012). 9 Waar bij ultrafiltratie de niet-specifieke adsorptie van componenten aan de wand of membraan een fout geeft bij de bepaling van de vrije concentratie, is dit niet het geval bij evenwichtsdialyse. Door niet-specifieke adsorptie daalt de recovery omdat de te analyseren component zal adsorberen aan membraan en wanden. Dit heeft geen invloed op het bepalen van de vrije fractie, aangezien deze bepaald wordt door de verhouding van de concentraties in beide compartimenten. Ondanks dit gegeven dient toch belang gehecht te worden aan de niet-specifieke adsorptie omdat het de tijd tot evenwicht tijdens de dialyse zal verlengen. Teflon wordt om die reden vaak gebruikt om de niet-specifieke binding te minimaliseren (Di et al., 2012). Een nadeel bij evenwichtsdialyse is dat dilutie van het oorspronkelijke serumstaal inherent is. Dialyse is thermodynamisch equivalent aan verdunning, waardoor de vrije concentratie zal dalen en nieuw antibioticum zal dissociëren van de bindingsproteïnen. Hierdoor is het evenwicht na dialyse niet meer identiek aan het evenwicht in het oorspronkelijk staal en zal de berekende gebonden fractie en vrije fractie respectievelijk lager en hoger zijn dan in werkelijkheid. Dit effect is minimaal voor geneesmiddelen die heel sterk gebonden zijn in plasma (> 99 %), maar des te uitgesprokener hoe minder het geneesmiddel eiwitgebonden is. Dilutie zal dus een grotere rol spelen bij vancomycine (30 tot 60 % gebonden) dan bij teicoplanine (90 tot 95 % gebonden). Om verdunning tot een minimum te beperken, moet het volume buffer voor dialyse zo klein mogelijk zijn (Nieschlag, 2004). Evenwichtsdialyse is in tegenstelling tot ultrafiltratie een tijdrovend proces. Voor analyse moeten beide compartimenten in evenwicht zijn en dit kan variëren van 4 tot 24 uur. Een ander vaak voorkomend probleem is volumeshift tussen de twee compartimenten, veroorzaakt door de osmotische druk afkomstig van de plasmaproteïnen die niet doorheen het membraan kunnen. Hierdoor wordt serum verdund met buffer, wat onder andere veranderingen in pH kan geven waardoor de bindingskarakteristieken van het geneesmiddel en de plasmaproteïnen kunnen beïnvloed worden. Het Gibbs-Donnan effect, veroorzaakt door geladen proteïnen die niet doorheen het membraan kunnen, is een vast gegeven bij dialyse. Hierdoor ontstaat een stroom van kleine ionen tot elektroneutraliteit wordt bereikt en wordt het membraan gedestabiliseerd. Dit 10 probleem kan omzeild worden door een isotone buffer te gebruiken waaraan ionen zijn toegevoegd om eenzelfde ionsterkte te bekomen als in serum (Eriksson et al., 2005). Daarnaast kan proteïnelekkage van kleine eiwitten (zoals complementfactoren, bijvoorbeeld C3a met een moleculair gewicht van ±10 kDa) vanuit het serumcompartiment naar het buffercompartiment een overschatting geven van de vrije fractie. Voornamelijk bij sterk eiwitgebonden geneesmiddelen ( > 99 % gebonden) kan dit een grote invloed uitoefenen op de resultaten (Khor et al., 1985). Uit voorgaande blijkt reeds dat de buffer waarmee de dialyse uitgevoerd wordt niet willekeurig kan gekozen worden. Idealiter heeft de buffer dezelfde pH, ionsterkte en osmolaliteit als serum. Het is eveneens mogelijk dat de ionen van de buffer interfereren met de evenwichtsconstante. Daarnaast is het noodzakelijk dat het te bepalen geneesmiddel stabiel blijft in de buffer (Eriksson et al., 2005). Evenwichtsdialyse wordt uitgevoerd bij 37 °C, omdat de evenwichtsconstante temperatuursafhankelijk is en we zo nauwkeurig mogelijk de binding in vivo willen benaderen. Voorwaarde hierbij is dat het geneesmiddel zowel in de buffer als in serum stabiel is bij deze temperatuur (Di et al., 2012). 1.6. ULTRAFILTRATIE Een tweede methode om vrije en gebonden fracties te scheiden in serum is ultrafiltratie. Hierbij wordt tot één milliliter serum in een ultrafiltratie device gebracht. Met behulp van een hydrofiel membraan wordt de vrije fractie bij centrifugatie gescheiden van de gebonden fractie en opgevangen. In het ultrafiltraat kan de vrije concentratie bepaald worden. Het voordeel van deze methode is dat er geen dilutie plaatsvindt en er dus – althans theoretisch - geen verschuiving van het evenwicht optreedt. Ultrafiltratie kan ook veel sneller uitgevoerd worden dan evenwichtsdialyse, in 5 tot 30 minuten kan een ultrafiltraat bekomen worden. Er hoeft geen buffer, gecorrigeerd voor pH en ionsterkte, samengesteld te worden zoals bij evenwichtsdialyse. 11 De vrije concentratie is afhankelijk van de temperatuur waarbij de ultrafiltratie uitgevoerd wordt en kan ingesteld worden op de centrifuge. In de literatuur wordt ultrafiltratie uitgevoerd bij 4 °C, 25 °C en 37 °C (Urakami et al., 2008) (Berthoin et al., 2009) (Beer et al., 2009). Het gebruik van ultrafiltratie ter bepaling van de vrije vancomycineconcentratie is niet gestandaardiseerd en veel variatie is terug te vinden in de analyseomstandigheden in de literatuur (tabel 1.1). Tabel 1.1: Literatuuroverzicht van de gebruikte experimentele condities ter bepaling van de vrije vancomycineconcentratie Bron Rodvold et al., 1988 Zokufa et al., 1989 Cantu et al., 1990 Sun et al., 1993 Morita and Yamaji, 1995 Dykhuizen et al., 1995 Berthoin et al., 2009 Butterfield et al., 2011 Zhang et al., 2012 Ampe et al., 2013 Type kolom Amicon MPS-1 Amicon MPS-1 Ultrafree Centrifree Amicon MPS-1 Amicon MPS-1 Centrifree Centrifree Centrifree Centrifree Aantal g 2000 2000 1000 1500 2000 1000 2000 1300 2000 2000 Tijd (minuten) 20 20 10 20 20 30 30 30 30 20 Temperatuur (°C) 25 25 KT 37 25 4 4 n.v. n.v. KT KT: kamertemperatuur, n.v.: niet vermeld Blootstelling van het serumstaal aan de lucht dient te worden beperkt om een pH-stijging, die de vrije concentratie kan beïnvloeden, te vermijden. Bij verlengde bewaring van het staal kunnen vetzuren vrijgesteld worden uit triglyceriden door lipolyse. Deze vrije vetzuren kunnen het geneesmiddel verdringen van zijn bindingsplaats en de vrije fractie laten toenemen (Millipore, 1999). Bewaring van de stalen voor minder dan één week bij 4 °C of -20 °C heeft slechts een beperkt effect op de lipidensamenstelling (Zivkovic et al., 2009). Ook wanneer stalen zes maanden bewaard worden bij -20 °C wordt geen significante daling in de triglyceridenconcentratie vastgesteld (Cuhadar et al., 2013). Daarentegen zorgen vriesdooi cycli wel voor een toename van de vrije vetzurenconcentratie, met een concentratietoename van 11 % na 10 cycli (Paltiel et al., 2008). 12 Wanneer niet-specifieke adsorptie van het geneesmiddel aan de wand of het membraan optreedt, zal de vrije concentratie dalen. Niet-specifieke adsorptie is afhankelijk van de ligandconcentratie, ionische en hydrofobe eigenschappen van het ligand, temperatuur, contacttijd en staalmedium. Daarnaast kan tijdens centrifugatie een opstapeling van proteïnen gebeuren ter hoogte van het membraan door de centrifugale kracht. Door deze obstructie zal de vrije fractie niet de mogelijkheid hebben om het membraan te passeren naar het filtraat. Om die reden wordt bij voorkeur een fixed-angle centrifuge gebruikt, waarbij de ‘laag’ macromoleculen door de centrifugale kracht niet evenwijdig met het membraan wordt opgebouwd maar onder een bepaalde hoek. Hierbij blijft een deel van het membraan beschikbaar voor ultrafiltratie (figuur 1.4). Dit is niet het geval bij een swinging-bucket centrifuge, waar de obstructieve laag evenwijdig met het membraan gevormd wordt en de flux kan inhiberen. Figuur 1.4: Schematische voorstelling van ultrafiltratie in een fixed-angle centrifuge (Beer et al., 2009) Het volume ultrafiltraat dat bekomen wordt, is vrij miniem (klassiek 100 tot 300 µl wanneer het uitgangsvolume 500 tot 1000 µl is). Bij het gebruik van een swinging-bucket in plaats van een fixed-angle centrifuge kan dit volume nog dalen. Hoe meer serum gebruikt wordt, hoe groter het ultrafiltratie volume. Daarnaast beïnvloeden ook de centrifugale krachten het volume (Kirchhoff et al., 2011). 13 2. OBJECTIEVEN Antibiotica zijn geneesmiddelen waarbij het farmacologisch effect niet eenvoudig te bepalen is. Vaak worden de serumspiegels van antibiotica, zoals vancomycine en teicoplanine, opgevolgd als hulp bij de farmacotherapie. Door therapeutic drug monitoring kan men bestuderen of de doelconcentraties gehaald worden en een verhoogd risico op resistentie door te lage concentraties vermijden. Vancomycine en teicoplanine zijn in het bloed gebonden op plasmaproteïnen en enkel de vrije fractie is farmacologisch actief, kan distribueren naar de weefsels en ondergaat glomerulaire filtratie. Bij TDM worden totale serumspiegels bepaald, wat de som is van de vrije en de gebonden concentratie. Een wijziging in de vrije concentratie van het geneesmiddel, door een veranderde fysiologische parameter of ziektetoestand, reflecteert zich niet noodzakelijk in een verandering van de totale concentratie. Bij die patiënten zou een bepaling van de vrije concentratie in plaats van de totale concentratie aangewezen zijn. Voor de vrije concentratiemonitoring kan uitgevoerd worden, moet de methode gevalideerd zijn. Om te kunnen garanderen dat de gemeten concentraties correct zijn, dienen de analytische beperkingen van de routinemethode te worden nagekeken. Bij evenwichtsdialyse wordt de antibioticumconcentratie gemeten in buffer en serum, bij ultrafiltratie in ultrafiltraat. In beide gevallen gaat dit om een andere matrix dan bij de routineanalyse, waar teicoplanine en vancomycine in serum of plasma bepaald worden. Er dient dus te worden nagegaan of de matrix een effect heeft op de detectiemethode en hoe hiervoor eventueel kan gecorrigeerd worden. De methode om vrije en gebonden fracties te scheiden moet herhaalbaar en reproduceerbaar zijn. Evenwichtsdialyse wordt vaak beschouwd als de ‘gouden standaard’ om vrije concentraties te bepalen. Daarnaast wordt ultrafiltratie toegepast, wat voordelen biedt ten opzichte van evenwichtsdialyse wat betreft praktische manipulaties en uitvoeringstijd. In de literatuur staat ultrafiltratie beschreven bij 4, 25 en 37 °C. De impact van de temperatuur waarbij gecentrifugeerd wordt op de vrije concentratie wordt nagegaan door ultrafiltratie bij 14 4 °C te vergelijken met ultrafiltratie bij 37 °C. Doel is om voor beide antibiotica de scheidingsmethode te bepalen die het best overeenkomt met evenwichtsdialyse. Na de bepaling van de vrije en totale glycopeptideconcentratie, kan de mate waarin vancomycine en teicoplanine gebonden zijn gerapporteerd worden en de variabiliteit binnen een patiënt bepaald worden. Na de methodevalidatie van de vrije concentratie, kan deze toegepast worden. Een eerste toepassing van de vrije concentratiebepaling van vancomycine, is de analyse van stalen van kritisch zieke kinderen (ADIC-studie). Er kan bepaald worden of de targetwaarde voor de AUC en dalconcentratie gehaald wordt. Daarnaast kan binnen deze populatie de mate van eiwitbinding en de invloed van bepaalde factoren (leeftijd, lengte, gewicht, albumine-, totaal eiwit-, ureum- en totaal bilirubineconcentratie) op deze binding bepaald worden. Een tweede toepassing is de analyse van continu ambulant peritoneaal dialysevocht (CAPD-vocht). Hierbij wordt getoetst of de vancomycineconcentratie in