Profielwerkstuk Neuroblastoom Anne Hoffman

Anne Hoffman - 6V1
Annemieke Wicherink
Alkwin Kollege, Uithoorn
Profielwerkstuk, 03-02-2015
Inhoud
I
Voorwoord....................................................................................................................................... 3
II
Wat is neuroblastoom? ................................................................................................................... 4
I)
Wat is kanker en hoe ontstaat het? ........................................................................................ 4
II)
Hoe en waar ontstaat neuroblastoom? .................................................................................. 8
III)
Symptomen, diagnose en stageringssysteem van neuroblastoom....................................... 10
III
Wat zijn de huidige behandelingen van neuroblastoom? ............................................................ 13
IV
Wat houdt de nieuwe behandeling op basis van gentherapie in? ................................................ 16
V
Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in? ............................................... 19
I)
Het praktisch onderzoek ....................................................................................................... 24
Onderzoeksvraag ......................................................................................................... 24
Hypothese .................................................................................................................... 24
Materiaal, methode en verwerking ............................................................................. 24
Resultaten .................................................................................................................... 27
Conclusie ...................................................................................................................... 28
Discussie ...................................................................................................................... 28
VI
Conclusie ....................................................................................................................................... 30
VII Discussie ........................................................................................................................................ 31
VIII Reflectie, evaluatie en verantwoording ........................................................................................ 33
IX
Geciteerde werken ........................................................................................................................ 35
X
Bijlagen .......................................................................................................................................... 38
XI
Begrippenlijst................................................................................................................................. 42
XII Logboek ......................................................................................................................................... 44
XIII Eindnoten ...................................................................................................................................... 48
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Voorwoord
Dokter. Dat is wat ik, zo lang als ik mij kan herinneren, wil worden als ik ‘groot’ ben. Zieke mensen
beter maken en in zo’n witte jas het ziekenhuis door lopen leken mij geweldig. Naarmate ik ouder
werd, besefte ik mij dat ‘beter maken’ niet zo simpel was als het altijd leek. Er zijn ontzettend veel
verschillende ziektes waaraan jaarlijks een grote hoeveelheid mensen overlijdt, maar dit stimuleerde
mij juist nog meer om arts te worden. Door mijn motivatie stond het al jaren vast dat ik geneeskunde
zou gaan studeren, en wel in Amsterdam. Voor mijn profielwerkstuk besloot ik dan ook om de
medische kant op te gaan. Het moest voldoen aan één eis: het moet een kinderziekte zijn, omdat ik
dat ontzettend interessant vind. Na lang zoeken zag ik op internet een filmpje uit Pauw & Witteman
waarin onderzoeker Jan Molenaar zijn verhaal deed over een doorbraak in het onderzoek naar
neuroblastoom, een kinderkanker. Vanaf toen begon ik mij in te lezen en werd ik steeds
gemotiveerder om hierover te schrijven, maar wat ik nu precies wilde onderzoeken was nog
onduidelijk. Totdat ik toevallig op een studievoorlichtingsavond een biologiestudente tegenkwam,
Marieke Bak. Zij vertelde mij dat zij op dat moment stage liep bij Jan Molenaar en dus in de wereld
zat van het onderzoek naar neuroblastoom. Van het één kwam het ander en op een gegeven
moment zat ik in het Academisch Medisch Centrum (AMC) te Amsterdam op het lab onderzoek te
doen naar een nieuwe behandeling van neuroblastoom. Geweldig!
Ik wil u graag meenemen op mijn ontdekkingstocht en u zo veel mogelijk vertellen over deze mogelijk
nieuwe behandeling van neuroblastoom, een zeer agressieve vorm van kanker bij jonge kinderen. Ik
zal u een beeld proberen te geven van de eventuele behandeling en de gevolgen die dit zouden
kunnen hebben op de genezing van neuroblastoom. De hoofdvraag luidt dan ook:
Wat zou de nieuwe behandeling van neuroblastoom op basis van gentherapie kunnen betekenen
voor de genezing van kinderen met deze ziekte?
Het mogelijke antwoord op deze vraag is een veelbelovende hypothese. Omdat deze behandeling
zeer specifiek is en belovende resultaten geeft in vitro, zou dit voor neuroblastoompatiënten
betekenen dat zij over een paar jaar effectiever behandeld kunnen worden.
In dit profielwerkstuk zal ik u meenemen door de wereld van neuroblastoom en de wereld van het
onderzoek hiernaar. Het is erg belangrijk dat er onderzoek kan plaatsvinden naar ziektes als deze
omdat er geen behandeling is of omdat de huidige behandeling weinig resultaat oplevert. Dus
misschien ziet u mij over twintig jaar ook wel in Pauw & Witteman, waar ik vertel over nieuwe
behandelingen van ziektes waar ik onderzoek naar heb gedaan. Dat zou mooi zijn.
De voorpagina is gemaakt met veel dank aan alle kinderen/ouders/familieleden/vrienden die foto’s
van deze prachtige kinderen op het Internet hebben geplaatst.
Hoofdstuk: Voorwoord
I
3
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Wat is neuroblastoom?
I) Wat is kanker en hoe ontstaat het?
Men loopt, staat, praat, eet, slaapt en leert. Kortom: men leeft. Zonder ons daarvan bewust te zijn, is
ons lichaam druk bezig met allerlei processen om ons in leven te houden. Het gaat vrijwel altijd goed,
maar opeens is daar dan een ontregeld stukje DNA dat ons uiteindelijk fataal kan zijn: kanker. Kanker
wordt gebruikt als scheldwoord, maar is voor de meeste mensen een stukje verdriet. Verdriet over
zichzelf, over familieleden of vrienden. Het is een complexe ziekte die bij iedere patiënt anders is en
die bij ruim honderdduizend mensen in Nederland per jaar ontstaat. Hoe komt het dat mensen deze
ziekte krijgen? En waarom is deze zo dodelijk?
Genetische code
Hetgene dat ons maakt zoals wij zijn, is voor een groot deel ons DNA. Hierin ligt onze genetische code
opgeslagen: hoe wij eruit zien, wie onze vader of moeder is en – misschien wel het belangrijkste – of
wij vatbaar zijn voor bepaalde ziektes, zoals kanker.
In 1953 ontdekten James D. Watson en Francis Crick het dubbele-helix model dat bestaat uit DNA
(desoxyribonucleïnezuur) (Figuur 1). Het bleek dat dit DNA de basis van ons leven is. DNA bevindt
zich in de celkern en is een polymeer van nucleotiden welke bestaan uit een desoxyribose, een
fosfaatgroep en een stikstofbase. Juist dit laatste compartiment van DNA zorgt voor de variatie in ons
lichaam. De verschillende stikstofbasen die in onze genen kunnen zitten zijn adenine, thymine,
guanine en cytosine. Deze worden respectievelijk aangegeven met een A, T, G en C. Adenine en
thymine zijn, net zoals guanine en cytosine, complementaire basen. Ze kunnen dus alleen maar
tegenover elkaar zitten in de dubbele helix van het DNA. Drie van deze nucleotiden vormen een
aminozuur, de basis voor een eiwit. Een gen is een opeenvolgende reeks van nucleotiden die met
circa 5000 andere genen verspreid liggen over de menselijke chromosomen (Figuur 2).
Figuur 1: James D. Watson en Francis
Crick met het helixmodel.
Figuur 2: de 48 (twee keer 22) menselijke chromosomen. Deze zijn
van een vrouw
Deze genen coderen voor eiwitten. Eiwitten zijn de bouwstenen van ons lichaam en zorgen ervoor
dat alle processen werken en blijven werken. Door middel van transcriptie wordt het DNA
overgeschreven naar RNA (ribonucleïnezuur). Door middel van translatie wordt dit RNA weer
Hoofdstuk: Wat is neuroblastoom?
II
4
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
vertaald naar aminozuren die met elkaar een
eiwit vormen (Figuur 3). Een aminozuur
wordt vertaald vanaf een codon, drie
nucleotiden naast elkaar.
Uit elke celdeling ontstaan twee nieuwe
cellen met exact hetzelfde DNA erin die op
hun beurt zich weer gaan delen. Er vinden
per dag miljoenen celdelingen plaats waarbij
het DNA dus ook miljoenen keren wordt
gekopieerd. Bij deze miljoenen delingen kunt
u zich voorstellen dat er tijdens de Figuur 3: van transcriptie van DNA naar translatie van RNA en
de vorming van een eiwit.
transcriptie een fout kan optreden doordat er
een verkeerde nucleotide is ingebouwd, gedupliceerd, geëlimineerd of vervangen. Deze mutaties
komen bij elke deling voor en zijn niet te vermijden. Meestal hebben ze geen groots effect op de cel,
maar in sommige gevallen wel. Wanneer er bijvoorbeeld te vroeg een stopcodon wordt ingevoegd,
zal het eiwit uit een kortere aminozuurvolgorde bestaan en eventueel een andere functie hebben. Er
kan ook een verkeerd aminozuur worden ingevoegd door een substitutie van een base. Als dit een
cruciaal aminozuur betreft, zal dit grote gevolgen hebben voor het eiwit en de cel.
Behalve dat er ‘kleine’ mutaties plaatsvinden, kunnen ook chromosomen muteren. Bij
chromosoommutaties kan er uitwisseling van DNA tussen twee chromosomen plaatsvinden
(translocatie). Daarnaast is inversie van DNA-segmenten en insertie van vreemd DNA ook mogelijk.
Deze chromosoommutaties komen alleen niet tot uiting als ze geen cruciale genen stilleggen of als ze
in het gepaarde chromosoom nog een werkend gen hebben.
Tumoren
Belangrijke
oncogenen
zijn
groeifactoren,
transmembraanreceptoren,
intracellulaire
signaaltransductie en kerneiwitten. Bij een mutatie in de genen van groeifactoren en
transmembraanreceptoren kan een cel teveel signalen ontvangen om zich te gaan delen; er ontstaat
ongeremde celgroei. Intracellulaire signaaltransductie eiwitten geven de groeisignalen van de
receptoren door aan de celkern. Wanneer het gen voor deze eiwitten is gemuteerd, kan ook in dit
geval de celkern teveel signalen tot deling ontvangen. De kerneiwitten zijn betrokken bij de
transcriptie en hebben bij mutatie een stimulerende invloed op de ontwikkeling van de cel.
De tumorsurpressorgenen zijn antagonisten van de oncogenen en willen juist celgroei voorkomen
door eiwitten te transleren die remmende signalen aan de kern geven. Om dit gen te onderdrukken,
zijn er mutaties in beide kopieën van de genen nodig; dus zowel in de kopie van de moeder als de
kopie van de vader. Dit in tegenstelling tot de oncogenen die maar één mutatie nodig hebben om te
ontsporen.
Hoofdstuk: Wat is neuroblastoom?
Bij het ontstaan van een tumor staan er twee genen op de voorgrond. Zij hebben een functie in de
regulatie van de celcyclus oftewel de celgroei en -deling. De twee belangrijke genen zijn oncogenen
en tumorsurpressorgenen welke respectievelijk de celcyclus stimuleren en remmen. Een paar
mutaties in dit soort genen kan leiden tot gestimuleerde celgroei en -deling, een kenmerk van een
tumor.
5
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Bovendien kunnen in kankercellen DNA-reparatiegenen zijn gemuteerd. Hierdoor worden fouten in
de genen slecht of niet verholpen, waardoor andere gemuteerde genen zoals oncogenen of
tumorsurpressorgenen telkens bij elke celdeling worden overgedragen. Zo ontstaan er continu cellen
die zich ongeremd blijven delen.
Voor deze ontspoorde cellen heeft het lichaam een mooi systeem: apoptose. Apoptose is
geprogrammeerde celdood die wordt veroorzaakt door bijvoorbeeld beschadiging aan het DNA. Het
p53-gen zorgt ervoor dat het apoptosemechanisme in gang wordt gezet (zie hoofdstuk 0). De
tumorcel kan dit gen inactiveren met als desastreus gevolg dat de cel zich niet meer kan vernietigen
bij DNA-schade. Bovendien kan een tumorcel een verhoogde productie hebben van eiwitten die
apoptose tegengaan (anti-apoptotische eiwitten) en zullen zij het maximaal mogelijk aantal
celdelingen van een cel vermijden.
Bovendien maakt de cel gebruik van de zogeheten genetische klok, die de cel laat stoppen met delen
wanneer deze haar maximaal aantal delingen – ongeveer vijftig tot zestig – heeft bereikt, dit wordt
het Hayflick-limiet genoemd. Deze biologische klok bestaat uit de telomeren. Telomeren zijn
uiteinden van chromosomen die na elke celdeling een klein stukje korter worden (Figuur 4 en Figuur
5). Op een gegeven moment zijn deze telomeren te klein, zal het chromosoom uit elkaar vallen en
wordt de apoptose geactiveerd in de cel. Het enzym telomerase zorgt ervoor dat deze telomeren na
elke celdeling weer hun oorspronkelijke lengte terugkrijgen; zo kan de cel continu blijven delen. In de
meeste cellen is dit enzym gedeactiveerd, maar in snel delende cellen zoals geslachtscellen en
stamcellen is dit enzym juist geactiveerd. Ook in de tumorcellen staat het gen voor telomerase
geactiveerd zodat tumorcellen deze ongeremd kunnen blijven delen.
Figuur 5: chromosomen met hun (oplichtende)
telomeren.
