Microbiologie
advertisement
Microbiologie: theorie Hoofdstuk 1: Introductie in de microbiologie Microbiologie • • • • Wat? Wetenschap rond studie van micro organismen .. mo’s Micro organismen? o Organismen die uitsluitend mbv microscoop zichtbaar zijn Uitzondering: schimmels (zichtbaar schimmeldek) zijn ook mo’s o Opgebouwd uit één of meerdere cellen met zeer weinig of zelfs geen celdifferentiatie Differentiatie betreft altijd de voortplanting of overleving Zonder weefsels of organen Waarom? o Het zijn excellente modellen voor het begrijpen van de celfunctie van hogere organismen (mensen bv) o Belangrijk om de werking vd biosfeer te begrijpen Besluit: microbiologie is de basis van alle biologische wetenschappen Eigenschappen van levende organismen 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. cellen a. elk organisme bestaat uit 1 (kleinste organismen) of meer cellen (hogere organismen, miljoenen) b. in de natuur interageren populaties met andere populaties in microbiële kolonies c. activiteiten van microbiële kolonies kunnen chemische & fysische eig. van een habitat beïnvloeden d. grootste deel vd biomassa op aarde is microbieel organische stoffen a. levende organismen & hun dode resten b. bv: proteïnen, KH, vetten, steenkool, olie anorganische stoffen a. uit levensloze natuur, komen ook in organismen voor b. bv: water, ijzer, koper, zuurstof metabolisme = stofwisseling a. = alle chemische processen in een organisme i. Bv: opname van voedingstoffen, afgifte van afvalstoffen b. In de cel? i. Bouwstofwisseling (assimilatie): reacties om celmateriaal op te bouwen ii. Bedrijfstofwisseling (dissimilatie): reacties die dienen om energie uit te halen reproductie a. ieder organisme kan nakomelingen krijgen b. biochemische reacties: groei van cellen, deling met vorming van meer cellen differentiatie a. tijdens: vorming van nieuwe substanties of structuren b. celdifferentiatie: onderdeel van cellulaire levenscyclus waarbij cellen speciale structuren vormen prikkelbaarheid & communicatie a. organimen (planten, dieren, 1- cellige organismen) kunnen reageren op prikkels uit de omgeving b. cellen reageren op chemische signalen uit omgeving die geproduceerd worden door andere cellen i. maw: cellen communiceren beweging a. niet universeel, maar toch kunnen bepaalde bewegingen ondergaan mbv bv flagellen evolutie a. wijzigingen van de celkarakteristieken ⇒ nieuwe eigenschappen b. en deze nieuwe eigenschappen overzetten op nakomelingen Prokaryoten en eukaryoten: eens lezen Welke organismen behoren tot de micro-organismen? Protozoën: ééncellige eukaryoten Algen: eukaryote fotosynthetische organismen Schimmels: eukaryote organisme Gisten: ééncellige schimmels Bacteriën: prokaryoot Archaeabacterien (archaea) Virussen Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -1- bv: pantoffeldiertje, malarieparasiet bv: paddestoelen, schimmels die op oud brood voorkomen bv: ook blauwalgen horen hierbij Microbiologie: theorie De betekenis van mo’s voor de mens Algemeen Zowel nuttig als schadelijk voor de mens Verschillende toepassingen: landbouw, kringloop, levensmiddelen, ziektes Verschillende werkvelden: levensmiddelen en medische microbiologie, energieproductie, biotechnologie Landbouw: Leguminosen o Leven in nauwe associatie met mo’s o Vormen nodulen op hun wortels o Converteren atmosferische N in gefixeerde N die planten gebruiken voor hun groei o Verminderd noodzaak aan vervuilende meststoffen Mo’s belangrijk voor verteringsproces van herkauwers Mo’s belangrijk voor nutriënt opname bij planten Kringloop: Verwijderen van organisch afval door het te gebruiken als hun voedsel. Dit wordt dan afgebroken tot anorganische stoffen die door planten hergebruikt worden. Die op hun beurt dienen als voedsel voor dieren Kringloop van elementen waardoor leven op aarde wel mogelijk is Bacteriën en schimmels in de natuur dienen voor het mens als afvalverwerking o Afvalwaterzuivering o Bodemzuivering Levensmiddelenindustrie Bereiding van kaas en yoghurt mbv melkzuurbacterien Hier worden niet schadelijke bacteriën gebruikt Ziektes Schadelijke bacteriën veroorzaken ziekten en voedselbederf Voedselinfectie: ziekte door aanwezigheid van mo in het voedsel Voedselvergiftiging: vorming van giftige stoffen dor schimmels of bacteriën in een levensmiddel Werkvelden # # # # Levensmiddelenmicrobiologie Gedrag, eigenschappen, en aantonen aanwezigheid schadelijke mo’s in levensmiddelen Vermijden & bestrijden van mo’s Drink en zwemwater wordt ook onderzocht in deze tak Medische microbiologie Aantonen van ziekteverwekkers (pathogenen) bij patiënten Onderzoek van pathogenen en nuttige mo’s Energieproductie Productie methaan, energie opgeslagen in mo’s Productie van ethanol Biotechnologie Gebruik van mo’s bij productie van veel producten Veranderen van eigenschappen van mo’s bv door DNA technieken Witte biotechnologie: gebruik van (genetisch gemanipuleerde) mo’s in industriële biosynthese voor synthese van producten van hoge commerciële waarde Historiek vd microbiologie • • • • • • Ontwikkeling microscoop Hooke ( 1665): schimmels Van Leeuwenhoek (1676): bacteriën Cohn: grondlegger van bacteriologie Ontdekker van bacteriele endosporen, genus Bacillus en proces van endosporeformatie Beschreep Bacillus levenscyclus (vegetatieve cel ⇒ endospore ⇒ vegetatieve cel) Ontdekte dat bij koken de vegetatieve cellen afsterven en de endosporen niet Pasteur: spontane generatie wat leidde tot de ontwikkeling van methoden die de groei van mo’s controleren Oude theorie: Spontane generatie: ontstaan van levend materiaal uit niet-levend materiaal … Weerleggen van theorie mbv experiment Vergelijking groei mo in fles met steriele vloeistof blootgesteld aan lucht en fles met steriele vloeistof niet blootgesteld aan lucht. Enkel groei van mo’s in fles blootgesteld aan lucht Koch: ontwikkelde postulaten rond hypothese dat een specifiek mo een specifieke ziekte kan veroorzaken Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -2- Microbiologie: theorie Hoofdstuk 2: Celstructuur en celfunctie Microscopie en celmorfologie Lichtmicroscopie • • • Algemeen: onmisbaar bij de studie van mo’s en heeft als karakteristieken Vergroting, oplossend vermogen, contrast Samengestelde microscoop bevat 3 lenssystemen: Condensor: aligneer lichtsignalen Objectief multipel om sferische en chromatische aberraties te minimaliseren Oculair Vergroting Totale vergroting = vergroting door objectief lens * vergroting oculair lens Oplossend vermogen (symbool I) = resolutie Vermogen om 2 naast elkaar gelegen punten van elkaar te onderscheiden = resolutie • • I= 0,6 • λ = geeft de kleinst mogelijke nog scherp te N•A zien afstand tussen 2 punten aan Met N . A = η . sin (θ) = numerieke apertuur Met 2 θ = hoek gevormd door lichtkegel Met η = brekingsindex Max. resolutie voor een lichtmicroscoop is 0,2 µm, voor hogere resoluties moet men een elektronenmicroscoop gebruiken Kleuringen Voordelen: contrast ⇒ morfologie en structuren worden beter zichtbaar Types Fasecontrast microscopie Visualiseren van levende stralen Vermijden van vervorming van celkleuringen Het beeldcontrast wordt afgeleid vd differentiële refractieve index van celstructuren Brightfield microscopie Enkelvoudige en/of differentiële celkleuring om het contrast te verhogen Dark field microscopie Grotere resolutie Enkel het specimen wordt belicht Fluorescentie lichtmicroscopie Visualisatie van autofluorescente celstructuren of fluorescente kleurstoffen Resolutie van cellen en structuren ↑ Driedimensionale beeldvorming Confocale scanning laser microscopie: vorm van lichtmicroscopie met grotere 3D beeldvorming Combinatie van een laser met lichtmicroscopie Beeldvorming door dikke specimen Visualisatie van elk vlak door aanpassen vh brandpuntsvlak van de laserstraal Atomic force microscopie Brengt detailleerd 3D beeld van levende preparaten Celmorfologie Algemeen Prokaryoten zijn typisch kleiner dan eukaryoten Grotere variëteit aan morfologieen ⇒ belangrijk naar identificatie Lichtmicroscopisch en elektronenmicroscopisch onderzoek is vereist bij studie van bacteriele cellen Kleine afmetingen hebben invloed op Fysiologie, groeisnelheid, ecologie Kleine celgrootte: hoogste oppervlakte tot volumeverhouding Rol in voeding en afvaluitwisseling met omgeving Celachtigestructuren kleiner dan 0,2 µm: levende organismen = nanobacterien Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -3- Microbiologie: theorie Morfologische groepen Coccen of bolvormige bacteriën Allen, in paren, groepen van 8, in clusters , in kettingen Diplococcen: celdeling in 1 richting ⇒ vorming van paren Deling en vermenigvuldiging gebeurt constant en regelmatig ⇒kettingen: lactococcus Gonococcen & meningococcen: niervormig of boonvormig Deling in 2 richtingen: 4 cellen; tetraden: Pediococcus Delingen in 3 richtingen symmetrische groepen uit 8 cellen: Sarcina Assymetrische groepen uit 8 cellen: Staphylococcus Algemeen spreekt men van: micrococcen, diplococcen (duplo), sarcinen, staphylococcen (druiventros) en streptococcen (ketting) Bacillen of staafvormige bacteriën 2 grote groepen: rechte staafjes en gebogen staafjes Rechte staafjes: Talrijke soorten: Enterobacteriaceae, Bacillus spp Celuiteinden spits of verdikt Staafjes als kettingen of andere zeer specifieke groeperingen Gebogen en kommavormige staafjes: bv spirillum, vibro Bevatten G- , G+ en G° gramvariabele staafjes OPM: tussenvorm ⇒ coccobacil = geen staafjes en ook geen coccen Spiraalvormige bacteriën Groep gekenmerkt door lange helicoidale structuur (bv Spirochaetales) Onderscheiden door lengte, aantal windingen, amplitude en op basis van fysiologische kenmerken Structuur van de bacteriele cel Oppervlaktestructuur Cytoplasmatisch membraan Structuur Cytoplasma wordt omsloten door membraan: CM of celmembraan Dunne elastische structuur aan binnenkant vd celwant ≈ 8nm Onder elektronenmicroscoop zichtbaar als een dubbele lijn Hoogselectieve permeabiliteitsbarierre : 40% fosfolipiden, 60% eiwitten Bilayer met hydrofiele buitenzijde en hydrofobe binnenzijde Fosfolipiden: basisstructuur vd membraan Iedere vetmolecule bevat: hydrofobe en hydrofiele groep Gevolg: spontane organisatie in dubbele moleculaire laag tgv het verschil in wateroplosbaarheid Bilayer uit 2 lagen hydrofiele groepen gescheiden door dubbele laag hydrofobe groepen Dit belet spontane doorgang van hydrofiele molecule Bij bacteriën is ≈ 8nm dik Er komen geen sterolen voor, maar wel hopanoiden Typische glycerolfosfatieden (=fosfolipide) in de bacteriele CM zijn Fosfatidylethanolamine (cefaline) Fosfatidylglycerol – 3 – lysine (lipo – aminozuur) Typische archaea Glyceroldiëthers + isoprenoïde keten ⇒ bilayer Diglyceroltetraëther + bifytanylketen ⇒ monolayer Glycoglycerollipiden bv: monogalactosyldiglyceride ⇒ monolayer Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -4- Microbiologie: theorie Eiwitten (polypeptiden) in gesloten in dubbele laag fosfolipiden Hydrofiele groepen gericht naar hydrofiele groepen van de fosfolipiden Dez e eiwitten maken tot meer dan 50% vh membraan gewicht uit Deze eiwitten maken tot 10 à 20 % vh totale eiwitgewicht uit Structuur van CM gelijkaardig in prokaryoten en eukaryoten Andere moleculen, sterolen en hopanoiden: versterken het membraan Dit doen ze door hun rigide planaire structuur Chemische bindingen in lipiden … heel belangrijk: de verschillen A) esterbinding bij bacteriën en eukaryoten B) etherbinding bij archeae C) Isopreen, basisstructuur hydrofiele zijketens bij Archaea CM volgt CW als uniforme laag CW geplooid in cytoplasma (intrusies) Stikstoffixerende bacteriën: Azotobacter Nitrificerende bacteriën: nitrosomas, nitrobacter Anaërobe fotosythetische bacteriën: Rhodopseudomonas CW soms los van CM Bij aërobe fototrofe cyanobacterien komen thylacoiden voor Dit zijn aparte organellen omgeven door CM membraanstructuren waar fotosyntheseapparaat is gevestigd Andere aparte organellen bezitten geen bilayer unit membraan, wel een eenlagige eiwitmembraan Chlorosomen: fotosyntheseapparaat in (anaërobe fototrofe) groene zwavelbacteriën Gasvesikels (drijfvermogen) Carboxysomen ⇒ CO2 assimilatie bij autotrofen Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -5- Microbiologie: theorie Functie Permeabiliteitsbarriere Vermijden lekkage van cytoplasmatische metabolieten in de omgeving Selectieve permeabiliteit verhindert diffusie vd meeste opgeloste stoffen Specifieke transportmechanismen voor accumuleren van nutrienten de tegen de