RT-PCR - Moleculaire Pathologie
advertisement
26-2-2009 Aanvraag voor Moleculaire Diagnostiek Door patholoog Chromosomale translocatie detectie in sarcomen d.m.v. reverse-transcriptase PCR (RT-PCR) Uitgangsmateriaal: Paraffineweefsel Vriesweefsel Beenmergbiopten Cytologisch materiaal Marjolijn Ligtenberg 4e bijeenkomst werkgroep “moleculaire diagnostiek in de pathologie 27 februari 2009 Laboratorium Management Systeem Weefselbewerking (paraffine, vries, cellen, bloed) Registratie en controle aanvraag lab moleculaire diagnostiek • Aanvraag – barcode sticker • Weefsel intern of extern • Registratie aanvraag in eigen systeem Weefsel representatief - Percentage tumor/verdachte cellen door patholoog. Vooraf HE – dikke coupes – achteraf HE Laboratorium Management Systeem DNA/RNA isolatie Diagnostische test bv • Weefsel representatief • Voldoende materiaal (µg) • Kwaliteit voldoende • Translocatie-detectie • PCR • agarosegel DNA -> Sizeladder-PCR 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp RNA -> cDNA -> PCR huishoudgen 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp Doel: Aantonen van een specifieke translocatie mbv PCR 1 26-2-2009 Moleculair resultaat • Voorlopige uitslag • Weefsel representatief • Kwaliteit DNA / RNA • Voldoende verdachte / tumorcellen • Conclusie moleculaire test (bv ondersteunt wel/niet; sluit niet uit met restrisico) • Evt. overleg met aanvrager • Moleculair bioloog of bevoegd analist autoriseert uitslag • Moleculaire uitslag komt in patiëntenverslag (PALGA) • Patholoog integreert uitslag in eindconclusie RNA isolatie Paraffine PARAFFINE VRIES Opslag en Transport kamertemperatuur -80 °C ULV Stikstof / droogijs DNA / RNA +/- +++ Morfologie +++ (gefixeerd) + (ongefixeerd) Snijden microtoom cryostaat Weefsel Bewerking +++ +/- cDNA synthese • Deparaffineren • ProtK o.n • RNA-Bee • Chloroform • Isopropanol precipitatie • OD-meting • cDNA synthese Vries 1 dag 1,5 uur • Random hexameren • Supercript II • RNA-Bee • Chloroform • Isopropanol precipitatie • OD-meting • cDNA synthese 90% 75% 90% 75% 85% 85% 95% 90% • 10’ 20 C • 60’ 42 C • 3’ 95 C o o o Controle en translocatie specifieke 1-staps PCR’s Opzetten RT-PCR assay • Behoefte bij pathologen • Literatuurstudie: frequentie; exonfusies • Primerontwerp (amplicongrootte verschillende fusies) • Opzoeken van positieve controles (PALGA) • Optimalisatie RT-PCR • Validatie op positieve en negatieve controles • Sequentie-analyse • Vaststellen SOPs • Vastleggen standaard uitslagteksten Helman and Meltzer, nature review cancer, 2003 2 26-2-2009 Helman and Meltzer, nature review cancer, 2003 Helman and Meltzer, nature review cancer, 2003 • Literatuur: fusie tussen ETV6 exon 5 en NTRK3 exon 13 (nu 16) ETV6 exon 5 en NTRK3 exon 13 (nu 16) (Bourgeois et al., 2000) 110 bp PALGA selectie van mesoblastisch nefroom/ congenitaal fibrosarcoom 6 tumoren (1994-2003) Positieve controles: 3/6 pos; 2/6 ntb (oud, slecht RNA); 1 neg (SYT-SSX +) Negatieve controles: 0/16 pos • Primers in • • • Knezevich et al, Nat Genet 1998 ETV6 NTRK3 Helman and Meltzer, nature review cancer, 2003 exon 13 (nu 16) exon 5 HMBS 150bp. Herhaalde RNA isolatie en cDNA synthese levert niets op Official Symbol SS18 Official Full Name synovial sarcoma translocation, chromosome 18 Also known as SYT; SSXT; SYT-SSX1; SYT-SSX2; MGC116875; SS18 ETV6-NTRK3 110 bp primer-dimer pos ntb pos Synoviaal sarcoom RT-PCR SS18-SSX1/2 110 bp PBGD >> HMBS 150bp. 110 bp 3 26-2-2009 Overall survival of patients with localized disease at presentation Fig. 5 univariate P was 0.08, multivariate was P = 0.04 Discussie in literatuur: Vaak geen significant verschil Klinisch niet relevant Ladanyi, M. et al. Cancer Res 2002;62:135-140 Helman and Meltzer, nature review cancer, 2003 Copyright ©2002 American Association for Cancer Research Proces bekken met forse weke delen uitbreiding bij 17jarige jongen • • botpijpje bekken rechts Botfragmenten met reactieve ombouw en een small blue round celpopulatie IHC: CD99 sterk membraneus + Desmine; MyoD1; Myogenine Synaptophysine CK pan AE; CK8/18; EMA ; bcl-2 CD34; CD45; CD3; CD20; CD79a • tumor 10 X Ewing’s sarcoom: EWSR1-FLI1 translocaties PCR: A: 7 & 9 B: 7 & 7 C: 9 & 7 • • • • • bot Type 2 Type 1 Type 3 Moleculair onderzoek naar Ewing’s sarcoom translocaties Khoury, Expert rev. Mol. Diagn. (2008) Gevoeligheid RT-PCR afhankelijk van primer design patiënt pos neg Type 1 Ewing’s RT-PCR pos patiënt neg EWSR1 patiënt pos FLI1 neg patiënt pos neg 331 bp 155 bp HMBS 150 bp. patiënt pos HMBS 250 bp. neg patiënt pos neg EWSR1-FLI1 A EWSR1-FLI1 B 7&9 7&7 patiënt pos EWSR1-FLI1 C EWSR1-ERG A EWSR1-ERG B 9&7 7&9 7&6 neg PCR: A: 7 & 9 600 B: 7 & 7 425 C: 9 & 7 Type 2 397 221 Type 1 331 155 Primer set gebruikt door 583 o.a. Bridge et al, 407 Modern Pathology 2006 163 Type 3 264 89 205 153 649 473 229 Khoury, Expert rev. Mol. Diagn. (2008) 4 26-2-2009 FISH probes Nadelen RT-PCR (Vysis; break apart) CHN CHOP FKHR • Validatie en implementatie tijdrovend • Geen gevalideerde kits • Positieve controle materialen nodig • Moleculair biologische expertise en apparatuur nodig Voordelen RT-PCR • Kleine hoeveelheid en laag % tumorcellen voldoende • Op vriesmateriaal snelle diagnostiek mogelijk • Nieuwe fusiegenen makkelijk toe te voegen • Informatie over exacte variant van de fusiegenen • Informatie over fusiepartners Helman and Meltzer, nature review cancer, 2003 Met dank aan het team van het moleculaire diagnostieklab …. en de pathologen m.n. Paul Monique Marian Marjolijn Yvonne Patricia Annemiek Greet Monique Sandra Manja Riki Han van krieken Konnie Hebeda Piet Slootweg Uta Flucke Monika Looijen Willeke Blokx Pieter Wesseling 5
