Vergelijkende studie tussen het gebruik van circulerende
advertisement
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar 2015 - 2016 Vergelijkende studie tussen het gebruik van circulerende tumorcellen en cel-vrij DNA in kankeronderzoek Adinda VAN DEN BERG Promotor: Prof. Dr. Nadine Van Roy Masterproef voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE “De auteur en de promotor geven de toelating dit afstudeerwerk voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk.” Datum 12/04/2016 Naam (student) (promotor) Adinda van den Berg Prof dr Nadine Van Roy DANKWOORD Deze thesis had niet voltooid kunnen worden zonder de steun van iedereen die mij de afgelopen twee jaar heeft bijgestaan en geholpen. Ik wil dan ook graag van deze gelegenheid gebruik maken om hen van harte te bedanken. Mijn dankwoord gaat vooreerst uit naar mijn promotor, prof. Dr. Nadine Van Roy, voor haar uitstekende begeleiding, de raad bij het oplossen van de problemen en vraagstukken die ik ondervonden heb bij het schreven van deze thesis en voor haar geduld met mijn vragen. Tenslotte wens ik ook mijn echtgenoot en familie te bedanken voor hun aanmoedigingen, steun en luisterend oor. INHOUD Dankwoord Abstract .............................................................................................................................................. 1 Woord vooraf ..................................................................................................................................... 2 1 2 Inleiding ...................................................................................................................................... 4 1.1 Wat is kanker ....................................................................................................................... 4 1.2 Metastasering....................................................................................................................... 8 1.3 Circulerende tumor cellen (CTC’s) ................................................................................... 11 1.4 Celvrije nucleïnezuren ....................................................................................................... 13 Detectie methodes voor CTC en cfDNA .................................................................................. 16 2.1 CTC detectiemethodes ...................................................................................................... 16 2.1.1 Aanrijking .................................................................................................................. 17 2.1.2 Detectiemethoden....................................................................................................... 21 2.1.3 Karakterisatie van CTC’s ........................................................................................... 23 2.1.4 CellSearch .................................................................................................................. 23 2.1.5 EM CTC onderzoeken ............................................................................................... 24 2.2 cfDNA opzoekingsmethodes ............................................................................................. 24 2.2.1 cfDNA Extractie ........................................................................................................ 24 2.2.2 cfDNA Analyse .......................................................................................................... 25 3 Methodologie ............................................................................................................................ 26 4 Discussie ................................................................................................................................... 27 4.1 Het gebruik van CTC’s...................................................................................................... 27 4.1.1 CTC-aantal ................................................................................................................. 28 4.1.2 CTC karakterisatie ..................................................................................................... 29 4.2 Het nut van CTC detectiemethoden .................................................................................. 31 4.2.1 Selectie op grootte ...................................................................................................... 35 4.2.2 Immuno-affiniteit ....................................................................................................... 35 4.2.3 CellSearch .................................................................................................................. 37 4.2.4 Microfluïdics .............................................................................................................. 38 4.2.5 Besluit detectiemethodes voor CTC’s........................................................................ 38 4.3 4.3.1 cfDNA concentratie ................................................................................................... 39 4.3.2 cfDNA karakterisatie ................................................................................................. 41 4.3.3 Besluit cfDNA............................................................................................................ 41 4.4 5 cfDNA ............................................................................................................................... 38 CTC’s versus cfDNA ....................................................................................................... 41 Besluit ....................................................................................................................................... 44 Appendix A: Afkortingen .................................................................................................................. I Appendix B: Nomenclatuur : (2),(7) ................................................................................................III Appendix C: Impact factoren .......................................................................................................... IV LIJST VAN FIGUREN EN TABELLEN TABEL 1 MOGELIJKHEID TOT UITSPRAAK OVER OS EN PFS OP BASIS VAN CTC TELLING .................... 30 TABEL 2 TABEL CTC ONDERZOEKSMETHODE ................................................................................................... 33 TABEL 3: CFDNA EXTRACTIE.................................................................................................................................. 40 TABEL 4 IMPACT FACTOREN VAN GEBRUIKTE JOURNALS ............................................................................IV FIGUUR 1: VERANDERINGEN IN CELLEN DIE KANKER VEROORZAKEN……………………………..……6 FIGUUR 2: VERSCHILLENDE STAPPEN NODIG VOOR METASTASE…………………………….……...……10 FIGUUR 3: VERSCHIL IN CTC AANTALLEN IN VERSCHILLENDE TYPES KANKER……………….………13 FIGUUR 4:VERSCHILLENDE DETECTIEMETHODES VOOR CTC’S…………………………………...…16 FIGUUR 5: VERBAND TUSSEN CTC AANTALLEN EN OVERLEVINGSKANS………………………….…….38 ABSTRACT Na cardiovasculaire aandoeningen, is kanker de meest voorkomende doodsoorzaak. Indien kankerpatiënten komen te overlijden, is dit meestal door het ontstaan van metastasen. Het vroegtijdig opsporen van deze metastasen en de mogelijkheid tot het aanpassen van de therapie aan de specifieke vorm van kanker bij de patiënt zou kunnen leiden tot het ontstaan van een meer effectieve en gepersonaliseerde behandeling. Het idee van een vloeibare biopsie, met name een bloedafname waarin circulerende tumorcellen (CTC) en celvrij tumor DNA (cfDNA) aanwezig zijn, is zeer actueel en het onderwerp van een groot aantal studies. Verschillende methodes voor het opsporen van deze tumorfragmenten werden reeds ontworpen en onderzocht. In dit werk worden verschillende technieken besproken, die deze CTC’s en cfDNA in bloed opsporen en analyseren. Verder wordt er ook besproken welke resultaten de verschillende onderzoeken hebben opgeleverd en welke implicaties deze kunnen hebben op het vlak van kankeronderzoek. Het aantal CTC’s en de ctDNA concentratie kunnen gebruikt worden om de overleving en progressievrije overleving in te schatten. Bovendien kan men door een vergelijking van de waarden voor en na therapie, de respons beoordelen. Elk van de besproken methodes heeft verschillende voor- en nadelen, en verschillende toepassingsgebieden, maar de perfecte methode voor het creëren van de vloeibare biopsie is tot op heden nog niet gevonden. Daarenboven blijft het gebrek aan specifieke tumormerkers en sensitieve analyses een struikelblok. Door het ontbreken van een consensus over de exacte definitie van een circulerende tumorcel is het moeilijk een vergelijking te maken tussen de verschillende methodes. Een veelbelovende piste is het gebruik van technieken die CTC’s en ctDNA combineren. Dit leidt bijvoorbeeld tot betere resultaten voor de bepaling van een goede respons op kankertherapie en zou eventueel op andere gebieden ook vooruitgang kunnen betekenen. Een betere vergelijking tussen de verschillende technieken zou eveneens mogelijk gemaakt kunnen worden door standaardisatie en protocollering inzake bloedafnames en de opslag van stalen. Verder onderzoek is eveneens aangewezen om te bepalen hoe CTC en cfDNA karakterisatie een rol kan spelen in het personaliseren van kankertherapie aan de hand van bepaalde moleculaire fenotypes. Pagina | 1 WOORD VOORAF Het menselijk lichaam bestaat uit een verzameling van verschillende types cellen. Sommige van deze cellen vernieuwen dagelijks of wekelijks, zoals bijvoorbeeld huidcellen, welke om de twee à vier weken vernieuwen. Andere cellen vernieuwen niet meer na hun ontwikkeling of differentiatie, tenzij er schade is gebeurd, zoals spiercellen en levercellen. Deze generatie en regeneratie van weefsels en cellen gebeurt onder controle van een zeer complex en gecoördineerd geheel van opeenvolgende stappen en welbepaalde interacties, welke tot op vandaag nog niet ten volle begrepen zijn (1). Indien er door een interne of externe factor iets fout loopt in dit gehele proces, dan kan er kanker ontstaan. Volgens Robbins en Cotran is kanker, na cardiovasculaire aandoeningen, de grootste doodsoorzaak in de Verenigde Staten (2). Ook in België is 1 op 4 overlijdens kanker gerelateerd (3). Ondanks de vele mogelijke behandelingen, zoals radiotherapie, chemotherapie en chirurgie, is kanker niet geneesbaar. Zelfs indien een behandeling succesvol is, bestaat er altijd de kans dat de kanker opnieuw optreedt of dat hij reeds uitgezaaid is. Zo treedt bijvoorbeeld bij 25% van de patiënten met colorectale kanker CRC opnieuw kanker op na resectie van de primaire tumor (4). Bovendien is 90% van de sterfte aan kanker gerelateerd aan de vorming van metastasen door een verspreiding van tumorcellen vanuit de primaire tumor via het bloed (5). Als er bij de patiënt metastasen worden ontdekt, is een chirurgische resectie vaak niet meer mogelijk en wordt geopteerd voor chemotherapie. Het is de laatste decennia ook duidelijker geworden waarom sommige behandelingen bij patiënten niet aanslaan en bij anderen wel. De oudere behandelingen tegen kanker waren namelijk gericht tegen een bepaald type van kanker, maar niet specifiek tegen de individuele manifestatie bij de patient. Tegenwoordig zijn behandelingen gebaseerd op specifieke kenmerken van biopsie van de primaire tumor. Deze methode stelt echter verschillende problemen. Ten eerste is een biopsie van de gezwellen is niet altijd mogelijk, door hun fysische locatie en aantallen. Ten tweede kan de primaire tumor wijzigen, zowel in de loop van de tijd als onder invloed van de kankertherapie(6). Hierdoor vertonen deze gemuteerde cellen niet meer dezelfde respons op de oorspronkelijke medicatie. Bovendien ondergaan cellen bij de vorming van metastasen vaak veranderingen, waardoor deze niet meer dezelfde karakteristieken zullen vertonen als de primaire tumor. Gezien zijn invasiviteit, is biopsie als opvolgingsmethode niet geschikt voor het opsporen van deze mutaties en de daaruit voortvloeiende therapie wijzigingen (7). Pagina | 2 Een eenvoudige manier om de mutaties in de primaire tumor en om metastatische gezwellen te karakteriseren, zou dus een grote vooruitgang betekenen. Hierbij kunnen circulerende tumorcellen en tumorcel fragmenten een belangrijke rol vervullen (8). Het voorkomen van circulerende tumorcellen (CTC’s) en tumor fragmenten zoals DNA en RNA werd reeds voor het eerst besproken in een artikel uit 1869 (9). De mogelijkheid om dit type cellen uit bloed te extraheren, was toen echter nog te beperkt om er diepgaand onderzoek naar te verrichten, waardoor dit fenomeen een lange tijd niet verder is onderzocht. Wegens de verstrekkende technologische ontwikkelingen van de laatste jaren, is dit onderzoek terug een “hot topic” in de wetenschappelijk kringen. Het onderzoek naar de rol van deze CTC’s en cel-vrije fragmenten zou de mogelijkheid bieden om ziekteprogressie en kankerbehandelingen onmiddellijk op te volgen, zonder invasieve biopsieën (10). De doelstelling van deze thesis is een vergelijking van de huidige detectiemethodes voor CTC’s en cfDNA en hun respectievelijke voor- en nadelen en toepassingsdomeinen. Hieruit worden conclusies getrokken over de klinische bruikbaarheid van beide methodes. De inleiding bevat een korte introductie over kanker en zijn ontstaansmechanisme. Hierna wordt de metastasering van kanker besproken. Na deze bespreking wordt overgaan tot de beschrijving van de circulerende tumorcellen en het huidige onderzoek dat hierop gebaseerd is. In dit gedeelte wordt onderzocht of deze cellen gebruikt kunnen worden voor kankeronderzoek. Eveneens zal er een korte introductie gegeven worden over vrij circulerende nucleïnezuren (cfNA: cell free Nucleïc acids, DNA, RNA) en het gebruik dan deze bij kankeronderzoek. Tot slot zal ik het gebruik van CTC’s en ctDNA vergelijken. Pagina | 3 1 INLEIDING 1.1 WAT IS KANKER Het Pinkhof Geneeskundig Woordenboek definieert kanker als (11): “Verzamelnaam voor meer dan honderd verschillende typen kwaadaardige gezwellen; kanker vormt met hart- en vaatziekten de belangrijkste doodsoorzaak in de westerse landen” De definitie gaat verder als: “Kwaadaardige nieuwvorming; ongecontroleerde vermenigvuldiging van cellen, gekenmerkt door vernietiging van het omgevende weefsel, ingroei in vaten en versleping van cellen via bloed en lymfe naar andere organen en weefsel” Het woord kanker komt van het Latijn cancer, letterlijk vertaald als krab, omdat de ziekte zich vastgrijpt aan de weefsels en lang blijft hangen. Kanker is niet één ziekte, maar een verzamelnaam voor verschillende aandoeningen. Er zijn verschillende factoren die de behandeling van kanker bemoeilijken, de twee belangrijke zijn: Ondanks de vele jaren van onderzoek, bestaat er nog heel wat onzekerheid over het precieze ontstaan hiervan. Dit voornamelijk door de grote diversiteit van kankergezwellen en de onduidelijke etiologie. Deze onduidelijkheid bemoeilijkt de behandeling. Dezelfde behandeling geeft vaak andere reacties bij verschillende patiënten, zowel qua toxiciteit als naar effect van de behandeling (2). Idealiter zou de therapie moeten aangepast worden aan het individu, hetgeen nu meer en meer wordt nagestreefd via genetische analyses van de tumor. Zowel micro- als macroscopische karakteristieken bepalen of een gezwel goed- dan wel kwaadaardig is. De niet-maligne gezwellen zijn deze die lokaal blijven, geen metastasen veroorzaken en waarbij chirurgie curatief is. Dit betekent echter niet dat ze geen negatieve gevolgen kunnen veroorzaken bij de patiënt. Zo kan een hersentumor bijvoorbeeld zorgen voor sensibele of motorische uitval, hetgeen kan leiden tot een belangrijke handicap bij de patiënt. Het onderscheid tussen benigne en maligne wordt gemaakt op basis van de graad van differentiatie of anaplasie1, de groeisnelheid2, lokale invasie en de aanwezigheid van metastasen(2). 1 Goed gedifferentieerde cellen lijken zowel morfologisch als functioneel op de normale cellen van het orgaan. Indien geen differentiatie meer aanwezig is spreekt men van anaplasie. 2 De groeisnelheid is vaak gecorreleerd met de differentiatiegraad: slecht gedifferentieerde gezwellen groeien sneller. Pagina | 4 Het is algemeen aanvaard dat een kankergezwel ontstaat door een opstapeling van niet-lethale genetische schade. Deze schade kan omgeving-gebonden of erfelijk zijn. Zo kan een levenslange blootstelling aan carcinogenen, bv. de blootstelling aan Uv-licht of chemicaliën, leiden tot een cumulatief effect. Dit cumulatief effectief van DNA-schade uit zich in een grotere kans op kanker op hogere leeftijd (2). Meestal ontstaan dit soort mutaties in somatische cellen, en zullen deze mutaties niet worden doorgegeven aan het nageslacht (1). Stochastische en spontane schade is eveneens mogelijk. Tumoren ontstaan uit de clonale expansie van een enkele precursor cel welke genetische schade heeft. Normaal zou deze schade moeten worden hersteld door de aanwezigheid van onderhoudsmechanismen aan het genoom, checkpoint signaalwegen etc.