CAPD-vocht overeenstemt met de vrije concentratie in serum. De bepaling van de vrije concentratie is praktisch gezien moeilijker en financieel duurder. Indien de vrije concentratie met voldoende nauwkeurigheid zou kunnen voorspeld worden uit de totale concentratie, zou vrije concentratiemonitoring niet aanbevolen zijn. 15 3. MATERIAAL EN METHODEN 3.1. LABORATORIUMONDERZOEK 3.1.1. Evenwichtsdialyse 3.1.1.1. Materialen Fast Micro Equilibrium Dialyzer (Harvard apparatus, Holliston, US): 1000 µl en 500 µl kamers Regenerated Cellulose Membrane (Harvard apparatus, Holliston, US): MWCO 25 000 Dalton Dialysebuffer (Yue et al., 2008) 2,595 g NaCl, 0,625 g Na3PO4·12H2O, 0,1615 g KCl, 0,123 g MgSO4·7H2O, 18,6 g HEPES, 0,15 g ureum, 0,1375 g CaCl2.2H2O en 0,26 g NaN3 wordt opgelost in 500 ml gedistilleerd water Schuddend warmwaterbad GFL 1083 op 37 ± 0,1 °C (GFL, Burgwedel, Duitsland) pH-meter CG 820 (Schott Geräte, Hofheim, Duitsland) NaOH 1 M (Tailor Made Chemicals, Roeselare, België) HCl 5 M (Tailor Made Chemicals, Roeselare, België) 3.1.1.2. Principe en uitvoering Bij evenwichtsdialyse wordt een scheiding van de vrije en gebonden fractie bereikt door evenwichtsinstelling over een membraan tussen een serum- en een buffercompartiment. De pH van de buffer wordt gecontroleerd en indien nodig bijgestuurd tot 7,28 ± 0,01 met NaOH of HCl. De benodigde membranen worden met behulp van een pincet verwijderd uit de bewaarvloeistof en toegevoegd aan een hoeveelheid buffervloeistof om te equilibreren bij kamertemperatuur. Na minimum één uur equilibratie worden de membranen in de dialysesystemen gebracht en de compartimenten gevuld met 500 of 1000 µl serum of buffer. De systemen worden in het schuddend warmwaterbad geplaatst met het serumcompartiment bovenaan. Na 24 ± 1 uren wordt het volume vloeistof in beide compartimenten overgebracht in proefbuizen. De vrije fractie wordt bepaald door de concentratie in buffer te delen door de concentratie in het serumcompartiment. De vrije 16 concentratie kan dan bepaald worden door de vrije fractie te vermenigvuldigen met de totale concentratie. De terugvinding kan berekend worden door de massa teruggevonden in het serum- en buffercompartiment op te tellen en te vergelijken met de totale hoeveelheid die oorspronkelijk in de kamer gebracht werd. 3.1.2. 3.1.2.1. Ultrafiltratie Materialen Centrifree Centrifugal Filter Devices (Millipore, Billerica, US): MWCO 30 000 Dalton Heraeus Labofuge 400 R Centrifuge (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland): swinging-bucket centrifuge 3.1.2.2. Principe en uitvoering Ultrafiltratie is een eenvoudige methode om de vrije en gebonden fractie van een geneesmiddel te scheiden met behulp van centrifugale krachten. Het staal en de centrifugeerbuis worden apart in de broedstoof op 37 °C geplaatst om te equilibreren. Na minimum 30 minuten equilibreren, wordt 500 µl staal in de centrifugeerbuis gepipeteerd. De Centrifree wordt in de centrifuge geplaatst en bij gewenste temperatuur wordt 30 minuten gecentrifugeerd op 1885 g. Bij centrifugatie wordt het ultrafiltraat opgevangen en kan nadien geanalyseerd worden. Optimaal zou een fixed-angle centrifuge zijn, maar deze is niet beschikbaar in het laboratorium. 3.1.3. 3.1.3.1. Vancomycinebepaling Materialen Architect i2000sr Plus (Abbott Diagnostics, Illinois, US) 3.1.3.2. Principe en uitvoering Routinematig wordt vancomycine in serum in het 24 uurslab van het UZ Gent bepaald met behulp van het Architect i2000sr systeem, door middel van de Chemiluminescent Microparticle Immunoassay techniek (CMIA) (figuur 3.1). 17 De chemiluminiscentie techniek berust op de detectie van het licht dat uitgezonden wordt door een chemische reactie. Het reactiemengsel bestaat uit het staal, antivancomycine antilichamen gecoat op het oppervlak van een paramagnetisch micropartikel en een vancomycine-acridinium gemerkt conjugaat. Het vancomycine aanwezig in het staal en het vancomycineconjugaat worden bij deze analysetechniek gebonden door de antivancomycine antilichamen (de capture molecule). Daarna trekt een magneet de paramagnetische partikels naar de wand en wordt een wasstap uitgevoerd om de ongebonden componenten te verwijderen. Na een tweede wasstap wordt de pre-trigger (H2O2) toegevoegd en wordt het achtergrondsignaal gemeten. Deze pre-trigger zorgt voor zure reactieomstandigheden, gaat het samenklitten van capture molecules tegen en zorgt voor de voorbereiding van acridinium. Door het toevoegen van de trigger oplossing (NaOH) ondergaat het acridinium een oxidatieve chemiluminiscente reactie en wordt Nmethylacridone gevormd, wat licht uitzendt. Dit licht wordt gemeten door het CMIAsysteem en hieruit wordt de concentratie berekend. De luminometer meet de elektrische stroom veroorzaakt door de uitgezonden fotonen, uitgedrukt in Relative Light Units (RLU). De hoeveelheid vancomycine in het staal is omgekeerd evenredig met de gemeten RLU (Abbott Laboratories, 2008). Figuur 3.1: Principe vancomycinebepaling op Architect i2000sr (Savas) 3.1.4. 3.1.4.1. Teicoplaninebepaling Materialen Indiko Plus (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland) 18 3.1.4.2. Principe en uitvoering Routinematig wordt teicoplanine in serum in het 24 uurslab van UZ Gent bepaald met behulp van de LABfx Teicoplanin kit (RolfGreiner BioChemica, Flacht, Duitsland) op de TDx FLx analyser (Abbott Diagnostics, Illinois, US). Dit meetsysteem is gebaseerd op de fluorescentie polarisatie immunoassay (FPIA) techniek. Bij dit systeem gaat teicoplanine in het staal in competitie met teicoplanine gekoppeld aan fluoresceïne (merker) voor een bindingsplaats op het antilichaam tegen het glycopeptide. Daarna wordt het complex bestraald met gepolariseerd blauw licht zodat de merker gepolariseerd groen fluorescent licht uitzendt. De polarisatie van dit uitgezonden licht is verschillend tussen gebonden en vrije merkers en zo is de gemeten polarisatie omgekeerd evenredig met de hoeveelheid teicoplanine in het staal. Bij een lage teicoplanineconcentratie in het staal zal veel merker gebonden zijn op de antilichamen en zal dus veel gepolariseerd groen licht worden uitgezonden (Abbott Laboratories, 1993). Dit toestel wordt momenteel niet meer verkocht en ook de technische ondersteuning zal de firma Abbott binnenkort stopzetten. Als alternatief zal teicoplanine in het 24uurs lab in de toekomst bepaald worden op een Indiko Plus analyser. Hierbij wordt teicoplanine bepaald met een Quantitative Microsphere System (QMS) immunoassay (figuur 3.2). Vergelijking van QMS immunoassay met de huidige methode FPIA toonde aan dat de QMS teicoplanine immunoassay een evenwaardig alternatief is voor FPIA. Er is een lineair verband tussen beide methoden vastgesteld. Wel lijkt de QMS analyse lagere resultaten te geven dan de FPIA en is er sprake van een systematische bias. In het therapeutisch gebied liggen de QMS-resultaten 10 % lager dan de FPIA-resultaten. Bij overschakeling van de analysemethode betekent dit dus dat de referentiewaarden zullen moeten worden hergeëvalueerd en eventueel aangepast (De Sloovere et al., 2013). Net zoals bij FPIA treedt bij QMS competitie op voor een antilichaam tegen teicoplanine tussen het glycopeptide in het staal en teicoplanine gebonden op micropartikels. Aan het staal wordt anti-teicoplanine antilichaam en teicoplanine gebonden op micropartikels toegevoegd. Wanneer het antilichaam bindt met het teicoplanine 19 gebonden op het micropartikel, ontstaat een snelle agglutinatie. Als er teicoplanine aanwezig is in het staal zal minder teicoplanine gebonden op micropartikels binden met de antilichamen en zal minder agglutinatie ontstaan. Fotometrisch wordt de snelheid waarmee de absorbantie wijzigt gemeten en deze is evenredig met de agglutinatiesnelheid. Wanneer een staal met teicoplanine wordt aangeboden, voordat het micropartikel reagens wordt toegevoegd, zal de agglutinatiereactie geïnhibeerd worden. De mate waarin de agglutinatiereactie optreedt, is omgekeerd evenredig met de hoeveelheid teicoplanine in het staal (Thermo Scientific, 2007). Figuur 3.2: Principe teicoplanine-bepaling op Indiko plus (Thermo Scientific, 2007) 3.1.5. 3.1.5.1. Albuminebepaling Materialen Cobas 8000 c502 module (Roche Diagnostics, Basel, Zwitserland) 3.1.5.2. Principe en uitvoering De albumineconcentratie in serum kan bepaald worden met behulp van een colorimetrische assay op Cobas 8000 c502 module. Door middel van een citraatbuffer wordt het staal bij pH 4,1 gebracht, waarbij albumine een overwegend kationisch karakter vertoont. Broomcresolgroen, een anionische kleurstof, wordt toegevoegd en vormt een complex met het albumine aanwezig in het staal. De absorbantie van het blauw-groene 20 complex wordt bichromatisch gemeten (505 en 570 nm) en is evenredig met de albumineconcentratie in het staal. 3.1.6. 3.1.6.1. Immunoglobuline A-bepaling Materialen Behring Nephelometer Analyzer II (Siemens AG, München, Duitsland) 3.1.6.2. Principe en uitvoering Bepaling van immunoglobuline A (IgA) in serum berust op het principe van nefelometrie. Hierbij worden antilichamen tegen IgA toegevoegd aan het staal, waardoor een complex gevormd wordt. Neerslag na vorming van deze complexen zorgt voor een toename in turbiditeit. Er wordt een lichtstraal (840 nm) doorheen het staal gestuurd, die afhankelijk van de turbiditeit verstrooid zal worden. Hoe hoger de concentratie IgA in het staal, hoe meer complexen gevormd worden en hoe hoger de intensiteit van het verstrooide licht. 3.1.7. 3.1.7.1. α 1 -zure glycoproteïnebepaling Materialen Behring Nephelometer Analyzer II (Siemens AG, München, Duitsland) 3.1.7.2. Principe en uitvoering Net zoals bij de bepaling van IgA wordt de α1-zure glycoproteïneconcentratie bepaald met nefelometrie. Antilichamen tegen dit eiwit worden toegevoegd en de intensiteit van het verstrooide licht wordt gemeten. 3.1.8. 3.1.8.1. Totaal eiwitbepaling Materialen Cobas 8000 c701 module (Roche Diagnostics, Basel, Zwitserland) 21 3.1.8.2. Principe en uitvoering De totale eiwitconcentratie wordt bepaald met een colorimetrische assay op Cobas 8000 c701 module. Bivalente koperionen reageren met peptidebindingen in een alkalisch milieu en vormen een karakteristiek paarsgekleurd complex. De absorbantie van het complex wordt bichromatisch gemeten (700 en 546 nm). 3.2. STATISTISCHE TESTEN De statistische testen worden in deze masterproef uitgevoerd met SPSS v21 (IBM, New York, USA) of MedCalc (Mariakerke, België). 