concentratiegradient in Ankerpunt voor: Membraanproteinen betrokken bij transport, bio-energiebalansen en chemotaxis Plaats voor energie in cel Transportsystemen Algemeen Snelheid en manier van opname van een voedingsstof door een mo is afhankelijk van: ♦ Aard nutriënt ♦ Structuur en fysiologische eigenschappen vh celoppervlak en vd celomgeving CW van actief groeiende mo: vrij permeabel voor kleine moleculen en ionen Rol in transport van voedingsstoffen is gering: sporen en cystenwanden is praktisch ondoorlatend CM: belangrijk in voedingsproces van mo’s CM: porien met een diameter van 0,5 A Transport van moleculen door celmembranen kan een gevolg zijn van: diffusie gradienten, elektrische potentiaalgradienten of actief transport mechanisme Deze laatste accumuleren zelfs nutrienten in cytoplasma tegen gradiënt in Nutriëntdiffusie: in beide richtingen doorheen het celmembraan ♦ Vetoplosbare stoffen en water passeren er vrij doorheen ♦ CO2, zuurstof en andere gassen diffunderen als concentratiegradienten Beweging van gassen gewoonlijk niet gecontroleerd door de cel Transport van water: osmotisch geregeld door aanpassing verhouding onopgeloste/opgeloste stoffen in de cel Transport van suikers en aminozuren, dipeptiden en oligopeptiden is intens bestudeert Overzicht vd bacteriele transportsystemen: ♦ Ongeladen, vetoplosbare moleculen passeren vlot ♦ Negatief geladen moleculen passeren niet want celwand is zelf negatief geladen Passieve diffusie Moleculen die vrij in beide richtingen de CM kunnen passeren. Totdat aan beide zijden vh CM evenveel moleculen aanwezig zijn Kost geen energie Di het geval bij hydrofobe stoffen: antibiotica penicilline en rifampicine, water, aquaporines Actieve diffusie Kost bacterie energie om moleculen de CM te laten passeren Meestal transport van buiten naar binnen ⇒ concentratie stoffen binnen is 1000x groter dan buiten cel Gevolg van dit hamsteren van voedingsstoffen ⇒ bacterie kan zich in leven houden en zelfst te delen met zeer weinig voedingsstoffen Oorzaak hiervan is dat het transportsysteem die hiervoor zorgt in het CM zit ♦ Elk te transporteren voedingsstof heeft zijn eigen enzym. Bv transport lactose met speciaal enzym ♦ Een bacterie heeft niet noodzakelijk alle enzymen inhuis E. Coli: lactose – transportenzym Salmonella: niet ⇒ Besluit: aanwezigheid is soortgebonden Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -6- Microbiologie: theorie Vorming exo-enzymen Voedingsstoffen in de omgeving van bacteriën: Bouw: grote moleculen, lange ketens, opgebouwd uit kleinere schakels ♦ Probleem: Moleculen te groot om het CM te passeren ♦ Oplossing: vorming exo-enzymen: afbraak van moleculen buiten bacteriecel tot kleinere eenheden ♦ Gevolg: Transport van de kleinere moleculen door CM naar binnen ♦ Voorbeeld: eiwitten → aminozuren; polysacchariden → enkelvoudige suikermoleculen Toepassingen: Kaasrijping ♦ Exo-enzymen: zijn verantwoordelijke voor een gedeeltelijke afbraak vd eiwitmoleculen uit melk ♦ Deze eiwitten worden door de exo-enzymen in kortere stukjes geknipt Gevolg: Smaak en structuur wordt ten goede verandert Exo-enzymen gebruiken om hun bacterie die ze vormt op te sporen ♦ De aanwezigheid uit zich door karakteristieke verandering vd voedingsbodem Bv: Staphylococcus Aureus op Baird Parker- Agar Exotoxinen (bijzondere groep exo-enzymen) Giftige stoffen, die bacteriën tijdens hun groei uitscheiden, bv : na infectie in mens of dier Voedselinfectie Giftige enzymen werken vaak in op de darmwand (enterotoxinen) Welke bacteriën doen dit? ♦ Salmonella & Bacillus cereus ♦ Clostridium botulinum: hittelabiel toxine, onschadelijk door enkele minuten koken ♦ Staphylococcus aureus: hitteresistent, verantwoordelijk voor minder ernstige vorm van voedselvergiftiging Het opwekken van energie Energie nodig voor: Groei, transport, (indien mogelijk) beweging Energie bron: Enzymatische afbraak van voedingsstoffen Die enzymen voor energie winning liggen in CM Vorming van celwand, kapsel of slijmlaag Aan CM: Synthese celstructuren buiten CM Bv: Celwand, eventueel kapsel of slijmlaag De celwand van prokaryoten: peptidoglycaan en gerelateerde moleculen Samenstelling Celwand die omsluit CM: Bepaald vorm & stevigheid vd cel Bied weerstand tegen osmotische druk van cytoplasma op CM 6 atmosfeer (G- bacteriën) en 20 atmosfeer (G+ bacteriën) Celwand maakt tot 20% uit vd droge celmassa Peptidoglycaanstructuur: universele unieke component vd celwand: Uitz: archeaobacteria, mycoplasma, chlamydia, isosphaera, gemmata, pirellula Peptidoglycaanstructuur: bestaat uit heteropolymeren van: 2 aminosuikers: N-Acetylmuraminezuur (NAMA of M) en N-acetylgucosamine (NAGA of G) Vormen glycaanstrengen, die β- 1, 4 alternerend G en M bevatten (10 à 65 per streng) Een kortere tetrapeptidenketen zit vast aan carboxylgroep van de melkzuurrest van M L- en D- Aminozuren L-Ala, D-Ala, D-Glu, L-Lys De aangrenzende peptidenketens zijn met elkaar verbonden (cross-linked) via een interpeptidenbinding (via DD-transpeptidase) tussen carboxylgroep vd terminale D-Ala van 1 keten en de vrije aminogroep van DAP op een andere keten Soms kopt een interpeptidenbinding voor van 1-6 AZ Vooral bij G+ bacteriën Combinatie van glycosidische en peptidenbindingen ⇒ moleculair zeefwerk uit 1 grote macromolecule die de protoplast en de CM omsluit Veel variaties vooral bij G+ bacteriën Celwand in veel lagen bij G+ bacteriën (20-50 nm) Celwand is 1 laag bij G- bacteriën ( 2- 3 nm) Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -7- Microbiologie: theorie Archaeabacterien: afwijkende celwandstructuur Halofiele archaea (Halococcus) ⇒ Heteropolysaccharide (aminosuikers, uronzuren) Methanogenen (Methanobacteriales) ⇒ pseudomureine β - 1,3 – NAGA – T met T=N- acetyltalosaminuronzuur Cross linked met tripeptide : L-GLU-L-ALA-L-LYS Eigenschappen van de celwand van bacterien in 2 categorien te verdelen G+ en G- bacteriën Functie Peptidoglycaan laag belangrijk want/voor Celvormbepalend Mechanische sterkte Werkt turgordruk tegen Vormt osmotische lyse Rol in celbeweging en celdeling Peptidoglycaan komt alleen voor bij bacteriën ⇒ vormt dus de achilleshiel vd bacterie ⇒ stoffen die de peptidoglycaan aantasten zijn dan ook specifiek werkende stoffen Bv: antibioticum Penicilline: deze verstoort de opbouw van peptidoglycaan en inhibeert DD-transpeptidase cross-linking stap tussen de peptidenketens Werkt bij groeiende en delende cellen Bv: lysozym (komt vrij in speeksel, traanvocht): deze tast bestaande bacteriecelwanden aan ⇒ afweer tegen bacteriën. Lysozym splitst NAGA-NAMA β 1,4 binding. (uitz: Archaea) Toepassing kaasindustrie: vervanging van nitriet ⇒ verhinderd groei van Clostridium butyricum, ‘laat los’ effect of scheurvorming in kaas Werk enkel bij “resting cells” Gram positieve (G+) Bacteriën Algemen: G- bacteriën: enkel een paar lagen peptidoglycaan (10% vd celwand) G+ bacteriën: veel lagen peptidoglycaan (90% vd celwand) Vorm wordt bepaald door de lengte vd ketens en de aard en hoeveelheid van crosslinking Peptidoglycaan bevat 40-90% vd celwandmassa Samenstelling varieert via postmodificatieproces Peptidoglycaanmatrix: covalentgebonden aan andere macromoleculen Bv: Polysacchariden Bv: polyolfosfaatpolymeren: teichoinezuren + teichuronzuren; substitutie met D-ALA Covalent gebonden aan C-6-NAMA via fosfodiesterbinding Kleine fractie verbonden met lipiden in CM = lipoteichoinezuren: verbinden celwand met onderliggende CM Teichoinezuren vormen oppervlakte antigenen bij G+ bacteriën Regelen ionentransport Rol in bacteriofaagadsorptie Sommige prokaryoten zijn vrijlevende protoplasten, die overleven zonder celwand doordat: Beschikken over opmerkelijk sterke membranen Leven in osmotisch beschermde omgeving, zoals menselijk lichaam Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -8- Microbiologie: theorie Gram negatieve (G-) bacteriën Algemeen Celwand: 1 laag mucopeptide met weinig dwarsverbindingen Laag gehalte peptidoglucaan 5 à10 % CW Binnenste monomoleculaire laag ( 2 – 3 nm) bovenop CM Meestal geen interpeptidenbrug AZ Weinig of geen interpeptidenbrug crosslinking Peptidoglycaan met speciaal lipoproteine Boven dunne peptidoglycaan laag: outer wall-layer (7-8nm) Samenstelling: zeer complex Proteïnen: porines (niet specifiek transport), channel proteins (specifiek transport) Fosfolipiden: zoals CM Lipopolysacchariden (LPS): sterk variërende samenstelling Deze opbouw werd best bestudeerd bij Salmonella spp LPS: dubbellaag met 1 onderste laag van gewone fosfolipiden (zoals in CM) LPS: oligomeren uit 3 subunits Elke subunit heeft 3 regio’s: lipide A (toxisch), R-oligosacharrideketen (core) en O zijketensuikers Subunits zijn via pyrofosfaatbruggen aan lipide A verbonden Lipide A bevat gefosforyleerd glucosamine disacharide, sterk veresterd met lange keten verzadigde vetzuren Aan één vd glucosamineresidues van lipide A zit het korte R-oligosacharide vast dat ongewone suikers bevat (heptose of octose) Aan de R-kern: lange hydrofiele O-zijketen bestaande uit suikers en naar buiten steekt Bij Smooth S-vorm geldt bovenstaand, bij Rough R mutant ⇒ geen O zijketen meer Toevoegen lysozym ⇒ ontstaan sferoplasten (LPS nog aanwezig) Outer wall-layer: 2 lagen Buitenste laag met LPS Binnenste laag gewone fosfolipide Verbinding met onderliggende peptidoglycaan gebeurt met lipoproteinemoleculen Porines Zorgen voor niet specifieke transport Bestaat uit eiwitten, per 3 units, die niet specifieke “crouss outer wall” kanalen vormen ⇒ bepaalde moleculen diffunderen Channel proteins Zorgen voor specifieke transport Vereenvoudigde diffusie (= absorptie plaats voor bacteriofaag λ) Somatische O-antigenische specificiteit bepaald door suikers (= antigenische determinanten) van O zijketens Grote variatie in O- zijketenstructuur ⇒ zeer grote antigenische specificiteit (bv salmonella) Pathogene B- bacteriën ⇒ hoge antigeendiversiteit ⇒ antilichaamsynthese in waard moeilijk LPS in bloedbaan Toxish via lipide A (= endotoxine) Geven koorts LPS zijn ook receptoren voor bacteriofaagadsorptie Outer wall layer = permeabiliteitsbarriere voor toegang van bepaalde antibiotica, kleurstoffen, galzouten Rough mutanten: gevoelig voor antibiotica behandelen met EDTA: vrijstellen LPS uit celwand ⇒ G- bacteriën minder antibiotica gevoelig De structurele verschillen in celwand tussen G- en G+ bacteriën worden duidelijk tijdens gramkleuringreactie Hoe? Alcohol → deze penetreert de lipide rijke buitenste membraan van G- bacteriën en extraheert onoplosbaar violet-iodine complex uit de cel Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -9- Microbiologie: theorie Oppervlaktestructuren en inclusies van prokaryoten Bacteriele celoppervlaktestructuren Prokaryote cellen bevatten verschillende oppervlaktestructuren o Fimbriae en pili, S-lagen, kapsels en slijmlagen Fimbriae: korte proteiniefilamenten voor aanhechting Pili: langere filamenten, belangrijk bij de conjugatie bv de geslachtspili: F-pili o Functie: vasthechten van cellen aan een vast oppervlak Prokaryoten kunnen celoppervlaktelagen hebben samengesteld uit: o 2D rooster van proteïnen, S-laag, polysacharidekapsel of meer diffuse polysacharridematrix of slijmlaag S laag: selectieve zeef die de doorgang van laagmoleculaire verbindingen toelaat, terwijl grote moleculen en structuren worden tegengehouden Celwand omgeven door dikke slijmlaag of kapsel o Het wordt kapsel genoemd wanneer het een compact scherp begrensd laagje betreft o Het wordt slijmlaag genoemd wanneer het laagje diffuser is o Geen soortgebonden fenomeen ⇔ binnen zelfde soort of stammen zijn er met en zonder kapsel o Voordeel van een kapsel: maakt dat sommige pathogenen weerstaan aan fagocytose ⇒ virulenter o Naargelang dikte en consistentie: macrokapsels, microkapsels en slijmlagen o Soms een zeer hard kapsel ⇒ schede o Slijmafscheidingen belangrijk in vlokvormingsfenomenen in microbiële gemeenschappen Actief slip ⇒ dichte goed bezinkbare vlok Macrokapsel o Microscopisch aantonen via kapselkleuring o Bij gramkleuring: geen goed afgelijnde beelden bij zo’n bacteriën o Bestaan uit polysacchariden of polypeptiden Voorbeeld: Tandplak (ongewenst) o Slijmlaagvormende bacterie zet zich op gebit of apparatuur → dt → dun laagje, een biofilm bestaande uit bacteriën en afscheidingsproducten in en beschermd door slijmlaag → moeilijk te verwijderen Voorbeeld: Suikerfabriek (ongewenst) o Slijmvorming door Leuconoctoc mesenteroides → deze produceren slijm uit suikerhoudende oplossingen → gelvormige oplossingen → leidingenverstoppen en verstoren productieproces Voorbeeld: yoghurt (gewenst) o Keuze zuurselstammen wordt bepaald door het vermogen slijm te produceren en zo de gewenste yoghurt structuur te bekomen Celinsluitsels # # # # # # # Bacterie cel → opslaan voedingsstoffen voor slechtere tijden Welke stoffen? Ketting van noodzakelijke voedingsstoffen , alias polymeren Hoe? Groot aantal kleine moleculen opslaan in groot onoplosbaarpolymeer ⇒ concentratie opgeloste stoffen wordt niet te groot, anders wordt te veel water aangezogen en knapt de cel Waar? In de vele internegranulen die als opslagmateriaal dienen of in magnetotaxis PHA: Poly-β-hydroxyalkanoaten en glycogeen als opslagpolymeren bij overmatige aanwezigheid van koolstof PHB: Poly-β-hydroxybyturaat = veel voorkomend opslag materiaal van Prokaryotische cellen Functie: koolstof en energie reserve Bouw: polymeer van vetachtige stof Zoals wij vetopslaan, slaan bacteriën PHB’s op Kunststofachtige eigenschappen? Bruikbaar als afbreekbare plastics? Niet alle bacteriën vormen PHB ⇒ determinatie via PHB kleuring Glycogeen Functie: Algemene reservestof, die ook voorkomt bij mensen Bouw: polymeer vanglucose Opslag van polyfosfaat gebeurt vaak omdat het een stof die weinig voorkomt Sommige G- prokaryoten kunnen zwavel in globulen in periplasma opslaan Magnetosomen Wat? Intracellulaire partikels van het ijzermineraal magnetiet Fe304 Gevolg? Organismen kunnen reageren in magnetisch veld Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -10- Microbiologie: theorie Gasvesikels # # # Bouw: kleine met gasgevulde structuren gemaakt uit proteïnen bevatten 2 verschillende proteïnen die een gaspermeabele en waterdichte structuur vormen Functie Verminderen celdensiteit ⇒ middel voor beweegbaarheid organismen in water worden instaat zich te positioneren voor optimale lichtoogst Groep: algemeen voorkomend in verschillende cyanobacterien spp Endosporen Algemeen Deze worden gevormd door de bacterie soorten Bacillus en Clostridium Wat? Overlevingsstructuur voor de cel Hoe? In de spore wordt het erfelijk materiaal opgeslagen → ∆t → Vorming van omhulsel en oude cel gaat kapot Werking? Soort rusttoestand, geen normale celstofwisseling of celdeling Voordeel? Overleven ongunstige omstandigheden Bv droogte, zeer hoge temperaturen, straling, chemicaliën, Ze kunnen deze vorm vele (duizenden) jaren aanhouden en bij gunstige omstandigheden binnen het uur ontkiemen en weer nieuwe cellen vormen Eigenschap? Hoogresistente gedifferentieerde bacteriele cel geproduceerd door bepaald G+ bacteriën Endoformatie leidt tot hoog gehydrateerde structuur met essentiele macromoleculen en variëteit aan substanties Kunnen eeuwig dormant blijven, maar germineren snel bij de juiste trigger OPM: kleine zuur oplosbare proteïnen Beschermen DNA tegen UV irradiatie en uitdroging Dienen als koolstof en energie bron tijdens germinatie Besluit: Ontstaan van vegetatieve cellen: endospore activatie → germinatie → uitgroei Kenmerken van een bacteriespore Hoe is een spore te zien? Onder microscoop Lichte, ‘lege’ plek in gekleurd preparaat (negatief beeld endospore) Geen moedercel meer ⇒ toevlucht tot fase-contrastmicroscoop ⇒ endosporen : sterk lichtbrekende bolletjes Speciale sporenkleuring Wanneer vindt sporevorming plaats? Als snelste groei voorbij is en 1 of meerdere voedingsstofen uitgeput raken Omstandigheden mogen ook niet te slecht zijn pH, temperatuur en ook zuurstofgehalte zijn belangrijke criteria voor de sporevorming Werking van spore vorming: zie onderstaande figuur Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -11- Microbiologie: theorie Waarom (hitte) resistent? Rijping: onttrekken van water aan prospore ⇒ 2 membranen Tussen 2 membranen: vorming beschermende sporewanden Binnen wand: cortex of schors uit zeer dikke laag van speciaal mucopeptide Weerstand aan zeer hoge celdruk op CM Deze wordt veroorzaakt door het lage watergehalte in sporoplast → water wil via diffusie naar binnen → sporoplast heeft neiging om uit te zetten → dit wordt tegengehouden door schors Hitteresistentie wordt ook veroorzaakt door deze lage watergehalte Buitenste laag of sporecoat Opgebouwd uit keratineachtig eiwit Veroorzaakt resistentie tegen chemicaliën en exo-enzymen van andere bacteriën Veroorzaakt de lichtbrekende eigenschappen Hitteresistentie ontstaat pas als het protoplasma grote hoeveelheden dipicolinezuur heeft gevormd en veel calcium ionen heeft opgenomen De ontkieming van sporen Activering Pas gevormde sporen blijven sowieso in rusttoestand, ook in voor ontkieming optimale omgeving Opheffen vd rusttoestand → activatie Activatie door: hitteschok, lage pH, ook langere tijd droog en koel bewaren werkt activerend Geactiveerde sporen zijn wel nog resistent Ontkieming Geactiveerde sporen in gunstige omgeving → ontkieming Proces Duur slechts enkele minuten en gebeurt binnen de sporecoat Waar te nemen waar de spore weer kleurstof kan opnemen en de verdwijning vd sterke lichtbreking Verlies van hitteresistentie Calscium, dipicolinezuur en stukjes mucopeptide worden uitgescheiden Schors wordt afgebroken, maar sporecoat blijft Ontkieming in omgeving zonder veel voedingsstoffen ⇒ spore blijft in dit stadium steken Uitgroei Als alle voedingsstoffen wel aanwezig zijn gaat het proces verder DNA, RNA en eiwitsynthese Celwand wordt gevormd en nieuwe cel verlaat de sporecoat Dit proces duur 1 à 2 uur De betekenis van sporevormers in de praktijk Pasteurisatie 10min 72°C of 15min 65°C Dood de vegetatieve cellen, maar niet de sporen Steriliseren Afdoden van alle vegetatieve cellen en sporen Appertiseren C. botulinum is het uitgangspunt. Deze bacterie mag niet meer voorkomen Bij normale opslagtemperaturen zullen deze geen problemen meer opleveren Enkele bekende (beruchte) sporevormers Bacillus cereus Voedselvergiftiging in rijst en zetmeelrijke producten Zeer hittestabiel exotoxine (90min 121°C) Komt nog voor in gepasteuriseerde melk Laatste jaren meer frequent stammen van Bacillus die kunnen groeien bij lage temperaturen (koelkast) Clostridium perfringens Sporen wijd verspreid in de natuur Anaëroob, maar ook groei bij lage zuurstofconcentraties Bij koken van voedsel niet gedood Er bestaat zelfs de kans dat er activatie vd sporen optreedt Stel het voedsel vervolgens bepaalde tijd <60°C ⇒ ontkieming en snelle vermeerdering Bacteriën die zo in darm belanden vormen daar weer sporen en tegelijk een enterotoxine ⇒ misselijkheid, buikkrampen en diarree Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -12- Microbiologie: theorie C. Botulinum → Een van de giftigste exotoxines Strik anaërobe bacterie Onwerkzaam door verhitting (enkele minuten bij 100°C of 20min bij 80°C) Sporen in bodem, water, grondstoffen van levensmiddelen ⇒ conservenindustrie zo lang verhitten tot sporen van deze bacterie dood zijn ⇒ nu geen voorkomen meer van botulisme in industrieel bereide conserven omdat de maatregel zo effectief is C. Tyrobuytricum Lastpost bij kaasbereiding Vormt boterzuur en gas in kaas ⇒ scheurvorming of ‘laat los’ effect Oorzaak? Te veel sporen in de melk, dit wordt veroorzaakt door de groei vd bacterie in het kuilvoer Highly Heat resistent sporeformer (HHRS) 1985: ontdekking van zeer hitteresistente sporen in UHT melk, komt nu wereldwijd voor Naam? Onbekende Bacillussoort ⇒ Bacillus sporothermodurans, maar meest wordt HHRS gebruikt Spore overleeft UHT behandeling Geen zichtbare veranderingen in de melk Groeit door tot beschikbare zuurstof op is of de concentratie van 10^4 à 10^5 gaat Geen ziekmakende eigenschappen gevonden tot op heden Microbiële beweging Zweepdraden en beweeglijkheid Flagellen Meeste bacteriën onbeweeglijk, indien wel beschikken ze over flagella of zweepdraden Opbouw: complexe structuur uit verschillende proteïnen vastgehecht aan CW en CM Beweging: rotatie zoals een propeller van motorboot met max. snelheid van 60 cellengtes / sec Samenstelling: flagella bestaan uit het proteïne flagelline Voorkomen: een variëteit aan locaties en arrangementen Ieder arrangement is uniek voor een bepaalde species: 2 types Polaire Flagellen: gebonden aan één of beide uiteinden vd cel Petrische Flagellen: geinsereerd op verschillende locaties op celoppevlak Flagellen zitten niet op de CW maar zitten goed verankerd Cellen beweging zich naar gunstige omstandigheden , postieve chemotaxis Cellen wenden zich af voor hun ongunstige omstandigheden De beweeglijkheid van bacteriën wordt gebruikt om hen te isoleren Bij een buis met halfvast medium zullen de beweeglijke overal te zien zijn na een tijd en de onbeweeglijke zullen op de entplaats blijven zitten (zie ook prakticum) Op niet goed gedroogde agarplaten kunnen beweeglijke bacteriën de hele plaat overgroeien ⇒ zgn spreiders Fimbriae (=pili) # Geen invloed op beweeglijkheid # Zorgen ervoor dat bacterie aan oppervlakte van het vloeistof blijft ⇒ vorming van valletje en zuurstof beschikbaar # Bij serotypering is pili soms verstorend omdat antigene eigenschappen en pili goed op elkaar lijken Sexpilus # Met dit uitsteeksel kan een bacterie erfelijke informatie (DNA) overbrengen naar een andere bacterie # Niet alle bacteriën bezitten dit # Erfelijk bepaald # Eigenschap kan van de ene op de andere bacterie overgedragen worden (conjugatie) Glijdende beweging en chemotaxis en fototaxis # # # glijdende beweging: geen gebruik van Flagellen, maar bewegen langs vast oppervlakt door een aantal mechanismen bv door slijmsecretie Chemotoxis: beweging organismen in respons op chemicaliën Fototaxis: beweging van fototrofe organismen naar een stijgende licht intensiteit Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -13- Microbiologie: theorie Hoofdstuk 3: Metabolisme en metabolische diversiteit Katabolisme en anabolisme Metabolisme: alle chemische reacties in levende wezens Chemische reacties: Katabolische reacties Afbraak complexe organische tot eenvoudige moleculen Vrijkomen van energie Leveren 12 precursormetabolieten van waar uit alle biosynthesereacties starten Anabolische reacties Opbouw complexe organische moleculen uit eenvoudigere moleculen Vereisen Biosynthesereacties: synthese monomere bouwstenen uit 12 precursometabolieten: AZ, suikers, … Polymerisatiereacties: opbouw vetten, eiwitten, polysacchariden, RNA en DNA Assemblagereacties tot cellulaire structuren Oxidatie –reductie reacties Oxidatie: verwijdering van é van een atoom of molecule (A(é)→A) Reductie: toevoegen van é van een atoom of molecule (B→B(é)) Reactie: A(é) + B → A + B(é) Met A(é) : elektronen donor Met B: elektronacceptor Meestal gaat het verwijderen van een é samen met het verwijderen van waterstofionen Energie leverende reacties waarbij hoog gereduceerde stoffen fungeren als é donor en worden geoxideerd Na een é-transfer via intermediairen worden ze uiteindelijk doorgegeven aan finale é-acceptor (02 voor aëroben) Vrijgekomen energie: ATP uit ADP ATP generatie door fosforylatie Op substraat niveau Omzetting ADP → ATP Oxidatieve fosforylatie via é-transportketen Elektronen uit oxidatie van substraat genereren ⇒ uiteindelijk ATP Fotofosforylatie É-stroom aangedreven door lichtenergie resulteert in ATP vorming Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -14- Microbiologie: theorie Energieleverende reacties bij mo’s Zeer grote metabolische diversiteit, waarbij sommige pathways uniek zijn voor specifieke groepen mo’s Mo’s zijn cruciale schakels in de koolstof, stikstof en zwavelcyclussen 4 criteria kunnen het metbaolisme van levende wezens beschrijven Koolstofbron CO2 → autotroof Organische stof → heterotroof Energiebron Licht → fototroof Redox-reacties → chemotroof Organische stof Anorganische stof Elektrondonor Organisch →organotroof Anorganisch → lithotroof Elektronacceptor O2 → Aërobe respiratie Organische molecule → fermentatief NO3-, SO2-, CO2 → anaërobe respiratie Chemoheterotrofen Gebruik van organische stoffen Als energie bron (chemo-) Als elektronendonor (organo-) Als koolstofbron (hetero-) Oxideren van organische stoffen als primaire bron van energie via 2 processen: respiratie en fermentatie Glycolyse en alternatieve pathways Eerste stap: oxidatie van glucose naar pyruvaat o Gevolg: ATP en NADH+ +H+ o OPM: dit vereist geen zuurstof, dus kan zowel aëroob als anaëroob doorgaan 3 mogelijke pathways (EM, PPC, ED): verschil in bijdrage is afhankelijk van species binnen zelfde genus Glycolyse (Emden-Meyerhof pathway / EM)(zie ook hieronder links ): meest voorkomend o Deze is niet actief waar ED als alternatief al actief is