In het algemeen geldt dat er meer dan vijf mutaties in verschillende celcyclusregulerende genen
binnen één cel moeten zijn om de cel tot buitensporig veel delen aan te zetten. Bij de mutaties zoals
bovengenoemde is er dus een kans dat er een hoop cellen ontstaan die zich erg snel delen. Zij
vormen een bol van ‘slechte cellen’ en trekken bloedvaten aan zodat de cellen worden voorzien van
voedingsstoffen en dus energie. Op deze manier kan de tumor zich blijven ontwikkelen.
Hoofdstuk: Wat is neuroblastoom?
Figuur 4: het verkorten van de telomeren na verscheidene
celdelingen.
6
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Kanker
Het is belangrijk om een onderscheid te maken tussen een
goedaardige tumor en een kwaadaardige tumor. Beide tumoren
bestaan uit cellen die zich ongeremd blijven delen, maar ze
verschillen in het verder ontwikkelen van de tumor. De
goedaardige (benigne) tumor – zoals een wrat – zal geen
andere weefsels doordringen en zich verspreiden naar andere
delen van het lichaam. Dit in tegenstelling tot de kwaadaardige
(maligne) tumor welke zich infiltreert in andere weefsels (een
invasieve tumor) en uitzaait naar andere delen van het lichaam;
Figuur 6: Mammogram (röntgenfoto van
metastase. Bij kwaadaardige tumoren zijn alle cellen op zo’n de borsten) waarbij de witte vlek
manier beschadigd, dat er geen controle meer gehouden kan hoogstwaarschijnlijk borstkanker is (AZ
worden over de groei en ontwikkeling. Hierdoor kunnen de Sint-Blasius).
kankercellen losraken van de tumor en ergens anders een secundaire tumor vormen. Een
kwaadaardige tumor wordt ook wel kanker genoemd.
Kanker bestaat dus uit een klomp van zeer snel delende cellen die zich kunnen metasteren en
infiltreren in omliggende weefsels. De tumor kan zichtbaar worden gemaakt door onder andere een
röntgenfoto, zoals te zien is in Figuur 6. Deze cellen hebben allerlei mutaties in de genen waardoor
de cel continu wordt gestimuleerd om te blijven delen en waardoor apoptose wordt gehinderd. Deze
mutaties ontstaan per toeval door het vele kopiëren van het DNA tijdens de celdelingen. Ook kan er
al een aantal mutaties overgedragen zijn door (één van) de ouders die vervolgens samen met andere
mutaties voor een tumor zorgen in het kind.
Figuur 7: Incidentie van kanker bij mannen en vrouwen in 2013 in Nederland, invasieve tumoren (Integraal kankercentrum
Nederland).
Hoofdstuk: Wat is neuroblastoom?
Kanker bij volwassenen ontstaat vaak door overgeërfde defecte genen of door eigen mutaties, terwijl
men denkt dat de meeste soorten kinderkanker ontstaan door een opeenstapeling van mutaties
tijdens de deling van embryonale cellen. Kinderen hebben namelijk minder celdelingen achter de rug
dan volwassenen; een kans op een spontane mutatie is dan ook erg klein. Kinderkanker kan ook bijna
nooit – in tegenstelling tot volwassen kanker – ontstaan door invloeden van buitenaf zoals roken,
asbest en alcohol. Deze omgevingsinvloeden worden carcinogene invloeden genoemd. Vandaar dat
er een relatief lage incidentie is van kinderkanker als je het vergelijkt met de incidentie van kanker bij
volwassenen (Figuur 7).
7
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
II) Hoe en waar ontstaat neuroblastoom?
Neuroblastoom komt van de woorden neuron (zenuw) en blastoom (nieuwvorming van onrijpe
cellen). Het neuroblastoom is in 1864 door Rudolf Virchow als eerste beschreven1. Sindsdien is men
gaan zoeken naar de oorzaak van neuroblastoom. Synoniemen van neuroblastoom zijn Ziekte van
Hutchinson en sympathicoblastoom.
Incidentie
Neuroblastoom is naast de hersentumor de meest voorkomende solide tumor bij kinderen. Onder
solide tumoren vallen alle tumoren, behalve leukemie (bloedkanker). Tot veertien jaar oud is de kans
op een neuroblastoom 0,011%, na deze leeftijd is het krijgen van een neuroblastoom zeer zeldzaam2.
Elk jaar krijgen gemiddeld 25 kinderen in Nederland een neuroblastoom, waarvan de meesten onder
de zes jaar oud zijn3, dit staat gelijk aan ongeveer één op de honderdduizend kinderen. Het is een
bijzonder soort kanker door haar bijzondere kenmerken. Zo kan een neuroblastoom spontaan
verdwijnen zonder dat men daar een verklaring voor heeft en is deze kanker bij kinderen jonger dan
één jaar veel slechter te behandelen dan neuroblastomen bij kinderen ouder dan deze leeftijd.
Het ontstaan
James Homer Wright, een Amerikaanse patholoog, ontdekte in 1910 een gelijkenis tussen
neuroblastoomweefsel en de embryonale bijnier. De bijnieren bevinden zich bovenop de nieren en
worden aangestuurd door het sympathische zenuwstelsel, welke ervoor zorgt dat je lichaam in actie
kan komen.
Hoofdstuk: Wat is neuroblastoom?
Hoewel de exacte oorzaak van neuroblastoom nog onbekend is, denkt men dat deze kankersoort
ontstaat in onrijpe neurale-lijstcellen in het embryo. Men ontdekte namelijk dat er waarschijnlijk
tijdens de ontwikkeling van deze neurale lijst mutaties optreden die uiteindelijk zullen leiden tot een
neuroblastoom4. Vanuit deze neurale lijst wordt uiteindelijk het sympathische zenuwstelsel gevormd,
zoals te zien is in Figuur 9. Dit zenuwstelsel loopt langs de wervelkolom van de hals tot onder het
staartbeen. Neuroblastomen kunnen overal in het sympathische zenuwstelsel ontstaan zoals in het
zenuwweefsel in het bekken, de buik of nek. Daarentegen bevindt ongeveer zestig procent van de
tumoren zich in het bijniermerg, dat samen met de bijnierschors de bijnier vormt (Figuur 8). Deze
bijnier vormt zich namelijk ook uiteindelijk uit de neurale lijst.
8
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Figuur 9: Het embryo met de neurale lijst (NL) waar
vanuit het sympathische zenuwstelsel ontstaat.
Figuur 8: Schematische afbeelding van de
nieren inclusief bijnieren. De bijnieren
bestaan uit het bijniermerg omhuld met
het bijnierschors.
Men heeft onderzocht of het ontstaan van een neuroblastoom te maken kan hebben met invloeden
tijdens de zwangerschap zoals roken, alcohol en medicijnen. Daar is echter (nog) geen bewijs voor
gevonden.
Metastasen van neuroblastoom komen vooral voor in de lymfeklieren, het beenmerg en het bot.
Daarnaast kunnen er ook tumorcellen zich gaan nestelen in de oogkassen, de lever en de huid5.
Genetische oorzaken
Daarnaast heeft men ontdekt dat bepaalde (stukken van) chromosomen zijn geamplificeerd of zijn
geëlimineerd. Zo is chromosoom 17q geamplificeerd wat een hogere expressie van een oncogen
veroorzaakt. Welk oncogen hierbij betrokken is, is
nog niet bekend. Ook zijn chromosomen 1p, 4p,
11q en 14q vaak geëlimineerd wat het inactiveren
van een tumorsuppressorgen representeert. Zoals
te zien is in Figuur 10, staat het cijfer voor deze
benamingen voor het bedoelde chromosoom. De
‘p’ staat voor het korte deel van het chromosoom
en de ‘q’ voor het lange deel van het chromosoom.
Deze twee delen samen worden verbonden door
het centromeer. De eventuele laatste cijfers, zoals
ook te zien in deze afbeelding, staan voor de
banden waarop het gen zich bevindt.
Figuur 10: De chromosomale locatie van een gen (USN).
Hoofdstuk: Wat is neuroblastoom?
Dankzij onderzoek heeft men een aantal mutaties in kaart kunnen brengen die zich vaak bevinden in
neuroblastoom6. Er is onder andere onderzocht dat in 25 tot 35 procent van de neuroblastomen het
oncogen N-myc gemuteerd is. Bij deze mutatie is er sprake van amplificatie van het gen, het gen is
dus (meerdere malen) gedupliceerd. De mutatie van dit oncogen zorgt ervoor dat de cellen zich
oneindig blijven delen.
9
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
III)
Symptomen, diagnose en stageringssysteem van neuroblastoom
Neuroblastoom is een agressieve tumor die in verschillende stadia kan voorkomen. Deze stadia zijn
geregistreerd in het Internationale Neuroblastoom Stageringssysteem. Het stadium beschrijft de
toestand van de neuroblastoom en bepaalt de behandeling die gegeven kan worden. Voordat een
patiënt in een stadium wordt geplaatst, moet eerst een diagnose van neuroblastoom worden
vastgesteld.
Symptomen
De symptomen hangen heel erg af van de locatie van de primaire tumor en eventuele metastasen.
Een abdominale tumor (gelegen in de buik) kan een opgezette buik of buikpijn geven, maar verder
geen alarmerende symptomen. Cervicale tumoren (gelegen in de hals) geven een zwelling en
eventueel moeilijkheden met ademhalen of een zware ademhaling, terwijl thoracale tumoren
(gelegen in de borst) weinig tot geen klachten geven. Tumoren die zich bevinden in het bekken
kunnen drukken op de blaas of de darmen waardoor er problemen ontstaan met plassen en
ontlasten. In een klein percentage (5%) van de gevallen kan de patiënt verlammingsverschijnselen
oplopen door een neuroblastoom dat zich in het zenuwkanaal in de wervelkolom bevindt.
Wanneer een neuroblastoom is uitgezaaid naar het beenmerg, zal het daar de stamcellen verdringen
waardoor er een tekort aan bloedcellen (bloedplaatjes, rode en witte bloedcellen) ontstaat. Deze
bloedcellen ontstaan namelijk uit de stamcellen in het beenmerg. Door een tekort aan rode
bloedcellen zal de patiënt bleek gaan zien en bij een tekort aan witte bloedcellen zal het
afweersysteem afnemen waardoor de patiënt vatbaarder is voor infecties. Bij een tekort aan
bloedplaatjes zal de stollingswerking van het bloed afnemen met verhoogde bloedingsneigingen tot
gevolg. Het is ook mogelijk dat de tumor zich heeft gemetastaseerd naar de botten. Door
botmetastasen zullen patiënten minder willen lopen en veel pijn hebben in de botten en gewrichten.
Diagnostisering
Er worden verschillende onderzoeken gedaan om neuroblastoom vast te stellen. Met behulp van
deze onderzoeken kunnen artsen vaststellen hoe groot de tumor is, wat zijn locatie is en of er
metastasen zijn. Hieronder volgt een opsomming van de onderzoeksmogelijkheden.
o
o
o
o
Er vindt standaard een anamnese plaats. Hierbij stelt de arts vragen aan de patiënt om er zo
achter te komen wat de precieze klachten zijn en hoe deze zich hebben ontwikkeld.
Bij algemeen onderzoek vindt er een aantal tests plaats waarbij bijvoorbeeld de lengte,
bloeddruk, het gewicht en de temperatuur worden gemeten. Daarnaast zal het lichaamsdeel
waar de vermoedelijke tumor zich bevindt worden onderzocht.
Bovendien wordt er bloedonderzoek uitgevoerd waarbij gekeken wordt naar de conditie van
het bloed en andere organen. Zo kunnen er eventuele andere afwijkingen worden
vastgesteld.
Ook vindt er urineonderzoek plaats. Een neuroblastoom kan namelijk bepaalde stoffen
afscheiden die in de urine terechtkomen.
Hoofdstuk: Wat is neuroblastoom?
Wanneer bij een patiënt neuroblastoom wordt vermoed, zal er een aantal tests worden gedaan om
de ziekte te bevestigen. Ongeveer de helft van de patiënten heeft bij een bezoek aan de arts al
metastasen van de primaire tumor.
10
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
o
o
Om vervolgens de tumor te lokaliseren en
eventuele uitzaaiingen in beeld te brengen,
kan er een echo of röntgenfoto worden
gemaakt. Daarnaast kan er ook gebruik
gemaakt worden van een MIBG-scan. De stof
MIBG (metaiodobenzylguanidine) staat erom
bekend dat het eenvoudig wordt opgenomen
door neuroblastomen, waarna het in
combinatie met ingespoten radioactief jood de
neuroblastoom
zichtbaar
laat
maken. Figuur 11: Resultaten van een MIBG-scan.
Vervolgens worden er foto’s van het hele lichaam gemaakt om zo de tumor te lokaliseren
zoals te zien is in Figuur 11. Ook kan er een botscan worden gedaan welke lijkt op de MIBGscan, maar in dit geval wordt er gebruik gemaakt van technetium en duurt de tijd tussen het
toedienen van de stof en de foto’s maken minder lang.
Een CT- en MRI-scan zijn beide geschikt voor het lokaliseren van de tumor en het uitsluiten
van metastasen. Bij de MRI-scan (Magnetic Resonance Imaging) wordt gebruik gemaakt van
magnetische velden en bij de CT-scan (computertomografie) van röntgenstraling. Bij beide
scans kunnen er dwarsdoorsneden van het lichaam worden gemaakt, soms is echter een van
de scans geschikter door de plaats van de tumor.