3.2.1. Mixed model Bij bepaalde experimenten worden van eenzelfde patiënt verschillende stalen geanalyseerd. Bij de analyse van deze gegevens moet er dus rekening gehouden worden met het feit dat bepaalde data afkomstig zijn van dezelfde patiënt. Voor de statistische verwerking hiervan wordt Dr. Deschepper van de cel Biostatistiek om advies gevraagd. Hiervoor wordt een lineair gemengde effecten model (Mixed models, SPSS) toegepast. Bij dit model wordt de respons van een subject aanzien als de som van een vast en een random effect. Vaste effecten zijn parameters die bepaald werden op de stalen, zoals albumine- en totale eiwitconcentratie, terwijl de patiënt ingevoerd wordt als random effect waardoor gecorrigeerd wordt voor de niet geanalyseerde patiëntenkarakteristieken. Bij de analyse wordt dan de invloed van deze ‘vaste effecten’ nagegaan op een variabele, ermee rekening houdend dat bepaalde stalen afkomstig zijn van eenzelfde patiënt. Wanneer er een model dient te worden opgesteld, moet bekeken worden welke variabelen geïncludeerd zullen worden in het model. Alle geanalyseerde variabelen toevoegen kan een model nodeloos complex maken. Om te bepalen welk statistisch model de beste informatie geeft, wordt het Akaike information criterium (AIC) bekeken. Dit is een maat voor de relatieve kwaliteit van een statistisch model en kan gebruikt worden voor de selectie van een model. Het AIC geeft een relatieve schatting van het verlies aan informatie wanneer een bepaald model gebruikt wordt. Het AIC houdt rekening met de correlatie en 22 straft af voor het aantal variabelen dat geïncludeerd wordt, dit omdat correlatie altijd toeneemt met het aantal parameters dat toegevoegd wordt aan het model. Wanneer verschillende modellen gegenereerd worden, is het voorkeursmodel dat waar AIC minimaal is. 3.2.2. Passing and Bablok regressie en Bland-Altman plot Voor de methodevergelijking wordt een Passing and Bablok regressie en een BlandAltman plot opgesteld met behulp van MedCalc. Het intercept A van de regressievergelijking is een maat voor de systematische verschillen tussen de twee methoden. Als het betrouwbaarheidsinterval voor A de waarde 0 bevat, kan besloten worden dat er geen systematisch verschil is. Uit het betrouwbaarheidsinterval voor de richtingscoëfficiënt B kan afgeleid worden of er proportionele verschillen zijn tussen de methoden. Als 1 deel uit maakt van het betrouwbaarheidsinterval is er geen proportioneel verschil. De Bland-Altman plot wordt gebruikt om een relatie tussen de verschillen en de grootte van de metingen kenbaar te maken en om eventuele outliers te identificeren. 3.3. ADIC-PROTOCOL In UZ Gent werd de ADIC-studie (Antibiotic Dosing in pediatric Intensive Care) opgestart in verband met antibiotica bij kritisch zieke kinderen op de intensieve zorg pediatrie, het brandwondencentrum en de afdeling cardiochirurgie. Kinderen die onder andere vancomycine toegediend krijgen, kunnen opgenomen worden in de studie. Huidige dosisberekeningen zijn gebaseerd op studies uitgevoerd bij relatief gezonde kinderen. Dit onderzoek wil nagaan wat de hoeveelheid antibiotica is in het bloed over verloop van tijd. Vancomycine wordt intermittent (infusietijd van een uur) of continu toegediend. In het geval van intermittente toediening worden van elke patiënt tien bloedstalen afgenomen in twee verschillende doseerintervallen, het eerste en het derde. Per dosisinterval wordt een staal genomen vóór toediening van vancomycine (predosis staal), een staal na het einde van de infusie, een distributiestaal (tussen één uur en twee uur na de start van de infusie), een staal drie uur na de start van de infusie (mid-dosis sample) en een staal zes uur na start van de 23 infusie, vlak voor de toediening van de volgende dosis (dal staal). In het geval van continue infusie worden drie stalen genomen: 12 uur na de start van de ladingsdosis, 24 uur nadien en 48 uur nadien. In sommige gevallen worden geen 10 stalen per patiënt afgenomen in het geval van intermittente toediening omwille van praktische redenen, vergetelheid van de verpleegkundigen of stopzetten van het antibioticum. Aangezien verschillende stalen per dosisinterval geanalyseerd worden in het geval van intermittente toediening, kan de oppervlakte onder de curve (AUC) berekend en vergeleken worden met de doelwaarde van 400. De AUC wordt berekend met behulp van PK Solver (Zhang et al., 2010). Deze doelwaarde van 400 voor de AUC is een 24 uurs-AUC terwijl in deze studie twee niet-opeenvolgende dosisintervallen gemonitord worden. De targetwaarde wordt daarom gecorrigeerd voor de gemonitorde tijd (in uren) met formule 3.1: Target AUC = 400 * Tijdsinterval / 24 (3.1) 24 4. RESULTATEN 4.1. 4.1.1. ULTRAFILTRATIE Spoelen In de gebruikershandleiding van Centrifree is terug te vinden dat het membraan sporen kan bevatten van het bewaarmiddel glycerine in een hoeveelheid van ongeveer 2 µl. Aangezien dit niet inherent aan het staal is, kan dit glycerine interfereren bij de analyse van de vrije concentratie. Daarnaast zorgt deze 2 µl voor verdunning van het staal, wat meer belang inwint naarmate het volume ultrafiltraat daalt. Om dit te voorkomen adviseert men in de bijsluiter (Millipore, 2012) om te spoelen met gedesioniseerd water of NaOH en minimum vijftien minuten te centrifugeren. In eerdere experimenten in het laboratorium waarbij ultrafiltratiemateriaal gespoeld werd, werd vier minuten gecentrifugeerd. Hierbij moet aandacht besteed worden aan het volume water dat vastgehouden wordt door het membraan. Als water vastgehouden wordt, zorgt dit voor verdunning van het ultrafiltraat en wordt geen correcte concentratie gemeten. Om dit te evalueren wordt het filtraatvolume gemeten bij niet spoelen, vier minuten centrifugeren en vijftien minuten centrifugeren. Onder deze condities wordt ook het verschil in vancomycineconcentratie in het ultrafiltraat bepaald. Vier Centrifree kolommen worden gevuld met 600 µl gedestilleerd water. Er worden 2 kolommen 4 minuten gecentrifugeerd en 2 kolommen 15 minuten, telkens bij 4 °C en 1885 g. Het water wordt nadien afgegoten (indien nog water achterblijft), de kolommen uitgeklopt en een halfuur gedroogd aan de lucht. In de 4 gespoelde en 2 niet gespoelde kolommen wordt 600 µl serum met vancomycine toegevoegd. Hiervoor wordt een pool van verschillende patiëntenstalen gebruikt, waarvan de totale vancomycineconcentratie 20,30 mg/l bedraagt. De kolommen worden 30 minuten gecentrifugeerd bij 4 °C en 1885 g en het ultrafiltraatvolume en de vancomycineconcentratie worden bepaald (tabel 4.1). Uit het experiment blijkt duidelijk dat vier minuten centrifugatie te kort is aangezien het volume ultrafiltraat door waterretentie verhoogt. Bij vier minuten centrifugatie zijn 25 visueel ook na de wasstap nog druppeltjes waar te nemen in het gedeelte boven het membraan, bij vijftien minuten was dit niet het geval. In de gebruikershandleiding lezen we eveneens dat tot 10 µl water opgehouden kan worden door het membraan. Aangezien het ultrafiltraatvolume slechts uit 80 µl bestaat, zorgt 10 µl water voor een relatief grote verdunning van het ultrafiltraat en zal de concentratie niet correct zijn. Dit zien we ook terug in het experiment, waar de gemeten concentratie 14 % gedaald is. Om die redenen beslissen we om niet voor te spoelen. Ook lijkt interferentie met glycerine bij de analyse geen probleem hier. Tabel 4.1: Ultrafiltraatvolume en vrije vancomycineconcentratie na wel of niet spoelen Volume (µl) Niet gespoeld 4 minuten 15 minuten 4.1.2. 80 80 95 95 85 80 Concentratie (mg/l) 8,38 8,56 6,82 6,98 7,59 6,98 Gemiddelde concentratie (mg/l) 8,47 Procentueel verschil 6,90 -18,54 % 7,29 -13,99 % Vrije fractie 41,28 % 42,17 % 33,60 % 34,38 % 37,39 % 34,38 % Herhaalbaarheid De herhaalbaarheid, ook wel within–run of intra-run precisie genoemd, wordt bepaald door de vrije vancomycineconcentratie in een pool van verschillende stalen in vijfvoud te analyseren. De vancomycineconcentratie in de pool wordt in duplo gemeten en bedraagt gemiddeld 24,0 mg/l. Het experiment wordt zowel bij 4 °C als bij 37 °C uitgevoerd zoals beschreven onder 3.1.2. Wanneer we de herhaalbaarheid van ultrafiltratie bekijken, bekomen we bij 4 °C een CV van 2,9 % en bij 37 °C 1,8 % (tabel 4.2). Deze variabiliteit is een combinatie van de precisie van de ultrafiltratie en de precisie van de analysemethode om vancomycine te bepalen. Ter vergelijking kijken we de within-run CV op de controlestandaarden na. Deze bedragen 2,05; 1,15 en 1,36 % in oplopende concentratie (n = 6). 26 Tabel 4.2: Herhaalbaarheid van ultrafiltratie ter bepaling van de vrije concentratie 1 2 3 4 5 Gemiddelde Stdev CV Vrije concentratie 4 °C (mg/l) 12,27 12,70 12,04 11,75 12,38 12,23 0,36 2,9 % Vrije fractie 4 °C 51,21 % 53,01 % 50,25 % 49,04 % 51,67 % 51,04 % Vrije concentratie 37 °C (mg/l) 16,11 15,38 15,48 15,79 15,68 15,69 0,29 1,8 % Vrije fractie 37 °C 67,24 % 64,19 % 64,61 % 65,90 % 65,44 % 65,48 % Stdev: standaarddeviatie, CV: variatiecoëfficiënt 4.1.3. Reproduceerbaarheid De reproduceerbaarheid, ofwel between-run, day to day of inter-run precisie, wordt bepaald door op zes verschillende dagen de vrije vancomycineconcentratie te bepalen via ultrafiltratie. Hiervoor wordt een pool van patiëntenstalen gebruikt, waarvan de totale vancomycineconcentratie 21,6 mg/l bedraagt. Dit is het gemiddelde van de totale concentraties bepaald op dag 1 en dag 6. Er wordt gecentrifugeerd bij 4 °C (volgens 3.1.2). Tabel 4.3: Reproduceerbaarheid van ultrafiltratie ter bepaling van de vrije concentratie van vancomycine 1 2 3 4 5 6 Gemiddelde Stdev CV Totale concentratie (mg/l) 21,35 21,82 21,59 Vrije concentratie (mg/l) 12,15 12,30 12,02 11,15 11,95 11,60 11,86 0,42 3,5 % Vrije fractie 56,29 % 56,98 % 55,69 % 51,66 % 55,36 % 53,74 % 54,95 % Stdev: standaarddeviatie, CV: variatiecoëfficiënt De variatiecoëfficiënt op de metingen van de vrije concentratie is een maat voor de reproduceerbaarheid en bedraagt 3,5 %. De between-run CV op het controlemateriaal van 27 de vancomycinebepaling bedraagt 4,38; 4,09 en 4,34 % voor de verschillende concentraties (n = 18). Ultrafiltratie is dus een herhaalbare en reproduceerbare methode ter bepaling van de vrije concentratie. 4.1.4. Niet-specifieke adsorptie Bij ultrafiltratie zorgt niet-specifieke adsorptie voor een daling van antibioticum in het ultrafiltraat. Om te vermijden dat de vrije concentratie te laag zou worden geschat, gaan we de niet-specifieke adsorptie na van vancomycine. In de bijsluiter (Millipore, 2012) wordt aangeraden van het experiment uit te voeren met ultrafiltraat als medium, vanwege de grotere overeenkomst met serum in vergelijking met buffer. Ultrafiltraat afkomstig van patiëntenstalen met vancomycine wordt gepoold en de concentratie wordt in duplo bepaald. In twee kolommen wordt 500 µl ultrafiltraat gebracht en deze worden 30 minuten bij 37 °C op 1885 g gecentrifugeerd. Er is nadien geen vloeistof meer zichtbaar boven het membraan. Uit tabel 4.4 kunnen we besluiten dat er geen niet-specifieke adsorptie optreedt. Wanneer we een gepaarde t-test uitvoeren op de resultaten besluiten we dat de gemiddelden niet significant van elkaar verschillen (p = 0,075). Het experiment bevestigt wat er in de literatuur terug te vinden is, namelijk dat vancomycine minimaal adsorbeert aan de Centrifree kolom (Butterfield et al., 2011) (Sun et al., 1993). Tabel 4.4: Concentraties ter bepaling van de niet-specifieke adsorptie van vancomycine 1 2 Gemiddelde 4.2. 