… Kankerstamcellen kunnen ontstaan als verschillende mutaties in deze cellen ervoor zorgen dat zij ongevoelig worden voor de verschillende signalen die wildgroei en over-proliferatie tegengaan. We krijgen hierbij zogenoemde onsterfelijke cellen. Het ontstaan van kanker of oncogenese is een samenspel van genetica en de omgevingsfactoren (12). Er zijn 4 grote doelwitten die genetische schade ondervinden: de groei-promoverende proto oncogenen, groei-inhiberende tumor suppressor genen, apoptotische genen en DNA-herstel-genen (1). Proto-oncogenen: Deze genen zorgen er normaal voor dat er een normale proliferatie van cellen gebeurt. Door een mutatie worden deze genen omgezet naar oncogenen, waardoor er een sterke celvermeerdering gebeurt d.m.v. proliferatie. Tumor suppressor genen: De tumor suppressor genen houden controle over de celgroei. De deactivatie van deze onderdrukking leidt tot een overgroei van deze cellen. Apoptotische genen: Deze genen controleren de apoptose van cellen die schade hebben opgelopen door bijvoorbeeld ziekte of ouderdom. Een deactivatie van deze genen zorgt ervoor dat deze cellen onsterfelijk worden. DNA herstelgenen: Deze genen zorgen ervoor herstelling indien er een fout is in het DNA door een foutieve transcriptie. Indien deze fout niet herstelbaar is, dan wordt deze geprogrammeerd tot apoptose. De uitschakeling van deze genen kan zorgen voor een opstapeling van verscheidene mutaties. Maligne verandering kan te maken hebben met een ‘gain of function’ effect: vb. proto oncogenen die muteren (RAS-gen), transloceren (BCR-ABL) of amplificeren (Her2-Neu). Mutante allelen bij proto-oncogenen worden als dominant aanzien, aangezien er een aberratie optreedt in de regulatie, Pagina | 5 zelfs indien het andere allel geen mutatie draagt. Bij haplo-insufficiëntie is er een verminderde functie door de aanwezigheid van een beschadigd allel. Ook een verlies van functie zoals van het welgekende TP53 gen, welke instaat voor tumorsupressie door gemuteerde cellen tegen te houden, kan het ontstaan van kanker in de hand werken. Indien deze niet meer goed functioneert dan zal de expressie van E-cadherine dalen, hetgeen EMT in de hand werkt. Hierdoor kunnen kankerstamcellen ontstaan en wordt tumorgroei en metastase mogelijk. Er is een verband gevonden tussen TP53 en Ki- 67 expressie wat gepaard gaat met grotere tumoren en de expressie van o.a. VEGF en EGFR. Zo is ontdekt dat mutaties in het TP53 gen aanleiding kan geven tot tumorprogressie en een teken is van slechte prognose in TNBC (13). Figuur 1: veranderingen in cellen die kanker veroorzaken(14) Volgens Hanahan et. al moet een cel zes verschillende kenmerken van kanker accumuleren vooraleer zij een gezwel kan vormen. Sinds de eerste publicatie van dit artikel in 2000 zijn al heel wat wijzigingen aangebracht aan deze simplistische hypothese. Naast deze 6 stappen wordt de wisselwerking tussen de cellen en hun omgeving nu eveneens in rekening gebracht (zie figuur 1) (14). In een eerste stap gebeurt een bepaalde mutatie in de cellen, waardoor zij apoptose of een stop van proliferatie vermijden (15). In deze fase worden de voedingsstoffen in de tumor aangeleverd via diffusie uit het bloed, die voldoende zijn voor overleving van de cel (16) . Eens de tumor een bepaalde grootte heeft bereikt zal het signalen uitsturen, opdat er angiogenese zou optreden voor verdere bloed- en ook voedselvoorziening (1). Dit is nodig om de tumor verder te laten toenemen in grootte. Bij verschillende kankerbehandelingen vormt de angiogenese een doelwit (2). De gevormde tumor is geen geïsoleerde massa, maar een geheel van heterotypische cellen die met elkaar in communicatie staan (15). Hierbij is het ook belangrijk in welke micro-omgeving de tumor zich bevindt. Een neoplasma is dus een abnormale groei van weefsel waarbij de groei groter is en Pagina | 6 ongecoördineerd ten opzichte van de groei van normaal weefsels. Deze overmaat blijft aanwezig zelfs nadat de stimulerende signalen die de verandering hebben veroorzaakt, zijn gestopt (2). De cellen die het neoplasma vormen zijn allemaal afkomstig van éénzelfde voorloper cel welke gemuteerd is. Het gezwel is dus monoclonaal in oorsprong (2). Bij alle tumoren is er een clonale groei van cellen, het stroma bestaat hierbij uit het bindweefsel, de macrofagen en de lymfocyten. De cellen bepalen het gedrag en consequenties, terwijl de groei en evolutie van het gezwel wordt bepaald door het bindweefsel. Deze evolutie werd tot nog toe niet in rekening gebracht bij het kiezen van een gerichte therapie. De therapie wordt in onze huidige setting nog teveel gekozen aan de hand van de primaire tumor, zelfs bij de behandeling van metastasen (17). Het verlies van heterozygociteit3 heeft eveneens een bepaalde rol bij het ontstaan van kanker. Sommige tumorcellen zijn in staat om het natuurlijke immuunsysteem te omzeilen (18). Zo kunnen kankercellen bijvoorbeeld het immuunsysteem ontwijken door zich te binden aan bloedplaatjes (19). Verder is het mogelijk dat de tumor immuun onderdrukking benut door het uitsturen van cytokines. Zo is uit verschillende onderzoeken is gebleken dat tumoren vaker voorkomen bij mensen die immuun gedeprimeerd zijn, zoals ouderen en mensen die op immuun suppressie-medicatie staan (20). Bij mensen met een goed werkend immuunsysteem ontstaat er een immuun gemedieerde aanval tegen de tumor antigenen. Deze is echter niet sterk genoeg om de maligne cellen te elimineren of om metastasering tegen te houden. Er zijn verschillende factoren die de therapie bemoeilijken. Hierbij zijn de heterogeniteit van de primaire tumor en het optreden van resistentie de belangrijkste. De heterogeniteit van de tumor wordt bevorderd door verschillende factoren, waardoor de tumorgenen wijzigen. De tumorcellen evolueren in de tijd doordat ze zich aanpassen aan hun omgeving en doordat zij het immuunsysteem ontduiken (18). Ook iatrogene factoren spelen een rol: de sterke tumorcellen die therapie overleven worden net door het geven van die therapie uitgeselecteerd waardoor resistentie zal ontstaan (17). Tumoren kunnen resistent worden aan de therapie, door verandering van signaalwegen, door verhoogde expressie van anti-apoptotische genen, maar ook door transformatie naar mesenchymale of verscheidene histologische fenotypes (21). 3 Verlies van heterogyzgociteit (LOH) betekent dat bij een recessieve genetische aanleg tot kanker, de kans op kanker zal verhogen als ook het tweede allel muteert. Pagina | 7 De volledige kankercellen kunnen zich verder uitbreiden via lokale invasie en via metastasering. De cel-cel cohesie via de cel adhesie molecules of CAM’s gaat hierbij verloren. Veel carcinomen hebben ook epitheliale cadherine expressie. Bij invasie is vaak ook de balans tussen activatie en inhibitie van proteolyse4 verstoord. De matrix metalloproteinsaen en hun weefsel inhibitoren (MMP en TIMP) worden tegenwoordig gebruikt als doelwitten in kankertherapie. Wanneer de cellen ook nog de verbinding met naburige cellen of het stroma verliezen, dan kunnen zij loskomen en aldus kan de tumor aldus verspreiden (1). Ze vormen dan zogenaamde metastasen. 1.2 METASTASERING Metastasen zijn tumorafzettingen die verschijnen in andere organen dan de primaire tumor, dit kan reeds in de eerste fase van het ontstaan van kanker voorkomen (22). Metastasering van de primaire tumoren vormt de grootste doodsoorzaak bij kankerpatiënten (23). Metastatische capaciteit is een duidelijk teken van een maligne tumor, benigne tumoren zullen immers nooit aanleiding geven tot metastasen. Met uitzondering van gliomen van basaal cel carcinomen, kunnen namelijk alle maligne tumoren aanleiding geven tot uitzaaiingen (1). Disseminatie van tumorcellen door intravasatie in het vasculair en lymfatisch stelsel kan deels door toeval, maar ook door interacties tussen receptoren en bepaalde cytokines. Deze worden gevonden in stromale in tumorcellen, zoals TNF, IL-6 en cytokines(12). Er zijn verschillende manieren waarop een primaire tumor kan uitzaaien: ofwel via directe inplanting, ofwel lymfogeen ofwel hematogeen.: Directe uitzaaiing gebeurt wanneer de maligniteit direct een natuurlijk caviteit binnendringt, bv: de peritoneale caviteit. Dit is vaak het geval bij een ovariumcarcinoom. Lymfogene uitzaaiing: de initiële disseminatie van een carcinoom gebeurt het vaakst via deze weg. Aangezien de disseminatie de natuurlijke lymfe-afvoer volgt, weet men welke lymfeknopen zullen aangetast zijn bij uitzaaiing. Bijvoorbeeld bij borstkanker in het bovenste laterale kwadrant, zijn vaak de axillaire lymfeknopen de eerst aangetaste locatie bij metastasen.. De sentinel knopen, ook schildwachten knopen genoemd zijn lymfeknopen die het eerste lymftoevoer krijgt vanuit de primaire toevoer. Deze lymfeknopen zorgen voor een eerste stoppunt in de disseminatie van tumorcellen, waardoor zij vaak toenemen in grootte, hetgeen een duidelijke klinische manifestatie kan zijn van de metastase van een kanker. 4 Proteolyse is de afbraak van proteïnen Pagina | 8 Hematogene spreiding is typisch voor sarcomen, maar kan ook voorkomen bij carcinomen. Hierbij worden arteriën, met hun dikkere wanden, minder makkelijk gepenetreerd dan venen. De arteriën kunnen wel gepenetreerd worden, wanneer de cellen voorbij de longen komen. Dit door de arterioveneuze shunt en capillaire bedden. Als de uitzaaiing via de venen gebeurt, volgen de tumorcellen de natuurlijke afvloeiing van de venen, zodat in dit geval de lever (portaal) en de longen (cavaal) vaak geïmpliceerd zijn bij de metastasevorming(12). Er bestaan verschillende modellen over het ontstaan van metastasen. Zoals alle modellen zijn ook deze slechts een benadering van de werkelijkheid. Eén bepaald model gaat uit van een primaire tumor van waaruit gedeeltelijke competente cellen losgelaten worden. Deze cellen zullen dan een metastase vormen wanneer zij volledig competent zijn. Een ander model beschrijft het bijna gelijktijdig ontstaan van metastasen met de primaire tumor, waarbij er bijna normale epitheliale cellen loskomen van de preneoplastische laesie(17) . Uit verschillende onderzoeken is gebleken dat hematogene verspreiding van circulerende tumorcellen de hoofdoorzaak is voor het ontstaan van metastasen(24). Elke dag worden miljoenen cellen losgelaten uit de primaire tumor, maar slechts enkele zullen aanleiding geven tot metastase. Bij vrouwen met borstkanker kunnen verschillende bloedafnames de aanwezigheid van circulerende tumorcellen bevestigen, maar bij deze vrouwen ontstaat er niet noodzakelijk een metastase (2). Slechts 1 op 10.000 tumorcellen uit de primaire tumor kan loskomen zal een secundaire tumor kunnen vormen(1). De cellen die in circulatie komen op verschillende manieren tegengehouden (2). De precieze mechanismen van het ontstaan van metastasen zijn nog niet volledig gekend(25). We weten echter wel dat metastasering bestaat uit verschillende stappen. Deze stappen zijn weergegeven in Figuur 2. Pagina | 9 Figuur 2 Verschillende stappen nodig voor metastase: sequentiële stappen bij hematogene spreiding van een tumor(2). Normale cellen blijven op hun plaats via cel-celadhesie en door de basale membraan, hetgeen een fysieke barrière vormt. De tumorcellen vallen de basale membraan aan via vezels uit de extracellulaire matrix. Met behulp van invadopodia5, die verschillende proteasen produceren, dringen deze cellen de bloedvaten binnen(1). Via het EMT ofwel het epitheliaal naar mesenchymale transformatie proces, zou er uit de oorspronkelijke tumor cellen vrijkomen die via de bloedbaan op een andere locatie een tumor veroorzaken(23). Dit proces is nodig om te overleven in de bloedstroom en om andere organen te penetreren(10). Bij het EMT proces zal de cel-cel adhesie verminderen en zal de cel mobieler worden en ook gemakkelijker invaderen. De verhoogde invastiviteit wordt bevordert door het verlies aan Ecadherine, waardoor de binding tussen de cellen onderling vermindert(22). De cel verliest de epitheliale merkers en zal qua fenotype meer op mesenchymaal weefsel lijken(26). Eens de cellen in de bloedbaan terecht zijn gekomen, moeten de tumorcellen bepaalde interacties met de gastheer kunnen overleven. Deze interacties hebben als doel de homeostase van de gastheer op peil te houden en zijn vaak lethaal voor de tumorcellen. Zoals eerder vermeld speelt het immuunsysteem hierbij een belangrijke rol. 5 Cel-uitstulping gevormd via actine cytoskeletvorming. Pagina | 10 Het EMT proces is reversibel: eens de cel is aangekomen op de eindbestemming zal het omgekeerde proces plaatsvinden: de mesenchymaal naar epitheliale transformatie of MET. De tumorcellen zullen zich vasthechten aan de basale membraan en uit de bloedbaan treden. De cellen vormen zo de basis van de metastase. Nadat de tumor een zekere grootte heeft bereikt is het noodzakelijk dat de tumor voor zijn eigen voeding kan voorzien via angiogenese, het vormen van nieuwe bloedvaten. Na deze stap is de verdere groei van de metastase mogelijk. Uit onderzoek is gebleken dat er predilictieplaatsen zijn voor de uitzaaiingen van bepaalde kankers. Zo zal een borstkanker vaker uitzaaien naar de longen dan bijvoorbeeld naar de darmen. Dit zou geassocieerd zijn aan een grotere affiniteit van de tumorcellen voor bepaalde andere weefsels (16). De rol van exosomen6 in het voorbereiden van bepaalde weefsels op het ontstaan van metastase is reeds onderzocht (27), maar in deze thesis zal hier niet verder over uitgeweid worden. De behandeling van metastatische kanker wordt bemoeilijkt door 3 belangrijke factoren; De eerste factor is dat de metafase wordt vaak pas ontdekt vanaf een bepaalde grootte, waarbij de nieuwe tumor al minstens een miljard cellen heeft kunnen ontwikkelen. De tweede factor is dat de tumoren worden beïnvloed door het weefsel waarin ze zich bevinden, waardoor een systemische behandeling minder gemakkelijk aanslaat. De derde factor is dat de tumor een heterogene samenstelling heeft, wat behandeling nog verder bemoeilijkt (16). Zoals eerder vermeld is de hematogene spreiding van kankercellen één van de meest voorkomende mechanismen van metastasering. De circulerende tumorcellen worden besproken in volgend gedeelte. 1.3 CIRCULERENDE TUMOR CELLEN (CTC’S) De CTC’s werden voor het eerst ontdekt door Ashworth(9), waarbij hij beschreef dat de cellen een gelijkheid vertoonden met de cellen gevonden in de primaire tumor. Bijna een volle eeuw later werden de CTC’s nogmaals beschreven door Engell(28). Deze merkte op dat hij veel meer CTC’s vond in het tumor drainerende bloed dan elders in de periferie. Door Leather(29) werd er bij patiënten met colorectaal kanker CTC’s gevonden via cytologie en kleuring. Via deze (en nog andere) vroege 6 Exosomen zijn kleine membraan vesikels (30–100 nm) die proteïnen, lipiden RNA en DNA bevatten. Deze kunnen worden overgedragen naar andere cellen. Pagina | 11 studies op het gebied van circulerende tumorcellen, werd langzamerhand duidelijk dat deze cellen een belangrijke rol konden spelen in kankeronderzoek. Zo kunnen CTC’s als biomerker gebruikt worden om de vroege opsporing van kanker metastase mogelijk te maken(8, 21). Zo werd bijvoorbeeld gezien dat CTC’s in CRC worden opgenomen door de lever en daarmee leidt tot het ontstaan van levermetastasen (30). Onderzoeksmethoden die gebruik maken van perifeer bloed van de patiënten bieden verschillende voordelen ten opzichte van traditionele methodes zoals tumorbiopsie. Een van de belangrijkste voordelen is dat dat deze nieuwe methodes minder invasief zijn. De nieuwe technieken zouden kunnen leiden tot een goede opvolging van de patiënt, door op verschillende tijdstippen een beoordeling te maken op farmacodynamisch, prognostisch, voorspellend vlak en op intermediaire eindpunten (31). Het aantal CTC’s zou nuttig zijn om een prognose te stellen in de vroege stadia van ziekte. Dit zou ook kunnen gebruikt worden om te zien of de patiënt nood heeft aan bijkomende therapie, en zou ook herval kunnen detecteren(8). Circulerende tumorcellen zijn epitheliale cellen afkomstig van de primaire tumor of van de metastasen(7). Het is eveneens mogelijk dat CTC’s circulerende kanker stamcellen zijn(32). CTC’s worden afgescheiden in de bloedvaten en in het lymfesysteem. Zowel passieve loslating als actieve invasie via EMT zijn gerapporteerd. De CTC’s die deze EMT transitie hebben doorgemaakt vertonen hierna geen EpCAM oppervlakte merkers meer, zijn in staat om te migreren en ook te binnen te dringen in andere organen(33). Uit onderzoek is gebleken dat CTC’s die geïnjecteerd werden in muizen een vlugge transitie maakten met een neerregulatie van EpCAM na een periode van 30 minuten tot 4 uur na injectie. Opmerkelijk genoeg werd deze neerregulatie niet opgemerkt in alle bloedpuncties: de CTC gevonden in bloed uit de longen bleven EpCAM positief(33). Deze verandering van gen expressie gebeurt dus zeer snel en is orgaan afhankelijk. De CTC’s hebben een korte levensduur eens zij in de circulatie komen. Zij worden immers aangevallen door het lichaamseigen immuunsysteem en overleven vaak minder dan 24 uur(34). De onderzochte CTC’s zijn ook vaak heel heterogeen. CTC’s kunnen ook samenklitten tot zogenoemde micro-embolieën van ongeveer 50 cellen groot(21). Pagina | 12 Een van de grote moeilijkheden bij methodes die gebruik maken van CTC’s, is het bepalen van de metastatische capaciteit van deze cellen. Zoals als eerder vermeld moeten de cellen de mogelijkheid hebben om zich in een bepaald weefsel te kunnen nestelen. Daarenboven moeten zij de homeostatische signalen van de gastheer kunnen weerstaan én moeten zij de capaciteit hebben om een nieuw letsel te vormen en te laten groeien. Dit betekent dus ook dat men CTC’s kan vinden in het bloed van patiënten waarbij er geen uitzaaiing zal voorkomen(24). De identificatie van de CTC met metastatische capaciteit is dus moeilijk, ook omdat er nog geen zekerheid bestaat over de verschillende bijdrage van de zogenaamde ‘soil and seed’ theorieën. Volgens deze theorie zijn de CTC’s de zogenoemde zaden die interageren met de ‘soil’, zijnde de locatie waarnaar de CTC’s aangetrokken worden, een belangrijke factor bij het ontstaan van metastasen(26). Bovendien stelt men de vraag