Unravelling Fyn SH2`s snap-lock mechanism: identification and

Unravelling Fyn SH2's snap-lock mechanism:
identification and analysis through NMR
Radu HUCULECI
Promoters: Prof. Dr. Tom LENAERTS & Prof. Dr. Ir. Nico VAN NULAND
Om hun functie te vervullen moeten eiwitten, naast alle andere taken,
zorgen voor zowel een efficiënte communicatie tussen verschillende
gebieden in de cel als ook tussen twee verafgelegen locaties in hun eigen
structuur. Ook al zijn er al vele studies voorafgegaan die inzicht proberen
te verwerven in dergelijke langeafstandscommunicatie door een
eiwitstructuur, blijven studies die proberen te begrijpen hoe deze
communicatie juist werkt een belangrijke bijdrage leveren aan het
begrijpen van de mechanismen die aan de basis liggen van die
communicatie. Het doel van dit doctoraat is bij te dragen tot die inzichten
door na te gaan hoe entropische veranderingen dergelijke communicatie
mogelijk maken, daarbij gebruik makend van het SH2 domein van Fyn als
model.
Het menselijk eiwit Fyn, dat behoort tot de familie van Src kinases,
vervult een essentiële taak in de signalisatieprocessen in cellen, waarbij
een slechte werking van dit eiwit gerelateerd is aan verschillende ziektes,
waaronder kanker. Fyn bestaat uit verschillende domeinen, die en rol
spelen in de regulatie van zijn activiteit. De activiteit van Fyn wordt
bijvoorbeeld ingeperkt door een gecoördineerde binding van het SH2 en
het SH3 domein, wat in de literatuur beschreven staat als een “snap-lock”
mechanisme. Dit mechanisme gaat ervan uit dat er op een of andere
manier een signaal vanuit de bindingssite van het SH2 domein ervoor
zorgt dat het eiwit zijn inhiberende structuur aanneemt. Het doel is hier
om de verspreiding van dat signaal te ontdekken en te begrijpen.
Om dit doel te bereiken hebben we eerst op basis van NMR experimenten
de drie-dimensionele structuur van het Fyn SH2 domein bepaald, zowel in
zijn vrije als gebonden vorm. De peptide waarop we gefocust hebben is
het C-terminale deel van het volledige eiwit dat met het SH2 domein
gebonden is als Fyn niet actief is. We hebben geobserveerd dat in het
geval van deze peptide voornamelijk de affiniteitssite, waar de
phosphotyrosine bindt, gebruikt wordt als vast ankerpunt. De effecten van
die bindingen zijn op het niveau van de ruggengraat van het eiwit beperkt
tot die flexibele gebieden dicht bij de affiniteitssite. Er worden ook subtiele
1/2
correlaties tussen beide bindingssites geobserveerd, wat erop kan wijzen
dat beide sites samenwerken in het bindingsproces.
Om de communicatiemechanismen te ontrafelen die een rol spelen in de
deactivatie van Fyn en om de exacte mechanismen bloot te leggen die
zich afspelen in de structuur van het SH2 domein, hebben we in dit
doctoraat een gedetailleerde analyse gemaakt van de veranderingen in de
zijketen dynamiek in dit domein. Methyl zijketen relaxatie experimenten
tonen de bewegingsvrijheid van verschillende zijketens in het domein die
methylgroepen bevatten. Onze experimenten tonen duidelijk dat de
methyls zowel dicht bij de affiniteitssite als op grote afstand van beide
bindingssites (meer dan 18 Å) effecten ondervinden. Doordat het
experimentele werk enkel beperkt is tot de aminozuren die een
methylgroep bevatten, werden de experimentele resultaten op basis van
een predictieve methode verder uitgebreid naar de andere aminozuren in
het eiwit. Op die manier werd op een experimenteel ondersteunde manier
een volledig beeld gecreëerd van de dynamische veranderingen die door
de binding van een peptide door de structuur worden gestuurd. Specifiek
werden er belangrijke veranderingen geobserveerd in het gebied waar het
SH2 domein geconnecteerd is aan het SH3 domein, wat ook het gebied is
dat zorgt voor de “snap-lock” configuratie die leidt tot de deactivatie van
Fyn. Onze analyse suggereert dus dat de bindingsinformatie op een
entropische manier doorgestuurd wordt van de bindingssite door het
centrum van het eiwit tot een functioneel belangrijke en sterk
geconserveerd gebied aan de andere kant van de SH2 structuur. Deze
dynamische verandering zorgen voor het openen en sluiten van het slot,
waarbij we dus voor de eerst keer een hypothese verstrekken hoe dit
mechanisme juist kan werken.
Ter afsluiting zijn we ervan overtuigd dat door onze combinatie tussen
experimentele en computationele methoden we een interessant model
geven dat zou kunnen verklaren hoe het SH2 domein verantwoordelijke is
voor de deactivatie van het Fyn kinase eiwit, wat op zich ook een
belangrijk inzicht geeft voor gans de familie van dit soort eiwitten. Op
termijn zullen dergelijke analyses een belangrijke bijdrage kunnen leveren
tot het ontwerpen van medicijnen die gebruiken maken van deze
dynamische informatie om de functie van die eiwitten te reguleren.
2/2