o Deze levert 6 vd 12 precursormetabolieten Entner-Doudoroff pathway zie ook volgende pagina Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -15- Microbiologie: theorie Entner-Doudoroff pathway (zie ook voorgaande pagina rechtsonderdaan) Komt slechts bij bepaalde bacteriën voor Pseudomonas, rhizobium, acetobacter, agrobacterium Kan EM en PPC volledig vervangen Levert 6 vd 12 precursormetabolieten hieronder vind je de PPC cyclus Pentosefosfaatcyclus Komt algemeen voor naast glycolyse en ED Oxidatie van pentose en glucose Levert 2 precursormetabolieten levert ook belangrijke intermediairen voor synthese van nucleine zuren en aminozuren voor sommige species is dit enige functionele pathway (bv Gluconobacter) Respiratie → omzetting van pyruvaat naar acetyl CoA Oxidatieve decarboxylatie → in stroma vd mitochondriën: pyruvaat wordt geoxideerd en gedecarboxyleerd. Gekatalyseerd door pyruvaat dehydrogenase → CO2 , NADH en acetylgroep die gebonden wordt aan co enzym A ⇒ Na deze 2e fase zijn dus 2 vd 6 koolstofatomen van glucose afgesplitst als CO2 + 2 NADH moleculen gevormd Krebscyclus (citroenzuurcyclus) ⇒ vrijstelling CO2, ATP, NADH+ H+ (deze cyclus levert ook 3 metabolieten) Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -16- Microbiologie: theorie Elektronen opgeslagen in NADH+ + H+ vervoerd door é-transportketen ⇒ protonengradiënt over membraan Elektronen worden doorgegeven aan de eind-elektron-acceptor ⇒ acceptor wordt gereduceerd (02 → H2O) De protonengradiënt is de drijfkracht vd ATP-synthase die ATP genereert uit ADP 1. • • • • • Totale aërobe oxidatie van 1 glucosemolecule a. 38 moleculen ATP b. Vorming van CO2 en H2O 2. Totale anaërobe respiratie: lagere opbrengst a. Oorzaak? Delen krebscyclus en e-transportketen functioneren niet in afwezigheid van zuurstof en andere elektronenacceptoren dan zuurstof Voedingsstoffen als polysacchariden, eiwitten, vetten → 1st afgebroken tot: monosachariden, AZ ⇒deze worden dan gebruikt in de glycolyse en Krebscyclus Niet alle C in de voedingsstoffen wordt gebruik voor energiemetabolisme door oxidatie naar CO2. Krebscyclus en glycolyse gebruiken ook C’s voor celmassa aan te maken (anabolische reacties): 40-70% Sommige bacteriën hebben beperkte oxidatie van het aantal organische substraten, andere hebben een breed gamma Niet geassimileerd substraat wordt volledig geoxideerd tot CO2 en H2O Onvolledige oxidatie Oorzaak: te weinig 02 aanwezig Gevolg: opstapeling van organische zuren (aërobe fermentatie) Voorbeeld: azijnzuurvorming bij Acetobacteraceae Suikers / alcohol worden omgezet azijnzuur en soms verder tot CO2 en H2O Genus Acetobacter: groeit op ethanol → zet om tot azijnzuur → en verder tot CO2 Genus Gluconobacter: stapelt azijnzuur op door onvolledige oxidatie van suiker Wereldwijde toepassing in bioreactoren Enkel in PPC actief Fermentatie Eigenschappen Stelt energie vrij van glucose of andere organische moleculen (AZ, organische zuren, purines, pyrimidines) Heeft geen zuurstof nodig Geen gebruik van Krebscyclus of é-transportketen Gebruikt een organische molecule als eind-é-acceptor Levert slechts 2 ATP op per glucose molecule door fosforylatie op substraatniveau Élektronen van NADH+ + H+ worden dorgegeven aan pyruvaat of aan een afgeleide organische molecule Deze eind-e-acceptoren worden zo gereduceerd tot verschillende eindcomponenten Soms obligaat anaëroob (bacteriën) Soms facultatief anaëroob (bacteriën , gisten): aanwezigheid onderdrukt zelfs de fermentatie ethanol fermentatie (gisten en bacteriën) Gisten ⇒ facultatief anaëroob Anaërobe condities: fermentatie Aërobe condities: bevorderen groei en onderdrukken van fermentatie Melkzuurfermentatie (melkzuurbacteriën = G+ bacteriën en zuurstoftolerant) Lactose → afbreken tot: glucose + galactose → fermenteren tot: melkzuur (homofermentatief) Lactose → ………….. → fermenteren tot: melkzuur en andere zuren/alcohol (heterofermentatief) Toepassingen: eens lezen Anaërobe respiratie ≈ O2 (kan) niet gebruikt als e-acceptor Probleem: bacteriën met een anaërobe respiratie bezitten wel meestal de glycolyse en krebscyclus, maar hebben een onvolledige transportketen Gevolgen: Ipv O2 worden andere organische verbindingen gebruikt als eind-e-acceptor: NO3-, SO42-, CO2 Deze worden dan gereduceerd door H uit het organisch substraat Energiewinst is lager dan aërobe respiratie Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -17- Microbiologie: theorie Denitrificerende bacteriën (Nitraatrespiratie) Groep: anaëroben en facultatief anaëroben Belangrijkste denitrificerende bacterie voor de bodem: pseudomonas Eind-e-acceptor: NO3- ,ipv O2 onder anaerobe condities Inductie enzymcomplexen door anaerobie en NO3 Wanneer/ Waar voorkomen in bodem? Rijstvelden, drainagesystemen Voorkomen van organische meststoffen samen met NO3 Belangrijke schakel in stikstofcyclus OPM: soms treedt enkel de eerste stap op bij facultatief anaeroben ⇒ Gevolg: nitrietaccumulatie Sulfaat en zwavelreducerende bacteriën (Sulfaat & zwavelrespiratie → Desulfo & Desulfu-) Groep: obligaat anaëroob Eind-e-acceptor: SO42- of S° → met de vorming van H2S Groeien op organische zuren, ketozuren, ethanol Wanneer/ waar voorkomen in bodome Anaërobe sedimenten en slib Vormen sulfide uit de natuur en veroorzaken indirecte corrosie van metallisch ijzer tot ijzersulfide Leven vaak in associatie met groene zwavelbacterien Deze produceren S° door anoxygenische FotoSynthese Chemoautotrofen Algemeen Oxideren anorganische e-donoren voor energie productie Kunnen aëroob en anaëroob zijn Koolstof o CO2 is enige koolstofbron o Wordt gefixeerd via de acetyl CoA weg of de Calvin Benson cyclus Fixatie van CO2 op ribulose (C5) door rubisco → glucose (C6) met recyclage van ribulose Hele Krebscyclus is niet nodig, enkel synthesefuncties voor aanmaak precursormetabolieten Soorten Methano bacteriën (Methno-) Acetogene bacteriën (Aceto-, aceti-) Nutrificierende bacteriën Autotrofe sulfaat- & zwavelreducerende bacteriën Zwaveloxiderende bacteriën (Thio-,sulfo-) Ijzeroxiderende bacteriën Waterstofoxiderende bacteriën Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -18- Microbiologie: theorie Methanogene bacteriën Strikt anaeroob en groep Archaea É-donor Waterstofgas: lithotroof Organische verbinging (methyl- of acetaat) : organotroof É-acceptor + enige C-bron: CO2 Carbonaatrespiratie Vorming van CH4 Voorkomen: rijstvelden, sedimenten, actief slib en rumen van herkauwers Probleem: vorming van broeikasgas CO2 want CH4 in de atmosfeer wordt omgezet tot CO2 Leven in associatie met waterstofproducerende bacteriën en methanotrofen (gebruik van methaan als C-bron) Voorbeelden: methanococcus, methanobacterium, methanospirillum … Reactie: 4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O CO2 CH3-X CH3-CO-X CH3-CO-CoA → (acetyl-coenzymeA) + CO2 → CH3-CO-COOH (pyruvaat ) Acetogene bacteriën Analoog als methanogene bacterien Verschil: vorming azijnzuur ipv ethaan Voorbeeld: clostridium aceticum Reactie: 4H2 + CO2 →CH3 COOH+ 2H2O Nutrificierende bacterien Werkwijze: oxideren NH4+ tot NO3- of NO2- met O2 als e-acceptor Nitroso-: NO3- + 3/2 O2 → NO2- + 2H+ + H2O Nitro-: NO2- + 1/2 O2 → NO3OPM: koolstofdioxidefixatie gebeurt via de Calvincyclus Groep: α en β proteobacteria Voorkomen: afvalwater rijk aan ammonium Gevolg van hun activiteit: In bodems → stikstof onder vorm van NH4+ vast aan kleimineralen en hummus gaat verloren onder de vorm van NO3- ⇒ verzuring vd bodem Aantasten van kalksteen, cement, beton via de vorming van HNO3 uit atmosferische NH3 Anammox Ammoniumoxidatie ook anaeroob met nitraat of nietriet als e-acceptor ipv O2 Reactie: NH4+ + NO2- → N2 + 2 H2O Belangrijk voor vele ecosystemen voor de afbraak van ammonium Verantwoordelijk voor 50% stikstofgas in de atmosfeer Aerotolerant Voorbeeld: planctomycetes Toepassing: efficiente verwijdering van ammonium uit afvalwater i.v.m. de tradionele nitrificatie/denitrificatie methodes Nitrificatie/ denitrificatie: NH4+ + 3/ 2O2 → NO2 - + 2H+ + H2O 2NO2 - + 6e- + 8H+ N2 + 4H2O (ook product ie CO2) Bij anammox moet slechts ½ vd ammonium eerst geoxideerd worden tot nitriet, waarbij dan gelijke delen nitriet & ammonium kunnen omgezet worden tot stikstofgas Autotrofe sulfaat - & zwavelreducerende bacteriën Analoog heterotrofe sulfaat en zwavelreducerende bacteriën Obligaat anaeroob SO42- of S° als eind-e-acceptor met vorming van H2S H2 als e-donor en fixeren van CO2 via acetyl-CoA weg Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -19- Microbiologie: theorie Zwaveloxiderende bacteriën Kleurloze zwavel bacteriën Oxidatie H2S of H2O3- of S tot SO42Aeroob (Thiobacillus thiooxidans) + Anaeroob (Thiobacillus denitrificans ~ via NO3 – dus autotrofe denitrificeerder) 1 genus: Sulfobus behoort tot Archaea Alle andere behoren tot α of β- proteobacteria Ijzeroxiderende bacteriën Oxideren meestal ook zwavelverbindingen Reactie: 4Fe2+ + 4H+ + O2 4Fe3+ + 2H2O Waterstofoxiderende bacteriën H2 kan gebruikt worden als e-donor bij anaerobe respiratie Sommige bacteriën oxideren H2 aeroob met zuurstof als eind-e-acceptor en fixeren CO2 Kunnen groeien in gasmengsel van 70% H2 , 20% O2 en 10% CO2 met anorganische zouten Taxonomische zeer heterogene groep: pseudomonas, bacillus, ralstonia, rhizobium Bij mixotrofe groei (facultatief auto/heterotroof) Organische substraten als C-bron (dus geen CO2 fixatie) en e-donor Energie wordt geleverd door oxidatie van waterstof Fotoautotrofen Algemeen CO2: enige lichtbron Anorganische stoffen als e-donor H2X (→litho-) Bacterie van licht op in bepaalde types (bacterio)chlorofyl→ lichtreacties Lichtreacties :vereisen licht waarbij dan het volgende gebeurt oxidatie van H2X ATP productie Generen van een reducerend vermogen onder de vorm van NADPH+ +H+ Deze 3 worden dan gebruikt bij de donkerreacties Donkerreacties: fixatie CO2 via calvincyclus 2 types: oxygenische fotoautotrofen en anoxygenische fotoautotrofen Oxygenische fotoautotrofen Uitvoeren van fotosynthese ⇒ vrijkomen van 02 ~ identiek zoals bij de planten Reactie: C02 + 2H2O → suikers / celmassa (CH20) + H2O + O2 Groep bacterium: cyanobacterien en prochlorales Opm: ze rijkten de atmosfeer met zuurstof aan tijdens het precambrium waardoor aeroob leven en evolutie mogelijk werd Cyanobacterien zijn voorlopers van chloroplasten vandaar dat hun fotosynthetisch pigment identiek is Anoxygenische fotoautotrofen Uitvoeren van fotosynthese ⇒ geen vrijkomen van 02 , oorzaak: gebruik van H2S ipv H20 als e-donor Reactie: C02 + 2H2S → suikers / celmassa (CH20) + H2O + S2 Groep: groene en paarse zwavelbacteriën Bij de groene zwavelbacteriën wordt CO2 gefixeerd via de reductieve Krebscyclus Het wordt daarbij gebonden aan succinyl CoA Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -20- Microbiologie: theorie Fotoheterotrofen # # # # # Eigenschappen: licht als energiebron via fotosynthese C bron en e-donor : organische stoffen ⇒ dus organo Groep: purper en groene niet-zwavel bacteriën ... beiden in de groep anoxygenische fotosynthetische bacteriën Dus geen vrijstelling van O2, want anoxygenisch Reactie: C02 + 2H2X → suikers / celmassa (CH20) + H2O + 2X met X = organische stof OPM: dus ook CO2 wordt gebruikt als C-bron Rodospirrilum rumun Groep: Purper niet zwavelbacterie Kan tot alle 4 de types metabolisme behoren afhankelijk vd omgevingsomstandigheden (chemoautotroof, chemoorganotroof, fotoautotroof, fotoheterotroof) Halobacterien Groep: Archaea Deze bezit het pigment bacteriorhodosine en die vormt een protonengradiënt bij lichtinval ⇒ ATP generatie Ander mechanisme dan fotosynthese Halofiel (zoutmeren, pekel) Stikstoffixatie Algemeen Bacteriën kunnen als enige stikstofgas uit de atmosfeer fixeren tot ammonium en zo gebruiken als N-bron Dit gebeurt door het nitrogenase-enzymcomplex die geïnactiveerd kan worden door zuurstofgas of een overmaat aan ammonium Zeer energie eisend proces: 10 – 12 ATP / mol gefixeerde N2 2 types Symbiotische stikstoffixeerders en vrijlende stikstoffixeerders Symbiotische stikstoffixeerders Belangrijkste bacteriën van dit type: Rhizobia (genera Rhizobium en Bradyrhizobium) Deze Doen in symbiose met vlinderbloemige planten (boon, erwt, klaver) aan stikstoffixatie Bradyrhizobium kan dit ook vrijlevend Vrijlevend in de bodem groeien ze aeroob In symbiose groeien ze micro-aerofiel Specificiteit vd symbiose: de bacterie moet een specifiek flavenoide, afgescheiden door de plant, herkennen Flavenoides induceren induceren bij de bacterie de aanmaak van nod-factoren ⇒ aanmaak van prenodules Werking: de bacteriën infecteren de wortelharen door penetratie via de epidermiscellen tot aan de tetraploide cortexcel ⇒ aanzetten van de tetraploide cortexcel van intense celdeling met vorming wortelknobbeltje (nodule) ⇒vacuoles van deze cellen groeien uit tot onregelmatige grote cellen (bacteroiden Symbiose: Plant geeft nutrienten aan de bacteriën en verzorgt de afwezigheid van zuurstof ⇒ stikstoffixatie kan doorgaan Voorbeelden: Actinomyceet Frankia: gaan in symbiose met niet leguminosen, bv els Cyanobacterie Anabae azollae: in symbiose met Azollae-varen in rijstvelden → geen N-bemesting nodig Vrijlevende stikstoffixeerders Vrijlevende stikstoffixeerders: talrijk in rhizosfeer (ca, 2mm zone rond planten wortel) waar veel voedingsstoffen aanwezig zijn Vrijlevende stikstoffixeerders behoren tot zeer veel bacterie groepen Voorbeelden: azotobacter (y-proteobacteria): aeroob, beschermt de activiteit van nitrogenase door zeer hoog zuurstofverbruik en kapsel van gomstoffen rond de cel Clostridium: anaeroob Groene en purper zwavelbacteriën (α-proteobacteria): anaërobe fotosynthetiseerders Cyanobacteria: nitrogenase in heterocysten, gespecialeerde cellen voor stikstoffixatie Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -21- Microbiologie: theorie Assimilatorische nitraatreductie NO3- onder aërobe omstandigheden: voor planten en mo’s de N-bron voor synthese van N-houdende bestanddelen Bij planten: de preferentiële N-bron (NO3- of NH4+) hangt af van omstandigheden NO3- assimilatie vereist veel reducerend vermogen en bezit dus een hoger substraat gebruik dan NH4+ Reactie: NO3→ NO2→ NH4+ Nitraatreductase B nitrietreductase Assimilatorische sulfaatreductie Sulfaat: de zwavelbron voor de synthese van zwavelhoudende AZ bij bijna alle bacteriën, planten en fungi Reactie: Reductie van SO42- naar SO32Hier wordt ze wel geïncorporeerd ipv vrijgesteld zoals bij zwavelrespiratie De eerste stap is dezelfde als bij zwavelrespiratie, daarna vergt het meer energie Ammonificatie . $ Vrijstelling ammoniakale stikstof uit organische N-bronnen (EW, purines, pyrimidens, ureum, N-houdende herbiciden) is zeer verspreid onder de mo’s hydrolytische afbraak van eiwitten ⇒ AZ , waarbij de aminogroep daarachter wordt verwijdert (deaminatie) Oxidat ieve deaminat ie R-CH-COOH + ½ O2 R-C-COOH + NH3 I II NH2 O Reduct ieve deaminat ie R-CH-COOH + (2H) R-CH2-COOH + NH3 I NH2 Ureolyt isch ( typisch voor Bacillus) CO(NH2) 2 + H2O 2NH3 + CO2 $ $ Samenvattingetje Micriobiele afbraak van polymeren Polymere koolhydraden Cellulose o β-1,4 -D-glucose o endo- β-1,4-glucanase: splitst ketens o exo- β-1,4-glucanase: splitst cellobiose af (= glucose-glucose) o β-glucosidase: cellobiose glucose o Aeroob (natuur, bosgrond) Fungi: fusarium, aspergillus, trichoderma Bacteriën: streptomyces, cellulomonas o Anaeroob (rumen) Bacteriën: clostridium, bacteriodes Zetmeel o amylose (1,4 α-D-glucose) & amylopectine (met 1,6-vertakkingen) o α -amylase: splitst ketens (endo) o β-amylase: splitst maltose af (= glucoseglucose)(exo) o maltase: maltose → glucose o α -1,6-amyloglucosidase: ont takkingsenzymen o Fungi: aspergillus o Bacteriën: bacillus, clostridium, streptomyces o Biergist heeft geen amylase: door weken van gerst wordt plant-amylase gaactiveerd = mouten → zet eigen zetmeel om in glucos → mout kan dan gebruik worden door gist voor alcoholfermentatie Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -22- Microbiologie: theorie Koolwaterstoffen C1 verbindingen - Bacteriën: aërobe Gram negatieven o Methanotrofen: op methaan CH4 → CH3OH → CO2 + biomassa (vereist methaanonooxygenase o Methylotrofen: op methanol CH3OH → CO2 + biomassa Aromatische koolwaterstoffen - komt vooral voor in lignine, ook chemische vervuiling (uoleen, benzeem - vooral aërobe afbraak - eerst omzetting van catechol (vanuit enkelvoudige 1,2-gesubstitueerde ring) of naar protocatechuaat (vanuit 1,3 en 1,4 gesubstitueerde ring) - ringsplitsing: vooral Pseudomonas - ortho-splitsing (komt meest voor) of meta-splitsing Xenobiotica - pesticiden: chloroaromaten en nitroaromaten: moeilijk biologisch afbreekbaar (Pseudomonas, Rodococcus) - Platics (polyethyleen, polypropyleen): niet biologisch afbreekbaar Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -23- Microbiologie: theorie Hoofdstuk 4: Systematiek en taxonomie van bacteriën en archaea Inleiding # # # # Klassificeren en ordenen van prokaryoten in groepen volgens gemeenschappelijke kenmerken Hoe? Volgens species Eukaryoten: individuen die vruchtbare nakomelingen kunnen brengen Prokaryoten: geen seksuele voortplanting ⇒ Historisch arbitair uitgevoerd en nu constant in ontwikkeling via de nieuwe methodes Belang van goed klassificeren Medische sector: ontwikkeling van een correct en efficiente behandeling Toegepaste micro, milieu, levensmiddelenbioglogie: enkel de juiste mo’s zal gewenste product leveren Internationale regels Latijnse (wetenschappelijke) naam uit 2 delen Geslacht (genusnaam) Soortnaam (speciesnaam) Binnen species: verschillende stammen met combinatie letters en cijfers Gebaseerd op onderlinge overeenkomsten tussen groepen van mo’s Eenheden systematische systeem Familie of familia Geslacht of genus Soort of species Classificatie Veel moeilijker dan bij hogere dieren en planten omdat er zeer weinig morfologisch verschil is 2 manieren voor classificatie Fenotypisch: vooral gebaseerd op morfologische en fysiologische kenmerken Genotypisch: vooral gebaseerd op DNA Belangrijkste is: 16S rDNA sequentie (ca 1600 bp) → Woese 1980 Zeer traag evoluerend gen, neutraal Universeel bij alle bacteria en archaea Bepalen van fylogenetische verwantschap De nieuwe aanpak om mo’s te classificeren volgens fylogenetische verwantschap, neemt nu snel de plaats in vd oude methodes van fenotypische kenmerken. Op basis van het 16S rRNA gen (18S rDNA voor eukaryoten) werd de eerste Tree of Life voorgesteld. De eerder gedefineerde genera worden nu hernoemd, opgesliptst en geherclassificeerd. Hierin worden nieuwe genera en species opgenomen Dit heeft zicht vertaalt in de nieuwe versie: Bergey’s manual of systematic bacteriology (2004) Taxonomisch overzicht van de MEEST relevante mo’s Domein Bacteria Gram-negatieve bacteriën Groep 1: Spirochetes Eigenschappen Zeer lang, (2-250 µm) maar ook zeer dun (150 nm) Flagellen ingesloten in vlies (endoflagellen) of rond cel gewonden Bewegen zich al boren voort (kurketrekker) Genus borrelia: ziekteverwekkers overdragen door knaapdieren, luizen, teken (ziekte van Lyme, gewricht) Teken met bacterie Borrelia burgdorferie → tekenbeet bij mens → mens geïnfecteerd met borrelia → ziekte van lyme. Ook huidverschijnselen of gewrichtsaandoeningen zijn mogelijk Groep 2: Beweeglijke gebogen (G-) staafjes Eigenschappen: Aeroob en meeste zijn van proteobacteria (α, β, γ, δ , ε) Sommige zeer groot, wellichte de eerste bacterie gezien door microscoop (van Leeuwenhoek, 1670) Genus Campylobacter Potentieel pathogeen dier: C. fetus abortus & steriliteit bij runderen) Mens: C. jejuni – zorgt voor darminfecties en levert problemen op bij zuivel bij incorrecte sterilisatie Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -24- Microbiologie: theorie Groep 4: G- rechte staafjes en coccen Familie 1: Pseudomonaceae → Genus: Pseudomonas Eigenschappen: Chemo-organotroof, eenvoudige groei op artificiële media, enorm metabolisch potentieel voor het gebruik van C bronnen door aanmaak van ongewoon aantal enzymen → degradatie dood organisch materiaal en polluenten (pesticiden, aromaten, petroleum) Volgt ED pathway Sommige geel- groen fluorescerende pigmenten (P. fluorescens) Sommige psychrofiel → bederf op voedingswaarden Efflux van antibiotica door pomp-resistentie Anaërobe respiratie met nitraat uitvoeren → verlies van meststoffen P. putida: groei op uiteenlopende C-bronnen, “De E Coli van de milieutechnologie” Familie 2: Azotobacteriaceae (γ-proteobacteria) Vrijlevende N2-fixeerders met de vorming van NH4 In bodem: Genera Azotobacter In water: Genera Azomonas Familie 3: Rhizobiaceae (α - proteobacteria) Genus: Rhizobium Wortelknobbeltjes Symbiose met leguminosen, belangrijk voor landbouw ED pathway Genus Agrobacterium Eigenschappen: Geen stikstoffixatie A. temufaciens: veroorzaakt tumoren bij planten dor Ti-plasmide, dat integreert in chromosoon vd plant. Gebruik voor genetische manipulatie van planten ♦ Vb: Endotoxine van Bacillus thuringiensis → plant produceert eigen insecticide Familie 5: Aceotbacteraceae ( α -proteobacteria) Eigenschappen: Zetten suikers/alcohol om tot azijnzuur en evt verder tot CO2 en H20 Wijn → wijnazijn Genus Acetobacter: Groeit op ethanol Afbraak azijnzuur tot CO2 (complete Krebscyclus) Genus Gluconobacter Opstapelen van azijnzuur Enkel PPC is actief Sterk oxidatievermogen → wereldwijde toepassing in bioreactoren: productie van gluconzuur (wasverzachter), sorbitol (vit C), dihydroxyaceton (bruinen zonder zon) Familie 6: Legionellaceae (γ-proteobacteria) Genus: legionella Pathogeen: veroorzaak legionellosis = veteranen ziekte, soort longontsteking Verspreid via vochtdruppels in aerosol → inademing (fontein, bubbelbad) Groep 5: Facultatief anaërobe G- staafjes Familie 1: Enterobacteriaceae Genus: Escherichia E. Coli ♦ 0,1% van microbiële darmpopulatie ♦ Opportunistisch pathogeen in door darmwand → nierontsteking ♦ Sommige stammen produceren endotoxines → voedselvergiftigingen ♦ Onderverdeling o.b.v. antigenetische eigenschappen O: Oligosacharride van LPS laag, K: kapsel, H: flagella, F: fimbriae ♦ Indicatororganisme voor fecale contaminatie ♦ Aangepast aan darmmilieu → resistent aan hoge conc van galzoutenn → selektieve isolatie op medium met galzouten ♦ Gebruikt bij studies moleculaire biologie ≈ proefkonijn Genus Salmonella Veroorzaken van allerlei darmstoornissen, oa tyfus Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -25- Microbiologie: theorie Groep 12: Aërobe chemolitho-autotrofe bacteriën Eigenschappen: Aeroob → 02 is elektronen acceptor Oxidatie van anorganische stoffen als energie bron CO2 als C-bron Subgroep 1: Zwaveloxiderende bacteriën (kleurloze zwavelbacteriën, β-proteobacterien Genus Thiobacillus (β-proteobacteria) ♦ H2S / S2032- / S → SO42♦ Toepassing in mijnbouw: bacteriën stellen SO42- vrij en reageren met metalen zodat metaalsulfaten in oplossing gaan (microbieel logen) ♦ T. denitrificans: anerobe nitraatrespiratie ♦ Thiomargarita namibiensis: grootste bekende bacterie: 750µm Gram positieve bacteriën Groep 17: Gram positieve cocen Genus: Deinococcus In groepjes van 4 of 8 zeer grote coccen D. radiodurans: bestendig tegen radioatieve straling en droogte door extra lagen in celwand Genus staphylococcus Facultatief anaeroob op huid en muceuze membranen , dringt binnen in wonden → opportunistisch pathogeen S. Aureus: verzweringen, abcessen, hospitaalbesmettingen, MRSA Cocvormige melkzuurbacterien (streptococcus, lactococcus) Homofermentatief: vormen enkel melkzuur uit glucose Heterofermentatief: vormen naast melkzuur ook azijnzuur, ethanol Aerotolerant Spijsverteringskanaal, geslachtstelsel, huidklieren Worden ingeent in voedingsmiddelen: zuurkool, melk→yoghurt en kaas Sommige pathogeen: S. pneumonia : long en ooronstekingen ; S. mutans: tandbederf Groep 18: Endosporenvormers Overleven 10min koken → tracer bij sterilisatie processen Genus Bacillus Aeroob chemo-organotroof, soms fermentatie of anaërobe respiratie (denitrificatie) Ureolytische capaciteit Nuttige species: → Velen produceren antibiotica B. thuringiensis; produceert endotoxine die toxisch is voor insecten → Bt-mais B. subtilis: best bestudeerde G+ bacterie, proteasen → waspoeder Genus Clostridium Strikt anaeroob, zit in bodem en darmkanaal vd mens Doet aan rottings en fermentatie processen (azijnzuur en ethanolfermentatie) Exotoxines C.tetatin: tetanus = zenuwverlamming door neurotoxine C.botulinium: extreem toxisch botulinetoxine → verlamt de zenuwen C. acetobuylicum: produceert aceton, butannol en ethanol uit zetmeel, suiker → industrieel proces C. thermocellum: cellulose als C bron , in rumen van herkauwers Groep 19: Regematige niet sporulerende G+ staafjes Genus lactobacillus Ook melkzuurbacterie zoals bij de coccen Industriële productie van 10000 ton melkzuur per jaar Aerotolerant In yoghurt samen met Streptococcus, zouden darmflora stabiliseren (probiotcica) verhogen immuunrespons Groep 20: Onregelmatige niet sporulerende G+ staafjes Bifidobacterium bifidum Koloniseert als eerst de darm van baby’s na