of een hogere concentratie van CTC’s in het bloed bij een grotere kanker niet zozeer een projectie is van de grootte van deze ene tumor, dan wel een teken van mogelijke uitzaaiingen. Een ander probleem is het opsporen van deze CTC’s in het bloed: hun aantallen zijn zeer beperkt: zo zal er in 1 ml bloed maar een enkele CTC’s te vinden zijn tussen 10 miljoen leukocyten en 5 miljoen erythrocyten(22). Deze lage aantallen zorgen ervoor dat de methodes die gebruikt worden om CTC’s te vinden, te tellen en te karakteriseren, voldoende sensitief en specifiek moeten zijn(7). Bovendien is er tussen verschillende types kanker een groot verschil in het aantal CTC’s dat men zal vinden. Figuur 3 Verschil in CTC aantallen in verschillende types kanker uit (35) 1.4 CELVRIJE NUCLEÏNEZUREN Wanneer cellen apoptotisch of necrotisch worden, zullen macrofagen deze cel resten via fagocytose opnemen. Hierbij zal Celvrij Nucleïnezuur (cfNA) worden vrijgesteld of zelfs actief worden uitgescheiden. cfNA werd voor het eerst beschreven in een onderzoek door Mandel en Métais in 1948. In Pagina | 13 1977 werden verhoogde niveaus in bloed of plasma in verband gebracht met de aanwezigheid van kanker (36). Pas in 1994 werd het belang van cfNA in kanker onderzoek ontdekt, via de detectie van RAS-gen mutaties bij kankerpatiënten. Toen in 1996 de microsatelliet alteraties werden ontdekt bij kankerpatiënten groeide de aandacht voor de cfNA nog verder (37). Steeds vaker stelt men ook voor om circulerende nucleïnezuren te gebruiken als biomerkers in plaats van, of in combinatie met CTC’s of andere kankermerkers. Zo zou bij longkanker een vroege opsporing van kanker door middel van cel-vrij DNA (cfDNA) een grote impact hebben op de overlevingskans (38). De detectie van cfNA bij patiënten zou kunnen dienen als een vorm van niet-invasieve biopsiemethode, waarbij meerdere afnames zouden kunnen gebeuren zonder al te veel belasting voor de patient7. Hierbij zou een opvolging van de veranderingen in het cfNA tijdens het ziekteverloop en tijdens de behandeling mogelijk worden. Hierdoor zou men vlugger therapieresistentie kunnen opsporen. De aanwezigheid van dit cel vrij DNA is ook aangetoond bij de gezonde populatie. Helaas is de aanwezigheid van cfNA niet specifiek voor kankerpatiënten: deze werden ook gemeten bij patiënten met benigne laesies, inflammatie en weefselschade (39). cfNA worden eveneens gebruikt bij onderzoek naar overbelasting in de sportwereld (40). Er werden echter hogere waarden gevonden bij patienten met longkanker (38). De concentratie van cfDNA is heel variabel (36). De grootte van dit cel-vrij DNA kan variëren van enkele bp tot kbp (37). Bij kankercellen blijken er echter meer variabele en eveneens langere sequenties van DNA fragmenten te ontstaan (36). Voor een bestaande tumor zal dagelijks 3.3% cfDNA worden vrijgesteld (37). Deze langere fragmenten kunnen dus gebruikt worden om vroegtijdig tumoren op te sporen (36). De verhouding van dit langere aberrante DNA t.o.v. het normale DNA wordt de DNA integriteitsindex genoemd. Deze index zou kunnen gebruikt worden als een indicatie voor maligniteit (36). Gemuteerde vormen van DNA kunnen opgenomen door gezonde cellen, waarbij in deze cellen biologische veranderingen ondergaan. Men kan stellen dat cfDNA kan zorgen voor tumorinductie (41). Voor kankeronderzoek is niet enkel de cfDNA hoeveelheid van belang, maar ook de mutaties op het 7 Uitzondering bij neonaten, waarbij 20ml al veel kan zijn Pagina | 14 cfDNA (42). Cel vrij DNA (cfDNA) zou kunnen gebruikt worden om mutaties op te sporen die relevant zijn voor het verloop van de kanker. Het gebruik van cfDNA is mogelijk voor verschillende tumortypes. Hierbij wordt dan gekeken naar de DNA integriteit, de methylatie-graad, microsatelliet veranderingen, mutaties en mitochondriaal of viraal DNA. In de meeste gevallen is dit cfDNA van diagnostische belang. ctDNA is voornamelijk afkomstig uit gelyseerde CTC en tumor afzettingen. De isolatie is gemakkelijker dan van CTC, maar er wordt veel mindere en meer variabele hoeveelheid ctDNA vrijgesteld in vergelijking met de vrijstelling van cfDNA uit normale cellen(21). Er is momenteel nog onzekerheid over de manieren waarop cfDNA vrijkomt in het bloed. Bovendien is het nog niet exact geweten hoe cfDNA zich gedraagt of hoe lang het blijft bestaan, eens het is vrijgekomen in het bloed (43). Pagina | 15 2 DETECTIE METHODES VOOR CTC EN CFDNA In bloed kunnen er verschillende kankerderivaten onderscheiden worden. Hier zullen we ons beperken tot twee types: de CTC’s, en de cfDNA’ s. Hierop kan een gedetailleerde moleculaire analyse worden uitgevoerd (21). De filtering van CTC’s en cfDNA uit bloed is mogelijk geworden door de grote vooruitgang in medische technologie. Dit biedt verschillende vooruitzichten voor moleculair specifieke kankertherapie. De technologie voor het opsporen en analyseren van CTC en ctDNA is nog in volle ontwikkeling, maar het is al zeker dat zij een majeure rol spelen in de visie van kanker als zijnde een heterogeen en moleculair gezien dynamisch landschap(21). Aangezien het onderzoek naar CTC’s verder gevorderd is in vergelijking met het onderzoek naar ctDNA, gaat dit werk dieper in op CTC dan op ctDNA, zowel qua beschrijving van de gebruikte methodes als qua onderzoek van de respectievelijke voor- en nadelen. 2.1 CTC DETECTIEMETHODES Er bestaan verschillende methodes voor de telling en karakterisatie van CTC’s. Al de huidige methoden hebben verschillende voor- en nadelen, er is geen enkele die feilloos werkt. De verschillende methodes worden kort toegelicht in dit onderdeel, terwijl er dieper wordt ingegaan op de voor- en nadelen in het onderdeel discussie. Een overzicht van deze methodes is beschikbaar in Tabel 1: Technologieën voor de isolatie van CTC’s (zie onderdeel discussie). Voor een illustratie van enkele methodes, zie onderstaande figuur. Figuur 4 verschillende detectiemethodes voor CTC's uit(23) Pagina | 16 De CTC ’s zijn moeilijk te isoleren door hun kleine aantallen ten opzichte van de enorme hoeveelheid andere bloedcellen (zo een 10 cellen per milliliter t.o.v. 10^9 rode bloedcellen en 10^6 witte bloedcellen). De grote moeilijkheid bestaat erin deze cellen te isoleren zonder ze te beschadigen. Er zijn verschillende strategieën bedacht voor de isolatie van de circulerende tumorcellen. Deze verschillende methoden berusten op verschillende technieken gaande van fysieke eigenschappen (voornamelijk grootteverschillen) tot het vertonen van bepaalde merkers (21). CTC’s worden meestal eerst aangerijkt en daarna gedetecteerd en onderzocht. Er zijn verschillende methodes, zowel qua aanrijking8 als wat detectie betreft. Er zijn eveneens verschillende technieken die deze stappen hebben gecombineerd (7). Hieronder worden de methodes, waar mogelijk, opgelijst per wijze van aanrijking. Methodes die verschillende aanrijkingsmanieren combineren zijn apart vermeld. 2.1.1 Aanrijking Om de hoeveelheid CTC’s te verhogen t.o.v. de rest van het staal gebruikt men verschillende aanrijkingsmethodes. Dit om de selectiviteit en sensitiviteit te verhogen, alsook om de detectietijd verkorten (44). De methodes zelf kunnen in twee grote groepen worden ingedeeld: scheiding op basis van morfologie en scheiding op basis van de interactie met specifieke antilichamen(7). 2.1.1.1 Filtratie op basis van (bio)fysieke karakteristieken/morfologie Bij deze technieken maakt men gebruik van eigenschappen zoals grootte, dichtheid enz. 2.1.1.1.1 Grootte Filtratiemethodes gebaseerd op grootte, maken gebruik van het feit dat CTC’s over het algemeen groter zijn dan WBC en dat zij meer rigide zijn van structuur(45). Enkele voorbeelden van methodes die gebruik maken van deze techniek zijn (7): ISET: Isolation by Size of Tumor cells. CTC’s zijn vaak groter dan leukocyten (>8 µm). De ISET techniek is hierop gebaseerd en scheidt de cellen via een filter. Nucleopore: zelfde techniek als ISET. CTC-chip van Clearcell: Deze maakt gebruik van de grootteverschillen tussen de verschillende cellen. Het bloedstaal met een zoutoplossing buffer gaat doorheen de spiraalvormige chip aan een hoge snelheid. De centrifugaal krachten scheiden de cellen waarbij de grotere CTC’s worden afgezonderd aan de binnenzijde van de chip. De opgevangen CTC’s zijn nog levend en kunnen gebruikt worden voor cultivatie. Onderzoeken zijn voornamelijk gebeurd 8 Aanrijking: een procédé waarbij het percentage van een bepaald element in een staal wordt vergroot. Pagina | 17 bij long en borstkanker. FMSA: Deze methode maakt ook gebruik van het verschil in grootte in de CTC’s. Voor verdere verfijning maakt men ook gebruik van de selectieve besmetting van CTC’s door een Adenovirus, met repressie van humaan telomerase gen, t.o.v. de besmetting van WBC’s (46). 2.1.1.1.2 Dichtheid Mononucleaire cellen hebben een lagere dichtheid dan andere bloedcomponenten; op deze manier worden tumorcellen en mononucleairen gescheiden van rode bloedcellen en granulocyten. De dichtheidsgradiënt die hierbij gebruikt wordt is 1,077 g/ml. Verschillende methodes zijn hier: Centrifugatie: Deze simpele methode maakt gebruik van het verschil in dichtheid om de cellen te scheiden. Door centrifugaalkrachten zullen bij het centrifugeren van een buisje de zwaardere cellen meer centraal komen, en de lichtere cellen zullen aan de buitenkant van het buisje komen. Een veel gebruikte methode hiervoor is de Ficoll gradiënt. Oncoquick maakt ook gebruik van dichtheid, maar combineert dit met het gebruik van een poreuze barrière, waardoor het staal niet wordt gecontamineerd met vol bloed. MCC: Bestaat uit een schijfje met verschillende zones. Gebruikt andere methodes zoals bv. Oncoquick als een eerste Aanrijkingsstap. Hierna wordt er RBC lysis toegepast. Een staal wordt met een pipet in het toestel gebracht. Door de oppervlaktespanning in de druppel, zullen de cellen bewegen naar de binnenzone van de schijf. In een zone met trage stroomsnelheid cellen dalen af doorheen een mengsel en blijven hangen op polystyreen bedekt met weefsel. De rest van de vloeistof wordt afgevoerd. 2.1.1.1.3 Vervormbaarheid Zoals eerder vermeld zijn CTC’s algemeen genomen meer rigide dan bloedcellen(45). 2.1.1.1.4 Diëlektrische verschillen Er is een verschil tussen cellen onderling in morfologie en geleidbaarheid. Deze zorgen voor diversiteit in frequentie-afhankelijke diëlektrische eigenschappen. Bij lage frequentie primeert de geleidbaarheid. Bij hoge frequenties zal het effect van een capaciteit ontstaan met een positieve en een negatieve pool. De diëlektroforetische9 methodes maken gebruik van deze verschillen om de verschillende types cellen te kunnen scheiden. 9 Diëlektroforese: het verschijnsel waarbij een partikel wordt gedragen onder invloed van een elektrisch veld.47. Pethig R. Review Article—Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 2010;4(2). Pagina | 18 De belangrijkste methode hier is genaamd ApoStream. Deze methode maakt gebruik van bovenstaande eigenschappen in een toestel met continue stroming om een hogere doorvoer te krijgen. De frequentie waarbij de DEP wisselt van positief naar negatief is afhankelijk van de geleidbaarheid en de morfologie van de cellen. Deze frequentie is lager bij kankercellen dan bij andere cellen aanwezig in het bloed (48). Bij het toepassen van een bepaald frequentie-interval worden de kankercellen verplaatst naar de positieve pool, terwijl de andere bloedcomponenten zich verplaatsen naar de negatieve pool. 2.1.1.2 Immunoseparatie en Immunomagnetisme : Antilichamen en magnetische velden De meest onderzochte techniek voor het opsporen van CTC’s is de antilichamen gemedieerde vangst van kankercellen. Deze methodes maken gebruik van antilichamen gericht tegen een bepaalde antigenen op de CTC (32). Welke antigenen hiervoor het best te gebruiken zijn, is nog veel discussie over. Dit leidt tot een grote variëteit aan definities voor CTC’s. Meestal maakt men gebruik van immunomagnetisme. Dit is een methode waarbij magnetische kralen die gelabeld met bepaalde antilichamen worden in het staal gebracht en geïncubeerd. De doelcellen zullen dan binden aan deze magnetische kralen. Het staal wordt dan in een magnetisch veld (elektromagneet of permanente magneten) geplaatst en de gewenste cellen zullen worden geselecteerd. Deze magnetische scheiding gebruikt men zowel in bulkmethodes als in de microchips(45). De CTC worden geteld en gekleurd, ofwel gelyseerd voor verdere moleculaire karakterisatie. Deze circulerende tumorcellen zijn vaak panleukocytair (CD45) negatief en pancytokeratine positief. De telling van CTC waarden kan informatie geven over de prognose bij verschillende types kanker. Maar vooral de verandering in waarden na behandeling zal van belang zijn in een klinische setting. Men ziet inderdaad een dramatische terugval in het aantal CTC’s bij eenzelfde patiënt met een effectieve therapie. De expressie van proteïne merkers bij CTC’s kan men bekomen via fluorescentie microscopie. 2.1.1.2.1 Positieve selectie Bij positieve selectie gebruikt men merkers die gericht zijn tegen antigenen (proteïnes of nucleïnezuren) van de cellen waar men naar op zoek is. Veel gebruikte merkers hierbij zijn de antilichamen gericht tegen EpCAM10 en cytokeratines. Bij prostaatkanker wordt ook PSMA gebruikt, wat een specifieke merker is voor dit type kanker(49). 10 EpCAM is homotypische calcium-onafhankelijke cel adhesie molecule welke voorkomt op het celoppervlak van epit- heliale cellen. Pagina | 19 2.1.1.2.2 Negatieve selectie Negatieve selectie maakt gebruik van merkers voor de stoffen die men uit het staal wil verwijderen. Bij deze methode worden de normale bloedcellen als doelwit gekozen voor verwijdering uit het staal. Hierdoor zou de ratio van zeldzame cellen zoals CTC’s groter worden t.o.v. de rest van het staal (44). Negatieve selectie gebeurt vaak op basis van CD45 (aanwezig op leukocyten) of op basis van CD69 waarmee men megakaryocyten en plaatjes kan uitsorteren(7). In deze technieken wordt er vaak gebruik gemaakt van RBC lysis. Ook zal men vaak een scheiding van bloedcomponenten toepassen door het gebruik van een Ficoll gradiënt11. Van de technieken met negatieve selectie is de leukocyten depletie de meest veelbelovende. Leukocyten hebben namelijk gekende merkers welke goed gekend zijn en niet variëren. Deze variatie bestaat wel bij CTC’s. CTC’s vertonen vaak verschillende epitopen, zelfs bij eenzelfde patiënt (50). De getagde leukocyten worden dan uit het staal verwijderd, en er blijven CTC’s over. Nog een bijkomend voordeel is dat ook niet epitheliale kankercellen op deze manier kunnen worden opgespoord. Dit is bijvoorbeeld het geval bij melanomen, of bij kankers waar een EMT is gebeurd. CTC-ichip (positief of negatief): Voor deze technieken is er extreem gespecialiseerd materiaal nodig zoals de zogenoemde CTC-ichip (i voor inertie). De CTC-ichip heeft 3 kamers en gebruikt een sample waarin magnetische microkraaltjes met CD45 Ab worden geplaatst. De cellen gaan eerst doorheen een eerste kamer waar RBC en bloedplaatjes doorheen de micropaaltjes gaan en geïsoleerd worden. In een tweede kamer worden de overblijvende cellen in een enkele rij gezet om dan de derde kamer binnen te gaan. Hier worden de WBC afgebogen door hun binding aan de microkraaltjes. De overblijvende cellen worden opgevangen. Borst, prostaat, enkele cel analyse.Deze methode is zeer effectief. De niet gemerkte CTC’s blijven dan over om verder te manipuleren. MACS (positief of negatief): multi advanced cell sorting: deze techniek gebruikt microkorreltjes met immunomagnetische labeling om de cellen te vangen. Er zijn veel verschillende mogelijkheden voor de merkers gebruikt in deze techniek. Een veelgebruikte merker is EpCAM, welke voorkomt op het celoppervlak van epitheliale cellen. Adnatest (positief): maakt gebruik van magnetische korrels met 2 Ab tegen MUC1 en 1 Ab tegen EpCAM. 11 Ficoll is een hydrofiele polysaccharide die op de bodem van een conische tube wordt geplaatst. Na centrifugatie zullen verschillende lagen met bloedcomponenten zich vormen en gemakkelijk te scheiden zijn. Pagina | 20 RARE (negatief): RosetteSep-Applied imaging Rare Event: gebruikt een combinatie van een dichtheidsgradiënt met een Ab gemedieerde aanrijking. Voor de aanrijking maakt men gebruik van CD45 positieve cellen, met een cross link met meerdere RBC via tetramere Ab complexen. Op deze manier worden rosetten gevormd. De dichtheid van deze ongewenste cellen neemt toe en zullen neerslaan bij centrifugatie. Op deze manier wordt een negatieve selectie bekomen: de CD45+ cellen zijn afgescheiden van de rest van het plasma via een scheidingsmedium. Uitgebreidere negatieve selectie is mogelijk via andere Ab samenstellingen. (10 min voor scheiding). 2.1.1.3 Microfluïde toestellen (vb CTC-chip) Microfluïdetechnieken zijn uitermate geschikt in de zoektocht naar zeldzame cellen zoals de CTC. Ze kunnen namelijk rechtstreeks op ongezuiverd bloed worden toegepast. Er bestaat de mogelijkheid om meerdere processen in parallel te laten gebeuren, zogenaamde multiplexing, zodat er een grote doorvoer kan worden bekomen via bijvoorbeeld CTC-chip. Hierbij wordt er een lage schuifkrachten bekomen met een maximale blootstelling van de CTC’s aan de antilichamen. De laatste decennia zijn de toestellen op basis van microfluïdics vaker onderzocht geweest, ook in het kader van kankeronderzoek. Deze microfluïdics werken op een nanoschaal (10^-9m) hebben als eigenschap dat elke stroming laminair zal zijn, waardoor de schuifkrachten minimaal zullen blijven(51). Dit heeft als voordeel dat als men cellen uit vol bloed vangt met antilichamen, deze niet terug zullen vrijkomen. Bovendien ondervinden de gevangen cellen minder schade. Bovendien zullen twee verschillende vloeistoflagen niet vermengen, maar enkel interageren via diffusie. De toestellen of chips bestaan meestal uit een aantal kleine paaltjes die gecoat zijn met antilichamen. Deze paaltjes worden dan gezet in een bepaalde geometrie om een optimaal contact tussen de CTC’s en de antilichamen te bekomen(52). Bovendien is de ratio oppervlakte/volume in deze kleine structuren zeer groot, wat deze interactie extra bevordert(51). De efficiëntie van celvangst wordt dus bepaald door de stroomsnelheid en de schuifkrachten(53). 