Samenvatting

Samenvatting
Nucleoside hydrolasen katalyseren de hydrolyse van de N-glycosidische binding in nucleoside
met vorming van de overeenkomstige base en ribose. Onze onderzoeksgroep heeft afgelopen
jaren haar krachten gebundeld om deze enzymen te karakteriseren. In ons labo werd het
nucleoside hydrolase van Trypanosoma vivax (TvNH) geanalyseerd als modelsysteem voor de
purinespecifieke nucleoside hydrolasen. Deze studie resulteerde in de bepaling van de
structuur-functie relatie en het katalytisch mechanisme van dit enzyme (Versées et al., 2001;
Versées et al., 2002). Mutagenese studies op dit enzyme toonden echter aan dat het TvNH
waarschijnlijk een complex meerstaps reactiemechanisme volgt. Mutagenese van de actieve
site residu’s en substraatengineering veroorzaakten nauwelijks een effect op de steady state
kinetische parameters, het geen erop wijst dat deze macroscopische parameters een
combinatie
zijn
van
verschillende
microscopische
snelheidsconstanten
resulterend
in
macroscopische parameters die ongevoelig zijn voor wijzigingen van de snelheid van de
chemische stap. Dit alles heeft ons ertoe aangezet het TvNH te onderwerpen aan een
doorgedreven kinetische analyse van het microscopische reactie mechanisme.
De doorgedreven kinetische analyse toont inderdaad aan dat het enzyme een complex
meerstaps mechanisme volgt met een trage productvrijgave als de snelheidsbepalende stap.
In deze productvrijgave is een trage isomerisatie van een stabiel enzym·ribose complex naar
het snel dissociërend los complex de algemeen snelheidsbepalende stap van de hydrolyse
reactie. Verder heeft deze kinetische analyse geleid tot de ontwikkeling van twee mogelijke
modellen. Beide modellen zijn gebaseerd op een geordend Uni-Bi kinetisch mechanisme met
de
vorming
van
twee
enzym·substraatcomplexen
en
met
ribosevrijgave
volgend
op
basevrijgave. Het verschil tussen deze modellen ligt hem in de katalytische capaciteit van de
twee enzym·substraatcomplexen. In het “Enkele chemische stap” model is enkel één van de
twee complexen katalytisch competent. Het andere complex ondergaat eerst een isomerisatie
tot vorming van het katalytisch competent complex alvorens chemie kan plaatsgrijpen. In het
“twee chemische stappen” model zijn beide enzym·substraatcomplexen katalytisch competent.
Deze modellen vormden de basis in de bestudering van de contributie van een flexibele loop
(loop II) aan de individuele stappen in deze modellen. Proteïne engineering (een proline scan
van de loop en loop deletie mutagenese) in combinatie met kinetische analyse (steady state
en pre steady state) en structuurbepaling hebben aangetoond dat deze loop een belangrijke
rol speelt in leaving group activatie en productvrijgave. Loop II vouwt zich over de actieve site
tijdens de reactie. Hierdoor wordt er een water kanaal gevormd dat een rol speelt in leaving
group activatie. De loop ordent dit water kanaal wat de protonatie van de N-7 van de leaving
group vergemakkelijkt. Eenmaal de chemische stap heeft plaatsgevonden, bepaalt de loop
dynamiek de snelheid van productvrijgave. De geordende productvrijgave bestaat uit vier
stappen. De dissociatie van elk product wordt voorafgegaan door een trage isomerisatie van
de stabiel gebonden enzym·productcomplexen naar snel dissociërende losse complexen.
Waarschijnlijk omvat de trage isomerisatie voor base dissociatie een perifere opening van de
loop bestaande uit het verwijderen van de actieve site tryptofanen (Trp83 en Trp260) van het
base gedeelte en de opening van de loop boven de actieve site. Dit zou omschreven kunnen
worden als het openen van een deksel. Ribose zit diep in de actieve site en interageert met
zijn 2’OH groep met Asp14. Deze interactie veroorzaakt een omwenteling van de Trp242
zijketen. Dit is beschreven als het trigger mechanisme van de loopordering en vouwing over
de actieve site. De relaxatie van het helix gedeelte van de loop II en de verbreking van de
interactie met loop I van de andere subunit zou kunnen leiden tot de verbreking van de
Asp14-ribose interactie en ribose dissociatie. Bijgevolg omvat ribose vrijgave een “totale” loop
opening. Deze “totale” opening vindt veel trage plaats dan de perifere opening vereist voor
base vrijgave.
Ten slotte werd nagegaan of de mechanistische principes van het TvNH ook van toepassing
zijn voor de andere specificiteitklassen van de NH’s. Hiervoor werden de mechanistische
principes vastgesteld tijdens purine hydrolyse gekatalyseerd door TvNH getoetst aan het de
hydrolase reactie gekatalyseerd door het IG-specifieke NH van Trypanosoma brucei brucei.
Deze kinetische analyse toont aan dat de trage isomerisatie van het stabiel gebonden
enzym·ribose complex naar snel dissociërende los complex een geconserveerde stap is in het
mechanisme van purine specifieke nucleoside hydrolasen. Vermits de flexibel loop II betrokken
in deze isomerisatie bij TvNH geconserveerd is in de nucleoside hydrolase familie, is het
mogelijk dat deze loop een functioneel element vormt in het katalytisch mechanisme van de
nucleoside hydrolase familie.