4.2.1. Concentratie vooraf (mg/l) 16,84 17,00 16,92 Concentratie nadien (mg/l) 17,64 17,63 17,64 EVENWICHTSDIALYSE Stabiliteit Om een evenwicht te bereiken bij evenwichtsdialyse wordt de dialyser 24 ± 1 uren in een schuddend warmwaterbad geplaatst bij 37 °C. Om de vrije concentratie correct te kunnen meten, is het noodzakelijk dat beide antibiotica minimum 24 uur stabiel blijven bij 28 37 °C. Hiervoor wordt de glycopeptideconcentratie in zes verschillende patiëntenstalen gemeten vooraf en nadat de stalen 24 uur in een broedstoof op 37 °C doorgebracht hebben. Tabel 4.5: Stabiliteit van vancomycine na 24 uur bij 37 °C Vancomycine Oorspronkelijke Concentratie concentratie (mg/l) nadien (mg/l) 27,03 26,51 19,73 18,87 28,96 27,12 1 2 3 Gemiddelde Verschil (mg/l) -0,52 -0,86 -1,84 Procentueel verschil -1,92 % -4,36 % -6,35 % -4,21 % Recovery 98,08 % 95,64 % 93,65 % 95,79 % Tabel 4.6: Stabiliteit van teicoplanine na 24 uur bij 37 °C Teicoplanine Oorspronkelijke Concentratie concentratie (mg/l) nadien (mg/l) 18,67 18,33 15,91 13,35 18,72 16,69 4 5 6 Gemiddelde Verschil (mg/l) -0,34 -2,56 -2,03 Procentueel verschil -1,82 % -16,09 % -10,84 % -9,59 % Recovery 98,18 % 83,91 % 89,16 % 90,41 % De gemiddelde procentuele terugvinding na 24 uur bewaring bij 37 °C bedraagt voor vancomycine 95,8 % (tabel 4.5) en voor teicoplanine 90,4 % (tabel 4.6). De beperktheid van dit experiment indachtig, besluiten we dat deze componenten voldoende stabiel zijn om evenwichtsdialyse te kunnen uitvoeren. Eerdere studies toonden hetzelfde gegeven aan voor vancomycine, waar het staal meer dan 90 % van zijn oorspronkelijke concentratie behield na 72 uur bij 37 °C (LaPlante et al., 2012) (Battistella et al., 2009) en meer dan 94 % recovery vertoonde na 24 uur (Nornoo and Elwell, 2006). Voor teicoplanine stelt de literatuur enkel dat het antibioticum stabiel is voor 8 uur bij 37 °C (Manduru et al., 1996). 4.2.2. Herhaalbaarheid De herhaalbaarheid van evenwichtsdialyse ter bepaling van de vrije concentratie van vancomycine wordt bepaald door een pool van patiëntenstalen te dialyseren in vijfvoud. Er wordt 1 ml serum wordt gedialyseerd tegenover 1 ml buffer. De totale 29 vancomycineconcentratie in de pool wordt in duplo bepaald, waarvan het gemiddelde 23,3 mg/l bedraagt. Tabel 4.7: Herhaalbaarheid van evenwichtsdialyse van vancomycine 1 2 3 4 5 Gemiddelde Stdev CV Concentratie buffer (mg/l) 7,65 7,99 7,76 7,98 8,02 7,88 0,17 2,1 % Concentratie serum (mg/l) 12,00 13,32 13,94 13,68 14,15 13,42 0,85 6,3 % Vrije fractie 63,75 % 59,98 % 55,67 % 58,33 % 56,68 % 58,88 % Vrije concentratie (mg/l) 14,84 13,97 12,96 13,58 13,20 13,71 0,74 5,4 % Recovery 84,39 % 91,52 % 93,19 % 93,02 % 95,21 % 91,47 % Stdev: standaarddeviatie, CV: variatiecoëfficiënt De variatiecoëfficiënt op de berekende vrije concentraties bedraagt 5,4 %, wat hoger is dan bij ultrafiltratie (zie 4.1.2). 4.2.3. Niet-specifieke adsorptie Uit de data van het experiment in verband met de herhaalbaarheid (tabel 4.7) hebben we een idee van de mate van de niet-specifieke adsorptie. De gemiddelde terugvinding van vancomycine na evenwichtsdialyse (n = 5) bedraagt 91,5 %. 4.2.4. Effect van dilutie Evenwichtsdialyse is thermodynamisch equivalent aan verdunning van het serumstaal, waardoor het evenwicht tussen vrij en gebonden antibioticum kan verschuiven. Om na te gaan hoe groot het effect van dilutie is op de bepaling van de vrije fractie, worden verschillende volumes serum van dezelfde pool gedialyseerd ten opzichte van eenzelfde volume buffer. Er wordt 1 ml serum en 0,5 ml serum gedialyseerd ten opzichte van 0,5 ml buffer, telkens in enkelvoud. Bij de dialyser waar 1 ml serum gebruikt wordt, treedt minder verdunning op en verwachten we een lagere vrije fractie dan waar 0,5 ml serum gebruikt wordt. De totale vancomycineconcentratie in de pool is 23,1 mg/l. 30 Uit dit oriënterend experiment met een beperkt aantal stalen waarbij de vrije fractie daalt met 2,3 % (tabel 4.8) besluiten we dat het effect van dilutie bij evenwichtsdialyse minimaal is. Tabel 4.8: Effect van dilutie op de vrije concentratiebepaling van vancomycine Staal 1 ml 0,5 ml 4.3. 4.3.1. Concentratie buffer (mg/l) 12,37 9,23 Concentratie serum (mg/l) 17,14 12,39 Vrije fractie 72,17 % 74,50 % Vrije concentratie (mg/l) 16,69 17,23 VANCOMYCINE Matrixeffect Na ultrafiltratie of evenwichtsdialyse dient de vrije vancomycineconcentratie te worden bepaald in ultrafiltraat of dialysebuffer. De routine-analyse is gevalideerd om vancomycine te bepalen in serum of plasma, zodus moet er nagegaan worden of deze methode ook gebruikt kan worden om vancomycine te bepalen in een andere matrix. Om te controleren of het matrixeffect een rol speelt bij de bepaling van vancomycine worden verdunningsreeksen gemaakt van de kwaliteitscontrole (QC) voor vancomycine met de hoogste concentratie (Liquichek immunoassay plus control Level 3, Bio Rad, Hercules, US). We maken een verdunningsreeks aan in vancomycine-vrij serum van een gezonde vrijwilliger en een verdunningsreeks in ultrafiltraat. Vanuit een staal volbloed van een vrijwilliger wordt serum bekomen door 8 minuten te centrifugeren op 1880 g. Het serum heeft een totale eiwitconcentratie van 78,9 g/l en een albumineconcentratie van 52,5 g/l. Ongeveer 1 ml serum wordt in de koelkast geplaatst, terwijl het andere deel ultrafiltratie ondergaat. Het serum wordt met Centrifree 30 minuten gecentrifugeerd op 1885 g bij 37 °C. Het ultrafiltraat wordt opgevangen om de verdunningsreeks aan te maken. Reeks A wordt bereid met eiwitrijk serum, reeks B met eiwitvrij ultrafiltraat (tabel 4.9). Het totale eindvolume is van elke verdunning 400 µl. 31 Tabel 4.9: Verhoudingen voor het aanmaken van de verdunningsreeks Kwaliteitscontrole Eiwitrijk serum Eiwitvrij ultrafiltraat 1A 1 2 1B 1 2A 1 3 2B 1 2 3A 1 4 3 3B 1 4 De verdunningsreeks met eiwitvrij ultrafiltraat is niet volledig eiwitvrij aangezien de kwaliteitscontrole ook eiwit bevat. De finale eiwit- en albumineconcentratie wordt bepaald van de verdunningsreeks met ultrafiltraat (tabel 4.9). De eiwitconcentratie is 75 tot 85 % lager dan de verdunningsreeks met eiwitrijk serum. De vancomycineconcentratie wordt vier uur na het aanmaken van de verdunningsreeks in triplo gemeten (tabel 4.10). Tabel 4.9: Eiwitconcentratie in verdunningsreeks met ultrafiltraat Totaal eiwit (g/l) Albumine (g/l) 1B 19,1 11,0 2B 14,6 8,4 3B 12,1 6,4 Tabel 4.10: Vancomycineconcentratie van de verdunningsreeksen 1 2 3 Gemiddelde 1/3 verdunning Serum Ultrafiltraat 11,82 12,37 12,14 12,76 12,27 12,41 12,08 12,51 1/4 verdunning Serum Ultrafiltraat 9,91 9,36 9,38 9,09 9,60 9,47 9,63 9,31 1/5 verdunning Serum Ultrafiltraat 7,03 7,38 7,14 7,62 7,23 7,72 7,13 7,57 Om na te gaan of het verschil in gemeten concentraties tussen de twee matrices significant verschillend is, voeren we een ongepaarde t-test uit op de resultaten. De 1/3 en 1/4 verdunning geven geen significant verschil van gemiddelde. Het verschil in concentratie bij de 1/5 verdunning is wel significant op basis van het 5 % significantieniveau (p = 0,019). Ondanks het significante verschil bij de 1/5 verdunning beschouwen we dit verschil als minimaal. De kalibratiecurve voor de bepaling van totaal vancomycine in serum kan ook gebruikt worden om vancomycine te bepalen in een matrix met zeer lage eiwitconcentratie. 32 4.3.2. Invloed van een vries-dooi cyclus op de vrije fractie Door een staal in te vriezen en opnieuw te ontdooien voor analyse kan de eiwitbinding veranderen. Een studie onderzocht de invloed van een vries-dooi cyclus en kwam tot de vaststelling dat de eiwitbinding sterk verschilt tussen een vers en een ontdooid staal. De gemiddelde eiwitbinding daalde van 54,0 % voor invriezen naar 40,2 % na een vries-dooi cyclus 30 dagen later (Butterfield et al., 2011). Deze studie werd uitgevoerd met serumstalen waarin vancomycine gespiked werd. We gaan na of de invloed van een vriesdooi cyclus op eiwitbinding ook kan aangetoond worden in patiëntenstalen met vancomycine. Hiervoor worden 3 verse stalen binnen 4 uur na afname geanalyseerd. De vrije concentratie wordt bepaald door middel van ultrafiltratie bij 4 °C. Een tweede deel van het staal wordt ingevroren en de volgende dag ontdooid om de totale en vrije vancomycineconcentratie op dezelfde manier te bepalen (tabel 4.11). Bij alle stalen stellen we een stijging van de vrije fractie vast door een vries-dooi cyclus. De vrije fractie stijgt echter niet meer dan 5 %. Bij voorkeur wordt de eiwitbinding bepaald op een vers staal. Tabel 4.11: Invloed van een vries-dooi cyclus op de eiwitbinding van vancomycine 1 2 3 Totaal (mg/l) 11,87 19,62 12,81 4.3.3. Vooraf Vrij (mg/l) 7,19 8,83 7,16 Vrije fractie 60,57 % 45,01 % 55,89 % Na vries-dooi cyclus Totaal (mg/l) Vrij (mg/l) Vrije fractie 12,36 7,98 64,56 % 20,63 10,19 49,39 % 12,69 7,14 56,26 % Methodevergelijking 4.3.3.1. Analyse van de vrije concentratie Om de meest geschikte methode te vinden om de vrije vancomycineconcentratie te bepalen, wordt een methodevergelijking uitgevoerd. Hierbij wordt de eiwitbinding in 11 Liheparine plasmastalen en 28 serumstalen (van 22 verschillende patiënten) bepaald met behulp van evenwichtsdialyse, ultrafiltratie bij 4 en 37 °C. 33 Uit de resultaten (figuren 4.1 en 4.2) kunnen we besluiten dat de temperatuur voor ultrafiltratie een cruciale factor is en dient gecontroleerd te worden. We voeren een gepaarde t-test uit op de resultaten, om te bepalen of de gemiddelde vrije concentraties statistisch significant van elkaar verschillen. De vrije concentratie, gemeten met behulp van ultrafiltratie bij 4 °C, ligt lager dan bij de andere methoden en de gemiddelden verschillen statistisch significant (p < 0,001). Ultrafiltratie bij 37 °C geeft een hogere gemiddelde vrije concentratie dan evenwichtsdialyse en dit verschil is statistisch niet significant op het 5 % significantieniveau (p = 0,135). Figuur 4.1 en 4.2: Boxplot van de vrije concentratie en vrije fractie aan vancomycine bepaald met evenwichtsdialyse (ED), ultrafiltratie bij 37 °C (UF 37 °C) en ultrafiltratie bij 4 °C (UF 4 °C). * toont aan dat de vrije fractie en de vrije concentratie bij UF 4 °C statistisch significant verschilt van ED en UF 37 °C. We vergelijken ultrafiltratie bij 37 °C en evenwichtsdialyse verder door een Passing and Bablok regressie (figuur 4.3) en een Bland-Altman plot (figuur 4.4) op te stellen met behulp van MedCalc (MedCalc Software, Mariakerke, België). Figuur 4.3 stelt visueel de Passing and Bablok regressie voor, waarbij de meest ideale rechte voor gelijkwaardige methoden voorgesteld wordt in stippelijn en de meest passende rechte voor deze data in volle lijn. Het betrouwbaarheidsinterval voor A bevat de waarde 0, dus kan besloten worden dat er geen systematisch verschil is tussen beide methoden. Aangezien 1 deel uit maakt van het betrouwbaarheidsinterval voor B is er geen proportioneel verschil tussen ultrafiltratie bij 37 °C en evenwichtsdialyse. Figuur 4.4 stelt het verschil tussen de metingen voor in functie 34 van het gemiddelde van de metingen. De Bland-Altman plot toont aan dat er geen outliers zijn en geen proportionele of systematische verschillen. Er is wel een relatie te zien tussen de grootte en de verschillen van de metingen. Figuur 4.3: Passing and Bablok regressie. Figuur 4.4: Bland-Altman plot. ED staat ED staat voor evenwichtsdialyse, UF 37 °C voor evenwichtsdialyse en UF 37 °C voor voor ultrafiltratie bij 37 °C en BI voor ultrafiltratie bij 37 °C. betrouwbaarheidsinterval. 