HPLC bepaling van theophyline

Sp 8.13 H.P.L.C. (Hoge Prestatie Vloeistof Chromatografie)
Samenvatting:
Bij dit practicum is het Theophyline gehalte bepaald in een Astma Tablet. Het gehalte
Theophyline is bepaald op 200,3 mg met een standaard deviatie van 2,5. De precisie kan beter
maar de juistheid is wel goed bepaald want er behoort zich 200 mg Theophyline te vinden in
het tablet. Kwalitatief is er geen salicylzuur aangetroffen.
De invloed van de flow op het chromatogram is:
Bij een hogere flow worden de pieken minder breed en daarmee worden de oppervlakten van
de pieken ook kleiner. Ook worden de retentietijden korter.
Bij een lagere flow worden de pieken breder en daarmee worden de oppervlakten van de
pieken groter. De retentietijden worden langer.
Inleiding & Theorie .
Bij High Performance Liquid Chromatografie (HPLC) is de mobiele fase een vloeistof. De
stationaire fase bestaat uit een gepakte kolom met kleine korrels. De druk die nodig is om de
weerstand van de pakking te overbruggen wordt geleverd door een pomp.
Bij dit experiment wordt theophyline in een astmamedicijn bepaald. Dit medicijn bevat verder
ook werkzame stoffen als: ephedrine, phonobarbital en kaliumjodide. Ook kunnen
magnesiumstearaat, zetmeel, natriumthiosulfaat en kalk aanwezig zijn. Het theophyline is
soms aanwezig in de vorm van een anhydride of als een dubbelzout met calciumsalicylaat.
In dit experiment is het mogelijk om het theophyline zowel kwalitatief als kwantitatief te
bepalen. De kwalitatieve bepaling vindt plaats door te kijken naar de plaats van de piek op het
chromatogram van de standaard en het monster. De kwantitatieve bepaling vindt plaats door
een ijklijn op te stellen. Het piekoppervlak is namelijk recht evenredig met de concentratie
van de opgebrachte stof. Voor het berekenen van het piekoppervlak wordt de volgende
formule gebruikt:
Oppervlak= 1,0632 * piekhoogte * piekbreedte op halve hoogte. (A= 1,0632 * H * Wh1/2 ).
Er wordt gebruik gemaakt van een UV/VIS-detector. Deze detector is makkelijk te bedienen,
is betrouwbaar, heeft een hoge gevoeligheid met een breed toepassingsgebied en is
ongevoelig voor variaties in de temperatuur en het debiet.
Naast theophyline wordt ook het salicylzuurgehalte in het monster bepaald (zowel kwalitatief
als kwantitatief). Een overmaat salicylzuur is schadelijk voor de gezondheid.
De kolom:
Er wordt gebruik gemaakt van een reversed phase kolom. Met als gevolg dat de stationaire
fase minder polair is als de mobiele fase. De apolaire stationaire fase is chemisch gebonden
aan een poreuze dragerkorrel. Als dragerkorrel wordt vaak silicagel gebruikt, dit bezit een
zuur karakter waardoor basische componenten sterke retentie ondervinden. We maken bij
deze kolom gebruik van alkaan C-18. De koppeling vindt plaats via dezelfde groepen die
verantwoordelijk zijn voor de activiteit.
Tijdens de scheiding zal het water de meest selectieve plaatsen bezetten op de kolom
waardoor de componenten (i.d.g. de matig polaire theophyline) de minst actieve plekken
bezetten. Bij de verdeling van een stof tussen de gebonden stationaire fase en de mobiele fase
spelen de volgende processen een rol:
 Van der Waalskrachten
 dipoolinteracties
 grensvlakspanning
 oplosbaarheidproduct
De stof die het slechtste bindt aan de stationaire fase zal er dus het eerst uitkomen. Doordat de
stof matig polair en hydrofiel (-NH-groep) is zal de verdeling/scheiding het meest plaats
vinden volgens het adsorptie proces. Hierbij wordt het component in het grensvlak tussen de
mobiele fase en de stationaire fase geadsorbeerd.
Doel:
-
kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van theophyline in astmatabletten
bepaling van de invloed van de flow op het chromatogram
Voorschrift:
Bereiding eluens (2 liter):
- 380 ml acetonnitril
- 1600 ml HPLC-water
- 20 ml azijnzuur
- 100 l triëthylamine (maatpipet)
Laat eluens eerst ontluchten in een ultrasoon bad, ongeveer 15 minuten.