de geboorte, vermindert met ouder worden Beschermende functie door afscheiden bacteriocines tegen pathogene bacteriën Gunstig effect als probioticum? (yoghurt met actieve bifidus) Groep 30: Mycoplasma Wijken soms af van universel DNA-triplet code Zeer dikke CM , maar toch zeer klein → vroeger behorend tot de virussen “Spiegelei-colonies” Vele pathogeen voor mens (slijmvliezen) , dier en plant Alle andere groepen zijn minder belangrijk…. Maar zeker en vast ook eens zeer goed bekijken Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -26- Microbiologie: theorie Hoofdstuk 5: Nutritie, aanrijking & kweek van bacteriën (Berdien Desaever Algemeenheden Voor groei MO alle substantie voor synthese celmateriaal & generatie energie uit omgeving Substanties = nutriënten Elementaire chemische samenstelling microbiële cellen : indicatie vr nutriënten vereist vr groei Elementen nodig in vrij grote hoeveelheden: macronutriënten C,H,O,N,P, S vaste stof 95% DS (droge stof) Ca,Mg,Na, K, Fe Water :80 totale gewicht Metalen & organische verbindingen in zeer kleine hoeveelheden: micronutriënten & groeifactoren Cultuurmedia Algemeen Groei MO in labo-omstandigheden in cultuurmedia met benodigde nutriënten Voldoen aan nutritionele behoeften MO Complex medium minimaal medium Gedefinieerd medium: Exacte chemische samenstelling, zeer zuiver componten, (an)organsiche chemicaliën Niet chemische/ complex medium? Groei vele MO Digestie van dierlijke & plantaardige proteïnen (caseïne,vlees,sojabonen) Geen precieze kennis samenstelling nutrienten Selectieve medium? Componenten selectieve inhibitie groei sommige MO Remmende bestanddelen Differentieel medium? Indicator (kleurstof) Differentiatie chemische reactie tijdens groei Aangerijkte medium Complex medium + additionele nutriënten (serum bloed) Beter “nabootsen “ gastheercellen Vb, Neisseria gonorrhoeae Verschillende MO met verschillende nutritionele behoeften: Selectieve, differentiële & aangerijkte media Isolatie bepaalde species Vergelijkende studie MO Cultivatie & behoud zuivere culturen door aseptische technieken ( contaminatie ander MO) Aanmaak in semi-vast vorm door toevoegen gelerend bestanddeel aan vloeibare media Vaste cultuurmedia immobilizeren cellen groei & vorming zichtbare Microbiele groei Toename aantal cellen → bij meeste MO: binaire deling 1 generatie : deling van 1 cel in 2 cellen generatietijd variabel afhankelijk van ♦ nutritionele ♦ genetische factoren Celdeling & chromosoomreplicatie gecoördineerd & gereguleerd door Fts proteïnen Fts proteïnen interageren: celdelingapparaat in cel : divisoom Proteïne FtsZ : celdelingsvlak in prokaryoten Mre proteïnen: celvorm Synthese nieuwe celwand tijdens bacteriële groei door insertie nieuwe glycaaneenheden in bestaand celwandmateriaal Hydrofobe alcohol (bactoprenol) vereenvoudigt transport nieuwe glycaaneenheden door CM voor insertie in groeiende celwand Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -27- Microbiologie: theorie Transpeptidatie: Vorming peptide crosslinks tss muraminezuureenheden tss verschillende glycaanketens Generatietijd= tijd verdubbeling celpopulatie & -massa = “doubling time” 1à2u (uitz. <10min tot dagen) eerste 30min:2cellen , daarna tss 4-4.5u:256cellen/30min Microbiële populaties: exponentiële groei Plotten aantal cellen tov tijd op semi-logarithmische grafiek time=t ; generaties=n (1=is een verdubbeling) ; g=t / n Lag fase Latente fase / aanpasingsfase Na inoculatie : na 2-3 incubatie groei Duur fase afh v. ouderdom inoculumbacteriën Herkomst bacteriën aan- of afwezigheid essentiële groeifactoren Niet onmiddellijk expontiële groei door inoculum: Oude “stationaire fase” Cellen beschadigd (hitte, radiatie) Rijke cultuur armere cultuur Log fase Exponentiële fase Actieve fysiologische fase Snelheid rechtevenredig met T,pH,samenstelling medium, genetica Prokaryoten sneller dan eukaryoten Stationaire fase Nutriënt uitgeput & groei vertragen Afvalproducten of ongunstige pH : inhibitie groei Geen netto stijging celaantal (geen groei) Andere functie: energiemetabolisme & biosyntheseprocessen Afdodingsfase Geen delen bacteriën Meeste afsterven Lyse door eigen enzymen Cryptic growth= Soms overlevende cellen groeien ten kost van nutriënten die vrijkomen bij lyse dode cellen Meten groei: verandering aantal cellen gedurende bepaalde tijd Microscopisch: totaal aantal cellen in populatie Celplaatteling: levende, reproducerende populatie: giet-&strijkplaatmethode Verdunningsreeks Turbiditeitmeting: indirect, zeer snelle en bruikbare methode vr meten microbiële groei standaardcurve industriële fermentatie: behoud celpopulatie in expon. Groei tijdens lange periode bepaald door conc groei-limiterend nutriënt in vat Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -28- Microbiologie: theorie Effect van temperatuur op de groei Belangrijke factor die microbiële groei controleert: “cardinal temperatures”: minimum, optimum & maximum temperatuur bij dewelke elk organisme groeit (groeperen volgens temperatuur) min: transport heel traag waardoor de plant niet kan groeien ultim: enzym reacties zijn maximaal max: denaturaliseer proteïne, celmembraan springt Mesofielen: middenwaarde optimumtemperatuur Warmbloedige dieren bij aquatische omstandigheden Extremofielen optimale groei bij zeer hoge of zeer lage temperaturen Psychrofielen: Optima bij koude temperatuur Meest extreme permanent in koude omstandigheden Biomoleculen die het beste functioneren bij koud temp, maar ongewoon gevoelig kunnen zijn voor warme temperaturen Psychrotolerant: ♦ groeit bij 0°C, maar optimale T bij 20-40°C Thermofielen: optimum groeittemperaturen: 45-80°C >80°C : hyperthermofielen “hete” omgeving: warmwaterbronnen → T>100°C Taq polymerase –polymerase chain reaction (PCR) Hyperthermofielen optimum > 80°C “hete” omgeving: warmwaterbronnen T>100°C Effect van pH en osmotische omstandigheden Effecten vd pH Sommige organismen: beste groei bij lage /hoge pH meeste organismen : pH 6-8 Interne pH cel relatief neutraal Externe pH sterk zuur /basisch lage pH: acidofielen Hoge pH: alkalifielen Osmotisch effect op groei Xerofielen: zeer droge omstandigheden Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -29- Microbiologie: theorie Hoofstuk 6: Schimmels en gisten Inleiding - Fungi: groep die schimmels en gisten bevat o Eukaryote, niet fotosynthetische en chemo heterotrofe mo’s Mo’s maar wel duidelijk versschil tussen Prokaryotische bacteriën en schimmels / gisten Zeer diverse groep: 100.000 gekarakteriseerd tot op heden maar er worden er op aarde 1,4 miljoen spp o Tov de planten: 300.000 soorten gekarakteriseerd vd geschatte 500.000 Slijmzwammen en Oömycota behoren niet tot schimmels (vroeger wel in dezelfde fylogenetische groep) o Meer verwant met protozoa dan met de schimmels o Protozao: fagocytose, geen celwand aanwezig, motiel Chromista: Onderscheiden zich van echte schimmels, wnt hun CW is nt opgebouwd uit chitine wel uit cellulose Schimmels zijn heel belangrijk op mens en economie Sommige schimmels zijn pathogeen voor mens, dier of plant Voedingswijzen van schimmels schimmels: absorptieve heterotrofen ↔ fagotroof heterotrofen (dieren) ↔ autotroof (planten) met heterotroof = chemo-organotroof = organisme dat niet instaat is om koolhydraten te synthetiseren uit anorganische bestanddelen, dus nood heeft aan organische componenten fungi: kunnen vele polymere organische stoffen afbreken en zijn niet veeleisend qua nutrienten Voedselopname: zoals bij bacteriën, in opgeloste vorm 3 verschillende types van levens wijzen Symbionten: essentieel voor andere organismen ⇒ symbiose tussen schimmels en planten (mycorrhizae) Saprofyten: opruimers in tal van ecosystemen (leven op niet-levend organisch materiaal) Pathogenen: leven op levende organismen waar ze schade berokkenen (diverse waardplanten) Celstructuur van fungi Meestal (uitz gisten) zijn fungi filamenteuze organismen Het vegetatief lichaam vd schimmels is een thallus Hyfen Cilindrische, vertakte filmaneten opgebouwd uit een cilindrische cel met daarin cytoplasma en organellen Deze vertakte filamenten vormen mycelium Meeste fungale hyfen zijn 2 – 10 µm diameter Radiale groei (substraatmycelium) of verticaal (luchtmycelium) Septa Verschillend afhankelijk van het type schimmel Chytridiomycota → geen echte hyfen Zygomycota → coenocytische hyfen Basidiomycota , ascomycota → septate hyfen ⇔ hyfen die gesepteerd zijn (met tussenschotten) Gesepteerde hyfen: ♦ Primaire septen: voornamelijk in jong mycelium. Ze zijn geperforeerd ⇒ organel en cytoplasmabewegingen zijn mogelijk ♦ Secundaire septen: Ze zijn niet geperforeerd om ouder mycelium af te snoeren en dus af te stoten Totale hyfen massa van een thallus wordt mycelium genoemd. Bij de eigenlijke gisten ontbreekt een mycelium Bij sommige gisten (itt filamenteuze schimmels) gebeurt replicatie via knopvorming: Deel vd cytoplasma puilt uit → wordt afgesplitst vd moedercel → geen echte hyfen ~ pseudohyfen. Bij andere gisten: splitsing vd moedercel na elongatie → dochtercellen ontstaan niet als afsnoeringen maar wordt de moedercel midden door gespleten na elongatie Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -30- Microbiologie: theorie Celwandsamenstelling Gelachtige componenten Glycoproteinen: deze vormen een matrix doorheen de celwand Glycoproteinen: zijn gekoppeld aan suikerketens (vaak mannose) Structurele compnenten (allemaal fibrillaire componenten die treksterkte geven aan de celwand) Chitine microfibrillen opgebouwd uit: β 1,4-linked polymeren van N-acetylglucosamine Bij Zygomycota: chitosan dit is een polymeer van β 1,4-glucosamine Glucaan Andere celwandcomponenten Melaninen: donker bruin tot zwart gepigmenteerd (resistentie tegen enzymatische lyse, mechanische sterkte, bescherming tegen UV en uitdroging, meestal aanwezig in overlevingsstructuren zoals sporen) Hydrofobines: hydrofobe eiwitten Plasmamembraan (onder de celwand) Fosfolipide bilayer met perifere (aan 1 kant vd bilayer) en integrale proteïnen (over de gehele bilayer) Semi permeabel Nuclei (kern) van schimmels 1 – 3µm diameter 3 – 40 chromosomen 13 – 40 Mb (milj. Basen paren) DNA codeert voor 6.000 – 13.000 genen Gewoonlijk haploïd Nucleaire membraan blijft bestaan gedurende de deling Nucleaire geassocieerde organellen (NAO’s): organellen in schimmelcellen die zeer sterk geassocieerd zijn met de kern. Microtubili en Centriolen Centriolen zijn de belangrijksste Functie: in en uit elkaar gaan van chromosomen tijdens de deling (meïose en mitose) 2 centriolen vormen samen het centrosoom Andere organellen (in het cytoplasma Mitochondria (te vergelijken met dieren): Functie = omzetten van energetische bestanddelen naar ATP Ribosomen (eiwitfabriekjes vd schimmel): Functie = omzetting van RNA naar proteïnen Het ER: 2 types ER RER: Rough ER: Functie = finalisatie vd proteinebiosynthese. Klaarmaken v. proteïnen voor excretie doorheen CW, PM Functie = detoxificatie van toxische bestanddelen SER: Smooth ER Lipde biosynthese ⇒ belangrijk voor lipiden van plasmamembraan Golgiapparaat Functie: specifieke modificatie van eiwitten en sorteren naargelang hun eindbestemming Functie: vesicels aanmaken voor excretie Vacuolen: stockage van afvalproducten en enzymen Lipid bodies: belangrijke excrietie van wateroplosbare componenten Microtubili: dragen bij tot de stevigheid, belangrijk bij celdeling vormen van het cytoskelet waarlangs organellen migreren in het cytoplasma Lysosoom: digestie van oude celwandbestanddelen en celvreemde bestanddelen Opslagcomponenten Glycogeen, lipiden en trehalose in fungi en dieren Zetmeel in planten Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -31- Microbiologie: theorie Reproductie bij schimmels →voortplanting is grondslag voor de classificatie van fungi omdat ze zeer divers zijn. Er zijn 2 vormen mogelijk : aseksueel of seksueel, maar de meeste schimmels kunnen beiden Holomorf: seksuele + aseksuele vorm anamorfe = aseksuele vorm mitospore = spore gevormd via asexuele reproductie (mitose) Sporenvorming (belangrijkst) Uiteinde van hyfen worden conidiosporen afgesnoerd ⇒ Conidien (=sporen) zijn resultaat van mitose Indien inwendig dan spreekt men van sporangiosporen. Bij de lagere schimmels noemt men dit zoosporen omdat zo uitzonderlijk beweeglijk zijn Knopvorming (bij de meeste gisten) Aan moedercel komt uitgroeisel waarin zich een kern nestelt Dwarsdeling (bij sommige gisten) of gewoon afbreken = fragmentatie ⇒ de arthrosporen Fragmentatie bij schimmels, deze afgebroken