4.3.3.2. Correlatie De vrije concentratie bepaald door middel van ultrafiltratie bij 4 °C correleert sterk met de vrije concentratie bepaald bij 37 °C (Pearson correlatiecoëfficiënt 0,96) (figuur 4.5). De vrije fractie, geanalyseerd met behulp van ultrafiltratie bij 37 °C, varieert van 58,8 tot 86,7 % met een gemiddelde van 74,4 %. De vrije concentratie varieert van 5,9 tot 26,0 mg/l met een gemiddelde van 17,0 mg/l. Wanneer we de correlatie bekijken tussen de vrije en de totale vancomycineconcentratie (figuur 4.6), bekomen we een Pearson correlatiecoëfficiënt (r) van 0,949. Hiermee kan de determinatiecoëfficiënt (r²) berekend worden, wat 0,90 is. 35 25,00 30,00 y = 1,30x + 1,69 R² = 0,92 Vrije concentratie (mg/l) Vrije concentratie 37 °C (mg/l) 30,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 y = 0,68x + 1,13 R² = 0,90 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 0,00 Vrije concentratie 4 °C (mg/l) 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 Totale concentratie (mg/l) Figuur 4.5: Vrije concentratie bepaald met Figuur 4.6: Correlatie tussen de totale en de ultrafiltratie bij 37 °C in functie van de vrije vrije vancomycineconcentratie bepaald met concentratie bij 4 °C ultrafiltratie bij 37 °C 4.3.3.3. Invloed van eiwitconcentraties In de literatuur vinden we terug dat vancomycine voornamelijk bindt aan albumine en IgA (Sun et al., 1993) (Zokufa et al., 1989). Een publicatie kon ook een verband aantonen met de α1-zure glycoproteïneconcentratie (Morita and Yamaji, 1995). Deze drie parameters en de totale eiwitconcentratie worden bepaald voor de 39 stalen om hun invloed op de vrije fractie te kunnen analyseren (tabel 4.12). Tabel 4.12: Samenvatting van de stalen gebruikt voor de methodevergelijking Minimum Maximum Gemiddelde Albumine (g/l) 17,4 41,0 27,6 IgA (g/l) 0,23 5,08 2,60 α1-zure glycoproteïne (g/l) 0,89 3,32 1,92 Totaal eiwit (g/l) 31,9 68,3 51,7 In de Mixed models analyse zijn albumine, IgA, α1-zure glycoproteïne en totaal eiwit vaste effecten, terwijl de patiënt ingevoerd wordt als random effect waardoor gecorrigeerd wordt voor de niet geanalyseerde patiëntkarakteristieken. Bij de analyse van de invloed van alle variabelen, blijkt enkel de totale eiwitconcentratie significant (p = 0,024) van invloed op 36 de vrije fractie. Bij een toename van de totale eiwitconcentratie met 10 g/l daalt de vrije fractie gemiddeld met 3,6 %. 4.3.3.4. Intrapatiënt variabiliteit Van patiënten waarvan meer dan één staal geanalyseerd wordt, kan de intrapatiënt variabiliteit bekeken worden (figuur 4.7). Zo varieert de vrije fractie van patiënt 13 van 86,7 naar 65,8 % in vijf dagen. Ook van patiënt 15 varieert de vrije fractie sterk over 5 dagen, van 63,8 naar 76,4 %. Figuur 4.7: Intrapatiënt variabiliteit in vrije fractie (ultrafiltratie bij 37 °C) vancomycine 4.3.4. Resultaten ADIC-studie In totaal werden tot dusver 73 vancomycinestalen voor de ADIC-studie afgenomen van 13 verschillende patiënten. Tabel 4.13 geeft een overzicht van de patiënten. Van elk staal wordt de totale en vrije vancomycineconcentratie bepaald met behulp van ultrafiltratie bij 37 °C. Als bijkomende parameters worden albumine, totaal eiwit, totaal bilirubine en ureum bepaald (tabel 4.14). 37 Tabel 4.13: Patiëntkarakteristieken ADIC-studie Patiënt Geslacht a 10 11 12 16 20 24 27 34 39 46 48 54 55 V V V M M M V V M V V V V Leeftijd (jaar) 0,25 6,00 0,50 12,00 3,50 0,83 5,00 3,25 3,33 1,42 0,92 1,50 9,00 Lengte (cm) 51 115 57 159 104 73 105 n.b. 98 78 71 n.b. 128 Gewicht (kg) 3,65 20 4,6 56 19 9,3 15 10 17 11 6,2 n.b. 28 Dosis (mg) 34 300 70 500 285 140 225 150 300 165 90 160 390 Dosis/gewicht (mg/kg) 9,32 15,00 15,22 8,93 15,00 15,05 15,00 15,00 17,65 15,00 14,52 n.b. 13,93 Geslacht: V = vrouwelijk, M = mannelijk, n.b.: niet bekend Tabel 4.14: Resultaten van de analyse op stalen van kritisch zieke kinderen Albumine (g/l) Maximum Minimum Gemiddelde 36,6 20,8 30,9 Totaal bilirubine (mg/dl) 0,46 0,05 0,26 Totaal eiwit (g/l) 70,7 40,5 56,1 Ureum (g/l) 34,3 5,4 19,3 Totale concentratie (mg/l) 67,7 2,1 22,5 Vrije concentratie (mg/l) 43,2 1,2 14,6 Vrije fractie 81,24 % 55,95 % 65,80 % Ter illustratie wordt van patiënt 27 de gemeten vancomycineconcentratie weergegeven tijdens het eerste en derde dosisinterval in figuur 4.8. In tabel 4.15 wordt elk dosisinterval geëvalueerd. De AUC van de eerste dosis bij patiënt 34 en 48 wordt slechts berekend met behulp van vier meetpunten, in tegenstelling tot vijf meetpunten bij de andere patiënten, omdat geen staal werd afgenomen van de dalspiegel. Telkens is de gemeten dalconcentratie lager dan 10 mg/l. 38 Figuur 4.8: Verloop van het eerste en het derde dosisinterval bij patiënt 27, representatief voor de andere patiënten Tabel 4.15: Evaluatie van de bereikte AUC en dalconcentratie van elk dosisinterval ID Nr dosis 1-11-V 1-11-V 1-12-V 1-16-V 1-24-V 1-24-V 1-27-V 1-27-V 1-34-V 1-34-V 1-39-V 1-46-V 1-48-V 1-54-V 1 6 1 1 1 3 1 3 1 3 3 3 1 3 Dosis (mg) 300 300 70 500 140 140 225 225 150 150 300 165 90 160 AUC 69,84 95,24 71,59 54,76 107,17 125,73 100,79 143,26 83,14 99,68 112,46 123,08 66,83 119,17 Tijdsinterval (uur) 6,04 4,02 5,98 5,65 6,00 6,00 6,27 6,00 3,93 4,10 5,88 5,97 3,07 5,65 Target AUC 100,63 66,95 99,67 94,17 100,00 100,00 104,50 100,00 65,50 68,33 98,05 99,45 51,11 94,17 Voldaan? ONWAAR WAAR ONWAAR ONWAAR WAAR WAAR ONWAAR WAAR WAAR WAAR WAAR WAAR WAAR WAAR Dalconcentratie (mg/l) 2,06 8,75 8,47 4,79 9,72 8,98 3,77 6,99 n.b. 6,02 5,83 8,70 n.b. 6,39 n.b.: niet bepaald wegens ontbreken staal, de kolom ‘Voldaan?’ geeft aan of de target AUC gehaald wordt De vrije fractie, geanalyseerd met behulp van ultrafiltratie bij 37 °C, varieert van 56,0 tot 81,2 % met een gemiddelde van 66,1 %. De vrije concentratie varieert van 1,2 tot 43,2 mg/l met een gemiddelde van 14,8 mg/l. De Pearson correlatiecoëfficiënt van de vrije 39 met de totale vancomycineconcentratie aan bedraagt 0,995. De determinatiecoëfficiënt Vrije concentratie (mg/l) bedraagt dan 0,99 (figuur 4.9). 50 y = 0,65x + 0,21 R² = 0,99 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 Totale concentratie (mg/l) Figuur 4.9: Correlatie tussen totale en vrije vancomycineconcentratie bij kritisch zieke kinderen Naast de vrije en totale vancomycineconcentratie wordt voor alle stalen ook de totale eiwit-, de totale bilirubine-, de albumine- en de ureumconcentratie bepaald in de stalen. Net als bij de methodevergelijking werken we ook hier opnieuw met verschillende stalen van eenzelfde patiënt. Hiermee wordt rekening gehouden wanneer we de data analyseren met behulp van Mixed models. In deze analyse zijn dosisinterval, staalnummer, leeftijd, lengte, gewicht, albumine, totaal eiwit, ureum en totaal bilirubine vaste effecten, terwijl de patiënt ingevoerd wordt als random effect waardoor gecorrigeerd wordt voor de niet geanalyseerde patiëntkarakteristieken. Bij de analyse van de invloed van alle variabelen apart, blijkt enkel de totale eiwit- en albumineconcentratie significant (p < 0,05). Wanneer de totale eiwit- en albumineconcentratie samen in het model gebracht worden, blijkt enkel de totale eiwitconcentratie significant. De verklaring hiervan ligt in het feit dat albumine geïncludeerd is in de totale eiwitconcentratie en dus geen aanvullende verklaring van de variabiliteit op de vrije fractie kan geven. Om te bepalen welk statistisch model de beste informatie geeft, wordt het Akaike information criterium (AIC) bekeken. Als we een model opstellen waarbij de invloed van alle 40 parameters individueel nagegaan wordt op de vrije fractie, blijkt het model met de totale eiwitconcentratie het laagste AIC te genereren. Vertrekkend vanuit dit model voegen we alle andere variabelen apart toe, om hun invloed op het AIC te bekijken. Geen enkel model met de totale eiwitconcentratie en een andere variabele geïncludeerd, heeft een kleinere AIC dan het model met de totale eiwitconcentratie alleen. Hieruit kunnen we afleiden dat de vrije fractie met 3,9 % daalt wanneer de totale eiwitconcentratie met 10 g/l toeneemt. Net zoals voor de stalen van de methodevergelijking, kan de intrapatiënt variabiliteit bij kritisch zieke kinderen bekeken worden (figuur 4.10). Er is geen verband tussen de vrije fractie en de plaats in het dosisinterval waar het staal genomen werd (op basis van de Mixed model analyse). Om na te gaan of er een verschil is in vrije fractie en de totale eiwitconcentratie tussen beide dosisintervallen, voeren we voor die patiënten waarvan 2 dosisintervallen gemonitord zijn (patiënt 11, 24, 27, 34) een gepaarde t-test uit. Voor elk van deze patiënten is de vrije fractie en de totale eiwitconcentratie niet significant verschillend (p > 0,05) tussen de twee dosisintervallen. Figuur 4.10: Boxplot ter illustratie van de variabiliteit in vrije fractie vancomycine bij kritisch zieke kinderen 41 4.3.5. Peritoneaal dialysevocht Bij peritoneale dialyse vindt er uitwisseling van opgeloste stoffen tussen serum en het dialysevocht over het buikvlies plaats en zo kan geredeneerd worden dat de vancomycineconcentratie in de dialysevloeistof gelijk is aan de vrije concentratie in serum (Seguin et al., 2009). Op een vers serumstaal en continu ambulant dialysevocht (CAPD-vocht) wordt de vrije en de totale vancomycineconcentratie bepaald, net als de albumine- en totale eiwitconcentratie (tabel 4.16). Tabel 4.16: Analyse van serum en CAPD-vocht Totale concentratie (mg/l) 17,81 8,37 Serum CAPD 4.4. Vrije concentratie (mg/l) 14,28 8,57 Vrije fractie 80,18 % 102,39 % Albumine (g/l) 24,5 1,6 Totaal eiwit (g/l) 50,3 1,7 TEICOPLANINE 4.4.1. Kalibratiecurve voor vrij teicoplanine Om vrij teicoplanine te kunnen meten wordt een kalibratiecurve opgesteld. Om een verdunningsreeks te maken, wordt een Targocid (Sanofi-Aventis, Parijs, Frankrijk) stockoplossing bereid. De stockoplossing wordt verdund met ultrafiltraat (zie 4.3.1 voor de aanmaak van ultrafiltraat) en een kalibratiecurve voor Teico Free wordt opgesteld (figuur 4.11). De test om teicoplanine in serum te bepalen, wordt verder Teico QMS genoemd. 0,2 Respons 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0 1 2 3 4 5 6 Concentratie (mg/l) Figuur 4.11: Kalibratiecurve voor Teico Free 42 4.4.2. Matrixeffect We gaan na of er een matrixeffect is bij de concentratiebepaling van teicoplanine door vier verschillende matrices te vergelijken: serum, ultrafiltraat, fysiologisch water en buffer. Om na te gaan in welke mate een matrixeffect optreedt bij de analyse van vrij teicoplanine na ultrafiltratie, wordt de Targocid stockoplossing gespiked in serum en in ultrafiltraat. Beide verdunningsreeksen worden geanalyseerd met behulp van Teico Free in duplo. De waarden weergegeven in tabel 4.17 zijn gemiddelden van de metingen. Uit de resultaten blijkt dat er een matrixeffect meespeelt bij de analyse van teicoplanine en dat teicoplanine in serum niet kan bepaald worden met de Teico Free kalibratie. Ook wordt de Targocid kalibrator gespiked in ultrafiltraat en gemeten met Teico QMS. De theoretische concentratie van deze verdunning is 10,0 mg/l terwijl 6,3 mg/l (gemiddelde waarde na meting in duplo) gerapporteerd wordt. Het is niet mogelijk om teicoplanine in ultrafiltraat te bepalen met Teico QMS. Tabel 4.17: Teicoplaninebepaling met Teico Free van een verdunningsreeks in serum en ultrafiltraat Berekende concentratie (mg/l) 0,00 0,50 1,00 2,00 3,00 5,00 Concentratie in serum (mg/l) 1,27 2,68 2,80 1,08 5,00 5,00 Concentratie in ultrafiltraat (mg/l) 0,16 0,83 1,19 2,18 3,30 5,00 Als een concentratie van 5,00 mg/l gerapporteerd wordt ligt de gemeten concentratie buiten de kalibratie. Aangezien ultrafiltraat commercieel niet verkrijgbaar is, zou het praktisch eenvoudiger zijn om kwaliteitscontroles te kunnen aanmaken in fysiologisch water. Hiervoor wordt de Targocid kalibrator gespiked in fysiologisch water en gemeten met behulp van Teico Free in duplo. Tabel 4.18 toont aan dat ook ultrafiltraat en fysiologisch water niet gelijkwaardig zijn en geen kalibratoren kunnen aangemaakt worden in fysiologisch water. 