Theophyline standaard:
- Los 15 mg op in eluens en vul aan tot 100 ml (0,15 mg/ml)
- Pipetteer hiervan 1,0; 2,0; 3,0 en 4,0 ml en vul aan tot 10 ml met eluens
Salicylzuurstandaard:
- Los 50 mg op in 100 ml eluens (0,5 mg/ml)
Als er salicylzuur in de astmatabletten aanwezig blijkt te zijn, maak dan een ijklijn als van de
theophyline standaard hierboven beschreven.
Instellingen H.P.L.C.:
- Kolom: C18 reversed phase 5 m (apolaire pakking met meer polair eluens is reversed
phase)
- Injectieloop: 20 l (inspuiten: apolaire componenten grotere retentie dan polaire
componenten)
- Detectie: 254 nm
- Mobiele fase: eluens; 19% acetonitril, 80% water en 1% azijnzuur met 2 mmol
triëthylamine per liter
- Flow: 1,0 ml/min, 1,5 ml/min en 0,5 ml/min
- Papiersnelheid: 0,2 mm/sec
- Attenuator: 0,08 (de 2 hoogste standaarden 0,16)
- Bereik recorder (range): 0,1 V (bij gebrek aan scheiding op 1,0 mV)
-
Injecteer de standaarden in duplo en bepaal de optimale omstandigheden
Monsterbereiding:
-
Weeg een astma tablet
Maal deze fijn
Weeg de helt van het gewogen gewicht van de hele tablet af in gemalen tablet ( 100 mg
theophyline) en los dit op in 100 ml eluens
Filtreer de oplossing (geen vaste deeltjes meer erin)
Verdun 10 en 20 keer ( 1ml en 0,5 ml in 10 ml oplossen)
Injecteer monsters, triplo
Herhaal dit bij een flow van 1,5 en 0,5 ml/min
-
Zet het apparaat op lage flow (0,1) en injecteer 100% methanol
Meetresultaten/Uitwerking:
Afgewogen:
Astma tablet: 103.4 mg.
Theophyline: 15.4 mg.
Salicylzuur: 50.8 mg.
Flow: 0.5 ml/min, Retentietijd 295 seconden.
TABEL:1
Theophyline standaard 1 ml
Hoogte (cm)
Breedte (cm)
Range 0.16 (15.4 mg/l)
(1/2 hoogte)
Meting 1
3.9
0.6
Meting 2
3.8
0.6
Gemiddeld
Theophyline standaard 2 ml
Hoogte (cm)
Breedte (cm)
Range 0.16 (30.8 mg/l)
(1/2 hoogte)
Meting 1
7.5
0.6
Meting 2
7.5
0.6
Gemiddeld
Theophyline standaard 3 ml
Hoogte (cm)
Breedte (cm)
Range 0.16 (46.2 mg/l)
(1/2 hoogte)
Meting 1
11.2
0.6
Meting 2
10.9
0.6
Gemiddeld
Theophyline standaard 4 ml
Hoogte (cm)
Breedte (cm)
Range 0.16 (61.6 mg/l)
(1/2 hoogte)
Meting 1
15.0
0.6
Meting 2
15.0
0.6
Gemiddeld
Deze waarden zijn uitgezet in de grafiek op bijlage 1. y=4.722x+0.125
Werkwaarden / Uitkomsten
waarde bx
sbx
BI (95%)
b0
0,125 0,205997573 0,886336636
b1
4,722 0,075219678 0,323644379
Oppervlakte
(berekend) (cm2)
4.98
4.85
4.91
Oppervlakte
(berekend) (cm2)
9.57
9.57
9.57
Oppervlakte
(berekend) (cm2)
14.29
13.91
14.10
Oppervlakte
(berekend) (cm2)
19.14
19.14
19.14
Monster 0.5 ml
Range 0.16
Meting 1
Meting 2
Gemiddeld
Monster 1.0 ml
Range 0.16
Meting 1
Meting 2
Hoogte (cm)
6.0
6.0
Hoogte (cm)
12.1
12.2
Breedte (cm)
(1/2 hoogte)
0.6
0.6
TABEL:2
Oppervlakte
(berekend) (cm2)
7.65
7.65
Breedte (cm)
(1/2 hoogte)
0.6
0.6
7.65
Oppervlakte
(berekend) (cm2)
15.44
15.44
Gemiddeld
15.44
De concentraties van de monsters zijn hierna verkregen met de formule y=4,722x+0,125 die
gegeven is bij de grafiek bijlage:
Monster 0.5 ml: 24.49 mg/l.