Daarnaast wordt er een biopt genomen van de tumor. Hierbij wordt onder narcose een klein
stukje weefsel verwijderd om vervolgens onderzocht te laten worden door een patholoog.
Tijdens dit onderzoek zelf vinden er ook nog een beenmergpunctie en een botboring plaats.
Hierbij gebruikt men respectievelijk een stukje van het beenmerg van het bekken en een
stukje van het bot. Dit materiaal wordt vervolgens op metastasen gecontroleerd.
Neuroblastoomweefsel vormt onder de microscoop een typerend Rosette patroon, zoals te
zien in Figuur 12.
Figuur 12: Een microscopische opname van een neuroblastoom. Het heeft een
typerend Rosette patroon.
De onderzoeken die plaats moeten vinden worden uiteraard voor elke patiënt apart vastgesteld.
Hoofdstuk: Wat is neuroblastoom?
o
11
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Internationale Neuroblastoom Stageringssysteem
Op basis van de resultaten die uit de onderzoeken komen, wordt bepaald in welk stadium de tumor
zich bevindt. Hierdoor kan een zo gericht mogelijke behandeling aan de patiënt worden gegeven.
Vooral het pathofysiologisch onderzoek van het stukje tumor is hierin erg belangrijk, omdat zo
eventuele belangrijke genmutaties kunnen worden vastgesteld. Zo is een verhoogde activiteit van
het gen N-myc zeer ongunstig voor de patiënt, aangezien dit betekent dat de patiënt een zeer
agressieve vorm van neuroblastoom heeft.
Tot stadium 1 behoren tumoren die op hun oorspronkelijke plek zitten en niet zijn gemetastaseerd
(gemetastaseerd). Bovendien kan de tumor tijdens een operatie worden verwijderd en zitten de
neuroblastoomcellen niet in de lymfeknopen rondom de tumor.
Stadium 2 bestaat uit twee substadia. Tot stadium 2A behoren tumoren die ook op hun
oorspronkelijke plek zitten, niet zijn gemetastaseerd, maar niet verwijderd kunnen worden door
middel van een operatie. Stadium 2B is hetzelfde als stadium 2A, maar de neuroblastoomcellen
zitten bij dit stadium in de lymfeknopen alleen rondom de tumor.
In stadium 3 is de tumor niet gemetastaseerd naar verre gebieden in het lichaam, maar er geldt een
andere voorwaarde. Eén van de drie voorwaarden is dat de tumor is gemetastaseerd naar de andere
kant van het lichaam, terwijl het eerst alleen bijvoorbeeld links of alleen rechts zat. Deze tumor kan
zich hebben verspreid naar de lymfeknopen rondom de tumor. Een andere voorwaarde houdt in dat
de tumor zelf nog wel aan één kant van het lichaam is, maar via de lymfeknopen is verspreid naar de
andere kant van het lichaam. De laatste voorwaarde is dat de tumor zich aan beide kanten van het
lichaam bevindt en niet verwijderd kan worden door middel van een operatie.
In stadium 4 hebben patiënten uitzaaiingen (metastasen) naar verre lymfeknopen, het beenmerg,
botten, lever of huid.
Patiënten met een stadium 4S-tumor zijn jonger dan één jaar oud en hebben een tumor aan één kant
van het lichaam. Er kunnen metastasen zijn de lymfeknopen aan dezelfde kant van de tumor. Verder
is de tumor wel gemetastaseerd naar de huid, lever en/of het beenmerg.
Hoofdstuk: Wat is neuroblastoom?
De behandelingen voor de verschillende stadia staan beschreven in hoofdstuk III.
12
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
III
Wat zijn de huidige behandelingen van neuroblastoom?
Stageringssysteem
De behandeling van een neuroblastoom wordt gebaseerd op het stadium van de tumor en de
risicogroep waartoe de patiënt behoort. Deze risicogroepen zijn, net zoals de stadia, internationaal
geregistreerd.
Laag risico
o Stadium 1 patiënten
o Patiënten jonger dan één jaar in stadium 2A of 2B
o Patiënten ouder dan één jaar in stadium 2A of 2B met een tumor zonder een extra kopie van
het N-myc gen
o Patiënten jonger dan één jaar in stadium 4S met een tumor met een positief uiterlijk onder
de microscoop en zonder extra kopieën van het N-myc gen
Hoog risico
o Patiënten ouder dan één jaar in stadium 2A of 2B met extra kopieën van het N-myc gen
o Patiënten (jonger en ouder dan één jaar) in stadium 3 met extra kopieën van het N-myc gen
o Patiënten ouder dan achttien maanden in stadium 3 met een negatief uiterlijk onder de
microscoop
o Patiënten (jonger en ouder dan één jaar) in stadium 4 met extra kopieën van het N-myc gen
o Patiënten ouder dan achttien maanden in stadium 4
o Patiënten tussen de één jaar en achttien maanden met extra kopieën van het N-myc gen en
negatief uiterlijk onder de microscoop.
o Patiënten jonger dan één jaar in stadium 4S met extra kopieën van het N-myc gen
Laag-risicopatiënten hebben een hele goede prognose, waarbij genezing bijna altijd mogelijk is. Acht
van de negen patiënten in de gemiddeld-risicogroep geneest ook na behandeling. Daarentegen
geneest 20% van de hoog-risicopatiënten, dit is slechts één op de vijf patiënten. Uiteindelijk
overlijden er vijf tot acht op de tien kinderen aan de gevolgen van neuroblastoom7.
Behandelingen
Bij patiënten die vallen onder de laag-risicogroep wordt vaak afgewacht wat de tumor zelf gaat doen.
In sommige gevallen slinkt de tumor vanzelf en zal deze eventueel nog verwijderd kunnen worden
door middel van een operatie.
Hoofdstuk: Wat zijn de huidige behandelingen van neuroblastoom?
Gemiddeld risico
o Patiënten jonger dan één jaar in stadium 3 met een tumor zonder extra kopieën van het Nmyc gen
o Patiënten ouder dan één jaar in stadium 3 met een tumor zonder extra kopieën van het Nmyc gen en met een positief uiterlijk onder de microscoop
o Patiënten jonger dan één jaar in stadium 4 met een tumor zonder extra kopieën van het Nmyc gen
o Patiënten jonger dan één jaar in stadium 4S met een tumor zonder extra kopieën van het Nmyc gen en een negatief uiterlijk onder de microscoop
13
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Patiënten in de middelmatig-risicogroep worden eerst behandeld met chemotherapie om vervolgens
(de rest van) de tumor chirurgisch te verwijderen.
De hoog-risicopatiënten krijgen de meest intensieve behandeling die er is. Zo krijgen zij een operatie,
chemotherapie, bestraling en indien nodig ook nog een hoge dosis chemotherapie met
stamceltransplantatie. De patiënten krijgen na de behandeling gedurende zes maanden een vorm
van vitamine A toegediend. Deze stof vertraagt de groei van de neuroblastoomcellen en is alleen
effectief bij minimale tumorresten. Daarnaast is het mogelijk dat de patiënten een MIBG-therapie
krijgen. Hierbij wordt er, net als bij de MIBG-scan, de stof MIBG samen met radioactief jood in het
lichaam gebracht wat vervolgens door het neuroblastoom wordt opgenomen. Op deze manier zal het
radioactieve jood de tumor van binnen bestralen en de cellen vernietigen.
Bestraling
Bij bestraling wordt de plek van de tumor na de operatie gedurende een aantal weken enkele
minuten per dag bestraald. Hierbij doodt de straling de tumorcellen met als resultaat dat het DNA in
de tumorcellen beschadigd raakt en de cel – doordat ze niet meer kan delen – doodgaat. Het nadeel
is dat ook andere, gezonde cellen worden bestraald en er dus cellen onnodig doodgaan. Daarnaast
kan de huid geïrriteerd raken door de dosis straling.
Figuur 13: Chemotherapie in het ziekenhuis.
Hoofdstuk: Wat zijn de huidige behandelingen van neuroblastoom?
Chemotherapie
14
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
De chemotherapie bestaat uit verschillende medicijnen (cytostatica) die celdeling remmen. Deze
cytostatica grijpen aan op snel delende cellen, zoals tumoren. Wanneer de cytostatica in het lichaam
van de patiënt komen, zullen zij alle snel delende cellen doden of laten krimpen. Cytostatica zijn
medicijnen met elk hun eigen werking, die elk op een ander moment in de delingscyclus van de cel
ingrijpen. Door dus een combinatie van cytostatica te gebruiken, zal de kanker het meest effectief
bestreden worden.
De chemotherapie kan door middel van een infuus (Figuur 13: Chemotherapie in het
ziekenhuis.Figuur 13), injectie of een Port-a-Cath (PAC) worden toegediend. Een PAC is een klein
reservoir onder de huid met een slangetje dat in een ader terechtkomt. Zo hoeft er niet telkens
opnieuw te worden gezocht naar een ader en de patiënt niet te worden geprikt.
De cytostatica adriamycine, cisplatin, cyclofosfamide, etoposide, ifosfamide en vincristine zijn in
verschillende combinaties effectief gebleken bij de behandeling van neuroblastoom.
Behandeling met cytostatica heeft echter veel bijwerkingen. Het doodt snel delende cellen zoals de
kankercellen, maar er zijn nog veel meer snel delende cellen in een (gezond) lichaam. Zo worden
cellen van het beenmerg, haarcellen en slijmvliescellen aangetast. Dit heeft onder andere tot gevolg
dat er te weinig bloedcellen worden aangemaakt, waardoor het afweersysteem verzwakt en er
bloedingen kunnen ontstaan. Daarnaast kan het haar van de patiënt uitvallen en kan de patiënt
diarree, mondproblemen en een verminderde conditie hebben. Het lichaam moet namelijk alle
verloren cellen opnieuw aanmaken, wat veel energie kost.
Wanneer een patiënt resistent is geworden voor eerder gebruikte cytostatica, wordt een zeer hoge
dosis chemotherapie toegediend, die ervoor zou kunnen zorgen dat de tumor toch nog verdwijnt. Dit
zorgt er echter ook voor dat gezonde cellen in bijvoorbeeld het beenmerg worden aangetast.
Hiervoor moeten er nieuwe stamcellen worden ingebracht in het lichaam omdat het lichaam zelf
geen bloedcellen meer kan maken door het tekort aan stamcellen; dit wordt stamceltransplantatie
genoemd.
Aangezien de huidige behandelingen veel bijwerkingen geven en niet selectief genoeg werken, is het
nodig om nieuwe specifieke behandelingen te ontwikkelen die effectiever en minder belastend voor
de patiënt zijn.
Hoofdstuk: Wat zijn de huidige behandelingen van neuroblastoom?
Door het verlies aan deze snel delende, gezonde cellen heeft een patiënt vaak extra ondersteuning
nodig, zoals bloedtransfusies, sondevoeding en extra medicijnen.
15
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Wat houdt de nieuwe behandeling op basis van gentherapie in?
Bepaalde neuroblastomen hebben een hoge expressie van het eiwit Bcl-28. Dit betekent dat dit eiwit
in grote hoeveelheden aanwezig is in de tumorcellen. Dit eiwit speelt een grote rol bij de
mogelijkheid tot apoptose van de cellen.
Apoptose
De apoptose speelt zich in eerste instantie af in de mitochondriën, de energiebronnen van een cel.
Zonder de mitochondriën kan een cel geen DNA repliceren, geen eiwitten maken en zijn taak niet
meer goed uitvoeren. Kortom, de mitochondriën zijn van essentieel belang voor de cel. In deze
celstructuren wordt adenosinetrifosfaat (ATP) aangemaakt. ATP is een energiedrager die chemische
reacties kan versnellen, oftewel katalyseren. Om een reactie te laten verlopen is er een bepaalde
activeringsenergie nodig: door de toevoer van ATP wordt deze activeringsenergie sneller bereikt.
Daarnaast speelt het mitochondrium een belangrijke rol bij de apoptose.
Het gaat echter niet altijd zoals het hoort in ons lichaam. Er ontstaan afwijkende cellen, cellen krijgen
te maken met een virus of een cel gaat ongeremd delen, zoals bij kanker. Normaliter ontvangt een
zieke of kapotte cel een signaal van buitenaf dat hij in apoptose moet gaan. Door deze signalen
wordt een heel mechanisme geactiveerd. De eiwitten betrokken bij de intrinsieke pathway, ook wel
mitochondriale pathway genoemd, behoren allemaal tot de Bcl-2 familie (Figuur 15) die zich bevindt
op de membraan van het mitochondrium (Figuur 14). Deze familie bestaat uit sensoren, beschermers
en effectoren. De sensoren ontvangen de signalen dat een cel in apoptose moet gaan en inhiberen
de beschermers (pro-apoptose), de beschermers beschermen de cel tegen de geprogrammeerde
celdood door de effectoren te inhiberen (anti-apoptose) en als laatste zorgen effectoren ervoor dat
het mitochondriaal apoptosemechanisme in gang wordt gezet (pro-apoptose). De verdeling van deze
pro-apoptotische en anti-apoptotische eiwitten bepaalt of de cel blijft leven of dat ze in apoptose
gaat.
Figuur 15: de Bcl-2 familie. Bovenaan staan de anti-apoptose eiwitten
met meerdere domeinen waaraan gebonden kan worden (BH1-BH4).
Onderaan staan de pro-apoptose eiwitten met meerdere domeinen
of alleen een BH3-domein.
