Project: de zebravis als model voor C9orf72 gerelateerde

Project: de zebravis als model voor C9orf72 gerelateerde ALS
Wim Robberecht, MD, PhD
Laboratorium voor Neurobiologie, KU Leuven
Vesalius Research Center, VIB, Leuven
Herestraat 49 bus 912, 3000 Leuven
Wim Robberecht,
MD, PhD
André Abreu Bento,
PhD
Steven Boeynaems
Bart Swinnen, MD
Samenvatting van het onderzoeksproject
Amyotrofische laterale sclerose (ALS) is een fatale neurodegeneratieve aandoening gekenmerkt door
het progressief afsterven van motorneuronen resulterend in spierzwakte. De aandoening is tot op
heden onbehandelbaar, desalniettemin wordt het mechanisme van de aandoening de laatste jaren
verder ontrafeld aan een steeds toenemend tempo. Recent werd de C9orf72 mutatie ontdekt als de
belangrijkste genetische oorzaak van ALS.1 Het achterhalen van het mechanisme van deze mutatie
zou onderzoekers kunnen helpen bij het zoeken naar een behandeling voor een groot aantal ALS
patiënten.
In dit onderzoeksproject gebruiken we zebravisembryo’s als diermodel voor ALS. Zebraviseitjes
worden net na de bevruchting ingespoten met een genetische stof (RNA) coderend voor de C9orf72
mutatie. Daags nadien wordt het zenuwstelsel van de zebravisembryo’s onder de microscoop
onderzocht en wordt gekeken of er tekenen zijn van zenuwschade. Vervolgens trachten we het
mechanisme hiervan verder te ontrafelen en tevens een volwassen zebravismodel te ontwikkelen om
zo steeds dichter bij een mogelijke behandeling te komen.
Waarom is de zebravis zo geschikt als diermodel?
De zebravis is een ware pionier in het
proefdieronderzoek omwille van enkele belangrijke
troeven. Ten eerste is de zebravis een extensief
onderzocht proefdier zodat we reeds veel kennis
hebben over de embryonale ontwikkeling en de
genetische code van dit dier is zeer goed gekend.2,3.
Ten tweede is het een vruchtbaar proefdier. Een
volwassen vrouwtje kan tot honderden eitjes per dag
leggen, wat zorgt voor een stabiele aanvoer van onderzoeksmateriaal. Ten derde vindt de
embryonale ontwikkeling van dit dier plaats in het water en is het embryo de eerste dagen van zijn
ontwikkeling doorzichtig. Hierdoor kan de ontwikkeling relatief eenvoudig opgevolgd worden. Ten
vierde kent een zebravisembryo een snelle ontwikkeling van het neurologisch systeem zodat reeds
één dag na bevruchting de neuronen en axonen aanwezig zijn die onderzocht kunnen worden.
1
Hoe worden de zebravissen verzorgd?
Volwassen zebravissen zijn slechts enkele cm groot en leven in relatief ruime waterbakken met
ongeveer 5 tot 10 vissen per bak. Aangezien het tropische vissen zijn moet het water warm en zuiver
zijn en krijgen ze minstens drie maal per dag speciale voeding. Licht- en geluidsprikkels worden goed
geregeld aangezien dit een nadelig effect heeft op de vruchtbaarheid van de vissen. De zebravissen
worden zodanig getraind dat een vrouwtje al haar eitjes op één moment van de dag legt, zo kan dit
afgestemd worden op de start van een experiment.
In 2011 heeft het Laboratorium voor Neurobiologie voor het zebravisproject een volledig nieuw rek
met 60 visbakken aangekocht en dit reeds met de steun van de ALS Liga.
Hoe verloopt een experiment?
Net na de bevruchting wordt één groep eitjes ingespoten met
een genetische stof (RNA) waarvan we vermoeden dat ze bij
de mens ALS kunnen veroorzaken (in dit geval C9orf72). De
andere groep wordt ingespoten met een controlevloeistof en
wordt aldus gebruikt ter vergelijking. Vervolgens ontwikkelen
de eitjes zich verder in een incubator met een temperatuur
van 28°C. De dag nadien (30u na de bevruchting) worden de
jonge embryo’s gefixeerd op sterk water (formol).
Vervolgens worden de embryo’s gekleurd zodat het zenuwstelsel zichtbaar wordt. Onder de
microscoop wordt gekeken of het zenuwstelsel van de
eerste groep aangetast is in vergelijking met de
controlegroep. Meer bepaald kijken we enerzijds of de
lengte van de axonen (de uitlopers van zenuwcellen)
korter is en anderzijds of de axonen abnormale
vertakkingen hebben 4.
Hoe kan dit ons inzichten verschaffen over de
mechanismen van ALS?
Indien bij een experiment blijkt dat de genetische stof
inderdaad schadelijk is voor het zenuwstelsel van de
zebravis kunnen we verder zoeken naar het mechanisme
datverantwoordelijk is voor deze toxiciteit. Ten eerste
doen we dit door wijzigingen aan te brengen aan de
ingespoten genetische stoffen en door te kijken of hierdoor
de schade minder of net erger wordt. Ten tweede kijken
we of het inspuiten van de schadelijke genetische stoffen
2
samen met verschillende eiwitten de schade kan veranderen. Door middel van deze techniek kunnen
we dus relatief snel een relatief groot aantal mogelijk beïnvloedende factoren nakijken en
identificeren.
Wat zijn de hieruit voortvloeiende experimenten?
Een beperking van het hierboven beschreven onderzoek is dat het een zogenaamd ‘transiënt’
diermodel betreft. De ingespoten genetische stof wordt immers binnen enkele uren/dagen
afgebroken door het embryo zodat de schade zich kan herstellen. Hierdoor kunnen we dit model niet
verder opvolgen tijdens zijn ontwikkeling en verkrijgen we dus geen informatie over de effecten in
het volwassen stadium.
Een volwassen zebravismodel voor ALS staat dichter bij de menselijke situatie (ALS ontwikkelt zich bij
volwassen patiënten) en moet ons toelaten de geïdentificeerde beïnvloedende factoren (zie
hierboven) verder te onderzoeken en zelfs hierop ingrijpende medicatie te ontwikkelen. In het
tweede deel van dit project zullen we proberen om de genetische fouten (in dit geval de C9orf72
mutatie), die bij de mens tot ALS leiden, permanent in te brengen in het DNA van de zebravis om zo
het ziektemechanisme in een volwassen stadium te kunnen onderzoeken.
Kostenplaatje
Op dit moment is, mede dankzij de steun van de ALS liga, dit project al enkele maanden lopende en is
reeds aangetoond dat RNA met de C9orf72 mutatie inderdaad schadelijk is voor het zenuwstelsel van
zebravis embryo’s. Er is voor de onderzoekers nog zeer veel interessant werk om het mechanisme te
ontrafelen.
Het hele project heeft een kostprijs van 400 000 euro. Dit omvat zowel de aankoop van
onderzoeksmaterialen als personeelskosten.
Referenties
1.
2.
3.
4.
DeJesus-Hernandez, M. et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of
C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron 72, 245–56 (2011).
Laird, A. & Robberecht, W. Modeling Neurodegenerative Diseases in Zebrafish Embryos. 167–184
(2011).
Ramesh, T. M., Shaw, P. J. & McDearmid, J. A zebrafish model exemplifies the long preclinical period of
motor neuron disease. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry (2014). doi:10.1136/jnnp-2014-308288
Van Hoecke, A. et al. EPHA4 is a disease modifier of amyotrophic lateral sclerosis in animal models and
in humans. Nat. Med. 18, 1418–22 (2012).
3