43 Tabel 4.18: Teicoplaninebepaling met van een verdunningsreeks in fysiologisch water Berekende concentratie (mg/l) 0,00 0,50 1,00 2,00 3,00 5,00 Meting 1 (mg/l) 0,00 0,35 0,62 0,79 1,01 1,59 Meting 2 (mg/l) 0,00 0,37 0,65 0,79 0,89 1,44 Gemiddelde concentratie (mg/l) 0,00 0,36 0,64 0,79 0,95 1,52 Ter controle van de verdunningsreeks wordt een 1 op 2 verdunning gemaakt in ultrafiltraat, vertrekkend van de verdunning met fysiologisch water met een theoretische concentratie van 10 mg/l. Na verdunning met ultrafiltraat is de theoretische concentratie 5 mg/l. De gemeten concentratie (Teico Free) is 3,2 mg/l, opvallend hoger dan 1,5 mg/l gemeten bij de verdunning met fysiologisch water. Omdat de vrije fractie bij evenwichtsdialyse moet gemeten worden in buffervloeistof en de kalibratiecurve opgesteld wordt in ultrafiltraat, moet bepaald worden of het matrixeffect een rol speelt. Hiervoor wordt de Targocid kalibrator gespiked in bufferoplossing en de concentratie gemeten met de Teico Free kalibratie. De berekende concentratie van de oplossing is 3,0 mg/l, terwijl 0,9 mg/l gemeten wordt. Door het matrixeffect kan teicoplanine niet correct bepaald worden in de bufferoplossing met de Teico Free kalibratie. Bij deze methodevergelijking kan dus niet vergeleken worden met de eiwitbinding bepaald met evenwichtsdialyse. 4.4.3. Methodevergelijking 4.4.3.1. Analyse van de vrije concentratie Net zoals voor vancomycine wordt evenwichtsdialyse vergeleken met ultrafiltratie bij 4 en 37 °C ter bepaling van de eiwitbinding van teicoplanine. Omdat er onvoldoende staal per patiënt beschikbaar was in bepaalde gevallen, wordt de voorkeur gegeven aan evenwichtsdialyse en ultrafiltratie bij 37 °C aangezien deze vergelijkbare resultaten gaven voor vancomycine. Voor 22 stalen (van 11 verschillende patiënten) wordt evenwichtsdialyse 44 en ultrafiltratie bij 37 °C uitgevoerd, waarvan 11 stalen (van 5 verschillende patiënten) ook ultrafiltratie bij 4 °C ondergaan. Teicoplanine bindt voornamelijk op albumine en deze parameter wordt in elk staal eveneens bepaald (Yano et al., 2007). Ter controle van de kalibratiecurve voor vrij teicoplanine werden twee kwaliteitscontroles (QC) meegenomen. Op eenzelfde dag wordt gekalibreerd voor Teico QMS en Teico Free, worden de kwaliteitscontroles bepaald en alle stalen geanalyseerd. Tabel 4.19 toont de resultaten van de meting in enkelvoud van de dag waarop de analyses gebeuren. Wegens gebrek aan commercieel beschikbare kwaliteitscontroles voor vrij teicoplanine wordt gebruik gemaakt van Targocid gespiked in ultrafiltraat. Tabel 4.19: Gemeten concentraties van QC voor teicoplanine Teico QMS Teico Free Target Gemeten Target Gemeten Concentratie (mg/l) 9,63 32,53 8,86 33,00 0,80 4,00 1,32 4,82 67,24 72,65 Uit de resultaten van de methodevergelijking (figuur 4.12 en 4.13) blijkt dat teicoplanine gemiddeld voor 87,1 % gebonden is wanneer de ultrafiltratie gebeurt bij 4 °C en gemiddeld voor 82,9 % wanneer de ultrafiltratie gebeurt bij 37 °C. Figuur 4.12 en 4.13: Boxplot van de vrije concentratie en vrije fractie aan teicoplanine bepaald met ultrafiltratie bij 37 °C (UF 37 °C) en ultrafiltratie bij 4 °C (UF 4 °C) 45 Om na te gaan of de gemiddelde vrije concentraties in beide groepen significant verschillen, voeren we een gepaarde t-test uit. Hieruit blijkt dat het gemiddelde tussen beide groepen significant van elkaar verschilt (p = 0,002). Ultrafiltratie bij en bij 37 °C zijn dus niet onderling uitwisselbaar om de eiwitbinding van teicoplanine te bepalen. 4.4.3.2. Correlatie De vrije concentratie na ultrafiltratie bij 4 °C correleert met de vrije concentratie bij 6,00 7,00 y = 1,31x + 0,23 R² = 0,81 5,00 Vrije concentratie (mg/l) Vrije concentratie 37 °C (mg/l) 37 °C met een Pearson correlatiecoëfficiënt (r) van 0,900 (figuur 4.14). 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 y = 0,075x + 1,47 R² = 0,71 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 0,00 Vrije concentratie 4 °C (mg/l) 20,00 40,00 60,00 Totale concentratie (mg/l) Figuur 4.14: Vrije concentratie bepaald Figuur 4.15: Vrije concentratie bepaald met ultrafiltratie bij 37 °C in functie van met ultrafiltratie bij 37 °C in functie van de vrije concentratie bij 4 °C de totale concentratie De vrije concentratie bepaald met ultrafiltratie bij 37 °C correleert met de totale concentratie (Pearson correlatiecoëfficiënt (r) 0,844). Dit betekent dat 71 % van de variantie op de vrije concentratie kan verklaard worden door de totale concentratie (figuur 4.15). 4.4.3.3. Verband met eiwitconcentratie Teicoplanine bindt preferentieel op albumine. Yano et al (2007) stelde een exponentieel verband vast tussen albumine en de vrije fractie, wat naar analogie toegepast wordt op deze resultaten (figuur 4.16). 46 30,00% Vrije fractie 25,00% 20,00% 15,00% y = 0,63e-0,045x R² = 0,51 10,00% 5,00% 0,00% 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 Albumine (g/l) Figuur 4.16: Verband tussen de vrije fractie en de albumineconcentratie 4.4.3.4. Intrapatiënt variabiliteit De intrapatiënt variabiliteit kan geëvalueerd worden aan de hand van de analyse van verschillende stalen van eenzelfde patiënt (figuur 4.17). De vrije fractie van patiënt 1 varieert van 14,8 naar 25,2 % in zes dagen. Van patiënt 4 varieert de vrije fractie van 9,0 naar 20,0 % in zestien dagen. Figuur 4.17: Intrapatiënt variabiliteit in vrije fractie teicoplanine 47 5. DISCUSSIE 5.1. VANCOMYCINE In de methodevergelijking voor vancomycine wordt evenwichtsdialyse (vaak beschouwd als referentiemethode) vergeleken met ultrafiltratie bij 37 °C en ultrafiltratie bij 4 °C. Vanuit klinisch standpunt lijkt ons ultrafiltratie bij 37 °C logischer dan 4 °C aangezien de evenwichtsconstante tussen vrij en gebonden vancomycine temperatuursafhankelijk is, maar eerdere studies bestudeerden eiwitbinding met behulp van ultrafiltratie bij 4 °C (Berthoin et al., 2009). Uit de resultaten kan besloten worden dat de temperatuur bij ultrafiltratie een cruciale factor is. Daarnaast dient ook de kostprijs voor het uitvoeren van ultrafiltratie en evenwichtsdialyse te worden bekeken. Een centrifuge, schuddend warmwaterbad en pHmeter zijn aanwezig in het laboratorium en hoeven niet te worden aangekocht. Zoals te zien is in tabel 5.1 is ultrafiltratie in aankoop en in uitvoering per staal goedkoper dan evenwichtsdialyse. Tabel 5.1: Kostprijsvergelijking tussen evenwichtsdialyse en ultrafiltratie Evenwichtsdialyse Aankoop Per staal Kamer Membraan Laborant (8 minuten) Aanmaken buffer (1 minuut) Totaal per staal Ultrafiltratie € 165,04 € 4,40 Kolom € 4,00 Laborant (1 minuut) € 0,50 € 8,90 € 6,93 € 0,50 € 7,43 Tabel 5.2: Voor- en nadelen van evenwichtsdialyse en ultrafiltratie Evenwichtsdialyse Pro Contra Gouden standaard Duurder Gestandaardiseerde omstandigheden Moeilijk inpasbaar in routinelaboratorium Lange tijdsduur Meer manipulaties nodig Ultrafiltratie Pro Goedkoper Contra Kritische invloed van de temperatuur Mogelijk in Tijd nodig om centrifuge routinelaboratorium te verwarmen Korte tijdsduur Eenvoudig 48 Evenwichtsdialyse wordt vaak beschouwd als de gouden standaard ter bepaling van eiwitbinding, maar ultrafiltratie wordt sneller en eenvoudiger uitgevoerd. Tabel 5.2 lijst de voor- en nadelen van evenwichtsdialyse en ultrafiltratie op. Uit deze methodevergelijking blijkt dat evenwichtsdialyse goed correleert met ultrafiltratie bij 37 °C en geen systematische of proportionele verschillen terug te vinden zijn. Ultrafiltratie is een robuuste methode en kan uitgevoerd worden in een routinelaboratorium. Om die reden worden verdere experimenten om de vrije vancomycineconcentratie te bepalen, uitgevoerd met ultrafiltratie bij 37 °C. Om praktische redenen kan beslist worden om ultrafiltratie bij een andere temperatuur uit te voeren, bijvoorbeeld omdat een centrifuge standaard ingesteld staat op 4 °C en er geen tijd is om de centrifuge op te warmen. Aangezien de vrije concentratie bepaald door middel van ultrafiltratie bij 4 °C sterk correleert met de vrije concentratie bepaald bij 37 °C (Pearson correlatiecoëfficiënt 0,96), kan een omrekeningsfactor in rekening gebracht worden om vanuit de resultaten bij 4 °C de vrije concentratie bij 37 °C te voorspellen. Met formule 5.1 (lineaire regressie) kan de vrije concentratie bij 37 °C berekend worden uit de vrije concentratie bij 4 °C: Vrije concentratie 37 °C = 1,30 * Vrije concentratie 4 °C + 1,69 (5.1) Tabel 5.3: Variatie in temperatuur bij ultrafiltratie en vrije fractie aan vancomycine Bron Rodvold et al., 1988 Zokufa et al., 1989 Sun et al., 1993 Dykhuizen et al., 1995 Berthoin et al., 2009 Ampe et al., 2013 Onze resultaten Onze resultaten Temperatuur (°C) 25 25 37 4 4 kamertemperatuur 37 4 Vrije fractie 70 % 71 % 70 % tot 77 % 63 % 63 % 73 % 74,4 % 51,5 % Wanneer we in de literatuur de vergelijking maken tussen verschillende temperaturen waarbij ultrafiltratie uitgevoerd werd, stellen we vast dat een lagere vrije fractie gerapporteerd wordt wanneer de ultrafiltratie uitgevoerd werd bij 4 °C dan wanneer ze bij 49 kamertemperatuur, 25 °C of 37 °C werd uitgevoerd (tabel 5.3). Onze resultaten liggen in dezelfde lijn. Uit de dataset voor de methodevergelijking blijkt dat de vrije concentratie sterk correleert met de totale concentratie (r = 0,949). Hieruit kan afgeleid worden dat 90 % van de variantie die bestaat in de vrije concentratie kan verklaard worden door de totale concentratie. Routinematig de vrije vancomycineconcentratie monitoren, is in dat opzicht niet aanbevolen. Indien de therapie faalt bij een patiënt, ondanks adequate totale vancomycinespiegels, zou de totale eiwitconcentratie bepaald kunnen worden. De totale eiwitconcentratie toonde zich namelijk significant van invloed op de vrije fractie van vancomycine. Dat er wel interesse is in technieken om de vrije concentratie te bepalen, reflecteert zich in een Europese patentaanvraag, recent gepubliceerd in augustus 2012. Er werd een patent aangevraagd voor een nieuwe methode om vrij vancomycine te bepalen. Deze nieuwe techniek biedt een methode aan voor detectie en kwantificatie van vrij vancomycine in een routinelaboratorium (European Patent Agency, 2012). De gevalideerde methode (ultrafiltratie bij 37 °C) wordt toegepast op stalen van kritisch zieke kinderen. In sommige gevallen wordt de targetwaarde voor de AUC niet gehaald. In elk van deze gevallen gaat dit om een eerste dosisinterval, wellicht omdat geen oplaaddosis wordt gebruikt en de steady state nog niet bereikt is. Bij de zesde dosis voor patiënt 11 of de derde dosis voor de andere patiënten wordt de targetwaarde voor AUC wel telkens