2.1.2 Detectiemethoden 2.1.2.1 Cytometrie Met een flow-cytometer maakt men gebruik verschillen in lichtverspreiding en verschillen in de emissie van fluorescentie van cellen wanneer zij doorheen een laserstraal komen. De FACS (fluorescence activated cell sorter) kan zo cellen met een verschillende fluorescentie isoleren. Bij immunocytometrie met een kleuring tegen protëinemerkers, worden individuele cellen geïsoleerd en geteld op basis van hun Ag expressie, zoals bijvoorbeeld epitheel specifieke antigenen en Pagina | 21 cytokeratines. Men kan de specificiteit verhogen door ook een kleuring toe te voegen voor bv. CD45, zodat WBC niet worden meegeteld. Met immunofluorescentie worden merkers gekoppeld aan een fluorescerende stof, zoals fluorescine. Als het fluorescerend Ab bindt met een specifiek Ag dan zal deze oplichten, wat detectie mogelijk maakt. Als men gebruik maakt van verschillende kleuren kan men een gelijktijdige detectie van verschillen Ag bekomen(1). Er is echter ontdekt dat ook de CK expressie vermindert bij agressievere vormen van kanker, waardoor de CK kleuring ook niet altijd geschikt is (54). 2.1.2.2 NA methodes RT-PCR en NGS worden gebruikt om mRNA en DNA afkomstig van CTC’s te detecteren. Deze methodes analyseren de expressie van genen die mogelijk specifiek zijn voor epitheliale cellen of normale weefsels waar de tumor uit zou kunnen ontstaan (22). Maar het vinden van echt specifieke genen die het ontstaan van tumoren veroorzaken en een correcte interpretatie van de resultaten, blijft moeilijk (54). Verdere wijzigingen aan proteïnes in de cel na translatie of een verandering in expressie van een proteïne kunnen niet worden opgemerkt door deze methodes. In vergelijking met de Laser scanning cytometrie werd gevonden dat technieken met RT-PCR sensitiever waren(7). Maar men moet opletten voor vals positieven met deze methode. Voor deze methodes moeten de cellen gebroken worden waardoor verdere analyse op morfologie en dergelijke uitgesloten is. (22). 2.1.2.3 Directe beeldvorming: Sinds het gebruik van de simpele lichtmicroscoop zijn er veel vooruitgangen geboekt. Huidige beeldvormingsmethodes maken gebruik van snelle laserscanners en kunnen hoge definitie beelden aanmaken. Eén van de methodes is hier de EPIC methode . De EPIC methode maakt gebruik van 10 ml bloedtubes. Met ammoniumchloride worden de RBC’s gelyseerd en daarna wordt het staal gecentrifugeerd. De cellen met een nucleus worden op een glasplaatje geplaatst. Hierbij wordt deze cellen gemerkt met immunofluorescentie met verschillende merkers, waarbij verschillende subpopulaties van CTC’s worden onderzocht (55). . Fluorescentie intensiteit van alle merkers en ook verschillende 86 morfologische parameters worden onderzocht. Dit computer algoritme gebruikt ook patroonherkenning om normale cellen te kunnen onderscheiden.(borst, prostaat) (56). Een computerprogramma zoekt vervolgens naar cellen met volgende eigenschappen: Traditionele CTC’s: groter dan de omgevende WBC, CD45-, CK+ en DAPI+ Kleine CTC’s: CD45-, CK+ en DAPI+, kleiner of even groot als omgevende WBC CTC clusters: 2 of meerdere CTC’s die samenklitten Pagina | 22 CK negatieve CTC’s: CK- en CD45- met intacte DAPI Apoptotische CTC’s : CK+ en CD45- met een DAPI die wijst om chromosomale condensatie of nucleaire blebbing of fragmentatie, overeenstemmend met apoptose. 2.1.3 Karakterisatie van CTC’s Met immunohistochemie, immunofluorescentie, gen kopienummer variatie via comparatieve genomische hybridisatie, sequenering en epigentische studies, kan een hele reeks genomische en proteïne gebaseerde testen worden uitgevoerd. Immunophenotypering kan niet enkel gebruikt worden voor de telling maar ook voor de karakterisatie. Deze methode is moeilijker uit te voeren in de vorm van multiplexing door de aanwezigheid van overlappende Ab die nodig zijn voor de identificatie van de CTC’s. Immunofluorescentie (zoals bij FISH) wordt gebruikt bij prostaat kanker om het verlies aan fosfatase en tensine homoloog PTEN op te sporen. Ook wordt het gebruikt om CNV van het AR gen te bestuderen of de aanwezigheid van ERG translocaties. Het gebruik van meerdere kleuren laat een gelijktijdig onderzoek van deze genen toe. DNA mutaties kunnen ook worden opgespoord(49). De evolutie van de tumor onder druk van de therapie kan men zo op een niet invasieve manier opvolgen(4). Maar men kan ook de heterogeniteit van de tumor zelf bestuderen(49). Met behulp van DNA sequenering en qRT-PCR kan men de gevonden CTC’s bijkomend karakteriseren. Hiermee kan men DNA mutaties en DNA methylatie detecteren (7).De moleculaire karakterisatie zou zo informatie kunnen geven over de therapeutische doelwitten. Eventuele veranderingen in de voornoemde zaken zouden een voorspelling kunnen zijn voor mogelijke resistentie. Bovendien is deze karakterisatie van groot belang voor het ontwikkelen van nieuwe medicamenteuze kankerbehandelingen (25). 2.1.4 CellSearch De CellSearch methode werd geïntroduceerd in 2004 en is de enige die tot dusver de goedkeuring heeft gekregen van de Food and Drugs Association (FDA) van Amerika (39). Dit systeem maakt gebruik van immunomagnetische aanrijking, fluorescente labels en detectie van zeldzame cel populaties. Bovendien werd er nog een speciale tube ontwikkeld om de sampling nog mogelijk te maken tot 96 uren na de bloedafname (Cellsave). Voor verdere extractie van RNA of indien levende cellen noodzakelijk zijn wordt een EDTA afname geadviseerd. De immunomagnetische aanrijking gebeurt geoptimaliseerd, om zowel hoge als lage expressie van Pagina | 23 antigenen te selecteren. Verschillende antigenen worden hiervoor gebruikt naargelang het type kanker: zo worden voor carcinomen EpCAM als doelwit gebruikt, voor myelomen gebruikt men CD138 en voor endotheelcellen en melanomen wordt CD146 als target gebruikt. EpCAM werd gekozen aangezien het voorkomt bij vele carcinomen, en niet op normale bloedcellen. Bovendien is het een oppervlakte eiwit waardoor herkenning mogelijk is via antilichamen(35). Volgens het CellSearch systeem is een CTC elke cel die voldoet aan de volgende voorwaarden(57): Intact, EpCAM+, >= 4micron, CK+, CD45- en de nucleus is aanwezig en bevindt zich minimaal 50% binnen het cytoplasma. Voor de telling gebruikt men de CTC kit waarbij reagenten de cellen aankleuren en fixeren. Na deze blootstelling kunnen ze gescheiden worden via de doorvoer van een magnetische veld. Nadien worden de gevonden cellen visueel bevestigd door een onderzoeker. 2.1.5 EM CTC onderzoeken Zoals eerder vermeld verliezen CTC hun EpCAM expressie bij de epitheliale naar mesenchymale expressie. In verschillende onderzoeken is deze overgang in verband gebracht met de metastatische capaciteit van de CTC(10). Om deze cellen op te sporen maakt men gebruik van PCR primers die in verband zijn gebracht met EMT, zoals de repetitieve AluJ sequenties in DNA, GAPDH en PPIA transcripten en verhoogde Vimentine expressie (33). In een recent werk (58) werd deze zoektocht verder uitgediept en ging men specifiek op zoek naar de CTC’s die EMT hadden ondergaan bij mBC. Hiervoor gebruikte men de DEPArray methode met negatieve depletie op CD45, waarna een kleuring werd toegepast met Ab tegen zowel epitheliale als mesenchymale merkers. Hierbij werden 4 subpopulaties aan CTC’s gevonden. Enkel positief voor epitheliale merkers, enkel positief voor mesenchymale merkers, positief voor beide en negatief voor beide. Uit dit onderzoek bleek dat de aanwezigheid van CTC’s met zowel epitheliale als mesenchymale merkers, negatief prognostisch waren voor OS en PFS. 2.2 CFDNA OPZOEKINGSMETHODES De cfDNA opzoekingsmethodes zijn nog in volle ontwikkeling om de klinische toepasbaarheid mogelijk te maken. 2.2.1 cfDNA Extractie De concentratie aan cfDNA in serum is hoger dan deze in plasma, maar is gecontamineerd door gWBC genomen. Hierdoor is plasma beter om zuiver cfDNA te extraheren. Stalen worden ook best binnen de 4 uur geanalyseerd om verder contaminatie te voorkomen. Om de zuiverheid van de Pagina | 24 cfDNA te verbeteren worden ook best 2 centrifugatiestappen uitgevoerd (41). PCR methodes worden vaak gebruikt voor de kwantificatie van cfDNA. PCR amplificeert bepaalde gekende sequenties uit DNA door het gebruik van een primer. Nog een andere manier is het gebruik van een DNA integriteits-index(36). DNA integriteit zou groter zijn bij cellen die necrose hebben ondergaan, dan bij cellen waarbij apoptose is opgetreden. Necrose komt vaker voor dan apoptose bij maligne cellen (41). QiAMP is een methode die vaak gebruikt wordt om DNA te zuiveren uit verschillende bronnen (bloed, plasma, urine…). Deze methode maakt gebruik van spin en vacuüm technieken om DNA uit deze bronnen te zuiveren, opdat deze zouden kunnen gebruikt worden voor verdere analyse. 2.2.2 cfDNA Analyse Er zijn een aantal puntmutaties en microsatelliet veranderingen12 gekend die in verband zijn gebracht met het ontstaan van verschillende types kanker. Hier wordt gericht naar op zoek gaan bij de analyse van cfDNA. Copy Number Variations (CNV’s) kunnen worden opgespoord met van de massively multiplexed PCR methode met daarna wordt een next generation sequencing (NGS) aan het licht te brengen (59). Men heeft ondertussen ook een kwantitatieve PCR methode ontwikkeld waarmee men rechtstreeks ctDNA-concentratie kan bepalen uit plasma, zonder deze eerst te moeten zuiveren (60). Deze methodes zijn heel specifiek (gemiddeld 0.77) en sensitief (gemiddeld 0.8) (38). ctDNA biedt de grootste mogelijkheid om gedetailleerde moleculaire technieken op toe te passen(21). Het opsporen van SNV en CNV is hiermee mogelijk gebleken. Deze methodes lijken goede resultaten te leveren. Er zijn verschillende mutaties ontdekt in DNA, welke in verband zijn gebracht met het ontstaan van kanker. Maar men kan ook het hele genoom bestuderen op afwijkingen, bv. Met NGS en arrayCGH. Op deze manier kan men mutaties vinden welke nog niet op voorhand gekend zijn (43). 12 Bv. LOH, microsatelliet instabiliteiten: korte motief herhalingen in DNA Pagina | 25 3 METHODOLOGIE Voor een eerste introductie tot het onderwerp “kanker”, net zoals voor verdere informatie over het ontstaan van metastasen, heb ik gebruik gemaakt van erkende studieboeken, zoals “Molecular Cell Biology”(1) en “Pathology of Disease”(2). Verdere informatie heb ik verkregen via opzoekingswerk op zoekmachines voor wetenschappelijke artikelen ‘PubMed’ en ‘Web of Science’. Hier heb ik de zoektocht beperkt tot artikels en review artikels uit de laatste 5 jaar. De resultaten werden ook gescreend op de impact factor van de publicerende tijdschriften waarbij de te laag scorende tijdschriften (IF <2) niet werden opgenomen. Zie Appendix C: Impact factoren. Bij zoektermen “cancer” en “metastasis” kreeg ik meer dan 5.000 artikels als resultaat. In zoekmachine Web of Science heb ik vervolgens de resultaten gerangschikt naar het onderdeel citaties, om zo meer gerespecteerde werken te bekomen. De zoektermen voor het werk over CTC’s die ik in zoekmachine PubMed gebruikt heb zijn “circulating tumor cells” en “metastasis”. Via een bijkomende filter werden enkel onderzoeken over mensen hieruit gefilterd. Finaal kreeg ik zo 832 resultaten. Ook in Web of Science heb ik deze zoekopdracht uitgevoerd, maar niet gesorteerd op citatie, gezien het onderzoek naar dit onderwerp nog in volle ontwikkeling is. Als resultaat kreeg ik 636 resultaten (maart 2015). Op Pubmed kreeg ik in april 2016 4910 resultaten voor “CTC” en 376 resultaten voor “cfDNA”. De werken werden eerst gescreend aan de hand van de titel. Daarna werden uit deze eerste triage een aantal artikels gekozen aan de hand van hun abstract. De exclusie criteria waren onder andere: “niet in de Engelse taal”, “Ander type kanker dan in het onderzoek opgenomen”. Het onderwerp van circulerende tumorcellen in het ontstaan van metastases bij kanker is zeker een “hot topic”. Elke maand komen er tientallen nieuwe artikels bij in de resultaten lijst van de zoekopdracht. Dit werk (begonnen in 2014 en afgewerkt in 2016) zal dan ook niet alle nieuwe onderzoeken kunnen includeren, desondanks wordt er getracht om een duidelijk overzicht te geven van de huidige progressie in het onderzoek naar dit fenomeen. De laatste opzoekingen zijn gebeurd in april 2016. Prostaat- en borstkanker zijn de meest voorkomende vormen van kanker bij respectievelijk mannen en vrouwen. Buiten deze werd eveneens gekeken naar long en colonkanker. Longkanker omdat het een van de meest voorkomende types van kanker is en colon kanker omdat dit type kanker zeer snel metastaseert. Bij CRC zou men dus enorm kunnen profiteren van de geboekte vooruitgang op het vlak van CTC en ctDNA onderzoek. Pagina | 26 4 DISCUSSIE Zoals eerder aangehaald is het onderwerp van de vloeibare biopsie met de opsporing van CTC’s en cfDNA momenteel een “hot topic” bij medisch onderzoek(61). In april 2016 waren er 947 lopende studies met als onderwerp CTC’s,18 studies met als onderwerp cfDNA en 7 studies met beide onderdelen als onderwerp. Ondertussen heeft men zelfs een boek uitgebracht over het onderwerp CTC’s: (32). Bij de aanvang van deze scriptie is er uitgegaan van het gebruik van circulerende tumorcellen bij het onderzoek naar metastasen bij kanker. Metastasen zijn immers de belangrijkste oorzaak van aan kanker gerelateerd overlijden(10). Dit onderwerp is in onderling overleg later uitgebreid, om ook het gebruik van circulerend tumor DNA te omvatten, en dit niet enkel bij het onderzoek naar metastasen, maar ook in het onderzoek naar primaire kanker en therapierespons. Het onderzoek naar dit onderwerp is immers in twee jaar waarin deze studie werd uitgevoerd, verder uitgediept. 4.1 HET GEBRUIK VAN CTC’S Idealiter zouden CTC’s kunnen worden gebruikt als screening voor kanker. De grote variabiliteit in de aantallen gecombineerd met de variabele gevoeligheid van de testen maakt dit momenteel nog onmogelijk. Een andere toepassing is het gebruik van de telling van CTC’s om de effectiviteit van de behandeling op te volgen. De moleculaire karakterisatie zou kunnen gebruikt om een meer specifieke behandelvorm te kiezen. Cultivering van de CTC’s zou kunnen gebruikt worden om de resistentie tegen therapie te testen(25). CTC als alleenstaand gegeven, wordt momenteel eigenlijk niet of zelden gebruikt als prognostische merker in de meeste studies. Hun aanwezigheid wordt vaak gecombineerd met andere kanker merkers, zoals de aanwezigheid van LDH of kankerproteïnes zoals CEA(39). CTC telling alleen voldoet namelijk niet aan de Prentice criteria13. In combinatie met bv. LDH zou hier wel aan voldaan zijn(49). 13 De Prentice criteria zijn een maat voor het effect van een maatregel na behandeling die zowel prognostisch is voor een klinisch eindpunt, als beschrijvend voor het effect van de behandeling. “These criteria require that the biomarker is evaluated in therapies that provide survival benefit, that the treatment has an effect on the proposed biomarker, that the biomarker has an effect on the clinical endpoint, and that the full effect of treatment on the endpoint is captured by the biomarker”62. Prentice RL. Surrogate endpoints in clinical trials: definition and operational criteria. Statistics in medicine. 