Figuur 14: Een mitochondrium met Bcl-2 (antiapoptose) en Bax (pro-apoptose).
Hoofdstuk: Wat houdt de nieuwe behandeling op basis van gentherapie in?
IV
16
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Wanneer de cel signalen voor apoptose van buitenaf krijgt, wordt het gen p53 geactiveerd dat de
productie van een BH3-only eiwit genereert. Normaliter vormen de pro-apoptotische eiwitten zoals
Bax en Bak een binding met de anti-apoptotische eiwitten zoals Bcl-2 en Bcl-XL. Nu is echter het eiwit
BH3-only actief. Dit eiwit zorgt ervoor dat de binding tussen het pro-apoptotische eiwit en het antiapoptotische eiwit verdwijnt. BH3-only inhibeert het anti-apoptotische eiwit en activeert het proapoptotische eiwit9. Vervolgens kan dit laatste eiwit, gepaard met een soortgenoot door de activatie,
een gat boren in het mitochondriaal membraan. Dit proces heet mitochondrial outer membrane
permeabilization (MOMP, doordringen van het mitochondriaal buitenmembraan). Het is een
moment waarop geen weg terug meer is en waarop het mitochondrium de cytochromen c vrijlaten10
(Figuur 16). Het cytochroom c is een klein eiwit van ongeveer 100 aminozuren en speelt binnen het
mitochondrium een belangrijke rol bij de energiewinning.
Figuur 16: De intrinsieke pathway (QIAGEN). In het bovenste
gedeelte van dit figuur is de situatie te zien die zich afspeelt in
een
gezonde
cel.
Onderin
het
figuur
is
het
apoptosemechanisme weergegeven.
Figuur 17: De vorming van het apoptosoom en de
omzetting van pro-caspase 9 in caspase 9 (Nitric
Oxide Research Group).
Hoofdstuk: Wat houdt de nieuwe behandeling op basis van gentherapie in?
Deze cytochromen vormen vervolgens samen met het eiwit Apaf-1 (apoptotic protease activating
factor 1) en ATP een apoptosoom. Aangezien Apaf-1 een bindingsplaats heeft voor caspase én een
bindingsplaats voor ATP, kan dit eiwit pro-caspase 9 omzetten in caspase 9, de actieve vorm (Figuur
17). Caspase 9 activeert op zijn beurt weer effectorcaspases zoals caspase 3. Deze effectorcaspases
binden substraten die vervolgens worden geknipt en hun functie verliezen. Deze substraten zijn
bijvoorbeeld kerneiwitten, eiwitten van het cytoskelet en eiwitten die betrokken zijn bij reparatie van
beschadigd DNA. Aangezien deze eiwitten belangrijke cellulaire functies hebben zoals het repareren
van DNA en het in stand houden van de cel, zullen deze bij afbraak leiden tot het eindstadium van
apoptose11.
17
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Bcl-2 in neuroblastoom
Er is in 2012 aangetoond dat sommige neuroblastomen een verhoogde
expressie van het anti-apoptotische eiwit Bcl-2 hebben12. Zoals al eerder
genoemd zit Bcl-2 gewoonlijk gebonden aan Bax wanneer de cel geen
signalen voor apoptose ontvangt. Cellen met een verhoogde expressie van
het eiwit Bcl-2 zijn minder geneigd om in apoptose te gaan, omdat de antiapoptotische eiwitten dan overheersen13, wat niet meer kan worden
gecompenseerd door de BH3-only eiwitten (Figuur 19).
Figuur 18: apoptose ten
gevolge van het toevoegen
van ABT-199. (Fresquet,
Rieger,
Carolis,
GarcíaBarchino,
&
MartinezCliment, 2014)
Figuur 20: apoptose in de cel na toevoeging van ABT-199 (Genentech)
Figuur 19: de verschillende manieren om de apoptose te blokkeren gebruikt door kankercellen. MOMP is de
situatie waarin apoptose plaatsvindt. De geremde apoptose class C is het gevolg van een teveel aan antiapoptotische Bcl-2 eiwitten. Er zijn geen BH3-only eiwitten over om Bax/Bak te stimuleren omdat ze enkel worden
gebruikt om de anti-apoptotische eiwitten te inhiberen. (Letai & Chonghaile, 2009)
Hoofdstuk: Wat houdt de nieuwe behandeling op basis van gentherapie in?
Nu men dit weet, kan er een gerichte behandeling worden ontwikkeld die
uiteindelijk kan worden gegeven aan patiënten. ABT-199 is een BH3mimetic compound wat betekent dat het lijkt op BH3-only eiwitten. Deze
compound is ontwikkeld om specifiek de Bcl-2 eiwitten te binden en te
remmen, zodat de anti-apoptotische overheersing wordt gereduceerd.
Aangezien de Bax moleculen op die manier vrij zijn om de cytochromen c
vrij te maken, voorspelt men dat de tumorcellen met een verhoogde
expressie van Bcl-2 na toevoeging van ABT-199 in apoptose zullen gaan
(Figuur 18, Figuur 20). De behandeling van neuroblastoompatiënten met
ABT-199 lijkt in theorie een effectieve behandeling.
18
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in?
Onderzoekers op het AMC doen onderzoek naar deze mogelijke nieuwe behandeling van
neuroblastoom. Ik mocht hier met het team van dr. Jan Molenaar een week meelopen en zelf
onderzoeken of deze compound invloed heeft op de neuroblastoomcellen.
Vooronderzoek
Sinds 1990 bezit het AMC een grote verzameling van tumorweefsel en gezond weefsel van
neuroblastoompatiënten dat continu wordt opgebouwd. In 2011 kreeg het onderzoeksteam in het
AMC toestemming en geld om het genoom van neuroblastoomcellen in kaart te brengen14. Zij
slaagden er in 2012 in om dit te voltooien en de resultaten te publiceren15. Dit is groot in het nieuws
gekomen door de betekenis die deze doorbraak zou kunnen hebben voor de behandeling van
neuroblastoom. Deze analyse van de neuroblastoomtumoren heeft ongeveer 1,2 miljoen euro
gekost. Dit werd vooral gesponsord door fondsen als Villa Joep en KIKA (Stichting Kinderen
Kankervrij)16.
Wanneer men weet wat er precies defect is bij een tumor kan er een gerichte behandeling worden
ontwikkeld. Zo is er in 2012 ontdekt dat het Bcl-2 gen in sommige neuroblastoomtumoren defect is17.
Volgende resultaten komen allemaal uit dit onderzoek (Figuur 22 en Figuur 21). Het defecte Bcl-2 gen
leidt tot een hoge RNA expressie van Bcl-2, terwijl ander tumoren en normaal weefsel deze hoge
expressie niet vertonen (Figuur 22a). Deze hoge RNA expressie zorgt voor grote hoeveelheid van het
eiwit Bcl-2 in de cel (Figuur 22b). Daarnaast is er gekeken naar verschillende cellijnen van
neuroblastomen. Een cellijn is een doorgekweekte eukaryoot van, in dit geval, een
neuroblastoomcel. Zo krijgt men dus een klomp identieke tumorcellen. De cellijnen hebben echter
een lage Bcl-2 RNA expressie in vergelijking met de neuroblastomen (Figuur 22a). Alleen in de
cellijnen KCNR en SJNB12 is een extreem hoge expressie van het eiwit Bcl-2 zichtbaar in de western
blot die overeenkomt met de expressie in de neuroblastomen (Figuur 22c).
Een western blot is een biochemische techniek waarbij kan worden vastgesteld of een specifiek eiwit
in een bepaald mengsel aanwezig is. De eiwitten worden op basis van hun moleculair gewicht
gescheiden door middel van gel-elektroforese. Deze techniek zal de eiwitten door een elektrisch veld
scheiden. Eiwitten zijn negatief geladen en zullen dus naar de onderkant – de positieve pool – van
het apparaat bewegen. Aangezien kleinere eiwitten sneller door de gel bewegen, zullen deze lager
eindigen dan grotere moleculen. Eiwitten met een hogere expressie geven een bredere band.
Actine (actin) is een controle western blot en moet bij elk monster een gelijke expressie weergeven18
(Figuur 22c). Het is in gelijke hoeveelheden aanwezig in alle eukaryoten omdat het een onderdeel is
van het cytoskelet in de cel, welke voor beweeglijkheid, stevigheid en vorm zorgt. Verder kan er
worden geconcludeerd dat de hoge Bcl-2 expressie karakteristiek is voor de neuroblastoomcellen als
het wordt vergeleken met de cellen uit de bijnierschors en de neuroblasten van de bijnier (Figuur
22d). Neuroblasten zijn cellen die cruciaal zijn voor de vorming van het zenuwstelsel en die mogelijk
bij ontsporing een neuroblastoom kunnen vormen19.
Hoofdstuk: Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in?
V
19
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Figuur 22: Bcl-2 expressie in neuroblastomen en cellijnen. (a) De Bcl-2 RNA
expressie in neuroblastomen (roodgekleurd), andere tumoren
(blauwgekleurd) en normaal weefsel (groengekleurd). Elke stip is
representatief voor één monster van het weefsel. Tussen de haken staat
de hoeveelheid monsters die is onderzocht. (b) Links: de samenhang
tussen de RNA expressie (y-as) en de eiwitexpressie (x-as). Rechts: een
tumor met een hoge Bcl-2 expressie (ITCC0221) en lage Bcl-2 expressie
(ITCCC0119). (c) De Bcl-2 RNA expressie van verschillende
neuroblastoomcellijnen. Rood is 4X meer dan de gemiddelde Bcl-2
expressie. Oranje is >2X het gemiddelde en <4X het gemiddelde. Geel is
>0,5X het gemiddelde en <2X het gemiddelde. Groen is <0,5X het
gemiddelde. Daaronder de western blot van de eiwitten Bcl-2 en actine.
(d) De Bcl-2 RNA expressie in de bijnierschors (adrenal cortex),
neuroblasten van de bijnier (adrenal neuroblasts) en neuroblastoomcellen
(NB tumor cells).
Hoofdstuk: Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in?
Figuur 21: KCNR, SJNB12, LAN5, SKNBE en SKNAS. (b)
Microscopische afbeeldingen van de cellen 72 uur na
de transductie met het lentivirale shRNA. (c) MTT
assay van de cellen 7-10 dagen na de transductie. De
levensvatbaarheid van de cellen is zichtbaar op de yas en de multiplicity of infection (MOI) staat op de xas. De MOI verwijst naar het aantal virusdeeltjes dat
per te behandelen cel is toegevoegd.
20
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Zoals in Figuur 21 te zien is, gaan de tumorcellen in apoptose wanneer het Bcl-2 gen is uitgeschakeld.
De Bcl-2 eiwitexpressie is met meer dan 80% verminderd in vergelijking met de eerdere western blot
(Figuur 22c) 72 uur na de transductie met het lentivirale shRNA. Daaronder is te zien dat het enzym
poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) is gesplitst, behalve bij de cellijn SKNAS. PARP is een eiwit dat
een belangrijke rol speelt bij het in stand houden van het cytoskelet. De splitsing van dit eiwit komt
door het eiwit caspase-3 welke ontstaat aan het begin van de apoptose van de cel, zoals te lezen in
hoofdstuk 0. Deze splitsing veroorzaakt twee fragmenten van verschillend moleculair gewicht,
waardoor op de western blot twee verschillende banden te zien zijn23. De splitsing van PARP is dus
een belangrijk kenmerk van de apoptose van een cel24. De Actine expressie is nog steeds gelijk in elke
cel (Figuur 21a). SHC002, D11 en E1 zijn drie verschillende vectoren die gebruikt zijn voor dit
onderzoek. SHC002 is een controlegroep en zou geen effect moeten hebben op de cel25. Daarnaast is
op microscopische afbeeldingen te zien dat de celstructuren van KCNR en SJNB12 veranderen na
behandeling met het lentivirale shRNA, terwijl SKNAS hetzelfde blijft (Figuur 21b). Dit laat zien dat
het uitschakelen van het Bcl-2 gen wel effect heeft op cellen met veel Bcl-2 eiwitten, maar geen
effect heeft op cellen met weinig Bcl-2. Vervolgens laten de MTT assays zien dat de
levensvatbaarheid van de cellen duidelijk afneemt wanneer het Bcl-2 gen wordt uitgeschakeld.
MTT assay is een colorimetrisch assay dat wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van een cel vast
te stellen. De stof MTT wordt enzymatisch door succinase-tetrazolium reductase omgezet tot
formazan. De gevormde kristallen hebben een paarse kleur. Succinate-tetrazolium reductase behoort
tot de mitochondriën en is dus alleen aanwezig in metabolisch actieve cellen. Hoe paarser de kleur
van de vloeistof, hoe hogere metabolisme-activiteit de cellen hebben (Figuur 25).
Hoofdstuk: Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in?
Vervolgens is het nodig om te bekijken of het uitschakelen van het Bcl-2 gen, waarmee de Bcl-2
eiwitexpressie afneemt, daadwerkelijk zorgt voor apoptose. Dit is onderzocht met cellijnen met een
hoge Bcl-2 expressie (KCNR en SJNB12), een gemiddelde expressie (LAN5 en SKNBE) en een lage
expressie (SKNAS). In alle cellijnen werd Bcl-2 uitgeschakeld door middel van lentivirale vectoren. Dit
zijn een soort voertuigen om genen in te vervoeren en over te brengen in een ander DNA20. Deze
lentivirale vectoren zijn speciaal geschikt voor neurale cellen21. De lentivirale vectoren dragen shRNA
(short hairpin RNA) in zich. Dit viraal RNA wordt met behulp van het enzym Reverse Transcriptase
omgebouwd tot viraal DNA waarna het in
het DNA van de cel wordt ingebouwd.