Monster 1.0 ml: 49.90 mg/l.
Neem ik hierna de verdunningen mee dan kom ik op:
Monster 0.5 ml: 48.98 mg theophyline in 0.1034 g tablet.
Monster 1.0 ml: 49.90 mg theophyline in 0.1034 g tablet.
Het totaalgewicht van de tablet was 0.4190 g. (0.4190/0.1034= 4.05).
Dus:
Monster 0.5 ml: 198.5 mg per tablet.
Monster 1.0 ml: 202.1 mg per tablet.
Gem. Monster 200.3 mg per tablet =2.5
Flow: 1.0 ml/min, Retentietijd 150 seconden.
Range 0.16
Hoogte (cm)
Meting 1 M.0.5
Meting 2 M 1.0
Meting 3 st. 1.0
Meting 4 st. 2.0
Meting 5 st. 3.0
Meting 6 st. 4.0
Meting 7 st. 4.0
4.4
8.8
2.9
5.2
8.7
11.8
11.8
Flow: 1.5 ml/min, Retentietijd 100 seconden.
Hoogte (cm)
Breedte (cm)
(1/2 hoogte)
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
TABEL:3A
Oppervlakte
(berekend) (cm2)
3.74
7.48
2.47
4.42
7.40
10.04
10.04
Breedte (cm)
TABEL:3B
Oppervlakte
Range 0.16
Meting 1 M. 0.5
Meting 2 M. 1.0
3.2
6.4
(1/2 hoogte)
0.4
0.4
(berekend) (cm2)
2.72
5.44
De invloed van de flow op het chromatogram is:
Bij een hogere flow worden de pieken minder breed en daarmee worden de oppervlakten van
de pieken ook kleiner. Ook worden de retentietijden korter.
Bij een lagere flow worden de pieken breder en daarmee worden de oppervlakten van de
pieken groter. De retentietijden worden langer.
Er is geen salicylzuur gevonden in het monster.
Voor visualisatie van de uitkomsten zie ook de bijgevoegde chromatogrammen.
Conclusie:
De bepaalde hoeveelheid theophyline is 200.3 mg in een tablet van 419.0 mg. Dit komt
overeen met de hoeveelheid van 200 mg theophyline die er in zou moeten zitten. Dus deze
bepaling is juist uitgevoerd.
Er is geen salicylzuur gevonden in het monster.
Bij een hogere flow worden de pieken minder breed en daarmee worden de oppervlakten van
de pieken ook kleiner. Ook worden de retentietijden korter.
Bij een lagere flow worden de pieken breder en daarmee worden de oppervlakten van de
pieken groter. De retentietijden worden langer.
Suggesties ter verbetering.
-
Ontluchten kan ook heel goed met helium, dit moet alleen wat langer staan (ong. 1 uur).
Als er via het bijgevoegde voorschrift wordt gewerkt, dan zal deze proef verder geen
moeilijkheden op leveren.
Vragen.
1. Verklaar het effect van de flow op de scheiding van de componenten. (resolutiefactoren
berekenen).
2. Een piek van theophyline heeft een oppervlak van 6,0 cm2. De concentratie is 15
mg/100ml en er werd 20 l ingespoten. De range van de detector is ingesteld op 0,16, de
papiersnelheid van de recorder is 0,2 cm/s en de recorder range bedraagt 10 mV over een
papierbreedte van 10 cm (is dus 1 mV/cm). Een monsteroplossing werd bij de volgende
instellingen geïnjecteerd: papiersnelheid 0,2 cm/s, recorder range 1mV over een
papierbreedte van 10 cm en de detector range moest op 0,02 ingesteld worden. Het
gevonden piekoppervlak was 1,2 cm2. Bereken de concentratie van het monster.
Antwoorden:
1. Flow wordt gehalveerd, dus de retentietijd verdubbeld maar de Wh1/2 wordt niet
verdubbeld. Rs = verschil in retentietijden
½ (Wa + W b)
Als de flow halveert neemt de teller meer toe dan de noemer, de resolutiefactor wordt groter
en de scheiding zal beter gaan.
2. 0,150 g/l * 20*10-6 l = 0,16 * 1 mV/cm * 6,0 cm2
x
0,02 * 0,1 mV/cm * 1,2 cm2
-6
x= 0,150 * 20*10 * 0,02 * 0,1 * 1,2
0,16 * 1 * 6,0
x= 7,5*10-9 gram/l