1989;8(4):431-40.. Pagina | 27 4.1.1 CTC-aantal Men kan zich de vraag stellen hoe nuttig de CTC tellingen zijn: niet elke CTC zal namelijk aanleiding geven tot een metastase. Een groot aantal zal snel in apoptose gaan(35). Hier kan men beargumenteren dat, indien het aantal gedetecteerde CTC’s verhoogd is, ook de cellen met metastatische capaciteit verhoogd zullen zijn, zodat we finaal toch een uitspraak kunnen maken over het risico op metastase bij de patiënt(25). Men kan de telling van CTC’s ook gebruiken om een beter inzicht te krijgen in mogelijke verspreiding bij chirurgische resectie van een tumor (63). Een bijkomende vraag blijft ook of de telling van de CTC’s correct verloopt. Deze telling is voornamelijk belangrijk om de patiënten te kunnen indelen volgens de zogenaamde ‘gunstige en ongunstige groep’, waarbij de afkapwaarde op 5 (of 3 bij CRC) CTC’s is gezet. De sensitiviteit van de testen wordt ook vaak uitgetest door eerst tumorcellen toe te voegen aan bloed, en deze daarna te proberen opsporen. Dit is echter niet representatief voor de werkelijkheid(35). Bovendien werden verschillende methodes gebruik die twijfelachtig zijn om de nodige CTC’s te bekomen. De testen werden bijvoorbeeld uitgevoerd bij patiënten in een later stadium (vooral bij CRC) zodat men een hoger aantal CTC’s kon bekomen. Er werd ook bloed genomen uit de drainerende vene, ofwel werden grotere hoeveelheden bloed afgenomen om het beoogde resultaat te behalen (4). Het voordeel van de verminderde invasiviteit door de perifere bloedafname, zoals eerder geargumenteerd, gaat hierbij verloren. Er is inderdaad aangetoond dat men meer CTC’s kon vinden in het bloed van een tumor drainerende vene. De verdere verdunning van het aantal CTC’s op een groter bloedvolume zou de oorzaak kunnen zijn dat er minder CTC’s worden gevonden in een afname op perifeer bloed. Een bijkomende probleem is nog dat er tot op heden geen uniforme definitie over het gegeven ”circulerende tumorcel” bestaat (64). Er bestaat namelijk een zeer grote heterogeniteit aan circulerende tumorcellen, niet enkel tussen verschillende kankerpatiënten onderling, maar ook binnen éénzelfde patiënt. Deze verschillen bevinden zich zowel op het gebied van cel dichtheid, expressie van proteinemerkers, als celgrootte (56). Dit gebrek aan een eenduidige definitie kan ervoor zorgen dat een bepaalde detectiemethode een bepaalde bias zal vertonen t.o.v. bepaalde CTC’s terwijl het biologisch relevante subpopulaties van CTC’s zal missen (56). Het gebruik van het aantal CTC’s als prognostische factor is al uit verschillende onderzoeken als werkbaar gebleken. Men kan hiermee de OS van CRC, prostaat Ca, borstkanker en longkanker inschatten, zowel bij primaire als bij metastatische kanker. Men kan hiermee ook de progressie van de Pagina | 28 ziekte inschatten. Bovendien is er bij de telling van CTC’s minder subjectieve interpretatie mogelijk dan bijvoorbeeld bij het inschatten van een mammografie (7). Bij borstkanker heeft de aanwezigheid van de oestrogeen receptor, progesteronreceptor en de HER2/neu receptor belangrijke implicaties, wat de behandeling betreft. Het aantal CTC’s is bij borstkanker prognostisch voor de OS en de PFS. Er is gebleken dat de voorspellende rol van CTC’s groter is bij ER en triple negatieve BC, dan bij HER2/neu positieve primaire tumoren (65). Ook bij CRC is de aanwezigheid van CTC’s geassocieerd met een slechtere prognose, zowel bij metastatische als niet metastatische kanker. Bij CRPC is gebleken dat het aantal CTC’s prognostisch was voor OS, na correctie voor gekende factoren De telling van CTC bleek ook accuratere voorspellingen te geven t.o.v. de bepaling van PSA, vooral bij een bepaling op vroegere tijdstippen in het verloop (49). Het vergelijken van het aantal CTC’s na een eerste ronde chemotherapie met de beginwaarde, kan gebruikt worden als een prognostische factor voor therapierespons. Deze respons kan vlugger beoordeeld worden, dan wanneer gewacht moet worden op resultaten van beeldvorming, of op PSA metingen bij prostaatkanker (7). Bij het aantonen van een verlengde PFS in functie van het aantal CTC’s is het belangrijk niet enkel de aantallen in rekening te nemen, maar ook de relatieve daling t.o.v. de uitgangswaarde (66). Helaas bleek uit eerdere studies dat een aanpassing in behandeling, op basis van de CTC aantallen, geen wijziging in PFS of OS kon teweegbrengen (67). Dit zou er echter op kunnen wijzen dat de aangepaste therapie nog niet specifiek genoeg was (57). 4.1.2 CTC karakterisatie Een beoordeling op genomisch en proteomisch niveau zou meer inzicht kunnen verschaffen in de ontwikkeling van kanker. Dit zou ook kunnen gebruikt worden voor de diagnose en bepaling van het stadium. Eventueel zou verder onderzoek naar CTC’s kunnen leiden naar de ontdekking van een beter geschikte biomerker (49). De karakterisatie van CTC’s zou inderdaad nuttig zijn voor het zoeken naar de juiste therapievorm, naargelang de karakteristieken van de cellen. Bovendien zou men hiermee vroegtijdig een therapieresistentie, door de aanwezigheid van mutaties in de cellen, bij de vorming van metastasen kunnen opsporen. Op deze wijze zou de behandeling kunnen aangepast worden aan de specifieke vorm van kanker bij de patiënt. Pagina | 29 Bij borstkanker is de aanwezigheid HER2/neu receptor een belangrijke bron van informatie. Deze geeft niet alleen informatie over de juiste therapiekeuze, maar ook over de prognose. Uit onderzoek bleek dat patiënten met een HER2 CTC’s een slechtere prognose hadden. Er is ook gebleken dat CTC’s Her2 positief kunnen zijn terwijl de primaire tumor HER2 negatief is: een discrepantie van ongeveer 18% werd opgemerkt. Het ontstaan van HER2 positiviteit t.o.v. de primaire tumor zou kunnen wijzen op een toenemend metastatisch karakter van de tumor (68). Bij patiënten met colorectaal kanker worden KRAS en BRAF onderzocht in de primaire tumor om zo de therapie te bepalen. Deze therapie is hoofdzakelijk gericht tegen EGFR en VEGF. Een KRAS mutatie is immers in verband gebracht met therapieresistentie. Net zoals bij borstkanker worden ook hier andere resultaten verkregen wanneer we een vergelijking maken van CTC’s en de primaire tumor. Er werd ook opgemerkt dat niet elke patiënt met KRAS mutatie een even goede respons vertoont op de anti-EGFR therapie. CTC’s en hun KRAS toestand zouden een onafhankelijke prognostische factor zijn voor de respons op bevacizumab en chemotherapie (69). Mensen met Non Small Cell Lung Cancer (NSCLC) die een EGFR mutatie dragen, kunnen behandeld worden met gefitinib. Deze mutatie kan opgespoord worden via DNA analyse van CTC’s gevonden via de CTC-chip. Deze patiënten werden hierna opgevolgd waarbij de wijzigingen in CTC tellingen gecorreleerd werden met radiologische en klinische respons. Bovendien was men in staat de opkomende resistentie op te sporen(52). Helaas blijkt uit verschillende onderzoeken dat, hoewel verhoogde CTC waarden gecorreleerd zijn met therapieresistentie, een vroege therapieswitch geen bijkomend voordeel geeft op het vlak van OS en PFS (35). Verder onderzoek is zeker nodig om de verschillende fenotypes van CTC’s te linken aan hun metastatische capaciteit. Bovendien is het afstellen van therapie aan de hand van deze karakterisatie niet eenvoudig: er is namelijk een enorme heterogeniteit binnen de CTC’s. De uitspraken die men kan doen volgens het aantal CTC’s is afhankelijk van het type kanker(25), zie hiervoor ook Tabel 1 hieronder. Mogelijkheid tot uitspraak over OS en PFS op basis van CTC's Kankertype long BC mBC mPCA CRC OS variatie met beginwaarden >=1 >=5 >=5 Stad IV PFS variatie indien hoge beginwaarden >=5 - ref: (70) (71) (72) Moreno2005 (4) Tabel 1 Mogelijkheid tot uitspraak over OS en PFS op basis van CTC telling Pagina | 30 4.2 HET NUT VAN CTC DETECTIEMETHODEN Bij een groot deel van de oudere methodes worden verschillende oppervlakte merkers gebruikt voor het opsporen van CTC’s. Niet alle CTC’s dragen echter de merkers welke door verschillende methodes worden gebruikt, zoals bijvoorbeeld EpCAM bij CellSearch. Deze EpCAM oppervlakte merker wordt, zoals eerder vermeld, verloren bij de overgang naar EMT. Net deze EMT wordt als een obligaat onderdeel van de stap naar hematogene metastasen aanzien. Hierdoor lijkt belangrijke informatie over de mogelijke aanwezigheid van metastasen bij een groot deel van de detectiemethodes die gebaseerd zijn op het vinden van oppervlaktemerkers, verloren te gaan. Bovendien blijken niet alle epitheliale cellen aanwezig in het bloed, van tumorale oorsprong te zijn(22). Deze kritiek komt terug in verschillende artikels(49, 73). Verschillende onderzoeksgroepen zijn hierdoor op zoek gegaan naar een meer algemeen bruikbare merker voor CTC cellen. Bij andere vormen van metastatische kanker blijkt echter dat de EMT met verlies van EpCAM expressie zorgt voor een vervormd beeld van CTC belasting van de patiënt wanneer men gebruik maakt van de gekende CTC methodes(74). Zo wordt er bij patiënten in laat-stadium metastatische borst en prostaat kanker maar bij 50% van de patiënten meer dan 5 CTC’s gevonden en bij CRC patiënten zelfs maar 26% met een CTC-aantal hoger dan 3(33). Er werden ook hogere CTC waarden gevonden met niet EpCAM afhankelijke zoekmethoden(75). Er is momenteel een zoektocht naar de ideale merker voor het opsporen van CTC’s. De vraag is nog maar of deze ooit zal gevonden worden. Waarschijnlijker is dat er een onderscheid zal blijven moeten gemaakt worden naargelang het type kanker en dat niet één soort merker “ideaal” zal zijn voor elke type. Het verlies van cytokeratine bij de tumorcellen wordt ook gezien als een teken van agressieve ziekte, waarbij fibronectine en vimentine expressie verhoogd worden bij EMT (26). Als tegenargument kan gezegd worden dat uit onderzoek is gebleken, dat bij bijvoorbeeld NSLC enkel de EpCAM positieve CTC’s een prognostische waarde hadden(35). Bovendien zou een groot percentage van de CTC’s EpCAM positief blijven. EpCAM zou kunnen gezien worden als een onderdeel van het proliferatief potentieel van een cel(74). Aan de verschillende CTC-detectiemethoden zijn bepaalde voor- en nadelen verbonden. Hieronder vindt u een niet exhaustieve lijst van CTC detectie technieken die tot op heden gebruikt worden met hun verschillende eigenschappen, detectiemethodes, duurtijd, recovery ratio en de duur van de zoektocht. Deze tabel werd gebaseerd op verschillende reviews om een zo volledig mogelijk beeld te kunnen geven. (56). Pagina | 31 VERRIJKINGSMETHODE TECHNOLOGIE 1. AFFINITEIT GEBASEERDE VANGST (CTC OPPERVLAKTE EIWITTEN) 1.1 EX VIVO OPMERKINGEN VOORDELEN NADELEN Enige FDA-goegekeurde methode voor patienten met metastatische borst CRC, PRC, ook niet metatstatische kanker aankoop systeem: €150000 €300 per sample • Visuele controle • Gevalideerd als acuraat, sensitief en reproduceerbaar •Hoge kostprijs, •subjectief door visuele controle, • EpCAM afhankelijk, • Geen bijkomende gen -analyse mogelijk CELLSEARCH (Janssen Diagnostics) Deels geautomatiseerde selectie van EpCAM-gecoatede ferrofluide nanoparticles , daarna IF for CK8, 18, 19; CD45; DAPI MACS system (Miltenyi Biotec) Negatieve selectie: Immunomagnetische CTC-negatieve verrijking via Ab tegen Geen densiteitsgradiënt, cytometrische analyse, moleculaire studies CD45 zoals EpCAM en HER2, lijn specifieke chimeer analyse mogelijk Positieve selectie: Immunomagnetische CTC verrijking: Ab tegen opp merkers tot nu toe nog geen grootschalige studies met deze methode of intracellulaire anti-pan CK Ab Quadrupole magnetic separator Lyse van RBC en immunomagnetische CD 45+ depletie, waarna IF kleuring, axiale stroming doorheen lange magnetische cilinders: maakt gebruikt van viskeuze stroming en magnetische krachten Studie demonstreert heterogeniteit van zeldzame cellen CTC definitie: 1) dubbel positief voor FITC and DAPI, 2) intact membraan 3) hoge kern/cytoplasmatische ratio Adnatest, Adnagen Verrijking via Ab gecoatede magnetische kralen, waarna de verrrijkte cellen worden getest via RT-PCR gen panelen in een multiplex systeem • Analyse van gen expressie in aangerijkte CTCs • Toepassing: borst, prostaat, colon, and ovariële kanker • €1200 voor een test CTC-chip MEMS Micro-Electromechanical System: microchip met Ab (EpCAM) gecoate paaltjes Toepassing: longkanker waartussen het bloedstaal vloeit CTC-iChipneg Deterministische laterale verplaatsing met selectie op basis van inertie en magnetische velden: labels met anti-CD45 and anti-CD66b Ab's Licensie door Janssen Diagnostics vangt ook CTC met lage EpCAM expressie Gecombineerde bol en microfluïde (inerte focus) verrijking (EpCAM+ mode) Licentie door Janssen Diagnostics CTC-iChippos CytoTrack Ephesia GEDI GEM chip GO Chip HB-Chip ImageStream (Amnis) Minimaal celverlies Staal wordt uitgezet op glazen schijfje en op hoge snelheid geroteerd en gescand Gelijkaardige recovery als bij CELLSEARCH op fluorescentie via laser straal, na centrifugatie en RBC lysis. CT4 scanner Definitie voor CTC: bijna ronde cel>4 μm , zichtbare nucleus (DAPI+), EpCAM onafhankelijk registreert IF events, waarna visuele controle gebeurt. CK+, CD45• Hoge capture specificiteit 94% • Analyses zijn mogelijk op kleine volumes Immobiele superparamagnetische EpCAM gefunctionaliseerde kralen in Microfluïde • Fluocytometrie gelijktijdig met cytologische karakterisatiemicrokanalen, vloeistof vloeit over de kanalen >snelle diagnose mogelijk • Hoge vangst efficientie en zuiverheid uit onverwerkte Microfluide geometrisch versterkte differentiële immunovangst (GEDI) met Ab bloed stalen, tegen specifieke Ag zoals PSMA or HER2, chip met micropaaltjes Definitie van CTC:CD45-,PSMA+ en met kern • Hogere gevoeligheid tov CellSearch CTCs hebben een lagere buoyancy dichtheid, waardoor RBC en WBS • Hoge efficientie en loslating Gebruik van geometrische optimalisatie van de interactie tussen magnetische • Veel levende cellen doorheen poreus opp drijven en de CTC op plasma interface kralen en CTC's voor optimale vangst • Proliferatie blijft mogelijk achterblijven • Hoge opbrengst, zelfs voor 3-5 cellen/ml Vangst waarbij men gebruik maakt van grapheen ocide nanosheets GO: Graphene oxide • GO is transparant wat helpt bij beeldvorming gefunctionaliseerd met polyethyleenglycol op een gouden oppervlak met een bepaald patroon • GO is biocompatibel en laat celproliferatie toe Verdere chips werden ontwikkeld maar de HB chip werd gebruikt voor Haring graat chip structuur die de interactie tussen CTC en het Ab gecoatede Glazen plaatje, bruikbaar voor beeldvorming EMT onderzoek chip oppervlak vergroot Glazen plaatje Laat de analyse van 5000 cellen/s toe Definitie CTC:EpCAM+ , labeling met anti-CD45-PE anti-Cytokeratin• Goedkopere analyse per sample dan CellSearch Immunomagnetische positieve sortering met anti-EpCAM gevolgd door flow FITC, DRAQ5 • Gelijkaardige resultaten aan CellSearch cytometrie en fluorescentie microscopie anti CD45, FITC en DRAQ5 aankoop systeem: 200 000€ prijs per sample: 40€ • Manuele methode • Meer variabele resultaten (onderzoekerafh) ja 2,5ml/h nee Sequist2009 R>99% ja R: afh van aantal CTC, gem 68% nee Hillig2015 1 ml/h ja Kirby2012 • Recovery daalt bij hogere stroomsnelheden R>90% Z:>84% 3,5 ml/h nee Sheng2014 R: >87% 1,2 ml/ h ja Yoon2014 R: 91,8% Z: 14% 1,2ml/h ja Yoon2014 5000 cellen/s 10 CTC's op 6h ja Lopez2013 • Lage precisie bij lage CTC aantallen • Lage sensitiviteit bij minder dan 10 CTC's in een sample • Voorafgaande verrijking nodig Efficiëntere celvangst dan CellSearch voor lage EpCAM expressie R: >75% Z: 1,4% 5,25 ml/h ja, maar andere Ab mogelijk Harb2013 • Hoge doorvoer met grote volumes mogelijk • Staal met grotere zuiverheid voor verdere analyse wordt bereikt. R>70% Z:afh van CTC aantal:100*[CTC]/([CTC ]+55) 8 ml/h ja, maar andere Ab mogelijk Jessamine R:95,7% op optimale snelheid 10 ml/h ja Earhart2014 R: 60% Z: 89% 9 ml/h ja Talasaz2009 R: 98% Z>80% 15 ml/h ja 3 a 4h neen •Hoge doorvoer •Hoge zuiverheid bij metastatische kanker • Minder goede resultaten met stalen met toegevoegde cellen • EpCAM afhankelijk • Vangst afhankelijk van zone van de staaf Hoge zuiverheid • Identificatie van zowel grote als kleine CTC en microembolen • Hogere sensitiviteit in vergelijking met CellSearch R: 90,5% • Geen cel adhesie of labelling nodig • Kan gebruikt worden voor verschillende kanker types • Weinig cel verlies GE2015 5 min centrifuge, 15 min incubatie, 1h fixatie,1h labeling • Kan zowel CK + als CK - CTC herkennen • Her2+ en hormoonreceptorstatus identificieren Potentiele CTC analyse in multipele tumor types 2,5 ml/h R: 97% Z: 68% Immunomagnetische vangst via Ab tegen EpCAM of andere oppervlakte merker, magnetische staaf wordt doorheen staal met buffer en magnetische kralen met Ab coating gehaald. Methode om verrijkte samples te concentreren in een toestel voor verdere Microfluidic cell concentrator (MCC) analyse onder invloed van zwaartekracht. De cellen dalen langzaam af vanuit een mengsel naar de verzamelkamer. 