Hierdoor ontstaat er viraal mRNA dat
eiwitten produceert (Figuur 2322). Door dit
lentiviraal shRNA In dit onderzoek konden
de cellen het eiwit Bcl-2 niet meer
produceren. Op deze manier kan er worden
gekeken naar de effecten op de tumorcel
wanneer deze geen Bcl-2 meer bevat en
kan er worden geconcludeerd of een
compound gericht op het inhiberen van Bcl- Figuur 23: de overdracht van lentivirale deeltjes in een cel.
2 enig effect zou hebben op de groei en de (GenTarget Inc., 2013)
dood van tumorcellen.
21
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Figuur 24: kleurenwiel met de bijbehorende golflengtes.
(Color Wheel with Wavelengths, 2013)
Vervolgens worden de cellen (na behandeling met SDS/HCL) in de Microplate Luminometer gezet. De
platen worden gemeten bij een golflengte van 570 nanometer (geel licht). Aangezien de stof zelf
rood is, zal deze het gele licht absorberen omdat deze kleuren tegenover elkaar staan in het
kleurenwiel (Figuur 24). De intensiteit waarmee het licht de vloeistof ingaat en de intensiteit
waarmee het licht uit de vloeistof komt worden met elkaar vergeleken. De verkregen waardes
worden door de Microplate Luminometer gelijk in een Excel bestand gezet, in RLU (Relative Light
Units). Hoe lager de RLU-waardes, hoe lager de mate van absorptie door de vloeistof en vice versa.
Dit is te zien in Figuur 21: een stijging van het aantal virusdeeltjes resulteert in een daling van de
metabolische activiteit van de cellen.
Nu weet men dat de cel in apoptose gaat als er een kleinere hoeveelheid van het Bcl-2 eiwit
aanwezig is. De volgende stap is een compound ontwikkelen die de grote hoeveelheid Bcl-2 in de
neuroblastoomcellen tegengaat. Het lab op het AMC kon gebruikmaken van compounds die al waren
ontwikkeld voor andere soorten kanker met dezelfde oorzaak. Aangezien neuroblastoom door haar
zeldzaamheid voor farmaceutische bedrijven niet even interessant is als bijvoorbeeld leukemie, is het
erg duur om voor neuroblastoom nieuwe compounds te ontwikkelen. Het bedrijf AbbVie was het
eerste bedrijf dat een compound heeft kunnen ontwikkelen die de BH3 domeinen van antiapoptotische moleculen kan binden. Zo heeft dit bedrijf onder andere ABT-737 en ABT-263
(Navitoclax) ontwikkeld. Deze laatste compound was het eerste dat klinisch getest kon worden26. Dit
gaf echter, naast positieve resultaten van de tumor slinking (Figuur 26), ook negatieve resultaten.
ABT-263 bleek namelijk niet alleen de Bcl-2 te binden, maar ook de Bcl-XL. Bloedplaatjes zijn
voornamelijk afhankelijk van Bcl-XL voor overleving, maar worden dus ook door de ABT-263 gedood
(Figuur 27a). Dit kan trombocytopenie veroorzaken, wat een tekort aan bloedplaatjes betekent. Dit
zorgt ervoor dat het bloed minder goed kan stollen wat heel gevaarlijk kan zijn voor de gezondheid.
Om deze reden heeft AbbVie Navitoclax opnieuw ontwikkeld tot een ander compound: ABT-199.
Deze compound lijkt erg op ABT-263, maar is nog specifieker gericht op Bcl-2 en minder op Bcl-XL
waardoor de bloedplaatjes gespaard blijven27 (Figuur 27b).
Hoofdstuk: Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in?
Figuur 25: een multititerplaat na een MTT assay.
Afnemend aantal cellen resulteren in een afnemende
paarse kleur. (Shinryuu)
22
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Figuur 27: het verschil tussen ABT-263 (Navitoclax) en ABT-199. (Davids & Letai, 2013)
In onderstaand praktisch onderzoek heb ik onderzocht wat het effect van ABT-199 is op de
neuroblastoomcellen.
Hoofdstuk: Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in?
Figuur 26: western blotting van PARP en Actine in de neuroblastoomcellen na behandeling met ABT-263 laat zien dat de cel
in apoptose is gegaan. (Lamers, et al., 2012)
23
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
I) Het praktisch onderzoek
Onderzoeksvraag
Hoe beïnvloedt het toevoegen van compound ABT-199 de groei van de KCNR-cellen?
Hypothese
De verwachting is dat de KCNR-cellen na toevoeging van de compound ABT-199 geremd zullen zijn in
hun groei en dat de cellen voor een groot gedeelte dood zullen zijn.
Voor deze hypothese wordt a-priorische kennis gebruikt uit onderzoeken naar deze compound in
combinatie met neuroblastoomcellen. Er wordt gebruik gemaakt van de informatie over de
kenmerken van neuroblastoomcellen. Deze informatie houdt in dat bepaalde neuroblastoomcellen
een te veel aan Bcl-2 moleculen hebben en dus niet in apoptose kunnen gaan. Daarnaast wordt er
gebruik gemaakt van eerdere onderzoeken naar het effect van ABT-199 op Bcl-2. Deze onderzoeken
tonen aan dat ABT-199 wel degelijk een remmend effect heeft op de tumorgroei en tumorsterfte.
Materialen
o Cellijn KCNR opgelost in DMEM
o Medium DMEM
o Stock solution 10 mM ABT-199 in DMSO (bewaard op -20°C)
o 10% SDS/0,01 M HCL in gedestilleerd water
o 5 mg/mL thiazolyl blue tetrazolium bromide oplossing in PBS (MTT)
o Trypsine
o 2 x 96-well multititerplaten
o Stift
o Handschoenen
o Laboratoriumjas
o Tips
o Pipet
o Microscoop
o Coulter Counter
o Microplate Luminometer
o Flowkast
o Incubator
o Vrieskast
o Programma GraphPad Prism 5
Methode
Het gevolgde protocol is een veelgebruikt protocol om IC50 waardes van het compound ABT-199 in
verschillende cellijnen te bepalen. Hierbij wordt onder andere gebruik gemaakt van een MTT
proliferatie analyse. Zo wordt de groei van cellen in kaart gebracht. Alle handelingen werden
uitgevoerd in een flowkast om de ruimte zo steriel mogelijk te maken. Bovendien werden er twee
paar handschoenen en een laboratoriumjas gedragen.
Hoofdstuk: Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in?
Materiaal, methode en verwerking
24
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Dag 1
De KCNR-cellen werden de eerste dag behandeld om ze gereed te maken voor het experiment. Om
de cellen los van de bodem te krijgen werd er trypsine toegevoegd. Vervolgens werden deze cellen
geresuspendeerd in het DMEM. De cellen werden met behulp van de Coulter Counter geteld. De
standaard, gewenste waarde van het tellen is 5000 cellen per 50 μL DMEM. Per oplossing werd er
drie keer geteld om zo secuur mogelijk te werken.
Uitslagen van het tellen:
o
o
In de blanco-oplossing bestaande uit DMEM (cellen/milliliter):
1.
26600
2.
24000
3.
22600
Gemiddelde van deze waardes:
(26600+24000+22600)/3=24400
In de oplossing bestaande uit DMEM en neuroblastoomcellen (cellen/milliliter):
1.
110800
2.
108800
3.
105400
Gemiddelde van deze waardes:
(110800+108800+105400)/3=108333
Op de microtiterplaten schrijft men de naam van de plaat en wat de concentraties van de compound
zijn. De DMEM en de KCNR-cellen in DMEM werden in de platen gepipetteerd, 50 μl per well. De
pipet werd dicht tegen de well gehouden om al de vloeistof in de well te krijgen.
Plaat 1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
B
C
D
E
F
G
H
Controleplaat
1
A
B
C
D
E
F
G
H
Hoofdstuk: Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in?
Dit zijn (108.333 - 24.400 =) 83.933 neuroblastoomcellen in één milliliter. Dit staat gelijk aan 4197
cellen per 50 μL.
25
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Legenda
50 μl DMEM
50 μl DMEM + KCNR
Leeg
Dag 2
Op de tweede dag werd de compound ABT-199 in verschillende concentraties toegevoegd aan de
cellen. Ten eerste moest er met behulp van de microscoop worden bepaald of de cellen nog aan de
bodem zaten oftewel of ze nog leefden. Ten tweede werd er in het donker gewerkt om ontleding van
ABT-199 tegen te gaan. Als laatste moesten de cellen vóór het toevoegen van de compound worden
gemengd om een gelijke verdeling van de cellen te behouden.
De concentraties verkreeg men door de compound te verdunnen met behulp van DMSO (zie bijlage:
Het verdunnen van ABT-199 in DMSO). De stockoplossing van ABT-199 in DMSO bedraagt 10 mM.
Vervolgens werd 50 μl van de concentraties in de cellen gepipetteerd volgens onderstaand schema.
In de cellen waar geen compound werd toegevoegd pipetteerde men voor een tweede maal 50 μl
DMEM. Het is belangrijk dat de volumes gelijk blijven.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
A
B
1
0 μM
0 μM
1 μM
5 μM
C
0 μM
0 μM
1 μM
5 μM
D
0 μM
0 μM
0,1
μM
0,1
μM
0,1
μM
1 μM
5 μM
10
μM
10
μM
10
μM
15
μM
15
μM
15
μM
20
μM
20
μM
20
μM
50
μM
50
μM
50
μM
100
μM
100
μM
100
μM
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0 μM
0 μM
0 μM
0 μM
0 μM
0 μM
0 μM
0 μM
0 μM
12
E
F
G
H
Controleplaat
1
A
B
C
D
E
F
G
H
Legenda
50 μl DMEM
12
Hoofdstuk: Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in?
Plaat 1
26
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
50 μl DMEM + KCNR
Leeg
Bovendien werd de controleplaat behandeld met de MTT. In de wells werd 10 μl van deze oplossing
gepipetteerd. De plaat werd in de incubator gezet. Na vier uur werd per well 100 μl van de 10%
SDS/0,01 M HCL oplossing in de wells gepipetteerd. De plaat werd in de incubator gezet.
Dag 5
De vijfde dag werd ook plaat 1 behandeld met de 10 μl MTT per well en de plaat werd in de
incubator gezet. Na vier uur werd de 10% SDS/0,01 M HCL oplossing voor 100 μl per well
gepipetteerd in de plaat en in de incubator gezet.
Daarnaast werd de controleplaat geanalyseerd met behulp van de Microplate Luminometer.
Dag 8
Op de achtste dag werd plaat 1 geanalyseerd met behulp van de Microplate Luminometer.
Resultaten
Plaat 1:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
0,524
0,698
0,37
0,427
0,317
0,627
0,519
0,304
0,399
0,465
0,513
0,367
B
0,663
0,097
0,274
0,144
0,125
0,067
0,052
0,061
0,051
0,009
0,368
C
0,736
0,149
0,334
0,238
0,174
0,129
0,065
0,06
0,051
0,053
0,006
0,404
D
1,037
0,091
0,297
0,254
0,164
0,135
0,086
0,063
0,055
0,056
0,009
0,427
E
0,994
0,532
0,281
0,474
0,494
0,467
0,449
0,429
0,494
0,379
0,402
0,378
F
0,005
0,003
0,002
0,004
0,003
0,003
0,002
0,003
0,002
0,003
0,003
0,003
G
0,006
0,004
0,002
0,001
0,003
0,003
0,005
0,004
0,002
0,003
0,003
0,002
H
0,004
0,002
0,003
0,003
0,004
0
0
0,002
0,002
0,001
0,004
0,005
0,1
1
5
10
15
20
50
100
I
J
K
L
M
N
O
P
Q
R
S
T
0,3155
0
0
86,84628 45,64184 39,61965 21,23613 16,48177 19,33439 16,16482 2,852615
105,863708 75,43582 55,15055 40,88748 20,60222 19,01743 16,16482 16,79873 1,901743
94,1362916 80,50713 51,98098 42,78922 27,25832
19,9683
17,43265
17,7496
2,852615
Figuur 28: de resultaten van de meting met de Microplate Luminometer. De eerste tabel geeft de droge resultaten weer in
RLU (Relative Light Units). De tweede tabel geeft het percentage RLU van B(3-11), C(3-11) en D(3-11) van de gemiddelde RLU
van B3, C3 en D3 (zie J3). De cellen K3-11 geven de concentratie ABT-199 weer. De tweede tabel is het percentage van de
cellen dat nog leeft na behandeling met ABT-199 van de cellen die niet zijn behandeld met ABT-199.
Hoofdstuk: Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in?
Verwerking van de resultaten
De verkregen waardes uit de meting werden met behulp van GraphPad Prism 5 omgezet tot een IC50
grafiek. Zie bijlage: Equation: log (inhibitor) vs. normalized response – Variable slope & Converting
concentration to log(concentration) –.
M TT570 min
720
M TT570 min
720
M TT570 min
720
M TT570 min
720
M TT570 min
720
M TT570 min
720
M TT570 min
720
M TT570 min
720
27
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Figuur 29: de IC50 curve gevormd met GraphPad Prism 5.
Deze grafiek geeft het percentage cel activiteit (y-as) weer tegen de concentratie van ABT-199 (x-as).