bereikt, hoewel de dalspiegels steeds lager liggen dan 10 mg/l. Hierbij zou men zich de vraag kunnen stellen of de targetwaarden voor de monitoring van dalspiegels bij kinderen niet te hoog liggen, aangezien de doelwaarde voor de AUC bereikt wordt in steady state. Deze resultaten liggen in dezelfde lijn als de resultaten van een recente studie waarbij 702 kinderen geïncludeerd werden (Le et al., 2013). Conclusie van deze studie is dat vancomycine moet gedoseerd zijn van 60 tot 70 mg/kg/dag om bij 75 % van de patiënten een AUC hoger dan 400 te bereiken. Een AUC van 400 correleert volgens deze studie met dalspiegels van 8 tot 9 mg/l. Bij de patiënten in ons experiment wordt gemiddeld 56,5 mg/kg/dag gedoseerd. De gemiddelde dalconcentratie bedraagt voor de eerste dosisintervallen 5,8 mg/l en voor de derde dosisintervallen 7,4 mg/l, wat de 8 tot 9 mg/l 50 benadert. Bij het eerste dosisinterval wordt in 4 van de 7 gevallen geen AUC van 400 bereikt, terwijl dit voor het tweede gemonitorde dosisinterval in alle gevallen wel zo is. De vrije vancomycineconcentratie correleert voor kritisch zieke kinderen sterk met de totale concentratie (r = 0,995). Dit betekent dat 99 % van de variantie die bestaat in de vrije concentratie kan verklaard worden door de totale concentratie. Deze correlatie is hoger dan bij de methodevergelijking bij volwassenen (r = 0,949). Hieruit kan men besluiten dat vrije concentratiemonitoring bij kritisch zieke kinderen geen meerwaarde biedt en de vrije concentratie kan voorspeld worden uit de totale concentratie (formule 5.2, lineaire regressie). Vrije concentratie = 0,65 * Totale concentratie + 0,21 (5.2) Ook bij deze stalen is de totale eiwitconcentratie significant van invloed op de vrije fractie. Een tweede toepassing van ultrafiltratie bij 37 °C is de bepaling in CAPD-vocht. Hieruit blijkt dat de vrije concentratie in serum niet aansluit bij de concentratie in CAPDvocht. Een mogelijke verklaring kan zijn dat er onvoldoende tijd is om te diffunderen vanuit het bloed naar het CAPD-vocht. Uit deze resultaten zou men zich kunnen afvragen of monitoring van vancomycine in serum bij CAPD-patiënten wel zinvol is en niet beter gemonitord zou worden in het CAPD-vocht. Dit experiment is weliswaar te beperkt om dergelijke conclusies te nemen, hiervoor dient een experiment met een groter aantal stalen te worden uitgevoerd. 5.2. TEICOPLANINE Om de vrije teicoplanineconcentratie te bepalen, moet de Teico Free methode nog verder op punt gesteld worden. Uit het experiment blijkt ultrafiltratie bij 37 °C ook voor teicoplanine niet dezelfde resultaten te geven als ultrafiltratie bij 4 °C. Verder dient men indachtig te zijn dat de manier waarop albumine bepaald wordt ook een invloed heeft op het resultaat van een regressie. Zo wordt albumine in het 24 uurslab bepaald met behulp van broomcresolgroen, terwijl albumine in de publicatie van 51 Yano et al (2007) bepaald wordt met broomcresolpurper. Bij externe kwaliteitscontroles tussen verschillende laboratoria blijkt de methode met broomcresolpurper gemiddeld 10 % lagere resultaten te geven dan de methode waarbij broomcresolgroen gebruikt wordt. Bij de vergelijking van onze resultaten met deze van Yano et al (2007), overlappen de resultaten elkaar duidelijk (figuur 5.1), ondanks de verschillende analysemethode. Figuur 5.1: Vergelijking van onze resultaten met Yano et al (2007). De grotere stippen zijn de resultaten van ons experiment, de kleinere deze van Yano et al (2007). Ter vergelijking van de analysemethode voor vrij teicoplanine worden de stalen van de methodevergelijking (oorspronkelijke stalen, ultrafiltraat, het buffer- en het serumcompartiment na evenwichtsdialyse) opgestuurd naar een ander laboratorium om deze te analyseren met een gevalideerde high perfomance liquid chromatography (HPLC) methode. 52 6. CONCLUSIES Ultrafiltratie en evenwichtsdialyse zijn robuuste methoden en geven betrouwbare resultaten. Wanneer de voor- en nadelen van ultrafiltratie naast deze van evenwichtsdialyse worden geplaatst, kunnen we besluiten dat ultrafiltratie de voorkeur geniet. Als een onderzoeksgroep beslist om de vrije concentratie te bepalen van vancomycine of teicoplanine met ultrafiltratie, moet de temperatuur gecontroleerd worden. Ook dient deze temperatuur vermeld te worden in de publicatie, wat momenteel niet steeds het geval is, om vergelijking tussen verschillende studies mogelijk te maken. Ultrafiltratie uitvoeren bij kamertemperatuur is niet aan te bevelen, aangezien de kamertemperatuur kan variëren. Vanwege de correlatie met evenwichtsdialyse bij de bepaling van vrij vancomycine, wordt bij voorkeur de temperatuur ingesteld op 37 °C. Indien dit niet mogelijk is en ultrafiltratie uitgevoerd wordt bij 4 °C, kan een correctiefactor ingevoerd worden. De invloed van verschillende variabelen op de vrije fractie van vancomycine werd nagegaan. Van de albumine-, IgA-, totaal eiwit- en α1-zuur glycoproteïneconcentratie blijkt enkel de totale eiwitconcentratie een significante parameter. Ook bij de analyse van de invloed van verschillende variabelen (leeftijd, lengte, gewicht, albumine-, totaal eiwit-, ureum- en totaal bilirubineconcentratie) bij stalen van kritisch zieke kinderen, heeft de totale eiwitconcentratie de grootste significante invloed. De correlatie tussen de vrije vancomycineconcentratie, bepaald met ultrafiltratie bij 37 °C, en de totale concentratie is sterk (r = 0,949). De vrije concentratie kan dus goed voorspeld worden uit de totale concentratie. Ook bij kritisch zieke kinderen correleert de vrije concentratie sterk met de totale concentratie (r = 0,995). Voor teicoplanine is de correlatie tussen de vrije en totale concentratie minder sterk (r = 0,844). Op basis van deze gegevens zou de vrije concentratiemonitoring van teicoplanine meer aangewezen zijn dan deze van vancomycine. Om dit mogelijk te maken moet de analysetechniek nog op punt gesteld worden. 53 7. LITERATUURLIJST ABBOTT LABORATORIES. 1993. TDxFLx system operations manual [Online]. Available: http://www.godob.com/mypic/201109/20110923094332125.pdf. ABBOT LABORATORIES. 2008. iVanco Architect Manual. AMPE, E., DELAERE, B., HECQ, J. D., TULKENS, P. M. & GLUPCZYNSKI, Y. 2013. Implementation of a protocol for administration of vancomycin by continuous infusion: pharmacokinetic, pharmacodynamic and toxicological aspects. Int J Antimicrob Agents, 41, 439-46. BATTISTELLA, M., WALKER, S., LAW, S. & LOK, C. 2009. Antibiotic lock: In vitro stability of vancomycin and four percent sodium citrate stored in dialysis catheters at 37 degrees C. Hemodialysis International, 13, 322-328. BEER, J., WAGNER, C. C. & ZEITLINGER, M. 2009. Protein Binding of Antimicrobials: Methods for Quantification and for Investigation of its Impact on Bacterial Killing. Aaps Journal, 11, 1-12. BEGG, E. J., BARCLAY, M. L. & KIRKPATRICK, C. M. J. 2001. The therapeutic monitoring of antimicrobial agents. British Journal of Clinical Pharmacology, 52, 35s-43s. BELGISCH CENTRUM VOOR FARMACOTHERAPEUTISCHE INFORMATIE. Glycopeptiden [Online]. Available: http://www.bcfi.be/ggr/index.cfm?ggrWelk=/GGR/MPG//MPG_KAEA.cfm&keyword= vancomycine. BERTHOIN, K., AMPE, E., TULKENS, P. M. & CARRYN, S. 2009. Correlation between free and total vancomycin serum concentrations in patients treated for Gram-positive infections. International Journal of Antimicrobial Agents, 34, 555-560. BUTTERFIELD, J. M., PATEL, N., PAI, M. P., ROSANO, T. G., DRUSANO, G. L. & LODISE, T. P. 2011. Refining Vancomycin Protein Binding Estimates: Identification of Clinical Factors That Influence Protein Binding. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 55, 4277-4282. CANTU, T. G., DICK, J. D., ELLIOTT, D. E., HUMPHREY, R. L. & KORNHAUSER, D. M. 1990. Protein-Binding of Vancomycin in a Patient with Immunoglobulin-a Myeloma. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 34, 1459-1461. CATALDO, M. A., TACCONELLI, E., GRILLI, E., PEA, F. & PETROSILLO, N. 2012. Continuous versus intermittent infusion of vancomycin for the treatment of Gram-positive infections: systematic review and meta-analysis. J Antimicrob Chemother, 67, 17-24. CUHADAR, S., KOSEOGLU, M., ATAY, A. & DIRICAN, A. 2013. The effect of storage time and freeze-thaw cycles on the stability of serum samples. Biochem Med (Zagreb), 23, 707. DAILLY, E., FRAISSINET, F., DESLANDES, G., BOUQUIE, R. & JOLLIET, P. 2013. Evaluation of the QMS(R) Teicoplanin Immunoassay (ThermoFisher Scientific) on Cobas(R) 8000 System (Roche Diagnostics) and Comparison to Fluorescence Polarization Immunoassay for the Determination of Teicoplanin Concentrations in Human Plasma. J Clin Lab Anal. DASGUPTA, A. 2002. Clinical utility of free drug monitoring. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 40, 986-993. DE SLOOVERE, M. M. W., VERSTRAETE, A. G., HOLLEBOSCH, M., VAN CAENEGHEM, E. & STOVE, V. 2013. Performance of the QMS Teicoplanin immunoassay in serum on the 54 Thermo Fisher Indiko Plus and comparison to fluorescence polarization immunoassay. Nog niet gepubliceerd. DI, L., UMLAND, J. P., TRAPA, P. E. & MAURER, T. S. 2012. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. Journal of Pharmaceutical Sciences, 101, 13271335. DYKHUIZEN, R. S., HARVEY, G., STEPHENSON, N., NATHWANI, D. & GOULD, I. M. 1995. Protein-Binding and Serum Bactericidal Activities of Vancomycin and Teicoplanin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 39, 1842-1847. ELYASI, S., KHALILI, H., DASHTI-KHAVIDAKI, S. & MOHAMMADPOUR, A. 2012. Vancomycininduced nephrotoxicity: mechanism, incidence, risk factors and special populations. A literature review. European Journal of Clinical Pharmacology, 68, 1243-1255. ERIKSSON, M. A. L., GABRIELSSON, J. & NILSSON, L. B. 2005. Studies of drug binding to plasma proteins using a variant of equilibrium dialysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 38, 381-389. EUROPEAN PATENT AGENCY. 2012. European Patent Application. EUROPESE FARMACOPEE. 2008. Vancomycin Hydrochloride. EUROPESE FARMACOPEE. 2009. Teicoplanin. FISH, R., NIPAH, R., JONES, C., FINNEY, H. & FAN, S. L. 2012. Intraperitoneal vancomycin concentrations during peritoneal dialysis-associated peritonitis: correlation with serum levels. Perit Dial Int, 32, 332-8. HAMMETT-STABLER, C. A. & JOHNS, T. 1998. Laboratory guidelines for monitoring of antimicrobial drugs. Clinical Chemistry, 44, 1129-1140. KHOR, S. P., WU, H. J. & BOXENBAUM, H. 1985. Simultaneous Correction for Volume Shifts and Protein Leakage in Equilibrium Dialysis Protein-Binding Experiments. International Journal of Pharmaceutics, 23, 109-113. KIRCHHOFF, F., BRIEGEL, J. & VOGESER, M. 2011. Quantification of free serum cortisol based on equilibrium dialysis and isotope dilution-liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clinical Biochemistry, 44, 894-899. LAPLANTE, K. L., WOODMANSEE, S. & MERMEL, L. A. 2012. Compatibility and stability of telavancin and vancomycin in heparin or sodium citrate lock solutions. American Journal of Health-System Pharmacy, 69, 1405-1409. LE, J., BRADLEY, J. S., MURRAY, W., ROMANOWSKI, G. L., TRAN, T. T., NGUYEN, N., CHO, S., NATALE, S., BUI, I., TRAN, T. M. & CAPPARELLI, E. V. 2013. Improved vancomycin dosing in children using area under the curve exposure. Pediatr Infect Dis J, 32, e15563. MANDURU, M., FARIELLO, A., WHITE, R. L., FOX, J. L. & BOSSO, J. A. 1996. Stability of ceftazidime sodium and teicoplanin sodium in a peritoneal dialysis solution. American Journal of Health-System Pharmacy, 53, 2731-2734. MILLIPORE. 