1.2 IN VIVO Usiakova2014 • Prostaat specifieke test MagSweeper (Illumina) OncoCEE (Biocept) nee Saliba2010 •Hoge doorvoer mogelijk (tot 25 ml/h) met nog acceptabele Microchip met magnetische poriën: Doorstroming doorheen vloeibare array met Magnetische gelabelde doelwit cellen worden gevangen aan de rand van recovery magnetische poriestructuur voor efficiënte scheiding van cellen gelabeld met poriën en kunnen daarna worden gebruikt voor cultuur, of gelyseerd • Recovery daalt tot zelfs 17% bij lagere EpCAM expressie • Gevangen CTC's worden gemakkelijk losgelaten zonder magnetische nanoparticles worden en geanalyseerd op mutaties via een biosensor chip verdere schade In microkanaal met een Streptavidine coating met CEE methode, vangst via biotine-streptavidine binding, verrijking met 10 Ab cocktail en analyse via ICC en of FISH Zborowski2011 ja Magnetic sifter Subtraction enrichment en immunostaining Fish: CK en EpCAM onafhankelijke WBC depletie met magnetische kralen gecoat met WBC merkers en detectie, combinatie van isolatie en detectie RBC scheiding via niet hematopoietische scheidingsmatrix neen enkele microL/min Immunomagnetische vangst binnen microfluide chip, positieve selectiemethode Direct geautomatiseerde DNA profilering SE-iFISH neen ja, maar andere Ab mogelijk Allard2004 R: >94% P: >85% LiquidBiopsy (Cynvenio) Modular CTC sinusoidal microsystem 3 functionele modules voor CTC selectie, telling en phenotypische identificatie, Electrische sensor voor telling en bepaling van levensvatbaarheid, (BioFluidica) sinusoïdale kanalen toepassing: borst, pancreas,prostaat,long, colorectaal 2h 2h REFERENTIES • Trage doorvoer Microfluide platform die controle van stroomsnelheid en immunomagnetische vangst combineert Vorm van de staaf beïnvloedt de recovery ja R: 77% R>65% EPCAM • Geen zuivere vangst, per ml blijven 32000 WBC's over • Speciale kennis is nodig voor het ontwikkelen van de chip IsoFlux (Fluxion) Definitie voor CTC's: CK+, CD45-, met kern en morfologisch intact DUURTIJD R: >85% R: >61% •Identificeert geen CK negatieve CTC Kan EpCAM negatieve CTC cellen identificeren met andere • Positieve selectiemethode heeft tot 50% CTC verlies tov oppervlakte merkers of bij CD45 depletie negatieve selectiemethode (lustberg) • Hoge doorvoer • Verrijking tot 10^4-voudig Geen absoluut zuivere depletie van CD45+ cellen • Verdere analyse voor CTC merkers met RT-PCR en immunocytochemie • minder CTC verlies • Hoge sensitiviteit, • Geen morfologische analyse • Detectie van levende cellen, • Geen telling mogelijk • Minder vals positieven dan enkelvoudige RT-PCR • De test is EpCAM en MUC1 afhankelijk, • Isolatie en detectie van kanker stamcellen en EMT merkers • Geen kwantificatie, cellen worden gebroken mogelijk • Hoge sensitiviteit • 98% levende cellen voor cultuur Lage stroomsnelheden zijn nodig, anders vermindert de • Gebruik van andere Ab zou opsporen van andere CTC's recovery ratio mogelijk maken • Snelle methode (8 ml/h) • Alle types CTC kunnen opgevangen worden. • Onveranderde cellen die kunnen gecultiveerd worden en verder moleculair and genetisch geanalyseerd worden •98% levende cellen, • sensitiever dan CellSearch •Hoge detectie ratio; visuele bevestiging van CTCs; •Zowel positieve als negatieve (EpCAM onafhankelijke) selectie zijn mogelijk RECOVERY:R ZUIVERHEID: Z • Voorafgaande verrijking nodig • Manuele methode met tussenpauzes van 2 minuten om het toestel niet te verstoppen R: 60,4% Casavant2013 Pagina | 32 VERRIJKINGSMETHODE TECHNOLOGIE CellCollector (GILUPI) Insertie van roestvrijstaal gefunctionaliseerde draad in vene van patiënt: 16 cm/ diameter: 0.5 mm In vivo detectie, screening van een groot volume bloed Immunologische analyse, EpCAM+ verrijking 2. BIOFYSIEKE EIGENSCHAPPEN 2.1 DICHTHEID Scheiding op basis van dichtheid: Ficoll paque is een vertakte polysaccharide, Ficoll gradiënt aggregatie hiermee vergroot de sedimentatie OncoQuick (Grenier Bio-One) RosetteSep CTC Enrichment Cocktail; EasySep CD45 Depletion (STEMCELL Technologies) OPMERKINGEN Centrifugatie zorgt voor het ontstaan van verschillende lagen VOORDELEN • Snel en goedkope methode Immunodichtheid negatieve selectie voor borst en long kanker. Anti-CD45 immunodichtheid of immunomagnetische depletie • Snelle methode • Hogere specificiteit • Detecteert levende cellen sensitiviteit en specifiek • Mutiplex is mogelijk, • Telling blijft mogelijk RECOVERY:R ZUIVERHEID: Z DUURTIJD D:70% • Grove scheiding • Lichtgevoelig • Lage specificiteit, • Contaminatie tussen verschillende lagen is mogelijk • Celverlies is mogelijk •Goedkoop •Gemakkelijk te gebruiken CTCs hebben een lagere drijfdichtheid, waardoor RBC en WBS 50-mL centrifugatie tube met poreuze barriere bovenop een scheidingsmedium doorheen poreus opp drijven en de CTC op plasma interface voor CTC verrijking door dichtheids centrifucatie en wassen achterblijven, vaak gebruikt in combinatie andere methodes Ongewilde cellen worden doelwit voor verwijdering via Tetramere Ab complexen die botsen met RBC: ook anti-CD45 bolletjes NADELEN •Goedgekeurd medisch toestel •Screening van grote bloedvolumes • Grootte-onafhankelijk EPCAM REFERENTIES ja R: 80% (Weitz et al., 1998) R: 72% nee 10 min Koningsberg2011 neen • Hoge CTCscope (RT-PCR) Verrijking met Ficoll gradient daarna detectie met geautomatiseerd systeem voor Gevoelig genoeg om een enkele molecule te detecteren, detectie van RNA detectie (rna-scope) mRNA expressie van CTC's AccuCyte–CyteFinder (RareCyte) Cell scheiding op basis van dichtheid en geautomatiseerde beeldvorming met optionele enkele-cel vangst Duale technologie platform dat individuele cel analyse toelaat • Hoge sensitiviteit CellSieve (Creatv MicroTech) 2D Microfilter techniek met precies geplaatste poriën en hoge porositeits Cellen behouden 3D morfologie door lage druk Definitie CTC: CK+/CD45− en DAPI+ cellen • 3D morfologie blijft behouden • Snelle methode • Grote vangst efficiëntie ISET (Rarecells) 2D Filter-gebaseerde verrijking:Filtratie op grootte en selectie met een tracketched polycarbonaat membraan Detectie van ALK ordening en gen mutaties op CTCs voor FU van behandeling crizotinib Definitie CTC: Grootte>8 micron, nucleus tot cytoplasm opp ratio, and nucleaire irregulariteiten • Kleuring en verdere analyse mogelijk, • Ook opsporing van micro-emboli, • EpCAM onafhankelijk, • Eenvoudig en goedkoop systeem. • Lage specificiteit, • Membraan kan verstoppen, • Geen grootschalige studies • 2D Parylene filter (Circulogix) Filter-gebaseerde verrijking: tweelagige filter met C-paryleen Vangst van levende CTC met een 3D microfilter membraan • Eenvoudige methode • Hoge sensitiviteit • Vangst van levende cellen: 74% • 3D • Beperkt tot 1,5 ml: samples van 7,5ml verstoppen het toestel • Morfologisch onderzoek van grote samples bijkomend bemoeilijkt door te grote celdichtheid ScreenCell (ScreenCell) Filter-gebaseerde selectie:Microporeus membraan filter laat grootte-selectieve isolatie van CTCs toe (6.5 um and 5.5 um) Laat een phenotype analyse toe en celcultuur, definitie van CTC: grote celkern>20 micron en grote kern-tot-cytoplasmische ratio (≥0.75) Toepassing: prostaat • Vangst van levende cellen • Label onafhankelijk • 2D R:>80,5% 3 min neen Chen2013 • Combinatie met microfilters • Huidig onderzoek combineert FMSA met adenovirus besmetting • 80% levende cellen • Werkt zonder pre-processing op vol bloed • snelle methode • Minder celschade dan andere microfiltratie methodes • 2D R> 90% 10 min neen Ma2015 Kritische gap 10 micron • Labelvrije methode • Via aan back-flush systeem wordt WBC contaminatie verminderd • 3D • Contaminatie met WBC: 200 cellen /sample R>69% 2 ml/h neen Chudziak2016 2.2 GROOTTE FMSA flexibele micro spring array: Scheiding op grootte en vervormbaarheid. Cell Optics Automated imaging platform gecombineerd met een isolatie op grootte Parsortix 3D: microfluide chip met steeds kleiner wordende kamers 2.3 INERTIE ClearCell FX (Clearbridge BioMedics) CTC-chip van Clearcell is een methode gebaseerd op grootte. Het bloedstaal met een zoutoplossing buffer gaat doorheen de spiraalvormige chip aan een hoge snelheid. De centrifugaalkrachten scheiden de cellen waarbij de grotere CTC’s worden afgezonderd aan de binnenzijde van de chip. De opgevangen CTC’s zijn nog levend en kunnen gebruikt worden voor cultivatie CTC's kunnen nog geanalyseerd worden en op cultuur gezet toepassing: long en borst €100 voor een chip Cluster-Chip 3 D: Verschillende rijen van geshifte driehoekige pilaren: lage schuifkrachten Enkele-cel doorgang: clusters bevatten zowel quiescente en prolifererende cellen, als andere types Vortex Gecombineerd gebruik van microschaal cortices en focusering met inertiekrachten Levende CTC isolatie met hoge zuiverheid (>50%) 2.4 DIELEKTROFORETISCHE KRACHTEN ApoStream (ApoCell) Continue stroom Dielectrophoretic Field-Flow Fractionatie (DEP-FFF) in microfluïde flow kamer ODEP optisch-geïnduceerde-diëlectrophoretische krachten op microfluïdics • Hoge vangst efficiëntie • Ab-onafhankelijk • Zeer snelle methode: 3mL op 30min-1h. 7,5 ml op 10 minuten voor de nieuwste types als RBC gebroken worden. • De CTC’s zijn nog bruikbaar voor cultivatie • Contaminatie en celverlies worden beperkt als men geen voorafgaande processen toepast. • Betaalbaar 100 dollar per chip. • Kan aangepast worden om ook andere zeldzame cellen te isoleren. • 3D morfologie blijft behouden • Detectie onafhankelijk van EpCAM expressie de scheiding gebeurt op basis van biofysieke verschillen tussen normale • Cellen zijn bruikbaar voor analyse en cultuur bloedcellen en tumorcellen: morfologie en geleidingsverschillen • Hoge doorvoer door continue stroming • Continue methode • Geen celbeschadiging • Hoge zuiverheid Epic (Epic Sciences) RBC lyse, daarna IF for CK, CD45, en DAPI, of andere specifieke merkers, daarna high-definition beeldvorming • Geen verrijkingstechnieken, dus ook geen celverlies. • Opslag van staal op -80°C laat latere analyse toe op een Screening zonder bias van alle genucleerde cellen in bloed, met detectie later tijdstip voor CTC en CTC clusters. • Eens de plaats van de cel op het plaatje opgetekend is kan deze later onderzocht worden op mutaties met NGS • Ook mogelijk voor het isoleren van andere zeldzame cellen FASTcell (SRI) Fiber optic array scanning technology (FAST): localiseren van immunofluorescent gelabelde cellen Laat simultane detectie van meerdere tumor specifieke biomerkers toe via multiplexing, RBC lysis verbetert resultaten Toepassing= op mCRC 3. DIRECTE BEELDVORMING •Membraan kan verstoppen • WBC contaminatie +/- 500/sample • 2D • Niet alle tumorcellen zijn groter dan bloedcellen • Er is geen perfecte scheiding van de cellen (per ml blijven nog 440 WBC’s aanwezig) Eerst negatieve selectie nodig • Lage doorvoersnelheid door dipoolinteracties •Geen nood aan labels • Tot 40% celverlies • Combinatie met voor verrijking via CellSearch geeft goede • Bruikbaarheid beperkt tot metastatische kanker met hoge resultaten CTC aantallen • Voorafgaande verrijking nodig • Isolatie van individuele zuivere CTCs voor dowstream analyse •Toepassing: getest voor CRC, cervicCa,BC •Geen verrijking of zuivering, dus ook geen celverlies. • Breed onderzoeksveld, kan heel het plaatje tegelijk onderzoeken Payne2012 R: 90% • Geen labels nodig • Levende cellen • Clusters ontdekt Chip, Bewegende dielectrophoretic kooien, gebruik van elektrische velden om cellen te scheiden, individuele cellen worden gevangen. IF voor tumormerkers DEPArray (Silicon Biosystems) Moeilijk uit te voeren in labo • Deze methode duur lang: voor een staal van 7,5 ml heeft men 12 slides, en per slide heeft men 2,5h nodig voor analyse, wat voor een staal van 7,5 ml betekent dat men 30h nodig heeft • Cellen zijn niet meer levensvatbaar na vangst • Niet commercieel verkrijgbaar Geen link met klinische resultaten R: 98% 2 min neen R: 98% ± 2% for fixed MCF-7 cells 3 min neen R>75% Adams2011 neen Sequist2009 R:>80% Z:>57% 7,5 ml/20 min Sollier2014 R: >70% Z:99% WBC scheiding >10ml/h nee Gupta2012 R>61% afh v celtype Z>64% 0,36 ml/h nee Huang2013 R: 92% Z: 7,5% 1,2ml/h nee Fernandez2014 R:>75% 0,25ml/h nee Bethel2014 Sensitiviteit 98% na bloedcellyse 5ml/h nee Lustberg2012 Pagina | 33 VERRIJKINGSMETHODE TECHNOLOGIE OPMERKINGEN ACIS automated cellular imaging system,laat sneller onderzoek van glazen plaatjes toe. Na de initiele scan zal de onderzoeker de gevonden cellen morfologisch onderzoeken. VOORDELEN NADELEN volledig geautomatiseerd scanning microscopen Analyse van alle fluorescentiesignalen binnen de cel Definitie CTC: EpCAM+, CK7 en 8+ • Volledig geautomatiseerd, • Realtime beeldvorming en analyse Verschillende stappen gaan het proces vooraf: • Centrifugatie • Filtering • Kleuring • FISH Ikoniscope® Robotic microscope (Ikonisys) geautomatiseerde beeldvorming platform: isolatie gebaseerd op grootte Maintrac (Simfo) RBC lyse;IF voor EpCAM+/CD45− cells,Laser-scanning cytometrie (LSC) correctie voor achtergrond fluorescentie, verplaatsing van de gevonden cel is mogelijk voor visuele bevestiging • Grote kans op levende celvangst door gebruik van tubes zonder stabilisator • Enkel levende cellen worden gedetecteerd • Weinig merkers nodig RECOVERY:R ZUIVERHEID: Z DUURTIJD EPCAM REFERENTIES nee Ntouroupi R: >98% 10 ml/h ja R: 80% Z: 0,9% 25000 cellen/h ja 24-48h incubatietijd neen Alix-Panabieres2015 neen Friedlander2014 4. FUNCTIONELE ANALYSE: PROTEÏNE OF CEL ADHESIE EPISOT CD45 depletie en kortdurende incubatie. IF voor verschillende merkers. Negatieve CD 45 selectie, CXCR4 verrijking (chemokinereceptor voor metastatische cel aantrekking), gesecreteerde proteines worden opgevangen op een membraan en geanalyseerd. Detectie gebaseerd op proteïne secretie Vita-Assay (Vitatex) Dichtheidsgradient centrifugatie, waarna de cellen aan een collageen adhesie matrix worden aangebracht, IF Detectie gebaseerd op invasie eigenschappen, nl CAM ingestie Kan clusters opsporen Photoacoustische flow cytometrie, maakt gebruik van absorptie spectra Toegenomen sensitiviteit bij onderzoek van WB in vivo Kan grote volumes bloed bekijken 5. IN VIVO DETECTIE PAFC • Nog geen bewijs van klinische relevantie • Proteïnes moeten actief uitgescheiden worden • Geen verdere identificatie of isolatie van CTC's mogelijk • lange incubatietijd nodig (24-48h) Tabel 2: CTC Onderzoeksmethoden, op basis van (10, 23, 57) Pagina | 34 4.2.1 Selectie op grootte Deze vorm van selectie is merker onafhankelijk, zodat er ook geen problemen zijn bij het onderzoek naar CTC’s die EMT hebben ondergaan (45). Er is ook gebleken dat de effectiviteit van deze methoden beter is in vergelijking met CellSearch (63). Bij deze vorm van selectie werd echter een grote overlap gevonden tussen de grootte van de kleinste CTC’s en WBC ‘s. Dit heeft negatieve weerslag heeft op de sensitiviteit van de op grootte gebaseerde methodes. Bovendien is gebleken dat CTC ’s onderling kunnen variëren in grootte, zelfs bij eenzelfde patiënt. Een bijkomend probleem is dat filters kunnen verstoppen door de grote hoeveelheid aan cellen. De doorvoer van grote hoeveelheden cellen kan leiden tot een grotere hemodynamische stress waardoor er lyse of beschadigingen kunnen optreden. De filtratie technieken worden verbeterd, maar deze technieken lijkt het best te gebruiken bij kankertypes met grotere tumorcellen. 4.2.2 Immuno-affiniteit Immunocytochemie wordt gebruikt om bloed en beenmerg te analyseren. In de oudere methodes gebruikt men geen of minimale aanrijking. De gevonden cellen worden geteld door visuele zoektocht door middel van een microscoop(44). Bovendien kan men verschillende antigenen tegelijk instellen als detectie-doelwit. Om bepaalde cellen te selecteren maakt men gebruik van antilichamen gericht tegen bepaalde antigenen. Als men deze antilichamen koppelt aan fluorescente stoffen dan kan men gebruik maken van verschillende immunofluorescentie methoden zoals eerder besproken. Heel vaak worden antilichamen gekoppeld aan magnetische microkralen welke in het bloedstaal worden gebracht. Hierna worden de gelinkte cellen verwijderd uit het staal via magnetische velden. De hierop gebaseerde methodes zijn algemeen genomen zeer tijdsintensief en de kwaliteit is afhankelijk van de onderzoeker. Er worden ook vaak vals positieven gevonden. De gevonden cellen kunnen meestal ook niet meer worden gecultiveerd voor verder onderzoek. Een bijkomend nadeel is dat de getagde cellen gebonden zijn door een covalente Ab-Ag binding, waardoor hun 3D morfologie verloren zal gaan. Het voordeel t.o.v. andere filtratiemethodes is dat de cellen minder schade zullen ondervinden. Daarnaast hebben methodes die gebruik maken van magnetisme als algemeen voordeel dat ze kunnen worden toegepast op zowel macro- als microschaal. 4.2.2.1 Positieve selectiemethodes Deze methodes zijn al vaak onderzocht geweest en zijn dus goed gekend. Daardoor worden zij ook vaker toegepast dan de andere besproken methodes. Bovendien zijn ze kost effectiever omdat er Pagina | 35 minder antilichaam voor nodig is, dan voor de negatieve selectiemethoden (32). Om deze zeldzame cellen te kunnen opsporen, heeft men gepoogd om bepaalde oppervlaktemerkers van deze epitheliale cellen te benutten. De meeste methodes gebruiken hiervoor EpCAM. Het grote nadeel dat hieraan verbonden is dat men met deze methoden de CTC die EMT ondergaan zal missen. Net deze EMT wordt als een obligaat onderdeel van de stap naar hematogene metastasen aanzien. Bij deze EMT gebeurt EpCAM neerregulatie (76). De EpCAM expressie vermindert t.o.v. de cellen in de primaire en in de metastatische solide tumoren. Hierdoor kunnen CTC’s gemist worden. Zo werd bij verschillende studies bij 70% van patiënten met metastatische borst en prostaatkanker CTC’s terug gevonden met het CellSearch systeem. Maar in andere studies werden de CTC’s maar gevonden bij 20-40%(77). Het is ook mogelijk dat de binding met anti-EpCAM Ab andere effecten heeft op de CTC’s, wat de resultaten van biologische karakterisatie zou kunnen beïnvloeden (54). Bovendien blijkt dat er verschillende resultaten worden behaald naargelang het type Ab dat men gebruikt om EpCAM te binden (78). Ook cytokeratine expressie vermindert bij het ontstaan van metastasen (44). Hierdoor lijkt belangrijke informatie over de mogelijke aanwezigheid van metastasen bij een groot deel van de detectiemethodes die gebaseerd zijn op het vinden van oppervlaktemerkers, verloren te gaan. Een bijkomende probleem is nog dat er tot op heden geen uniforme definitie over het gegeven ”circulerende tumorcel” bestaat (64). Dit is ook te zien in tabel 1 (kolom opmerkingen). Er bestaat namelijk een zeer grote heterogeniteit aan circulerende tumorcellen, niet enkel tussen verschillende kankerpatiënten onderling, maar ook binnen eenzelfde patiënt. Deze verschillen zijn zowel op het gebied van cel dichtheid, expressie van proteïnemerkers als celgrootte (56). Dit gebrek aan een eenduidige definitie kan ervoor zorgen dat een bepaalde detectiemethode bepaalde bias zal vertonen t.o.v. bepaalde CTC’s terwijl het biologisch relevante subpopulaties van CTC’s zal missen (56). Positieve selectie methodes behalen over het algemeen een hogere zuiverheid dan negatieve selectie en selectie op basis fysische eigenschappen. Daarentegen is hun doorvoersnelheid vaak lager, waardoor het langer zal duren om de samples te analyseren(79). 4.2.2.2 Negatieve selectie Deze methode zal de cellen welke CD45+ zijn eerst weghalen. Hierdoor zullen de leukocyten die zeker CD45+ zijn, uit het staal worden gehaald. Dit heeft als voordeel dat de aanwezige CTC’s minder wrijfkrachten zullen ondervinden, waardoor zij vaker intact kunnen worden onderzocht. Methodes die gebaseerd zijn op negatieve selectie zullen ook EpCAM negatieve cellen kunnen detecteren, Pagina | 36 maar de samples blijven vaak gecontamineerd door WBC. Door de RBC lysis is er vaak ook schade aan de CTC’s en zal er celverlies optreden(54). Er is momenteel nog discussie over het effect op de zuiverheid. Volgens bepaalde bronnen is de zuiverheid hier gecompromitteerd, anderen beweren dat de zuiverheid net zal verbeteren (44). Bij negatieve selectie moet men ook opletten dat het aanrijkingsniveau hoog genoeg blijft om de abnormale cellen te kunnen detecteren. Qua resultaten hebben de methodes die gebaseerd zijn op negatieve selectie ook uitgewezen dat zij de aanwezigheid van CTC’s kunnen aantonen in alle stadia van borstkanker. Een bijkomend voordeel is dat bij een selectie op grootte na het toepassen van negatieve selectie, de kleinere CTC’s, welke niet veel verschillen van grootte van leukocyten, ook zullen worden afgescheiden. 