Bovendien geeft het de IC50 waarde van 1,2 μM. De IC50 (Inhibitory Concentration) vertelt bij welke
concentratie van de compound 50% van de celgroei is verhinderd.
A
B
C
D
E
F
G
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
0,505
0,422
0,327
0,335
0,274
0,002
0,004
0,003
0,396
0,006
0,367
0,002
0,52
0,367
0,152
0,407
0,342
0,002
0,002
0,002
0,003
0,001
0,002
0,002
0,346
0,309
0,161
0,348
0,358
0,002
0,001
0,001
0,002
0,001
0,003
0,002
0,353
0,202
0,162
0,365
0,309
0,002
0,002
0,001
0,003
0,005
0,002
0,002
0,395
0,468
0,387
0,337
0,332
0,003
0,001
0,001
0,003
0,002
0,002
0,003
0,005
0,005
0,002
0,003
0,002
0,003
0,001
0,003
0,002
0,003
0,003
0,003
0,003
0,005
0,002
0,003
0,003
0,003
0,003
0,003
0,002
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,002
0,002
0,003
0,001
0
0,005
0,002
0,002
0,002
0,006
Figuur 30: de resultaten van de meting met de Microplate Luminometer.
De LC50 (Lethal Concentration) kan worden berekend door het gemiddelde van B3, C3 en D3 te delen
door twee. Dit geeft een LC50 van 0,0792. Dit getal wordt vergeleken met de waardes uit de
resultaten van plaat 1. Hieruit kan men concluderen dat de LC50 samengaat met een concentratie van
5-10 μM. De LC50 vertelt bij welke concentratie van de compound 50% van de cellen is gedood.
Conclusie
Uit de resultaten kan worden geconcludeerd dat de groei van de KCNR-cellen wordt geremd wanneer
er ABT-199 aan wordt toegevoegd. Naarmate de concentratie van ABT-199 hoger wordt, neemt de
activiteit van de cel af. Bij 1,2 μM ABT-199 is de celgroei met 50% afgenomen ten opzichte van het
begin. Bij een concentratie van 5-10 μM ABT-199 zal 50% van de cellen sterven.
Discussie
De resultaten geven een verminderde celgroei bij een verhoogde concentratie ABT-199 weer. Dit is
het gevolg van de processen die in de cel plaatsvinden. De cellen sterven als gevolg van geactiveerde
apoptose door de BH3-mimetic compound ABT-199 die de apoptose in gang zet. Aangezien ABT-199
Hoofdstuk: Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in?
Controleplaat:
28
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
erg lijkt op de compound ABT-263, kan er worden aangenomen dat ook in dit onderzoek de KCNRcellen zijn aangetast door apoptose en niet door toxiciteit (Figuur 26).
Figuur 31: IC50 curve van een vergelijkbaar
experiment.
Figuur 32: een voorbeeld van een goede IC50 curve.
De resultaten kunnen zijn beïnvloed door fout gepipetteerde wells en door het te laat toevoegen van
de MTT waardoor de cellen minder optimaal hebben kunnen reageren met de MTT. Fout
gepipetteerde wells kunnen resulteren in afwijkende waardes. Bovendien is één plaat niet voldoende
om een waardevolle conclusie te kunnen trekken met betrekking tot de werkelijke effecten van ABT199 op een neuroblastoom.
Bij een vervolgonderzoek is het belangrijk om alle wells zo nauwkeurig mogelijk te pipetteren en de
MTT op tijd toe te voegen. De gemeten waardes liggen namelijk niet allemaal perfect op de grafiek
en de curve lijkt niet op de meest ideale curve. Om een compleet beeld te krijgen is het bovendien
noodzakelijk om de ABT-199 vervolgens te gaan testen in vivo. Op die manier kunnen uiteindelijk de
gevolgen voor de patiënten ook worden meegenomen in de resultaten en conclusie.
Wanneer de apoptose in de neuroblastoomcellen door de BH3-mimetic ABT-199 wordt geactiveerd,
zullen deze cellen doodgaan. Dit zal voor het hele neuroblastoom gebeuren. Wanneer de tumor
slinkt, zal deze verder geen schade kunnen aanrichten aan het lichaam van de patiënt. Deze
resultaten beloven veel voor de behandeling van neuroblastoom. De compound moet eerst nog
worden getest in muizen om de in vivo resultaten te verkrijgen. Daarna kan het – na goede
resultaten in de muizen – klinisch worden getest. De LC50 geeft de maximaal toedienbare dosis
aangezien het na deze concentratie toxisch is voor de patiënt. De IC50 kan worden gebruikt om de
concentratie van de compound te bepalen in de uiteindelijke behandeling.
Hoofdstuk: Wat houdt het onderzoek naar de behandeling met ABT-199 in?
Een IC50 curve van hetzelfde onderzoek gecreëerd door een ander lid van het onderzoeksteam geeft
een IC50 van 2,2 μM (Figuur 31). Deze curve geeft een andere IC50 waarde en is ook minder steil,
echter liggen de IC50 waardes dicht bij elkaar, waardoor je mag veronderstellen dat het geen ernstige
problemen zal opleveren als deze concentraties in vivo worden gebruikt. Een voorbeeld van een
goede IC50 curve is te zien in Figuur 32. Deze curve komt niet overeen met de curves van de ABT-199
in neuroblastoomcellen. Dit zou verklaard kunnen worden doordat KCNR eventueel een hoge
gevoeligheid heeft voor ABT-199 waardoor de celgroei eerder geremd wordt.
29
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Conclusie
Neuroblastoom een soort kinderkanker die niet veel voorkomt, maar waarvoor wel snel een goede
behandeling nodig is. De huidige behandelingen met onder andere chemotherapie en bestraling
geven zeer veel bijwerkingen voor de patiënten. De behandeling van neuroblastoom met de
compound ABT-199 is echter een hoopvolle behandeling: het is specifiek gericht op één bepaald gen
dat defect is waardoor de gezonde cellen – in tegenstelling tot bij de huidige behandelingen met
cytostatica – theoretisch bespaard zouden blijven. Niet alle neuroblastoompatiënten zullen effectief
behandeld kunnen worden, aangezien niet elk neuroblastoom een defect Bcl-2 gen heeft. Wanneer
deze compound tot een medicijn wordt ontwikkeld, zullen klinische studies moeten uitwijzen wat dit
werkelijk voor neuroblastoompatiënten zou kunnen betekenen.
Hoofdstuk: Conclusie
VI
30
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Discussie
Cytostatica kunnen worden toegepast bij alle patiënten met neuroblastoom, maar omdat deze
aspecifiek werken, zijn er helaas ook veel bijwerkingen. Deze bijwerkingen ontstaan omdat naast de
tumorcellen ook gezonde cellen worden gedood. Door de lage overlevingskans van
neuroblastoompatiënten met de huidige behandelingen is het van groot belang dat er nieuwe
therapieën ontwikkeld worden.
De compound ABT-199 geeft in het laboratoriumonderzoek veelbelovende resultaten. Het doodt de
cellen met een hoge expressie van het eiwit Bcl-2, terwijl de gezonde cellen niet worden aangetast.
Deze resultaten blijken uit het onderzoek zoals beschreven in hoofdstuk V. De tumor zal theoretisch
na toediening van ABT-199 slinken, waardoor de patiënt – zonder al te veel bijwerkingen –
uiteindelijk een kleinere tumor zal hebben of wellicht zelfs wel kan genezen van de tumor.
Hoewel de resultaten veelbelovend zijn (zie conclusie pagina 28), moet er wel een aantal kritische
kanttekeningen gemaakt worden bij het praktisch onderzoek:
o
o
o
Het onderzoek bedroeg slechts één week, terwijl laboratoriumonderzoek naar nieuwe
medicijnen soms wel jaren kan duren.
De resultaten van mijn onderzoek dienen gevalideerd te worden om bepaalde
onduidelijkheden helder te maken. Dit was helaas niet mogelijk om binnen het tijdsbestek
van mijn profielwerkstuk te realiseren.
Zoals al vermeld in de discussie op pagina 28 is er een aantal meetonnauwkeurigheden
ontstaan door het fout pipetteren van een gedeelte van de wells en het te laat toevoegen
van een stof. Dit heeft tot gevolg dat de resultaten niet geheel betrouwbaar zijn en dat de
voorlopige conclusie op eventuele onjuiste resultaten is gebaseerd.
De behandeling met ABT-199 lijkt theoretisch effectiever dan een behandeling met chemotherapie.
Helaas richt ABT-199 zich alleen op de cellen met een hoge expressie van het Bcl-2 eiwit. Zoals eerder
in dit profielwerkstuk gezegd, zijn alle tumoren uniek en zullen niet alle neuroblastomen een hoge
expressie van dit eiwit Bcl-2 hebben. Met deze behandeling zullen dus niet alle tumoren verdwijnen
en dus ook niet alle patiënten genezen.
Verder is het belangrijk om te weten wat de klinische studies met ABT-199 zullen uitwijzen. Wanneer
het blijkt dat ABT-199 een negatief effect heeft op de tumorgroei en geen andere cellen doodt, zou
dit voor vele neuroblastoompatiënten een goede behandeling zijn. Wanneer deze compound echter
een positief effect heeft op de tumorgroei of andere cellen doodt, zal ABT-199 niet meer verder
ontwikkeld worden tot medicijn.
Klinische studies zullen ook moeten aantonen op hoeveel patiënten deze eventuele nieuwe
behandeling betrekking heeft en welk effect ABT-199 heeft in het menselijke lichaam. Zo moet het
medicijn uiteraard niet toxisch zijn voor de mens en moet het op een acceptabele manier kunnen
worden ingenomen, bijvoorbeeld door middel van tabletten, een infuus, een injectie of een PAC
zoals nu met de chemotherapie ook wordt gedaan.
Ik zou nog heel graag in het veld ervaring willen opdoen en in persoonlijk gesprekken met patiënten
en artsen willen leren wat het betekent om neuroblastoom te hebben en hoe belastend de
behandelingen zijn. Gecombineerd met de kennis die ik heb opgedaan in het laboratorium, zou ik
Hoofdstuk: Discussie
VII
31
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
mijn ervaringen dan willen delen met farmaceutische bedrijven om hen te enthousiasmeren om te
gaan werken aan een behandeling van neuroblastoom.
Farmaceutische bedrijven zijn eigenlijk niet geïnteresseerd in ziektes die zelden voorkomen (in
Nederland “slechts” 25 nieuwe patiënten met neuroblastoom per jaar). Dit is voor hen financieel niet
aantrekkelijk of zelfs niet haalbaar. Het zou dus mooi zijn als ik één of meer farmaceutische bedrijven
zou kunnen overtuigen om nieuwe medicijnen te ontwikkelen, zodat uiteindelijk alle patiënten met
neuroblastoom kunnen genezen.
Hoofdstuk: Discussie
We krijgen door dit onderzoek hopelijk een beetje zicht op de genezing van neuroblastoom.
32
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
VIII
Reflectie, evaluatie en verantwoording
Reflectie en evaluatie
Zoals in mijn inleiding is te lezen, ben ik heel nieuwsgierig naar de ziekte neuroblastoom en naar
nieuwe behandelingsmogelijkheden. Ik heb de unieke gelegenheid gehad om in een academisch
onderzoekslaboratorium te mogen werken. Dit was een onvergetelijke ervaring voor mij waarin ik
kennis heb gemaakt met wetenschappelijk onderzoek. Dit geeft een stimulans om mij nog meer in te
zetten voor de medische wereld en om met veel plezier en enthousiasme mijn studie geneeskunde te
beginnen. Ondanks dat het wetenschappelijk onderzoek interessant en uitdagend was, kan ik niet
wachten om in een klinische setting daadwerkelijk met patiënten te maken te krijgen. Dan kan je
echt zien om wie het gaat en voor wie je het doet.
Het doen van onderzoek op universitair niveau was een geweldige kans die ik met beide handen heb
aangegrepen, maar het was een grotere uitdaging dan ik had verwacht. De onderzoekers in het
laboratorium zijn gewend om te werken met studenten die al een paar jaar basiskennis hebben
opgedaan. Vandaar dat het voor mij soms lastig was om alles in één keer te begrijpen. Het niveau lag
ontzettend hoog waardoor het af en toe zwaar was om het praktische gedeelte tot in detail kloppend
uit te werken.
Het liefst had ik alle punten genoemd in de discussie zelf willen onderzoeken en oplossen, maar
daarvoor zijn de mogelijkheden voor het maken van een profielwerkstuk te beperkt. Met bijna een
dubbel aantal uren dat moet worden besteed aan het maken van het profielwerkstuk, heb ik alles
eruit gehaald om er een boeiend, leerzaam en interessant verslag van te maken.
Ik hoop oprecht dat ik mijn kennis van en betrokkenheid bij dit onderwerp met veel enthousiasme
heb kunnen overdragen aan de lezers van mijn profielwerkstuk.
Verantwoording
Dit werkstuk heb ik individueel gemaakt, maar dit had ik niet kunnen doen zonder een aantal
mensen.
Als eerste dank ik graag Dr. Jan Molenaar, onderzoeker in het AMC. Het wetenschappelijk onderzoek
had ik niet kunnen doen zonder zijn medewerking. Hij heeft mij de gelegenheid gegeven om in de
‘keuken’ van zijn onderzoek rond te kijken, hetgeen ik met heel veel plezier heb gedaan.