cellen worden door dikke wand omgeven ⇒ chlamydosporen Chlamydosporen zijn ook stapelplaatsen voor reservestoffen Teleomorf = seksuele vorm Meiospore : spore gevormd via seksuele reproductie (meïose) Versmelting van 2 cellen (n chromosonen) tot 1 cel met versmelting vd kernen (⇒ 2n chromosomen) →recombinatie van genetisch materiaal tot oorspronkelijk naantal chromosomen = reductiedeling Verschillende fasen tijdens de teleomorfe fase. Deze kunnen afhankelijk vd schimmelsoort lang of kort duren Plasmogamie: versmelting 2 cytoplasma’s met vorming van een dikaryon (1cel met 2 kernen) Lang: bij de paddestoelen Kort: bij de gisten Karyogamie: versmelten van de 2 kernen diploïde cel (zygote = 2n) Lang : bij de gisten Kort : bij ascomyceten en basidiomyceten Meïose: vorming van ascosporen (haploïd) waaruit een haploïd mycelium ontstaat Lang : bij heterothallische gisten Kort: bij homothallische gisten Taxonomie (Berdien Desaever) Phylym: Chytridiomycota Zeer primitieve schimmels vormen geen echt mycelium Leunen sterk aan het dierenrijk Aseksuele fase: zoospore gevormd in zoosporangium Seksuele fase: bij bepaalde vertegenwoordigers gebeurt plasmogamy + karyogamie wnnr 2 sporen elkaar tgnkomen. sporagium gevormd nieuwe zoosporen gevormd Rust spore (cyste) : 20 jaar levensvatbaar ; vector vd virusziekte bij sla Nood aan water voor verspreiding vd zoosporen Saprofyten en pathogenen Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -32- Microbiologie: theorie Pyllum: Zygomycota Klasse : trichomytes en zygomycets Heterothallische homothallisch: *homo: seksuele cyclus ontstaat uit mycelium v eenzelfde schimmelisolaat (1 individu) *hetero: 2 of meer verschil. Schimmelisolatien nodig Mating type: te vergelijken met “geslacht” bij het hogere organismen Pyllum: Ascomycota Aseksuele sporen (conidia) nt gevormd in aparte ruimte (sporangiosporen) wel rechtstreeks afsplitsing vanop mycelium (condiogene gebieden) Seksuele sporen: ascosporen in ascus. Open (apothecium) , gesloten sfeervorming (cleistothecium), flesvormig (pethecium) Woronin bodies Gisten: G1: gevoelig voor “mating factoren” S: DNA synthese G2: vorming niuwe kop M: mitose+afsplitsing vd dochtercel Klasse:ascomycetes, pseudocytidomycetes, pyrenomycetes, saccharomycetes (gisten), schizoschharmomycetes, taphrinomycetes Phylum: Basidiomycota Paddestoelen + buisjeszwammen (eetbare en geen eetbare) Basidiosporen gevormd komen vooral voor op voedsel Plantenziekteverwerkers (sommige leven in symbiose, ander patogene) Klasse: badidiomycetes (steeltjeszwammen), urediniiomycetes (roesten) , ustilagiinomycetes (branden vb, bij maïs) Dolipore septa “Deuteromycota : fungi imperfecti “ Theorie : hebben geen geslachtelijke vorm of de geslachtelijke vorm is tot op heden nt gekend Zowel schimmels uit ascomycota als basidiomycota indien geslachtelijke vorm voorkomt dan heeft deze prioriteit boven de ongeslachtelijke schimmel geclassifeerd onder de geslacht. vorm Vb, botrytis cinerea (ongeslacht.,anamorf) en botryotinia fuckeliana (geslacht,telomorf) telkens hetzelfde organisme Klasse: hyphocetes (geen vruchtlichaam) Coelomycetes (sporen in vruchtlichaam) Agonomycetales (geen sporen) Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -33- vorm en wordt de Microbiologie: theorie Hoofstuk 7: Virologie Ontdekking • • Niet belangrijk Momenteel worden wel pogingen ondernomen om virussen aan te wenden om pathogenen (insecten, schimmels, bacteriën) te bestrijden. Dit noemt men faagtherapie De virusstructuur • Virusdeeltje of virion: extracellulaire vorm vh virus met RNA of DNA genoom • Bacteriele virus = bacteriofaag = faag • Introductie vh virusgenoom in de gastheercel gebeurt door een infectie • Zichtbaar via elektronenmicroscoop • Afmetingen: 20-500nm (dus beduidend kleiner dan bacteriën) • Classificatie: volgens replicatiestrategie en gastheertype OPM: Nucleine zuur : bevat DNA of RNA, nooit beide, maar bevat wel gewijzigde basen Soms unit membrane envelope (E) , andere naakt (N) • • • Eiwitten: gecodeerd door virale genen Fosfolipide is afgeleid vd waarcelmembraan (uitz. Poxvirussen) o E: vele dierlijke virussen bv herpesvirus o N: meeste plantenvirussen en bacteriofagen In ‘Enveloped’ virussen: 1 of meerder lipoproteinenlagen rond nucleocaspide o Nucleocapside: symmetrisch, met specifiek aantal en een arangement van structurele units rond virale nucleïnezuur Eiwitmantel • • • • • Sferisch of polyhedraal bij dierlijk & plantenvirussen & fagen De eiwitsubeenheden (n capsomeren = capside): geaggregeerd tot pentameren (P) of hexameren (H) Helicale (helix of staafstructuren) eiwitmantel o Voorbeelden: influenzavirus (E) ; tabaksmozaiekvirus (N) ; filamenteuze fagen (N) Sferisch + helicaal = binale structuur o Voorbeelden: vele fagen, niet-planten & dierlijke virussen “Head plus tail” configuratie = kop + staartstructuur Virusclassificatie Algemeen • • • • • • DNA of RNA: circulair, lineair, enkel (ss) of dubbelstrengig (ds) o Sommige RNA-virussen: meerdere genomen in virion: “segmented genome” o RNA-virussen Soms RNA (=plusstreng RNA) = direct mRNA Soms RNA (=minusstreng RNA) => complementair RNA = mRNA Helicaal, polyhedraal, binaal Evneloped E of naakt N Afmetingen; aantal capsomeren Genaamd naar ziekte, waardplant Ook aparte classificatie voor: dierlijke-, plantaardige- en bacteriele virussen Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -34- Microbiologie: theorie Enkele typische virusziekten • • • • Poxvirussen o Pokkenvirus: uitgeroeid na wereldwijde vaccinatie met levend virusvaccin in 1977 o Virusvariantie: Vaccinia virus door Jenner aangewend als vaccin o Lineair ds DNA virus o DNA repliceert in cytoplasma vd cel & synthetiseren zelf E o Hoe zichtbaar? Virus vormt puisten op de huid o Verspreiding? Via de lucht en ingeademd door andere persoon o De multiplicatie gebeurt in het lymfeweefsel en wordt verspreid via de bloedbaan naar huid en organ o De recovery geeft totale immuniteit Retrovirussen o Bevatten en enveloppe o Meestal +RNA virussen o RNA wordt via reverse transcriptase omgezet in ds DNA dat geïntegreerd wordt in de kern o Meeste retrovirussen zijn tumorverwekkend, bv leukemie o Human Immunodefiency virus (HIV) = meest bekende retrovirus Veroorzaakt AIDS syndroom. Hierover kun je zelf wel veel over vertellen é Ontdek in 1981 in Afrika en is nu verspreid over de hele wereld. Veroorzaakt ziekte vh immuunsysteem en infecteer T4 helpercellen Patienten zijn zeer gevoelig voor bepaalde kankers en opportunistische infecties Rhabodovirussen o Minusstrengvirus (-RNA virus) met E o Bezit eigen replicase in het vierion o Gekend als:“rabiesvirus”; veroorzaakt hondsdolheid o Verspreiding naar mens gebeurt via direct contact met vertebraten o Tast zenuwstelsel van warmbloedigen aan (mens, hond, knaagdieren) o Het is een neurotroop virus: verspreid en gerepliceerd via de zenuwen Baculovirus o Circulair ds DNA virus met enveloppe (300x40nm) o Veroorzaakt gewenste ziektes o Schadelijk voor insecten en niet voor vertebraten o Gebruik: bio insecticide o Virussen en kanker: oncogene virussen • • • Bij kanker -> weefselcellen hebben geen contactinhibitie meer gevolg is dat ze ongeremd verder groeien wat leidt tot een tumor Goedaardige tumoren: non-invasief ( wrattenvirus) o Kwadaardige tumoren: versprieden bv: metastase Sommige tumoren worden veroorzaakt door 30-tal gekende virussen Na invasie in de cel: geen lytische infecte maar transformeren cel in kanker cel: werking o Kankervirussen integreren in de waardcelchromosoom of bestaan als extrachromosaal element o Virus integratie: genetische wijziging vd waardcel (virale conversie) o Viraal gent komt tot expressie en genproducten veroorzaken de transformatie tot kankercel (=oncogenen) Bacteriofagen • • • De eerst in detail bestudeerde virussen waren bacteriofagen met lineaire en ds DNA die E coli en een aantal gerelateerde Bacterie infecteren Isolatie en studie van virussen als modelsysteem voor virusreplicatie. Deze veriussen werden gebruikt voor het vinden vd fundamentele principes vd moleculaire biologie en genetica Die fagen kregen volgende benamingen T1, T2 tot en met T7 Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -35- Microbiologie: theorie Groei en kwantificatie Fagen • • • • • • • • • Alleen replicatie in sommige types cellen of in volledige organismen bacteriofagen: modelsysteem: gastheercellen eenvoudig op te groeien en manipuleren in cultuur Cultivatie van vele dierlijke en plantaardige virussen is mogelijk 1 virion nodig voor initiatie infectueuze cyclus Niet alle virions zijn even infectueus Plaque assay: meten van infecteerbaarheid van virus Plaques: “opgehelderde zones” in lawn van gastheercellen Theoretisch: 1 plaque door infectie en enkel viruspartikel Virale plaque: analoog als bacteriele kolonie Plantenvirussen • Lokale lesies op bladeren Dierlijke virussen • • • “Pock assay” op kippenembryo’s in eieren Weefselculturen in vitro: plaques Op proefdieren, organen voor het bereiden van vaccis Kinetiek van de virusmultplicatie • • • • • • • Levenscyclus virus: 5 stadia o Aanhechtig (adsorptie) virion aangevoelige waardcel o Penetratie (injectie) virion of zijn NZ in de cel o Eiwit- & NZ-synthese door celmetabolisme o Samenstelling capsomeren & packaging NZ in nieuwe virions o Vrijstellling van mature virions uit de cel Verschillende stadia starten na infectie cellen door virion o “Eclipse” (latent) Virus: NZ + eiwitmantel afzonderlijk Replicatie van NZ + eiwit o Maturatie (latent) Gesynthetiseerde eiwitten vormen eiwitmantel o Vrijstelling virions (Burst): kan tijdsafhankelijk zijn Bij mo’s: 20-60min Bij dieren: 8-10u Aanhechting virion aan waardcel: hoog-specifiek proces met complementaire receptoren op het oppervlak van de waardcel en zijn infecterend virus. Hoe resistentie door de waardcel tegen infectie door virus? Door gebruik van restrictie-modificatiesytstemen die vreemd ds DNA herkennen en afbreken Voor de replicatie van virale NZ wordt het mRNA overgeschreven van viraal genoom voor productie van nieuwe virale eiwitten. o In sommige RNA virussen is het virale RNA gelijk aan het mRNA o Bij andere RNA virussen is het virusgenoom de template voor de vorming van mRNA o In sommige gevallen zijn essentiele transcriptie enzymen aanwezig in het virion Klassificatie van virussen: Baltimore Classificatie schema (7 klassificaties voor virussen) Baltimore gebasseerd op: o mRNA: plus (+) configuratie o Complement: min(-) configuratie o Nomenclatuur ook gebruikt bij het beschrijven vd configuratie vh genoom van een ss virus, wanneer het genoom RNA of DNA bevat o Virus met ssRNA genoom met zelfde orientatie als mRNA = positive-strand RNA virus o Virus met ss RNA genoom complementair aan mRNA = negative-strand RNA virus Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -36- Microbiologie: theorie Lytische en lysogene infectiecyclus (bij bacteriofagen) Specifieke infectie cyclus bij fagen 1. Faag hecht zich aan de buitenzijde vd bacteriecel en brengt DNA in de cel 2. Faag DNA repliceert in de bacteriecel 3. In de cel: aanmaak structuureiwitten, samenstelling vd nieuwe faagpartikels en vrijstelling uit bacterie • • • Infectie cyclus o Meestal zeer kort (soms minder dan 20min) o Lytische cyclus genoemd, want vrijstellen vd faagpartikels gaat gepaard met lyse bacteriecel o Snelle opeenvolging vd verschillende stappen => Faag DNA molecule heeft geen tijd om zich stabiel in te bouwen in gastheercel Lysogenebacteriofagen o Infectie cyclus: inbouw DNA in bacterieel chromosoom o Tijdens zgn lysogenisatie: integratie vh faag DNA in het chromosoom vd gastheercel en vd gastheercel o De geïntegreerde vorm vh faag DNA: profaag o Bacterie die een profaag draagt: lysogeen o Lysogene bacteriecel: niet de onderscheiden een wild type cel o De profaag kan na verloop van tijd terug uit bacterieel worden vrijgesteld en M13 bacteriofaag o Andere structuur o Kleiner dan landa-genoom (6407 nt) o 3 proteinen (eiwitkapsel) kop-staart : 15 EW o Eenvoudigere infectie cyclus o <10kb o enkelstrengig DNA o RF: ds DNA (plasmide achtig) Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -37- bacterieel vermenigvuldiging bij het delen van chromosoom terugkeren naar lytische infectiecyclus Microbiologie: theorie Viroiden, virusoiden, prionen, virino’s (=subvirale partikels) Viroiden • • Ontdekt in 1967 (Diener, VSA): sterk fytopathogeen, geen capside Naakte circulaire ssRNA moleculen (<400nt) o RNA bevat geen signalen voor vertaling in eiwit Prionen • • • • • Kleine infectueuze macromoleculen Normale prionen: PrPc (prion-protein cellular) o Alle zoogdieren o Onmisbaar, bv slaapritme Afwijkende (mutant) infectueuze vormen PrPSC (prion-protein scrapie) o Vormveranderingen doorgeven aan normale eiwitten => kettingreactie o Eveneens transformeren tot infectueuze prionen o Niet door normale eiwitsplitsende mechanisme vd cel herkend en afgebroken Gevolg: opstapeling in hersenen, zenuwstelsel • Gevolg: gaten in hersenen die een sponsachtig uitzicht geven o Protease resistent Onoplosbare aggregaten in neurale cellen => Destructie neurale cellen => Neurologische symptonen Volgens anderen veroorzaak door o Spiroplasma achtige bacterie die wordt overgedragen door insecten, mijten (FO Bastian 1993) o Acinetobacter calcoacetus (A. Ebringer, 1999) o Of toch een slow virus of auto-immuunziekte? Veroorzaakt degeneratie zenuw of hersenweefsel o Bij schaap, geit, hert, … “scrapie” ziekten o Runde: dolle koeien ziekte, via voederen van scrapie-besmet vlees en of beendermeel nr mens o Mens: Creutzfeldt-Jacob (CJD) ziekte o Jonge mensen: humane variant BSE, via eten van besmet vlees : hersenen ruggemerg Antivirale stoffen 1. Vaccinatie (soms uiterst moeiiljk: griep, verkoudheid, …) 2. Preventie, hygiene 3. Chemotherapie: schaarse resultaten a. Veelal te toxisch voor waardcel b. Moeilijke evaluatie; antibiotica niet effectief 4. Interferon: 1959: Isaacs en lindemann + Japanese onderzoekers a. Antivirale glycoproteines door eukaryote waardcel gevormd na virusinfectie en het virus inactiveren. b. Interferonen binden op speciale receptoren van niet geïnfecteerde cellen en stimuleren oa de synthese van 2 enzymen i. 2,5 oligoadenylaatsynthetase: deze katalyseert synthese van het polymeer 2,5-oligoadenylaat (die een endonuclease activeert, dat viraal DNA afbreekt) ii. Proteinekinase: deze wordt geactiveerd door dsRNA (intermediair in RNA-virusreplicatie met uitzondering de retrovirussen) en fosforyleert factor elF2 (vereist door initiatie van eiwitsynthese) die daardoor inactief wordt c. Interferonen worden snel na infectie gevormd en bieden bescherming tot specifieke antivirale antilichamen verschijnen i. Anti-tumor eigenschappen? Specifiek? ii. Profylacties toedienen: moeilijke productie (via rDNA) d. Interferon-inducers: synthetisch poly I=C 5. Immunomodulatoren: bepaalde celwandpreparaten van bacteriën en fungi stimuleren het afweersysteem Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -38- Microbiologie: theorie Hoofstuk 8: Fysische & Chemische bestrijding mo’s Chemische bestrijding Chemische agentia Antimicrobiele stof: chemische verbinding die groei mo’s verhindert of zelfs afdoodt Antiseptisch (germicide): chemische verbinding die mo’s afdood of groei inhibeert en voldoende non-toxisch is voor gebruik bij levende wezens Desinfectans: eliminatie van mo’s van bv oppervlak Fungicidaal/viricidaal/bactericidaal: stof die schimmels/virussen/bacterien afdoodt Fungistatisch/viristatisch/bacteriostatisch: stof die groei schimmels/virussen/bacteriën afremt OPM Bacteriostatisch: Inhibiteren eiwitsynthese Binding ribosomen Vb: vele antibiotica OPM: cidaal : bindend target en geen lyse OPM: lytisch Inductie afdoding lyse Celaantal ↓ Antibiotica inhibitie vd celwandsynthese (penicilline) Detergent Selective toxiciteit Niet selectief: op alle cellen gelijk Selectief: meer toxisch bv bij mo’s dan bij dierlijke cellen Antiseptica en desinfectantia Halogenen Organische en anorganische Cl en I verbindingen = cidaal: oxideren eiwitten en beschadigen CM I2: jodium oplossing in water of alcohol: Antisepticum Antiprotozoaal Cl-verbinding Desinfectans, deodorants Inactivatie reactie met organisch materiaal Organische derivaten ⇒ waterontsmetting (tabletten) Alcoholen Desinfectans, -icidaal, geen effect op sporen Coaguleren EW, solvent voor lipiden in CM Effectief bij 70 – 80% Hogere alcoholen beter: methanol, ethanol, isopropanol Alcohol + formo = sporocidaal Fenolen Aromatische alcoholen Eiwitprecipiatie & denaturatie; membraandisruptie via opervlaktespanningverlaging Fenol Sinds 1867 (Lister) als germicide Standaard test (fenolcoefficient) Zeer stabiel, corrosief, toxisch Matig sporocidaal Activatie samen met Cl of organische stof Ook pijnstillend Detergenten Lossen lipiden op in CM Hydrofobe-hydrofiele moleculen; tensioactief 1 ontschuiming Anionische (-): mild bactericidaal Kationische (+): sterk bactericidaal (niet op sporen) Voorbeeld: quarternaire ammoniumzouten Zware metalen Precipiteren enzymen en eiwitten Reactie met SH-groepen van cysteine As- verbindingen: vroeger syfilisbehandeling, antiprotozoaal ZnO: in zalven, antifungaal Sommige bacteriën zijn resistent aan zware metalen (plasmiden) Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -39- Microbiologie: theorie Peroxiden H2O2: onstabiel; efficiënt antisepticum 0,3 – 6%: desinfectie 6-25% sterilisatie, sporocidaal Na2O2, ZnO2: tegen acne Aldehyden Eiwitdenaturatie Formaldehyde (formol) HCHO Glutaaraldehyde (actief bij ph>7,5) 20% oplossing in 70% alcohol ⇒ steriliserend mengsel Kleurstoffen Bacteriostatisch; uitwendig gebruik Acridines: bv acriflavine ⇒ mutatie Rosalines: bv kristalviolet: tegen G+, gisten, protozoa Ook in selectieve media Zuren Eiwitdenaturatie H+ ionen bezetten negatieve ladingen op celwand en interfereren met ionentransport Minerale zuren: HCL, H2SO4: desinfecteren Organische zuren (als bewaarstoffen in voeding) Benzoezuur, sorbinezuur, azijnzuur, melkzuur, citroen zuur Alkaliën Als desinfectans in zepen, waspoeder, … Eiwitdenaturatie KOH, NaOH, NH4OH Gassen Ethyleen oxide Alkylerende stof, toxisch Explosief gas (freon, ..) 12u bij 60°C en 12% concentratie Groot penetratievermogen (plastic, matrassen, ruimtevaart) Formoldamp: fumigatie van ruimten bij 25°C Reactie met SH, COOH, NH2 en OH groepen Geringe penetratie: polymiseert als dunne film op het te behandelen materiaal Methylbromidedamp Desinfectans voor schimmels en bacteriën Fumigatie (in bepaalde landen verboden) + ethyleenoxide ⇒ sterilisatie, ruimtependels, satellieten Testmethoden voor antiseptica en desinfectans $+ Fenolcoefficient Vergelijking antibacteriële werking product met die van fenol tov testorganismen (=biodosage) o Staphylococcus aureus ATCC 6538, Salmonella chloreasuis ATCC 10708 , Pseudomonas .. Vermeng fenoldiluties en testproductdiluties met voornoemde culturen → DT 5, 10, 15 min → overenten in kweekmedium → ∆t: incubatietijd → na incubatie doen we controle op subculturen diluties op zichtbare groei. De fenolcoefficient = ratio vd hoogste verdunning v/e testproduct die afdoodt na 10minuten en niet na 5 minuten tot de fenoldilutie die hetzelfde effect geeft $ + Use dilution test: Wat is geschikte germicidedilutie voor praktijk? $ + Bacteriostatisch of bacteriocidaal Afhankelijk vd concentratie product Via subculturen van diluties, die de 1e ronde gn groei vertonen: indien terug groei ⇒ bacteriostatisch Idem: fungicidaal, virucidaal $ + Weefseltoxiciteitstest: Effect van dierlijke weefselstructuren tov bacteriën $ + Virusdesinfectantia (virucide) Stelt problemen ! Influenzavirus sensitief voor desinfectantia, maar bv voor enterovirussen (polio, echovirus, …) resistent Hittebehandeling is veiligste (zie fysiche methoden) Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -40- Microbiologie: theorie Chemotherapie en antibotica # # # # # # Vroeger plantenextracten, nu chemische of microbiële synthese Chemotherapeuticum: elke chemische stof die selectief toxisch werkt op parasiet zonder schade aan de waard aan te brengen. Antibioticum Microbiële stof met niet – toxische selectieve antimicrobiële actie bij lage concentratie Geproduceerd via industriële fermentatierprocessen of bioconversies Toepassingen: mens en dierengeneeskunde, landbouw, fytopathologie, rec DNA-technologie Bekend om microbiële infectieziekten Isolatie pathogene stam ⇒ selectieve media Bepaling vd gevoeligheid tov diverse antibiotica en chemotherapeutica (antibiogram) Bepaling min. inhibitieconcentratie (MIC) antimicrobiële stof Biodosage MIC: min. inhibitieconcentratie → groei remmen MBC: min. bactericidale concentratie (uittesten na subcultuur) → afdoden Antibiogram: op vaste media (boorgaten, filterdisken, cilindertjes) of vloeibare media Kwantitatieve biodosage via agardiffusietechniek met testorganisme (diam. Inhibiezone/logconcentratie) = dosage antibioticum (residu’s) in bloed, urine, weefsel & fermentatievloeistoffen Dosage groeifactoren & vitamines: groeizone! Bv. melkzuurbacterien Screening naar nieuwe biologschie actieve stoffen of enzymen (bv. via inhibitie-of klaringszone) Fysische bestrijding Vroeger: verbranden van klederen vd zieken: beschermende functie vh vuur Nu: andere technieken die we in het volgende bespreken Hittebehandeling en sterilisatie Thermale afdodingstemperatuur: Temperatuur waarbij suspensie van mo’s steriel is na 10min behandeling Thermale dodingstijd: tijd vereis om bij bepaalde temperatuur een suspensie van mo’s te steriliseren D-waarde (decimale reductietijd): tijd nodig om 90% vd cellen in een suspentie te doden bij een bepaald T Bv: D100°C Z-waarde: toename in aantal T-graden om de D-waarde te verlagen tot 1/10 vd originele waarde (Bigelow waarden) Voorbeeld: Bacillus megaterium sporen: D1OO = 1 minuut D95= 10 minuut ⇒Z=5 Voorbeeld: D105 = 6 sec en D110 = 0,6sec Indien de suspensie 10^9 sporen bevat per ml, dan zou het ongeveer 7 sec duren bij 110°C om het aantal te reduceren tot 1 per ml Berekening vd sterilisatietijd ⇒ belangrijk voor industrie, voeding, geneeskunde Sterilisatie: doden of verwijderen van alle levensvormen Controle via: thermometer, chemische verkleuring, biologische indicator Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -41- Microbiologie: theorie Vochtige warmte Doodt via denaturatie van eiwiten en wijziging in fysische toestand van lipiden Autoclaveren = steriliasatie met stoom onder druk zonder lucht (1atm overdruk), meestal wordt Na-benzoaat gebruikt als corrosie remmer Tijdens koken (15min bij 100°C) overleven de meeste sporen en virussen Pasteurisatie Toepassing :Voedingswaren, melk, … Functie -Verlengen van bewaarperiode en reductie vd bederfflora - Elimineren van “milk-borne, water-born, food-borne” ziekte kiemen (TBC, bricellose, streptococceninfecties, staphylocccenintoxicatie, salmonellosis, shigellosis, … Bath heating: 30min bij 62-65 °C HTST: 15-40sec bij 71°C Flash-pasteurisatie: 1 à 4 sec bij 85-90°C Geen inactivatie van toxines en sporen tijdens de pasteurisatie Tyndallisatie Werking: Herhaalde hittebehandeling bij 80-100°C met als doel ook gekiemde sporen te doden in thermolabiele vloeistoffen of media Droge warmte Oxidatie celcomponenten ⇒ droge cellen zijn resistenter aan droge dan aan vochtige warmte Incineratie ⇒ oognaald, instrumenten; niet geschikt voor vele materialen (plastic, rubber, …) Warme lucht: oven op 160°C (tot 170°C) gedurende 2u (of 1u bij 170°C). Glaswerk, poeders, olie Verwarmen in olie, siliconen, zand (160°C gedurende 1u) Radiatie Ultraviolet (UV) straling: 254nm (NZ-basen absorberen bij 260nm) … dit slaat op de golflengte λ Mutatie: thymidinedimeren; vermijdt fotorepair! Oogirritatie Geringe penetratie, enkel voor dunne lagen Lucht & watersterilisatie (steriele kamers, entkamers, bronnen, zwembaden, aquaria, …) Sterilisatie van plasma, vaccins Effect op bepaalde virussen (polio, echo, reo – virussen) Ioniserende straling → α, β, γ straling ⇒ mutatie Groot penetratievermogen Sporen relatief resistent G- gevoelig G+, gisten, fungi relatief gevoeliger Deinococcus radiodurans: resistent (herstelt snel DNA-schade) Sterilistie van materialen, naalden, voedingswaren … dit noemt men radiosterilisatie Ultrasonore trillingen Celdisruptie gebaseerd op cavitatie-effect Uittesten via Deinococcus radiodurans, Bacillus pumilis, Streptococcus sp. Filtratie en andere mechanische methodes Warmtegevoelige vloeistoffen of gassen: dieptefiltratie en membraanfiltratie (0,2µm) Vloeistoffilters: klei, porselein (Chamberland), diatomeeënaarde, papierfilters, gesinterd glas, cellulose-acetaat Luchtfilters: droge katoenwol, diepte en membraanfilters, high-effiency particular air (HEPA) filters Steriele (stofvrije) atmosfeerkamers: ruimtevaart, chipindustrie, biotechnologie, maskers, luchtconditionering Aëratie in fermentoren (luchtin- en uitlaat) Andere technieken die niet absoluut zijn: centrifugatie, sedimentatie, microfiltratoe, hoge druk, … Stijn Vandelanotte (Berdien Desaever) -42-