4.2.3 CellSearch Een groot voordeel van CellSearch is dat deze methode semi-geautomatiseerd verloopt, wat de snelheid gunstig beïnvloedt. Deze methode is effectief en reproduceerbaar maar levert slechts kleine aantallen CTC’s op, bovendien blijft zij kostelijk. De oorzaak hiervan is het verlies van deze zeldzame cellen via de zuivering in een proces met meerdere stappen, maar ook een inefficiënte scheiding van de gelabelde cellen tussen de grote aantallen niet-gelabelde cellen(21). De aanwezigheid van CTC’s is getest door Allard et al. in 2004 waarbij de aantallen werden vergeleken bij gezonde deelnemers en patiënten met kanker, zowel benigne als metastatische carcinomen. Bij meer dan 36% van de kankerpatiënten was het CTC-aantal >=2. Verschillende onderzoeken hebben al aangetoond dat een hoger CTC aantal gecorreleerd is met een slechtere prognose, zowel bij borst, colorectale, prostaat en longkanker. Dit geldt zowel voor als na behandeling. De afkapwaarde voor de gunstige en ongunstige groepen werd gesteld op 5 CTC’s op 7.5ml. Bovendien werd gezien dat een overgang naar de gunstige groep na behandeling kon gebruikt worden als een meting voor therapiedoeltreffendheid. De correlatie is duidelijk zichtbaar wanneer men de CTC waarden uitzet ten opzichte van de prognose. Pagina | 37 Figuur 5: Verband tussen CTC aantallen en Overlevingskans uit (29) 4.2.4 Microfluïdics Methodes die gebaseerd zijn op microfluïdics hebben als voordeel dat zij weinig bloedvolume nodig is voor het uitvoeren van de test. Dit kan een voordeel zijn bij het testen van neonaten. Bovendien is een telling van CTC’s mogelijk en zijn deze methodes vaak goedkoop(79). De recovery en sensitiviteit van de CTC-ichip zou volgens onderzoek hoger liggen dan deze van CellSearch (52). Bij een te hoge doorvoer vermindert de efficiëntie van de vangst. Bovendien wordt het oogsten van de cellen bemoeilijkt door de covalente binding tussen de Ab en de cel (45). 4.2.5 Besluit detectiemethodes voor CTC’s Een definitief vergelijkende studie blijft momenteel nog moeilijk aangezien de gebruikte methodes niet alleen verschillen in de onderliggende technologie, het aantal ml bloed nodig voor het onderzoek, maar ook in het aantal onderzochte patiënten en controlegroepen en de kwaliteit van het onderzoek naar de sensitiviteit en specificiteit van de methodes (22). 4.3 CFDNA Het grootste voordeel van het gebruik van cfDNA in kankeronderzoek is dat deze methodes niet invasief zijn. Men zou een specifieke monitoring kunnen uitvoeren van progressie aan de hand van Pagina | 38 gen mutaties in bepaalde genen. Zo is de monitoring van stadium IV patiënten, waarbij biopsie niet altijd mogelijk is, mogelijk met deze technieken. Een tweede voordeel van deze methode is dat de isolatie van cfDNA uit bloed eenvoudiger is dan de isolatie van CTC (8). cfDNA zou dan ook kunnen gebruikt worden als bron voor biomerkers voor het opsporen van preneoplastische laesies. Het niveau aan DNA in plasma zou kunnen gebruikt worden om het effect van therapie na te gaan. Deze methodes zijn kosteneffectief, met een hoge specificiteit en sensitiviteit. De kosten voor NGS analyses zijn namelijk gedaald naarmate deze technieken meer en meer ingeburgerd zijn geraakt. Deze kosteneffectiviteit stijgt als men deze testen meer gecentraliseerd uitvoert in specialistische laboratoria (80). De terugbetaling van deze testen door het RIZIV zou dan inderdaad mogelijk worden. Er bestaan echter nog geen standaard procedures, noch voor afname en kwantificatie, noch voor de analyse (81). De testen zijn vaak nog te laag in specificiteit en sensitiviteit. Een groot nadeel is dat veel van de methodes gebruik maken van gekende mutaties in DNA om het staal te bestuderen, zodat bijkomende mutaties soms over het hoofd worden gezien. 4.3.1 cfDNA concentratie De gevonden concentraties aan cfDNA zijn zeer afhankelijk van de gebruikte methode. Er zijn weinig vergelijkende studies te vinden voor de verschillende extractiemethoden. In vele studies worden kits gebruikt, zoals deze van QIAGEN. Bij de meeste methodes voor het opsporen van celvrije nucleïnezuren heeft men een hoge sensitiviteit, maar men boet in aan specificiteit door de aanwezigheid van ruis (7). Vooral PCR is hiervoor gevoelig (41). Zo kan er bij het gebruik van buffers tot 40% van het cfDNA verloren gaan (60). Volgens een bepaald onderzoek zou CNA kit > DBM kit > NS kit > FA kit (81), Zie tabel 3. Er is een grote (niet-normale) verdeling van concentraties aan cfDNA in bloed en plasma. Desondanks lijkt het gebruik van concentratie aan cfDNA een mogelijk goede merker voor de aanwezigheid van maligniteit. Er is namelijk verschillende keren opgemerkt dat er een significant hogere concentratie aanwezig is bij mensen met een maligniteit(36). Maar er is ook gezien dat er een hogere waarde is bij andere ziektes, zoals SLE, myocard infarct en weefselschade, zodat deze stijging niet specifiek is voor kanker. Men kan ook niet het type kanker bepalen met enkel informatie over de cfDNA concentratie (41). Er is aangetoond dat deze DNA integriteits index significant hoger is bij maligniteit in vergelijking Pagina | 39 met gezonde patiënten en ook bij benigne letsels (36). Bij verschillende stadia van kanker is deze index hoger in stadium III-IV zodat deze index ook voor stadiëring kan worden ingezet. Andere onderzoeken hadden echter tegenstrijdige resultaten: de ctDNA fragmenten bleken korter te zijn (82). Deze tegenstrijdige resultaten kunnen eventueel te wijten zijn aan het gebruik van andere technieken.Uit onderzoek bleek dat de uitgangswaarde van cfDNA een significante prognostische factor voor PFS en OS bij NSCLC (70). METHODE TECHNOLOGIE 1. NIET COMMERCIÊLE METHODES 10 min koken 58°C , gevolgd door chloroform:isoKoken amyl alcohol en isopropanol precipitatie Alcohol precipitatie centrifugatie en lysis met proteïnase K 1.1 organische extractie: beter zuiverheid dan koken proteinase K , dehydratie and precipitatie van of proteïnes met een saturated NaCl oplossing gevolgd door, Conventionele methode phenol:chloroform:isoamyl alcohol extractie en ethanol precipitatie THP protocol Verhitting van plasma met Triton-X-100 en zuivering met phenol en chloroform 2. COMMERCIELE METHODES 2.1 Silica-membraan technologie: duurder, duurt langer, hoge zuiverheid QIAamp DNA blood kit (DBM) Binding van DNA aan siliciumgel membraan in kolommen, gericht op extractie van hoog-integriteit cfDNA,spin-column of 96-well-plate procedures QIAmp circulating nucleic acid (CNA) kit Deze methode bestaat uit 4 stappen (breken, binden, wassen en uitwassen). Nucleospin (NS) Absorbtie van DNA in 'chaotropric salts' VOORDELEN Gemakkelijke en snelle methode Gemakkelijke en snelle methode Gemakkelijke en snelle methode • Hoge zuiverheid>38,7% • Lage kost • Goede kwaliteit Medium tot hoog moleculair gewicht DNA Hoge zuiverheid: Z:18,7%, R>20% Gemakkelijk en snelle methode R>80% •Kleine DNA fragmenten kunnen ook gevonden worden R: +/- 20% • Snelle methode 2.2 Anion-uitwisseling methode: medium kost, hoge zuiverheid 2.3 Magnetic-particle technologie: makkerlijk dan methodes met centrifugatie, specifieke collectie en opslag nodig om contaminatie te vermijden Beads, Emulsion, Amplification an Magnetics: combiHoog moleculair gewicht DNA BEAMing natie van emulsie PCR met magnetische kralen en FC Hoge zuiverheid voor detectie en kwantificatie van mutant tumor DNA Tabel 3: CFDNA extractie op basis van (41) Pagina | 40 4.3.2 cfDNA karakterisatie De zoektocht naar gekende mutaties kent bepaalde nadelen. Er worden vaak slechts enkele van deze puntmutaties gezocht. Sommige worden hierbij gemist. Hersequenering biedt dan een mogelijkheid om gekende mutaties in bv. Tumorsupressie genen op te zoeken. Om tumor specifieke mutaties op te sporen werd het “tagged-amplicon deep sequencing” gebruikt. Hiermee kon men zelfs laag frequente mutaties opsporen (sn en sp>97%). De gevoeligheid van de methodes is daarbij nog afhankelijk van het opgezochte gen(41). WGS methodes hebben een lage analytische gevoeligheid en een hoge sensitiviteit. 4.3.3 Besluit cfDNA CfDNA zou kunnen worden gebruikt om hoog risico patiënten te screenen, als prognostische methode of als intermediaire eindpunten in chemopreventie en therapeutische experimenten. De verschillen in extractie methodes, voorbereiding van stalen, analysemethodes, etc. beperken de reproduceerbaarheid en dus de klinische bruikbaarheid van deze methodes. Het is nog niet duidelijk welke van deze methodes het beste is voor klinische toepassingen (43). Verder onderzoek is hier dus aangewezen. 4.4 CTC’S VERSUS CFDNA Zowel CTC als ctDNA blijken valabele onderzoeksmethoden te zijn in de strijd tegen kanker. Beide methodes kunnen zowel primaire als secundaire mutaties onder invloed van kankertherapie opsporen (34). De grote medische bedrijven wijzen er echter op dat deze methoden nog niet in alle gevallen toepasbaar zijn (83). De klinische bruikbaarheid lijdt o.a. onder het gebrek aan gestandaardiseerde staalafname, bewaar en analysemethodes. Bloedanalyses zijn zeer welkom in een tijd waarin er nieuwe doelwit specifieke therapieën voorhanden zijn. Ook wanneer de tumor niet bereikbaar is om een biopsie te nemen, kan CTC en ctDNA genotypering gebruikt worden voor de therapiebepaling. Zij kunnen immers snel de respons op de therapie weergeven, zodat zo snel mogelijk kan worden overgeschakeld naar de meest specifieke therapie, zonder daarbij te moeten wachten op radiologisch zichtbare veranderingen in de tumor. Bij het nakijken van de respons op therapie werd zowel in ctDNA als CTC grote waardeverschillen gezien voor en na een correcte therapie in prostaatkanker. Bij longkanker zouden enkel de begin- Pagina | 41 waarden van cfDNA prognostisch zijn voor PFS en OS (70). De uitgangswaarde van CTC zou volgens deze onderzoekers geen informatie geven over de uitkomst. Om een uitspraak te doen over OS zou beter een vergelijking worden gebruikt van CTC waarden na therapie en de uitgangswaarde(66). Een significante prognose over PFS blijkt echter alleen mogelijk bij patiënten met een hogere baseline CTC telling(70). Uit een bepaald onderzoek blijkt het gebruik van CTC in thoracale maligniteiten effectiever dan het gebruik van ctDNA (84). Uit onderzoek naar CRC is gebleken dat cfDNA prognostisch is voor OS (85). De grootste impact van deze technieken ligt echter op het gebied van een snelle diagnosestelling. De meeste huidige onderzoeken gebeuren vaak bij mensen bij wie een gekende metastatische kanker aanwezig is. CTC en ctDNA zouden kunnen worden gebruikt om recidieven op te sporen en om residuele kankers te vinden. Recent is meer en meer onderzoek naar mutaties binnen CTC en ctDNA, welke een voorspellende waarde kunnen hebben voor de respons op bepaalde doelwit specifieke inhibitoren. Beide technieken zijn niet invasief, specifiek en zouden de heterogeniteit van kanker zowel in de ruimte als in de tijd kunnen onderzoeken. Als nadeel hebben ze ook beiden dat er een veel ruis is door hun lage aantallen. Ook heeft de manier waarop het staal wordt verkregen een grote impact, en zou standaardisatie hiervan een uitkomst bieden (57). CTC methoden hebben als voordeel dat zij analyses kunnen uitvoeren van proteïne expressie. Bovendien kunnen zij functionele analyses uitvoeren ex vivo. Hun nadeel tov cfDNa is dat de heterogeniteit van de tumor de opzoekingsmethoden kan beïnvloeden. cfDNA is ook sensitiever. Hoewel deze scriptie de bedoeling had een vergelijking te maken tussen het gebruik van circulerende tumorcellen en circulerend tumor DNA, bleek uit verdere onderzoeken dat het gecombineerde gebruik van beide zou leiden tot betere resultaten voor de bepaling van een goede respons op kankertherapie(50). Sommige onderzoekers hebben deze combinatie reeds toegepast: zo heeft het bedrijf Cynvenio (86) een methode uitgewerkt waarbij bij onderzoeken gelijktijdig zouden kunnen gebeuren op een periode van 7 dagen. Voor de patiënten is het uiteraard van levensbelang om de juiste diagnose te krijgen en voor die bepaalde diagnose de juiste therapie te bekomen. Daarom is het als oncoloog noodzakelijk om op de hoogte te blijven van de recente ontwikkelingen op dit gebied. Dit wordt echter bemoeilijkt door de Pagina | 42 snelheid van ontwikkelingen in dit veld, en de veelheid aan publicaties hierover. Permanente vorming is dan ook een noodzaak. Met het gebruik van de voornoemde technieken zou men deze therapieën kunnen aanpassen aan een specifieke vorm van tumor bij een individuele patiënt. Deze nieuwe therapievormen, gericht tegen bv. heel specifieke afwijkingen in proteïnes, receptoren ed. zijn echter ook vaak heel duur, wat het belang van een correcte diagnose met de juiste techniek en een minimum aan vals positieven nog verder benadrukt (80). Terugbetalingscriteria voor deze nieuwe technieken moeten ook besproken worden. Het zou immers van weinig nut zijn om perfect aangepaste medicijnen te ontwikkelen als de patiënt de onderzoeken naar de best aangepaste therapie onmogelijk kan betalen. Pagina | 43 5 BESLUIT Het gebruik van CTC’s en ctDNA in kankeronderzoek blijft een belangrijk onderzoeksonderwerp. De interesse blijft hoog, ondanks de vele tegenslagen, net omdat de mogelijkheden van deze methodes zo veelbelovend zijn. De afgelopen jaren is er reeds veel vooruitgang geboekt. De grote verscheidenheid aan methodes hebben elk hun eigen mogelijk toepassingsdomein. Zowel CTC’s als ctDNA geven bijvoorbeeld informatie over de prognose (OS en PFS) bij patiënten met verschillende types kanker. Het gebruik van deze technieken maakt ook de opvolging van kankertherapie beter mogelijk. Desondanks blijft het gebrek aan specifieke tumormerkers en sensitieve analyses een struikelblok. Door het ontbreken van een consensus over de exacte definitie van een circulerende tumorcel is het moeilijk een vergelijking te maken tussen de verschillende methodes. Elk van de methodes heeft dus verschillende voor- en nadelen, maar de perfecte methode voor het creëren van de vloeibare biopsie is tot op heden nog niet gevonden. Een veelbelovende piste is het gebruik van technieken die CTC’s en ctDNA combineren. Dit leidt bijvoorbeeld tot betere resultaten voor de bepaling van een goede respons op kankertherapie en zou eventueel op andere gebieden ook vooruitgang kunnen betekenen. Bijkomende vooruitgang zou eveneens gefaciliteerd kunnen worden door standaardisatie en protocollering inzake bloedafnames en opslag van stalen. Dit zou een betere vergelijking tussen verschillende technieken mogelijk maken. De verschillende artikels, ondermeer over het gebruik van microfluïdics en diëlektroforese, de aanmaak van microchips, het opsporen van kanker-specifieke wijzigingen in DNA,… bestrijken erg veel verschillende takken van de wetenschap. Elk van deze gebieden vergt een zekere kennis en inzicht om doelgericht onderzoek te kunnen verrichten. Men kan dus stellen dat een breed interdisciplinair team en duidelijk overleg zeker geen overbodigheid zijn, om tot een verder en beter begrip van deze technieken te komen. Verder onderzoek is eveneens aangewezen om te bepalen hoe CTC en cfDNA karakterisatie een rol kan spelen in het personaliseren van kankertherapie aan de hand van bepaalde moleculaire fenotypes. In deze thesis werd nog geen kostenanalyse gemaakt van deze technieken door een tekort aan correcte data. Gezien het kostenplaatje en de mogelijk grote impact op de patiënt, zou een kosten baten analyse een nuttige oefening zijn. Pagina | 44 Bibliografie Boeken 1. Lodish HF. Molecular cell biology. New York, NY: Freeman; 2008. 2. Robbins Stanley Leonard CRS, Kumar Vinay, Abbas Abul K., Fausto Nelson. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. Philadelphia, Pa: Elsevier Saunders; 2010. 8. Jain KK. Applications of Biotechnology in Oncology: Springer New York; 2014. 11. Pinkhof HEJJEv. Geneeskundig woordenboek. Houten: Bohn Stafleu van Loghum; 2006. 12. Kumar PJ, Clark ML. Clinical medicine: Philadelphia (Pa.) : Saunders; 2002. 41. Gahan PB. Circulating Nucleic Acids in Early Diagnosis, Prognosis and Treatment Monitoring: an Introduction. Golubnitschaja O, editor: Springer Netherlands; 2015. 476 p. 44. Lustberg M, Jatana KR, Zborowski M, Chalmers JJ. Emerging Technologies for CTC Detection Based on Depletion of Normal Cells. In: Ignatiadis M, Sotiriou C, Pantel K, editors. Minimal Residual Disease and Circulating Tumor Cells in Breast Cancer. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2012. p. 97-110. 49. Lorente D, Mateo J, de Bono JS. Molecular characterization and clinical utility of circulating tumor cells in the treatment of prostate cancer. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO American Society of Clinical Oncology Meeting. 2014/05/27 ed2014. p. e197-203. 79. Fan KCaZH. Introduction to Microfluidic. In: Vitha MF, editor. Circulating Tumor Cells: Isolation and Analysis. Chemical analysis: A series of Monographs on Analytical Chemistry and Its Applications: Wiley; 2016. p. 464. Scriptie 7. Mostert B. Circulation Tumor Cells: counts and characteristics 2012. Artikel uit een tijdschrift 4. Bork U, Grutzmann R, Rahbari NN, Scholch S, Distler M, Reissfelder C, et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World journal of gastroenterology. 