Laurel Bate Eya heeft mij wegwijs gemaakt in de wereld van het laboratorium van het AMC. Hoewel
het door de taalbarrière soms lastig was, heeft zij mij goed geholpen om de resultaten te begrijpen
en mijn vragen te beantwoorden
Ook Marieke Bak heeft mij geholpen in mijn traject van het wetenschappelijke onderzoek. Zij zat
tijdens mijn periode in het AMC volop in haar eigen onderzoek voor haar studie biologie. Toch
Hoofdstuk: Reflectie, evaluatie en verantwoording
Hoewel ik het jammer vind dat ik de kans niet heb gekregen om daadwerkelijk in de kliniek mee te
mogen lopen, ben ik erg trots op mijn profielwerkstuk. Ik heb bijzonder veel geleerd in het
wetenschappelijk laboratorium van het AMC en tijdens mijn uitgebreide literatuuronderzoek.
33
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
maakte zij vaak tijd voor mij vrij om al mijn vragen te beantwoorden en alvast een opzet te maken
voor mijn uiteindelijke profielwerkstuk.
Ik ben bovengenoemde personen veel dank verschuldigd voor de tijd en moeite die zij aan mij
hebben besteed en de gelegenheid die zijn hebben geboden: een onvergetelijke ervaring!
Ik wil ook graag mijn profielwerkstukbegeleider en biologie docente Annemieke Wicherink hartelijk
danken voor haar kritische blik, opbouwende kritiek en onvoorwaardelijke hulp tijdens de
totstandkoming van mijn profielwerkstuk.
Hoofdstuk:
Ten slotte wil ik mijn ouders, zus en andere mensen om mij heen bedanken voor hun enthousiasme
en steun om mijn profielwerkstuk tot een goed einde te brengen.
34
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
IX
Geciteerde werken
U.S. National Library of Medicine.
(sd).
Opgeroepen
op
Januari
20,
2015,
van
http://www.maudvoorleven.nl/stichting/neuroblastoom
Maud
voor
Leven:
AZ
Sint-Blasius.
(sd).
Opgeroepen
op
Januari
20,
2015,
van
http://www.azsintblasius.be/zorgaanbod/d/hoofdpagradiolo/beeldvgynaecolo/Mammografi
e
Caron, H. N., de Kraker, J., & Voûte, P. A. (1997). Kinderoncologie. Houten/Diegem: Bohn Stafleu van
Loghum.
Chipuk, J. E., Bouchier-Hayes, L., & Green, D. R. (2006). Mitochondrial outer membrane
permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario. Cell Death and
Differentiation(13), 1396-1402.
Color Wheel with Wavelengths. Lehigh University Chemical Engineers.
Commissie Genetische Modificatie (COGEM). (sd). Termen & begrippen. Opgeroepen op november
12,
2014,
van
Cogem:
http://www.cogem.net/index.cfm/nl/qa/termenbegrippen/begrip/lentivirale-vector
Damjanov, I., McKinnell, R. G., Parchment, R. E., Perantoni, A. O., & Pierce, B. (2006). The Biological
Basis of Cancer, Second Edition. Cambridge University Press.
Davids, M. S., & Letai, A. (2013). ABT-199: Taking Dead Aim at BCL-2. Elsevier(2), 139-141.
De Graaf, A. O., & Jansen, J. H. (2004). Regulatie van apoptose in oncogenese. Nederlands tijdschrift
voor hematologie(5), 185.
Fresquet, V., Rieger, M., Carolis, C., García-Barchino, M. J., & Martinez-Climent, J. A. (2014, juni 26).
Acquired mutations in BCL3 family proteins conferring resistance to the BH3 mimetic ABT199 in lymphoma. Blood(26), 123.
Genentech USA. (2014, oktober 28). Apoptotic pathways. Opgeroepen op november 13, 2014, van
BioOncology: http://www.biooncology.com/research-education/apoptosis/pathways
GenTarget Inc. (2013). SureTiter Lentiviral System. Opgeroepen op november 12, 2014, van
GenTarget: http://www.gentarget.com/support/technology/suretiter-lentiviral-system/
GraphPad Software Inc. (2007). Prism 5 Manual. La Jolla, California, Verenigde Staten.
Hibelgaufts. (2002, januari). Opgeroepen op 11 19, 2014, van Cope With Cytokines:
http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi?key=MTT%20assay
Hoofdstuk: Geciteerde werken
Genentech. Selective BCL-2 inhibitor (GDC-0199/ABT-199). Selective BCL-2 inhibitor (GDC-0199/ABT199). Genentech & BioOncology.
35
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Integraal kankercentrum Nederland. (sd). Opgeroepen op Januari 25, 2015, van Cijfers over kanker:
http://www.cijfersoverkanker.nl/selecties/incidentie_kanker_totaal/img54cccdab6f098?div=
table&toggle=open
Johnson, M. (2012). Loading Controls for Western Blots. Princeton, New Jersey: Synatom Research.
Lamers, F. (2012). New Therapeutic Targets in the Intrinsic Apoptotic Pathway in Neuroblastoma.
Amsterdam.
Lamers, F., Schild, L., den Hartog, I. J., Ebus, M. E., Westerhout, E. M., Ora, I., et al. (2012). Targeted
BCL2 inhibition effectively inhibits neuroblastoma tumour growth. Elsevier, 3093-3103.
Letai, A., & Chonghaile, T. N. (2009). Mimicking the BH3 domain to kill cancer cells. Oncogene(27),
S149-S157.
Life Technologies. (sd). Lentiviral and adenoviral delivery of RNAi vectors. Opgeroepen op november
12, 2014, van Life Technologies: http://www.lifetechnologies.com/nl/en/home/lifescience/rnai/virus-based-rnai-analysis/lentiviral-shrna-and-mirna-analysis.html
Molenaar, J. J., Koster, J., Zwijnenburg, D. A., Van Sluis, P., Valentijn, L. J., Van der Ploeg, I., et al.
(2012). Sequencing of neuroblastoma identifies chromothripsis and defects in neuritogenesis
genes. Nature, 589-593.
Nitric Oxide Research Group. Caspases and the apoptosome. Caspases and the apoptosome. Nitric
Oxide Research Group.
O'Brien, M. A., Moravec, R. A., & Riss, T. L. (2001, april). Poly (ADP-Ribose) Polymerase Cleavage
Monitored in Situ in Apoptotic Cells. BioTechniques(30), 886-891.
QIAGEN. Regulation of mitochondrial apoptosis. Regulation of BAX mediated apoptosis by BCL2
family members. QIAGEN.
Schwartz, L. M., & Ashwell, J. D. (2001). Apoptosis. Academic Press.
Shamas-Din, A., Brahmbhatt, H., Leber, B., & Andrews, D. W. (2011). BH3-only proteins:
Orchestrators of apoptosis. Elsevier(4), 508-520.
Sigma-Aldrich Co. LLC. (2012). Opgeroepen op november 12, 2014, van Sigma-Aldrich:
http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigmaaldrich/docs/Sigma/Bulletin/shc001bul.pdf
Villa Joep. (2011, juli 6). Nieuws. Opgeroepen op november 12, 2014, van Villa Joep:
http://www.villajoep.nl/oznieuws.php?cat_Id=21&pub_Id=177
VOKK.
(sd).
Opgeroepen
op
Januari
20,
2015,
van
http://webwinkel.vokk.nl/_files/Neuroblastoom%20gereduceerd.pdf
www.vokk.nl:
Weinberg, R. A., & Varmus, H. (1995). Celdeling en Kanker. Maastricht/Brussel: Natuur & Techniek.
Hoofdstuk: Geciteerde werken
Shinryuu. MTT Plate.
36
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Hoofdstuk: Geciteerde werken
Youle, R. J., & Strasser, A. (2008). The Bcl-2 protein family: opposing activities that mediate cell
death. Nature(9), 47-59.
37
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
X
Bijlagen
1. Het verdunnen van ABT-199 in DMSO
Het berekenen van de verdunningen doet men door met telkens dezelfde vloeistof te verdunnen,
zo wordt verspilling tegengegaan. De berekening gaat met behulp van de formule:
C1 x V1 = C2 x V2  V1 = (C2 x V2) / C1
C1 = de startconcentratie van de ABT-199 in DMSO
V1 = het volume van de ABT-199 in DMSO die nodig is om de concentratie te krijgen
C2 = de concentratie van de ABT-199 die je in de cellen wilt hebben
V2 = het gewenste volume van de totale oplossing van ABT-199 in DMSO en medium
Voorbeeld: welk volume van een 10 mM stockoplossing is nodig om 20 ml van 50 μM van die
oplossing te maken?  V1 = 100 μL
De gewenste Te bereiden
concentratie concentratie
ABT-199
*
Te bereiden oplossing
Berekening
100 μM
200 μM
V1 = (200*4000)/10000 = 80 μL
50 μM
100 μM
20 μM
40 μM
15 μM
30 μM
10 μM
20 μM
5 μM
10 μM
1 μM
2 μM
0,1 μM
0,2 μM
0 μM
0 μM
80 μL van 10 mM ABT-199 in
DMSO in
3920 μL medium
2 mL van 200 μM ABT-199 in
2 mL medium+**
400 μL van 200 μM ABT-199 in
1600 μL medium+
600 μL van 100 μM ABT-199 in
1400 μL medium+
800 μL van 100 μM ABT-199 in
3200 μL medium+
2 mL van 20 μM ABT-199 in
2 mL medium+
1 mL van 10 μM ABT-199 in
4 mL medium+
500 μL van 2 μM ABT-199 in
4,5 mL medium+
Medium+
V1 = (100*4000)/200 = 2000 μL
V1 = (40*2000)/200 = 400 μL
V1 = (30*2000)/100 = 600 μL
V1 = (20*4000)/100 = 800 μL
V1 = (10*4000)/20 = 2000 μL
V1 = (2*5000)/10 = 1000 μL
V1 = (0,2*5000)/2 = 500 μL
*De waardes zijn het dubbele van de oorspronkelijke waardes omdat er al 50 μL DMEM in de wells
zit.
** Medium+ = 32 mL medium in 640 μL DMSO
Hoofdstuk: Bijlagen
V1 = 0 μL = alleen medium+
38
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
2. Equation: log (inhibitor) vs. normalized response – Variable slope & Converting concentration
to log(concentration) – (GraphPad Software Inc., 2007)
Introduction
Many log(inhibitor) vs. response curves follow the familiar symmetrical sigmoidal shape.
If you have good control data, it can make sense to normalize the response to run between 0%
and 100%. This model assumes that the data have been normalized, so forces the curve to run
from 100% down to 0%. The goal is to determine the EC50 of the inhibitor - the concentration that
provokes a response equal to 50%.
It only makes sense to fit a normalized model when you are sure you have defined 0% and 100%
quite accurately. If your data define a complete sigmoidal curve, it is best to fit the entire curve
and let Prism fit the Top and Bottom plateaus. If your data don't form a full sigmoidal curve, but
you can define the bottom and top by solid control data, then fitting to a normalized model is
preferable.
Many inhibitory dose-response curves have a standard slope of -1.0. This model does not assume
a standard slope but rather fits the Hill Slope from the data, and so is called a Variable
slope model. This is preferable when you have plenty of data points.
Step by step
Create an XY data table. Enter the logarithm of the concentration of the inhibitor into X. Enter
response into Y in any convenient units. Enter one data set into column A, and use columns B, C...
for different treatments, if needed.
If you prefer to enter concentrations, rather than the logarithm of concentrations, use Prism
to transform the X values to logs:
Transforming X values with Prism
All the dose-response equations built-in to Prism expect the X values to be the logarithm of dose
or concentration.
1. From the data table, click Analyze and then choose Transform, which is the very first analysis
listed on the Analyze dialog.
2. On the Transform dialog, check the option to transform X, and choose X=log(X) .At the
bottom of the dialog, check the option: Create a new graph of the results.
3. Go to the newly created graph.
Hoofdstuk: Bijlagen
If you entered actual doses or concentrations, instead of their logarithms, use Prism to transform
the X values.
39
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
From the data table, click Analyze, choose nonlinear regression, choose the panel of
equations "Dose-response curves - Inhibition" and then choose the equation "log(inhibitor)
vs. normalized response -- variable slope".
Model
Interpret the parameters
Hoofdstuk: Bijlagen
Y=100/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope)))
40
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Hoofdstuk: Bijlagen
HillSlope describes the steepness of the family of curves. A HillSlope of -1.0 is standard, and you
should consider constraining the Hill Slope to a constant value of -1.0. A Hill slope more negative
than -1 (say -2) is steeper.
41
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Begrippenlijst
Coulter Counter
Een apparaat om het aantal cellen in één milliliter
vloeistof te tellen.
Apoptose
Een mechanisme van een cel waarbij deze bij
beschadiging (van het DNA) processen activeert die
de cel uiteindelijk laten doodgaan.
Compound
Een combinatie van twee of meer verschillende
chemische elementen. In dit onderzoek is het een
voorloper op een medicijn.
DMEM
Dulbecco’s
Modified
Eagle
Medium,
een
groeimedium waarin cellen worden gevoed en
kunnen groeien.
DMSO
Een oplosmiddel met de kenmerken dat er hydrofobe
stoffen in kunnen oplossen, dat het niet kristalliseert
en dat cellen niet worden gedood in deze oplossing.
Eukaryoot
Cellen die een celkern bevatten.
Kanker
Een maligne (kwaadaardige) tumor welke zich
infiltreert in andere weefsels en uitzaait naar andere
delen van het lichaam; metastase.