1999. Assay of Free Anticonvulsant Drugs [Online]. Available: http://www.millipore.com/techpublications/tech1/an1002en00 MILLIPORE. 2012. Centrifree ultrafiltration devices user guide. MORITA, K. & YAMAJI, A. 1995. The Serum-Protein Binding of Vancomycin in Patients with Methicillin-Resistant Staphylococcus-Aureus Infection - the Role of Serum Alpha(1)Acid Glycoprotein Levels. Therapeutic Drug Monitoring, 17, 107-112. 55 NAILOR, M. D. & SOBEL, J. D. 2011. Antibiotics for Gram-Positive Bacterial Infection: Vancomycin, Teicoplanin, Quinupristin/Dalfopristin, Oxazolidinones, Daptomycin, Telavancin, and Ceftaroline. Medical Clinics of North America, 95, 723-+. NIESCHLAG, E. 2004. Equilibrium dialysis. In: PRESS, C. U. (ed.) Testosterone: Action, Deficiency, Substitution. NORNOO, A. O. & ELWELL, R. J. 2006. Stability of vancomycin in icodextrin peritoneal dialysis solution. Annals of Pharmacotherapy, 40, 1950-1954. PALTIEL, L., RONNINGEN, K. S., MELTZER, H. M., BAKER, S. V. & HOPPIN, J. A. 2008. Evaluation of Freeze Thaw Cycles on stored plasma in the Biobank of the Norwegian Mother and Child Cohort Study. Cell Preserv Technol, 6, 223-230. ROBERTS, J. A., NORRIS, R., PATERSON, D. L. & MARTIN, J. H. 2012. Therapeutic drug monitoring of antimicrobials. British Journal of Clinical Pharmacology, 73, 27-36. ROBERTS, J. A., PEA, F. & LIPMAN, J. 2013. The clinical relevance of plasma protein binding changes. Clin Pharmacokinet, 52, 1-8. RODVOLD, K. A., BLUM, R. A., FISCHER, J. H., ZOKUFA, H. Z., ROTSCHAFER, J. C., CROSSLEY, K. B. & RIFF, L. J. 1988. Vancomycin pharmacokinetics in patients with various degrees of renal function. Antimicrob Agents Chemother, 32, 848-52. RYBAK, M. J. 2006. The pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of vancomycin. Clinical Infectious Diseases, 42, S35-S39. RYBAK, M. J., LOMAESTRO, B. M., ROTSCHAFER, J. C., MOELLERING, R. C., CRAIG, W. A., BILLETER, M., DALOVISIO, J. R. & LEVINE, D. P. 2009. Vancomycin Therapeutic Guidelines: A Summary of Consensus Recommendations from the Infectious Diseases Society of America, the American Society of Health-System Pharmacists, and the Society of Infectious Diseases Pharmacists. Clinical Infectious Diseases, 49, 325-327. SAVAS, G. Vergelijkende studie van vancomycinebepaling op Advia Centaur, Architect i200sr en Abbott Axsym. SEGUIN, P., VERDIER, M. C., CHANAVAZ, C., ENGRAND, C., LAVIOLLE, B., DONNIO, P. Y. & MALLEDANT, Y. 2009. Plasma and peritoneal concentration following continuous infusion of cefotaxime in patients with secondary peritonitis. J Antimicrob Chemother, 63, 564-7. SHIN, W. G., LEE, M. G., LEE, M. H. & KIM, N. D. 1991. Factors influencing the protein binding of vancomycin. Biopharm Drug Dispos, 12, 637-46. SIEMENS HEALTHCARE DIAGNOSTICS. 2009. Therapeutic Drug Monitoring (TDM) An Educational Guide [Online]. Available: http://www.medical.siemens.com/siemens/en_GLOBAL/gg_diag_FBAs/files/product s_disease_states/TDM/TDM_Guide_FINAL.pdf. SUN, H., MADERAZO, E. G. & KRUSELL, A. R. 1993. Serum Protein-Binding Characteristics of Vancomycin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37, 1132-1136. TAMINIAU, J. A. J. M. 1989. Geneesmiddelen bij kinderen. Nederlands Tijdschrift voor Geneeskunde, 133, 916-9 THERMO SCIENTIFIC. 2007. Thermo Scientific QMS Immunoassays for Therapeutic Drug Management [Online]. Available: https://static.thermoscientific.com/images/D13194~.pdf. TOBIN, C. M., LOVERING, A. M., SWEENEY, E. & MACGOWAN, A. P. 2010. Analyses of teicoplanin concentrations from 1994 to 2006 from a UK assay service. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 65, 2155-2157. 56 TRUONG, J., LEVKOVICH, B. J. & PADIGLIONE, A. A. 2012. Simple approach to improving vancomycin dosing in intensive care: a standardised loading dose results in earlier therapeutic levels. Internal Medicine Journal, 42, 23-29. ULLDEMOLINS, M., ROBERTS, J. A., RELLO, J., PATERSON, D. L. & LIPMAN, J. 2011. The Effects of Hypoalbuminaemia on Optimizing Antibacterial Dosing in Critically Ill Patients. Clinical Pharmacokinetics, 50, 99-110. URAKAMI, T., MAIGUMA, T., KAJI, H., KONDO, S. & TESHIMA, D. 2008. Analysis using fluorescence polarization immunoassay for unbound teicoplanin concentration in serum. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics, 33, 357-363. WARNER, A., PRIVITERA, M. & BATES, D. 1998. Standards of laboratory practice: antiepileptic drug monitoring. Clinical Chemistry, 44, 1085-1095. WELTY, T. E. & COPA, A. K. 1994. Impact of Vancomycin Therapeutic Drug-Monitoring on Patient-Care. Annals of Pharmacotherapy, 28, 1335-1339. WILSON, A. P. R. 2000. Clinical pharmacokinetics of teicoplanin. Clinical Pharmacokinetics, 39, 167-183. YANO, R., NAKAMURA, T., TSUKAMOTO, H., IGARASHI, T., GOTO, N., WAKIYA, Y. & MASADA, M. 2007. Variability in teicoplanin protein binding and its prediction using serum albumin concentrations. Therapeutic Drug Monitoring, 29, 399-403. YUE, B. F., ROCKWOOD, A. L., SANDROCK, T., LA'ULU, S. L., KUSHNIR, M. M. & MEIKLE, A. W. 2008. Free thyroid hormones in serum by direct equilibrium dialysis and online solidphase extraction-liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Clinical Chemistry, 54, 642-651. ZHANG, F. L., XUE, J. P., SHAO, J. W. & JIA, L. 2012. Compilation of 222 drugs' plasma protein binding data and guidance for study designs. Drug Discovery Today, 17, 475-485. ZHANG, Y., HUO, M. R., ZHOU, J. P. & XIE, S. F. 2010. PKSolver: An add-in program for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in Microsoft Excel. Computer Methods and Programs in Biomedicine, 99, 306-314. ZIVKOVIC, A. M., WIEST, M. M., NGUYEN, U. T., DAVIS, R., WATKINS, S. M. & GERMAN, J. B. 2009. Effects of sample handling and storage on quantitative lipid analysis in human serum. Metabolomics, 5, 507-516. ZOKUFA, H. Z., SOLEM, L. D., RODVOLD, K. A., CROSSLEY, K. B., FISCHER, J. H. & ROTSCHAFER, J. C. 1989. The influence of serum albumin and alpha 1-acid glycoprotein on vancomycin protein binding in patients with burn injuries. J Burn Care Rehabil, 10, 425-8. 57 BIJLAGEN GOEDKEURING STUDIE DOOR DE COMMISSIE VOOR MEDISCHE ETHIEK 1 2 INTERNATIONALISATION AT HOME Dr. Dirk Van Duppen hield in zijn lezing een uitleg over en verdediging van het Kiwimodel. In het Kiwi-model vertrekt de overheid van de nood aan een bepaald geneesmiddel, waarvoor een openbare aanbesteding wordt uitgebracht en zo op een objectieve wijze het meest farmaco-economisch geschikte geneesmiddel kan gekozen worden. In Nieuw-Zeeland is dit model actief, en zijn op die manier de kosten van de gezondheidszorg sterk teruggedrongen. De grootste kritiek op de farmaceutische industrie van Dr. Van Duppen is de onwaarschijnlijk hoge uitgaven aan marketing en beïnvloeding van de artsen om hun product te verkopen. Volgens voorstanders wordt door de invoering van het Kiwi-model de concurrentie uitgeschakeld, waardoor er geen marketingkosten meer zijn, en het vrijgekomen geld kan benut worden voor onderzoek naar en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Volgens mij bevat het Kiwi-model heel wat waarheid en zijn de medicijnen op de Belgische markt op dit moment te duur. De hoge uitgaven aan marketing van de farmaceutische bedrijven in vergelijking met wat geïnvesteerd wordt in onderzoek is pijnlijk. Of het Kiwi-model nu op elk geneesmiddel moet toegepast worden betwijfel ik. Ook is het nog maar de vraag of het vrijgekomen geld door het overbodig maken van de marketing zal geïnvesteerd worden in onderzoek naar en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Pieter Neels, lid van CHMP (Committee for Medicinal Products for Human Use), had het er in zijn lezing over waarom vaccins anders zijn dan andere geneesmiddelen en hoe moeilijk het is om een vaccin te registreren. Het CHMP onderzoekt de voordelen en risico’s verbonden aan geneesmiddelen en geven advies aan de Europese Commissie die dan een bindend besluit uitvaardigt. De ontelbare instanties die betrokken zijn bij de registratie van vaccins maken het er niet eenvoudiger op. Ook bestaat een regel uitgevoerd door het EMA dat geen klinische trials voor een vaccin mogen uitgevoerd worden in een land dat zich het vaccin niet kan veroorloven. Om een nuttige klinische trial uit te voeren voor een vaccin, waarvoor al een vaccin bestaat en in de meeste welvarende landen wordt toegediend, is het dus heel moeilijk een klinische trial uit te voeren met een positief resultaat. Daarnaast probeerde hij ons te overtuigen van het nut van vaccins en schilderde hij de anti-vaccinlobby 3 af als een hoop nonsens. Een publiek van studenten farmacie overtuigen van het nut van vaccins, is volgens mij geen uitdaging en zijn betoog was niet echt nodig. Rudi Pauwels, doctor in de farmaceutische wetenschappen, deelde met ons zijn visie op het gezondheidssysteem. Volgens hem is het huidige systeem als een chronisch zieke patiënt, onmogelijk om te blijven behouden. Er moet afgestapt worden van het principe dat iedere patiënt hetzelfde geneesmiddel toegediend krijgt en naar een individuele therapie gestreefd worden. Door op voorhand bij een patiënt te bepalen of een geneesmiddel werkzaam zal zijn of niet, kan veel kostbare tijd en geld bespaard worden. Zijn bedrijf Biocartis ontwikkelde methoden om routinematig genen en biomerkers te identificeren uit biologische stalen. Ik ben van mening dat Rudi Pauwels al heel wat mooie dingen uitgevoerd heeft. Ik ga akkoord met zijn visie dat er gestreefd dient te worden naar een geïndividualiseerde therapie. Als dit kosten-efficiënt kan uitgevoerd worden, geloof ik dat er een toekomst in zit voor onze gezondheidszorg. Niet werkzame geneesmiddelen bij een bepaalde patiënt zullen niet meer gebruikt worden, waardoor sneller kan overgeschakeld worden naar een werkzame therapie. Hierdoor kan zowel de outcome van de patiënt verbeteren als wordt geld bespaard. Professor Philippe Vanparys bracht ons in zijn lezing iets bij over alternatieven voor dierproeven in de farmaceutische, cosmetische en chemische sector. Hij maakte ons duidelijk dat het noodzakelijk was om alternatieven te vinden, zowel op ethisch, financieel en organisatorisch vlak. Dat er zoveel verschillende soorten alternatieven bestaan heb ik bijgeleerd. Ook deel ik de mening van de spreker i.v.m. dierproeven. Hij is van mening dat dierproeven moeten vervangen worden door alternatieven, als die evenwaardig zijn en kunnen garanderen dat een geneesmiddel of chemische stof veilig is. Als geen alternatieven voorhanden zijn, zijn dierproeven noodzakelijk om de veiligheid van mensen te garanderen. Ook zijn opinie over de ban op dierproeven bij cosmeticaproducten deel ik. Sinds maart 2013 mag niets van cosmetica getest worden op dieren, maar niet voor alle testen zijn alternatieven voorhanden. Dus komen bepaalde producten op de markt, waar onvoldoende toxiciteitstesten op gebeurd zijn. 4