2014;20(30):10296-304. 5. Wicha MS, Hayes DF. Circulating tumor cells: not all detected cells are bad and not all bad cells are detected. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2011;29(12):1508-11. 6. Kelly B, Madelyn SL, Samir D, Anand K, Rachelle L, Mohsen S-G, et al. Fluid phase biopsy for detection and characterization of circulating endothelial cells in myocardial infarction. Physical Biology. 2014;11(1):016002. 9. Ashworth T. A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death. Aust Med J. 1869;14(3):146-9. 10. Hyun K-A, Kim J, Gwak H, Jung H-I. Isolation and enrichment of circulating biomarkers for cancer screening, detection, and diagnostics. Analyst. 2016;141(2):382-92. Pagina | 45 13. Fernandez SV, Bingham C, Fittipaldi P, Austin L, Palazzo J, Palmer G, et al. TP53 mutations detected in circulating tumor cells present in the blood of metastatic triple negative breast cancer patients. Breast cancer research : BCR. 2014;16(5). 14. Hanahan D, Weinberg Robert A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 2011;144(5):646-74. 15. Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011;144(5):646-74. 16. Fidler IJ. The Biology of Human Cancer Metastasis. Acta oncologica. 1991;30(6):669-75. 17. Dawson MIS-J. Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA for Precision Medicine. Dream or Reality? Ann Oncol. 2014;25(12):2304-13. 18. Whiteside TL. Immune responses to malignancies. The Journal of allergy and clinical immunology. 2010;125(2 Suppl 2):S272-83. 19. Yoon HJ, Kozminsky M, Nagrath S. Emerging role of nanomaterials in circulating tumor cell isolation and analysis. ACS nano. 2014;8(3):1995-2017. 20. Whiteside TL. Immune suppression in cancer: effects on immune cells, mechanisms and future therapeutic intervention. Semin Cancer Biol. 2006;16(1):3-15. 21. Haber DA, Velculescu VE. Blood-Based Analyses of Cancer: Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA. Cancer Discovery. 2014;4(6):650-61. 22. Paterlini-Brechot P, Benali NL. Circulating tumor cells (CTC) detection: Clinical impact and future directions. Cancer Letters. 2007;253(2):180-204. 23. Harouaka R, Kang Z, Zheng SY, Cao L. Circulating tumor cells: advances in isolation and analysis, and challenges for clinical applications. Pharmacology & therapeutics. 2014;141(2):209-21. 24. Castle J, Shaker H, Morris K, Tugwood JD, Kirwan CC. The significance of circulating tumour cells in breast cancer: A review. The Breast. 2014;23(5):552-60. 25. Pesta M, Kulda V, Narsanska A, Fichtl J, Topolcan O. May CTC technologies promote better cancer management? The EPMA Journal. 2015;6(1). 26. Gradilone A, Raimondi C, Nicolazzo C, Petracca A, Gandini O, Vincenzi B, et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2011;15(5):1066-70. 27. Hoshino A, Costa-Silva B, Shen TL, Rodrigues G, Hashimoto A, Tesic Mark M, et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 2015;527(7578):329-35. 28. Engell HC. Cancer cells in the circulating blood; a clinical study on the occurrence of cancer cells in the peripheral blood and in venous blood draining the tumour area at operation. Acta Chir Scand Suppl. 1955;201 (1955):1– 70. 29. A.J. Leather NCG, G. Kocjan, F. Savage, C.S. Smales, W. Hu, P.B. Boulos, J.M. Northover, R.K. Phillips. Detection and enumeration of circulating tumour cells in colorectal cancer. Br J Surg. 1993;80 (1993):777–80. 30. Deneve E, Riethdorf S, Ramos J, Nocca D, Coffy A, Daures JP, et al. Capture of viable circulating tumor cells Pagina | 46 in the liver of colorectal cancer patients. Clinical chemistry. 2013;59(9):1384-92. 31. Yap TA, Lorente D, Omlin A, Olmos D, de Bono JS. Circulating tumor cells: a multifunctional biomarker. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2014;20(10):2553-68. 32. Cristofanilli M. CTC in Advanced Breast Cancer Prognosis, Monitoring, and Clinical Utility. In: Cote JR, Datar HR, editors. Circulating Tumor Cells. New York, NY: Springer New York; 2016. p. 257-70. 33. Gorges TM, Tinhofer I, Drosch M, Rose L, Zollner TM, Krahn T, et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC cancer. 2012;12:178. 34. Alix-Panabieres C, Pantel K. Clinical Applications of Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA as Liquid Biopsy. Cancer Discov. 2016. 35. Allard WJ, Terstappen LWMM. CCR 20th Anniversary Commentary: Paving the Way for Circulating Tumor Cells. Clinical Cancer Research. 2015;21(13):2883-5. 36. Kamel AM, Teama S, Fawzy A, Deftar M. Plasma DNA integrity index as a potential molecular diagnostic marker for breast cancer. Tumor Biology. 2015:1-8. 37. Schwarzenbach H, Hoon DS, Pantel K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nature reviews Cancer. 2011;11(6):426-37. 38. Zhang R, Shao F, Wu X, Ying K. Value of quantitative analysis of circulating cell free DNA as a screening tool for lung cancer: A meta-analysis. Lung Cancer. 2010;69(2):225-31. 39. Scher HI, Heller G, Molina A, Attard G, Danila DC, Jia X, et al. Circulating Tumor Cell Biomarker Panel As an Individual-Level Surrogate for Survival in Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer. Journal of Clinical Oncology. 2015. 40. Breitbach S, Tug S, Simon P. Circulating Cell-Free DNA. Sports Medicine. 2012;42(7):565-86. 42. Madhavan D, Wallwiener M, Bents K, Zucknick M, Nees J, Schott S, et al. Plasma DNA integrity as a biomarker for primary and metastatic breast cancer and potential marker for early diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 2014;146(1):163-74. 43. Heitzer E, Ulz P, Geigl JB. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clinical chemistry. 2015;61(1):112-23. 45. Earhart CM, Hughes CE, Gaster RS, Ooi CC, Wilson RJ, Zhou LY, et al. Isolation and mutational analysis of circulating tumor cells from lung cancer patients with magnetic sifters and biochips. Lab on a chip. 2014;14(1):78-88. 46. Ma Y, Hao S, Wang S, Zhao Y, Lim B, Lei M, et al. A Combinatory Strategy for Detection of Live CTCs Using Microfiltration and a New Telomerase-Selective Adenovirus. Molecular cancer therapeutics. 2015;14(3):835-43. 47. Pethig R. Review Article—Dielectrophoresis: Status of the theory, technology, and applications. Biomicrofluidics. 2010;4(2). 48. Gupta V, Jafferji I, Garza M, Melnikova VO, Hasegawa DK, Pethig R, et al. ApoStream(™), a new dielectrophoretic device for antibody independent isolation and recovery of viable cancer cells from blood. Biomicrofluidics. 2012;6(2). Pagina | 47 50. Rothwell DG, Smith N, Morris D, Leong HS, Li Y, Hollebecque A, et al. Genetic profiling of tumours using both circulating free DNA and circulating tumour cells isolated from the same preserved whole blood sample. Molecular Oncology. 2015. 51. Hansen C, Quake SR. Microfluidics in structural biology: smaller, faster… better. Current Opinion in Structural Biology. 2003;13(5):538-44. 52. Sequist LV, Nagrath S, Toner M, Haber DA, Lynch TJ. The CTC-chip: an exciting new tool to detect circulating tumor cells in lung cancer patients. Journal of thoracic oncology : official publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2009;4(3):281-3. 53. Nagrath S, Sequist LV, Maheswaran S, Bell DW, Irimia D, Ulkus L, et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 2007;450(7173):1235-9. 54. Lin PP. Integrated EpCAM-independent subtraction enrichment and iFISH strategies to detect and classify disseminated and circulating tumors cells. Clinical and Translational Medicine. 2015;4. 55. Marrinucci D, Bethel K, Kolatkar A, Luttgen M, Malchiodi M, Baehring F, et al. Fluid Biopsy in Patients with Metastatic Prostate, Pancreatic and Breast Cancers. Physical Biology. 2012;9(1):016003. 56. Shannon L. Werner RPG, Mark Landers, David T. Valenta, Matthew Schroeder, Stephanie B. Greene, Natalee Bales, Ryan Dittamore and Dena Marrinucci. Analytical Validation and Capabilities of the Epic CTC Platform: Enrichment-Free Circulating Tumour Cell Detection and Characterization. J Circ Biomark. 2015;4(3). 57. Ignatiadis M, Lee M, Jeffrey SS. Circulating Tumor Cells and Circulating Tumor DNA: Challenges and Opportunities on the Path to Clinical Utility. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2015;21(21):4786-800. 58. Bulfoni M, Gerratana L, Del Ben F, Marzinotto S, Sorrentino M, Turetta M, et al. In patients with metastatic breast cancer the identification of circulating tumor cells in epithelial-to-mesenchymal transition is associated with a poor prognosis. Breast cancer research : BCR. 2016;18(1):30. 59. Kirkizlar E, Zimmermann B, Constantin T, Swenerton R, Hoang B, Wayham N, et al. Detection of Clonal and Subclonal Copy-Number Variants in Cell-Free DNA from Patients with Breast Cancer Using a Massively Multiplexed PCR Methodology. Translational oncology. 2015;8(5):407-16. 60. Breitbach S, Tug S, Helmig S, Zahn D, Kubiak T, Michal M, et al. Direct Quantification of Cell-Free, Circulating DNA from Unpurified Plasma. PloS one. 2014;9(3). 62. Prentice RL. Surrogate endpoints in clinical trials: definition and operational criteria. Statistics in medicine. 1989;8(4):431-40. 63. Kaifi JT, Kunkel M, Das A, Harouaka RA, Dicker DT, Li G, et al. Circulating tumor cell isolation during resection of colorectal cancer lung and liver metastases: a prospective trial with different detection techniques. Cancer Biology & Therapy. 2015;16(5):699-708. 64. Andree KC, van Dalum G, Terstappen LW. Challenges in circulating tumor cell detection by the CellSearch system. Mol Oncol. 2015. 65. Aktas B MV, Tewes M, Zeitz J, Kasimir-Bauer S, Loehberg CR, et al. Comparison of estrogen and progesterone receptor status of circulating tumor cells and the primary tumor in metastatic breast cancer patients. Gynecol Oncol. 2011;122:356-60. Pagina | 48 66. Helissey C, Berger F, Cottu P, Dieras V, Mignot L, Servois V, et al. Circulating tumor cell thresholds and survival scores in advanced metastatic breast cancer: the observational step of the CirCe01 phase III trial. Cancer Lett. 2015;360(2):213-8. 67. Smerage JB, Barlow WE, Hortobagyi GN, Winer EP, Leyland-Jones B, Srkalovic G, et al. Circulating tumor cells and response to chemotherapy in metastatic breast cancer: SWOG S0500. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2014;32(31):3483-9. 68. Wulfing P, Borchard J, Buerger H, Heidl S, Zanker KS, Kiesel L, et al. HER2-positive circulating tumor cells indicate poor clinical outcome in stage I to III breast cancer patients. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 2006;12(6):1715-20. 69. Sastre J, Vidaurreta M, Gomez A, Rivera F, Massuti B, Lopez MR, et al. Prognostic value of the combination of circulating tumor cells plus KRAS in patients with metastatic colorectal cancer treated with chemotherapy plus bevacizumab. Clinical colorectal cancer. 2013;12(4):280-6. 71. Bidard FC, Mathiot C, Delaloge S, Brain E, Giachetti S, de Cremoux P, et al. Single circulating tumor cell detection and overall survival in nonmetastatic breast cancer. Ann Oncol. 2010;21(4):729-33. 72. Bidard F-C, Peeters DJ, Fehm T, Nolé F, Gisbert-Criado R, Mavroudis D, et al. Clinical validity of circulating tumour cells in patients with metastatic breast cancer: a pooled analysis of individual patient data. The Lancet Oncology. 2014;15(4):406-14. 73. Ge F, Zhang H, Wang DD, Li L, Lin PP. Enhanced detection and comprehensive in situ phenotypic characterization of circulating and disseminated heteroploid epithelial and glioma tumor cells. Oncotarget. 2015;6(29):27049-64. 74. Kirby BJ, Jodari M, Loftus MS, Gakhar G, Pratt ED, Chanel-Vos C, et al. Functional characterization of circulating tumor cells with a prostate-cancer-specific microfluidic device. PloS one. 2012;7(4):e35976. 75. Konigsberg R, Obermayr E, Bises G, Pfeiler G, Gneist M, Wrba F, et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 2011;50(5):700-10. 76. Zborowski M, Chalmers JJ. Rare Cell Separation and Analysis by Magnetic Sorting. Analytical chemistry. 2011;83(21):8050-6. 77. Nora Dickson M, Tsinberg P, Tang Z, Bischoff FZ, Wilson T, Leonard EF. Efficient capture of circulating tumor cells with a novel immunocytochemical microfluidic device. Biomicrofluidics. 2011;5(3):034119--15. 78. Antolovic D, Galindo L, Carstens A, Rahbari N, Büchler MW, Weitz J, et al. Heterogeneous detection of circulating tumor cells in patients with colorectal cancer by immunomagnetic enrichment using different EpCAMspecific antibodies. BMC Biotechnology. 2010;10(1):1-8. 81. Devonshire AS, Whale AS, Gutteridge A, Jones G, Cowen S, Foy CA, et al. Towards standardisation of cellfree DNA measurement in plasma: controls for extraction efficiency, fragment size bias and quantification. Analytical and bioanalytical chemistry. 2014;406(26):6499-512. 82. Mouliere F, Robert B, Arnau Peyrotte E, Del Rio M, Ychou M, Molina F, et al. High fragmentation characterizes tumour-derived circulating DNA. PloS one. 2011;6(9):e23418. 84. Freidin MB, Freydina DV, Leung M, Montero Fernandez A, Nicholson AG, Lim E. Circulating Tumor DNA Outperforms Circulating Tumor Cells for KRAS Mutation Detection in Thoracic Malignancies. Clinical chemistry. 2015;61(10):1299-304. Pagina | 49 85. Spindler KLG, Pallisgaard N, Andersen RF, Brandslund I, Jakobsen A. Circulating Free DNA as Biomarker and Source for Mutation Detection in Metastatic Colorectal Cancer. PloS one. 2015;10(4):e0108247. Elektronische bronnen 3. Belgium ADS-S. Kanker verantwoordelijk voor meer dan één overlijden op vier. 2016. 61. Ashford M. Promise of Liquid Biopsy as Clinical Tool Continues to Grow Among Cancer Researchers 2015. Available from: https://www.genomeweb.com/cancer/promise-liquid-biopsy-clinical-tool-continues-grow-amongcancer-researchers. 80. (KCE) FKvdG. Nieuwe generatie DNA-analyse-technieken brengt gepersonaliseerde kankerbehandeling in stroomversnelling. 2015. 83. Karow J. Foundation Medicine CSO Calls for Caution on Clinical Use of ctDNA Assays, CTC Test Development 2015. Available from: https://www.genomeweb.com/molecular-diagnostics/foundation-medicine-csocalls-caution-clinical-use-ctdna-assays-ctc-test. 86. Dempsey P. A head-to-head comparison of whole blood derived samples (cfDNA vs CTC DNA) for cancer research using next-generation sequencing. Cancer: Research, Discovery and Therapeutics 2015. Abstract 70. Genova C, Truini A, Rijavec E, Barletta G, Biello F, Dal Bello MG, et al. The role of circulating free DNA (cfDNA) and circulating tumor cells (CTC) in advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) patients receiving platinum-based chemotherapy (CHT). Journal of Clinical Oncology. 2015;33(15). Pagina | 50 APPENDIX A: AFKORTINGEN Ab: Antibody, antilichaam Ag: antigeen BC: breast cancer, borstkanker CAM: Cel Adhesie Molecule CD: cluster van differentiatie cDNA: complementair DNA CEC’s: circulerende endotheel cellen CK: cytokeratin CRC: colorectal cancer CRPC: castration resistant prostate cancer, castratie resitente prostaat kanker CTCs: circulerende tumor cellen DAPI 4’,6-diamidino-2-phenylindole dsRNA: double-stranded RNA DTCs: disseminated tumor cells EDTA: ethyleendiamine tetra-acetate EGFR: epithelial growth factor receptor EMT: Epithelial-to-Mesenchymal Transition EpCAM: Epithelial Cell Adhesion Molecule ER: estrogen receptor FDA: Food and Drug Administration FISH: fluorescence in situ hybridization FU: follow-up gDNA: genomic DNA HER2: human epidermal growth factor receptor 2 H(B)D healthy (blood) donor HR: hazard ratio ICC: immunocytochemistry Ig: immunoglobuline mBC: metatstatische borstkanker mCRC: metatstatische CRC miRNA: micro ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid I NA: nucleic Acid NPV: negative predictive value, negatief voorspellende waarde NSCLC: non-small cell lung cancer OS: overall survival PD: progressive disease PFS: progression-free survival, ziekteverloop zonder verdere progressie PR: progesteron receptor pre-miRNA: precursor miRNA pri-miRNA: primary miRNA qRT-PCR: quantitative reverse transcribed polymerase chain reaction RT: reverse transribed SCLC: small cell lung cancer TNBC: Triple-negative breast cancer =geen ER of PgR, en geen HER2 vs.: versus WB: whole blood, vol bloed II APPENDIX B: NOMENCLATUUR : (2),(7) -oma: benigne weefseltumor (uitz: lymphoma, melanoma) Adenoma: benigne tumor uit klierweefsel Benigne: zal niet spreiden, blijft gelokaliseerd, de microscopische en macroscopische karakteristieken zijn onschuldig. Dit betekent echter niet dat zij niet kunnen zorgen voor ernstige ziektebeelden. Carcinoma: maligne tumor van ectodermale of epidermale oorsprong. (epitheel of neuraal epitheel) Cysteadenoma: benigne cystische tumor Maligne: kan invaderen in naburige structuren en kan zorgen voor uitbreiding op afstand. Metastasering: uitzaaiing van tumorcellen die dan op een andere plaats dan de primaire tumor hun celdeling voortzetten. Neoplasma: nieuwe groei, nieuwvorming Sarcoma: maligne tumor uit mesenchymaal weefsel (spier, bloed, bindweefsel precursoren) III APPENDIX C: IMPACT FACTOREN Naam journaal IF World journal of gastro enterology 2,430 BMC Cancer 3,319 Gynecologic Oncology 3,687 Acta oncologica 3,710 International Journal Of Cancer 5,007 Cancer Letters 5,016 Lab on a Chip 6,115 Cancer and Metastasis Reviews 6,449 Annals Of Oncology 6,578 Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 7,000 Biochimica Et Biophysica Acta-Reviews On Cancer 7,584 Pharmacology And Therapeutics 7,745 Clinical Chemistry 7,768 Current Opinion In Genetics & Development 8,568 Journal Of Cell Biology 9,688 Cancer Discovery 15,929 Journal Of Clinical Oncology 17,879 Cancer Cell 23,893 Science 31,477 Cell 33,116 Nature Reviews Cancer 37,912 Tabel 4 Impact factoren van gebruikte journals IV