KCNR
Een neuroblastoomcellijn afkomstig van patiënt K.C.
met een Neuroblastoma Relapse (terugkomst),
stadium 4.
Metastase
Het uitzaaien van tumorcellen naar andere delen van
het lichaam dan de plek van de primaire tumor.
Microplate Luminometer
Een apparaat dat wordt gebruikt om de absorptie van
vloeistoffen te meten.
MTT assay
Een colorimetrisch assay dat wordt gebruikt om de
levensvatbaarheid van cellen vast te stellen.
Multititerplaat
Een plaat met 96 wells waarin reacties kunnen
plaatsvinden. De verdeling is 8 x 12 wells.
Neuroblastoom
Een solide tumor die bij kinderen vóórkomt en wordt
gevormd tijdens de embryonale ontwikkeling van de
neurale lijst.
De eenheid gebruikt door de Microplate
Luminometer.
RLU (Relative Light Units)
SJNB-12
Een neuroblastoomcellijn afkomstig van patiënt S.J.
Hoofdstuk: Begrippenlijst
XI
42
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Well
Eén ruimte in de multititerplaat.
Western Blotting
Een biochemische techniek waarbij kan worden
vastgesteld of een specifiek eiwit in een bepaald
mengsel aanwezig is.
Hoofdstuk: Begrippenlijst
met een Neuroblastoom (NB).
43
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Logboek
Maand
Datum & tijd
Wat heb ik gedaan
Maart
6/3/2014
3 uur
April
17/4/2014
1 uur
Mei
6/5/2014
1 uur
Juni
2/6/2014
8 uur
Presentatieavond PWS van 6vwo-leerlingen. Ik heb deze
avond veel inspiratie opgedaan voor mijn PWS en tips
gekregen van deze leerlingen.
In dit uur heb ik onderzoek gedaan op internet naar
neuroblastoom. Zo heb ik artikelen en algemene
informatie verzameld die ik op internet heb kunnen
vinden.
PWS voorlichting van Wim Bax. We kregen hier informatie
over het PWS en ik ben toen na gaan denken over hoofden deelvragen.
Vandaag heb ik met Laurel Bate Eya, mijn
proefbegeleider, de eerste stappen van mijn onderzoek
ondernomen. We hebben de cellen van mijn gebruikte
cellijn (KCNR) geteld om te kijken of we genoeg hadden
om het onderzoek voort te zetten. Deze cellen hebben we
in twee platen gepipetteerd; een controleplaat en één
waar we later de compound (medicijn) aan gaan
toevoegen. Deze platen hebben we vervolgens in de
verwarmkast gezet om er de volgende dag weer mee
verder te gaan. Vervolgens kreeg ik een uitleg van mijn
algemene begeleider, Jan Molenaar, over de basis van
kanker en neuroblastoom in het bijzonder. Ook heeft hij
nog wat extra uitleg gegeven over de handelingen die ik
deze morgen heb verricht.
Deze dag hebben we de compound (ABT-199) in
verschillende concentraties toegevoegd aan de plaat (niet
de controleplaat). Van tevoren hebben we deze eerst
opgelost en vervolgens verdund. Aangezien de volumes
overal gelijk moeten zijn hebben we hierna medium
(DMEM, waarin de cellen ook oorspronkelijk opgelost
waren) toegevoegd. We hebben in het donker gewerkt
aangezien de compound in het licht wordt afgebroken.
Vervolgens heb ik weer extra uitleg gekregen over de
proef en nog wat berekeningen doorgegaan.
Vanochtend was er een wekelijkse werkbespreking.
Tijdens deze volledig Engels gesproken vergadering
vertellen twee teamleden wat zij in de afgelopen drie
maanden hebben onderzocht en wat voor resultaten ze
hieruit hebben gekregen. Deze woensdag was het de
beurt aan Ellen en Mohamed, maar hun onderzoek was
voor mij nog te complex om te begrijpen. Vervolgens
werd er een voorbeeld uit de praktijk laten zien: de
behandeling en vooruitgang van een patiëntje met
neuroblastoom. Er werd ook een duidelijke link gemaakt
met het onderzoek dat het team uitvoert en de resultaten
in de praktijk. Hierna kreeg ik een uitleg van Marieke Bak
(de studente door wie ik hier ben gekomen) over mijn
proefje en de verwerking van de resultaten. Ook heeft zij
mij nog wat verteld over haar onderzoek en studie.
3/6/2014
6 uur
4/6/2014
3,5 uur
Vragen /
knelpunten
Oplossing /
advies
Hoofdstuk: Logboek
XII
44
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
6/6/2014
3 uur
13/6/2014
7,5 uur
Augustus
19/8/2014
3,5 uur
25/8/2014
1 uur
29/8/2014
2 uur
September
Oktober
5/9/2014
3 uur
6/9/2014
1 uur
22/9/2014
2 uur
23/9/2014
2 uur
6/10/2014
2 uur
8/10/2014
2 uur
13/10/2014
1 uur
Donderdagochtend ben ik naar de muizen geweest. In het
AMC doen ze (uiteraard) ook onderzoek op muizen met
de compound zodat ze weten hoe het ongeveer in de
mens zou reageren. Hier waren immuun deficiënte
muizen en muizen zonder B-cellen. Deze diertjes hadden
neuroblastomen onder de huid of in de bijnieren, daar
waar de meeste neuroblastomen voorkomen. In het
eerste geval wordt de tumor opgemeten en in het tweede
geval wordt er luciferine ingespoten zodat de tumor licht
gaat geven. Ik mocht zelf niets doen aangezien er erg
strenge regels gelden en er dus niet zomaar andere
mensen met de muizen mogen werken. Daarna heb ik
samen met Jan nog de opzet van mijn PWS besproken en
heeft hij mij nog boeken en een artikel meegegeven.
Laurel heeft mij nog uitleg gegeven over het cellen tellen
van het begin deze week.
Deze ochtend hebben we MTT assay toegevoegd aan de
plaat. Dit MTT laat zien hoeveel cellen er nog actief zijn.
De cellen zullen door MTT van kleur veranderen. Na vier
uur voegen we een SDS/HCl-oplossing toe. Dit is een zure
zeepoplossing waardoor de reactie stopt en de
membranen knappen. Bij dit laatste was ik persoonlijk
niet aanwezig.
We zijn naar het wetenschapscongres in Leiden geweest.
Hier kregen we tips over literatuuronderzoek en zagen we
presentaties van 6vwo-leerlingen over hun PWS. Ik heb
goede tips gekregen voor mijn PWS en het onderzoek
doen naar bronnen.
Rondleiding in de universiteitsbibliotheek van de VU. Les
gekregen in het zoeken naar boeken en tips gekregen
over ons PWS. Ondertussen heb ik gezocht naar literatuur
over mijn onderwerp.
Gewerkt aan werkplan: onderzoek omschreven, bronnen Wat moet er
en definitieve deelvragen genoteerd.
bij de
theoretische
informatie?
Hoe groot
wordt mijn
praktisch
onderzoek in
mijn PWS?
Een korte
samenvatting
over de
theorie die je
tot nu toe
hebt geleerd.
Het praktisch
onderzoek
wordt een
deelvraag in
het PWS.
Gewerkt aan werkplan: planning voor de komende weken
en een samenvatting van de theoretische informatie
gemaakt.
Naar de VU-bibliotheek geweest om medische boeken te
zoeken en reserveringen op te halen. Thuis ben ik verder
gegaan met het uitwerken van mijn praktische onderzoek.
Uitwerken van mijn praktisch onderzoek.
Uitwerken van mijn praktisch onderzoek.
Uitwerken van mijn praktisch onderzoek.
Uitwerken van mijn praktisch onderzoek.
Uitwerken van mijn praktisch onderzoek.
Uitwerken van mijn praktisch onderzoek.
Hoofdstuk: Logboek
5/6/2014
6 uur
45
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
17/10/2014
2 uur
November
Materiaal en methode van het praktische onderzoek
afgemaakt.
Begonnen aan deelvraag Wat is kanker?
6/11/2014
2 uur
9/11/2014
5 uur
10/11/2014
3 uur
11/11/2014
6 uur
Uitwerken deelvraag Wat houdt de nieuwe behandeling
op basis van gentherapie in?
Uitwerken deelvraag Wat houdt de nieuwe behandeling
op basis van gentherapie in?
Uitwerken deelvraag Wat houdt het onderzoek naar deze
behandeling in?
Uitwerken deelvraag Wat houdt het onderzoek naar deze
behandeling in?
12/11/2014
6 uur
13/11/2014
3 uur
14/11//2014
2 uur
Uitwerken deelvraag Wat houdt het onderzoek naar deze
behandeling in?
Uitwerken deelvraag Wat houdt de nieuwe behandeling
op basis van gentherapie in?
Uitwerken en afronden deelvragen Wat houdt de nieuwe
behandeling op basis van gentherapie in? en Wat houdt
het onderzoek naar deze behandeling in?
Analyseren resultaten en uitwerken in het praktisch
verslag.
Afronden praktisch verslag en deelvragen Wat houdt de
nieuwe behandeling op basis van gentherapie in? en Wat
houdt het onderzoek naar deze behandeling in?
perfectioneren.
Uitwerken deelvragen Wat is neuroblastoom? en Wat zijn
de huidige behandelingen van neuroblastoom?.
Perfectioneren rest van het theoretisch gedeelte en
praktisch onderzoek.
Commentaar op het concept bekijken en antwoorden
proberen te vinden op de vragen.
PWS voortgangsgesprek.
19/11/2014
8 uur
Januari
Uitwerken van mijn praktisch onderzoek en voorbereiden
op afspraak met Laurel en Jan op 16/10/2014.
Afspraak op het AMC: laatste vragen en knelpunten
doorgenomen met Laurel en een paar vragen gesteld aan
Jan.
De grafiek van de resultaten proberen te maken De juiste
aangezien ik een verkeerde grafiek opgestuurd had grafiek kwam
gekregen.
er niet uit.
30/10/2014
1 uur
1/11/2014
2 uur
5/11/2014
1,5 uur
17/11/2014
3 uur
18/11/2014
3 uur
December
Uitwerken van mijn praktisch onderzoek.
22/12/2014
1 uur
09/01/2015
1 uur
20/01/2015
2 uur
22/01/2015
2 uur
24/01/2015
3 uur
25/01/2015
1 uur
Grafiek proberen te maken van resultaten.
De juiste
grafiek kwam
er voor een
tweede keer
niet goed uit.
Uitwerken deelvraag Wat is kanker en hoe ontstaat het?
Uitwerken deelvraag Wat is kanker en hoe ontstaat het?
Uitwerken deelvraag
neuroblastoom?
Uitwerken deelvraag
neuroblastoom?
Hoe
en
waar
ontstaat
Hoe
en
waar
ontstaat
18/10 mailtje
gestuurd naar
begeleider,
nog geen
antwoord
(4/11)
Weer een mail
gestuurd naar
begeleider,
nog geen
antwoord
(7/11)
Grafieken
ontvangen van
begeleider.
Hoofdstuk: Logboek
14/10/2014
1 uur
15/10/2014
4 uur
16/10/2014
1 uur
46
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
Uitwerken deelvraag Wat houden de verschillende stadia
van neuroblastoom in?
Uitwerken deelvraag Wat houden de verschillende stadia
van neuroblastoom in?
Uitwerkingen deelvraag Wat zijn de huidige
behandelingen van neuroblastoom?
Uitwerkingen deelvraag Wat zijn de huidige
behandelingen van neuroblastoom?
Uitwerken conclusie en discussie.
Uitwerken conclusie, discussie & reflectie.
Perfectioneren werkstuk.
Hoofdstuk:
Totaal
26/01/2015
2 uur
28/01/2015
3 uur
29/01/2015
2 uur
30/01/2015
2 uur
31/01/2015
5 uur
01/02/2015
6 uur
02/02/2015
6 uur
146 uur
47
NEUROBLASTOOM: ZICHT OP GENEZING? – Anne Hoffman – februari 2015
XIII
Eindnoten
1
(Caron, de Kraker, & Voûte, 1997)
(Caron, de Kraker, & Voûte, 1997)
3
(VOKK)
4
(Caron, de Kraker, & Voûte, 1997)
5
(Caron, de Kraker, & Voûte, 1997)
6
(Caron, de Kraker, & Voûte, 1997)
7
(Maud voor Leven)
8
(Lamers, et al., 2012)
9
(Shamas-Din, Brahmbhatt, Leber, & Andrews, 2011)
10
(Chipuk, Bouchier-Hayes, & Green, 2006)
11
(De Graaf & Jansen, 2004)
12
(Lamers, et al., 2012)
13
(De Graaf & Jansen, 2004)
14
(Villa Joep, 2011)
15
(Molenaar, et al., 2012)
16
(Villa Joep, 2011)
17
(Lamers, New Therapeutic Targets in the Intrinsic Apoptotic Pathway in Neuroblastoma, 2012)
18
(Johnson, 2012)
19
(Villa Joep, 2011)
20
(Commissie Genetische Modificatie (COGEM))
21
(Life Technologies)
22
(GenTarget Inc., 2013)
23
(O'Brien, Moravec, & Riss, 2001)
24
(Schwartz & Ashwell, 2001)
25
(Sigma-Aldrich Co. LLC., 2012)
26
(Davids & Letai, 2013)
27
(Davids & Letai, 2013)
Hoofdstuk: Eindnoten
2
48