Laura Vanbelle
advertisement
Bachelorproef TISPA, een alternatief? Vergelijkende studie tussen weefselprocessing met organische solventen of superkritische CO2. OLV Aalst – Asse – Ninove Pathologische ontleedkunde Moorselbaan 164, 9300 Aalst Promotors: Dr. Kris Van Der Steen – patholoog Mr. Robin Laplanche – hoofdlaborant Laura Vanbelle Departement GEZ-LA Bachelor Biomedische Laboratoriumtechnologie Afstudeerrichting Medische Laboratoriumtechnologie 2013-2014 Bachelor Biomedische laboratoriumtechnologie | Erasmus Hogeschool Brussel Departement Gezondheidszorg en Landschapsarchitectuur Laarbeeklaan 121 | B-1090 Jette | t +32 (0)2 472 52 00 | [email protected] | www.erasmushogeschool.be Voorwoord Bij aanvang van dit eindwerk zou ik eerst en vooral al de mensen willen bedanken die bijgedragen hebben tot de realisatie van mijn eindwerk. Eerst zou ik mijn promotoren Dr. Kris Van Der Steen, Robin Laplanche en Bart De Wiest willen bedanken voor de nodige begeleiding en nuttige opmerkingen gedurende mijn stageperiode. Ook wil ik hen bedanken om mij de kans te hebben gegeven om mijn eindwerk in het OLV Aalst te laten doorgaan. Daarnaast wil ik ook al de laboranten van de dienst Pathologische Ontleedkunde bedanken voor de hulp, en de aangename en leerrijke sfeer. Vervolgens ook een woord van dank aan de hogeschool, EHB, waarbij ik 3 jaar niet enkel kennis, maar ook manuele vaardigheden in een boeiende vorm kreeg aangeboden. Ik dank hierbij ook mijn stagementor, Elke Vanneste. Tenslotte wil ik mijn ouders en familieleden danken voor hun steun en kritische opmerkingen gedurende mijn hele opleiding. Hierbij wil ik in het bijzonder mijn ouders bedanken om mij de kans te hebben gegeven om deze opleiding te volgen. ii Organigram iii Inhoud Voorwoord ...............................................................................................................................................ii Organigram..............................................................................................................................................iii Lijst met afkortingen .............................................................................................................................. vii Lijst met figuren..................................................................................................................................... viii Lijst met grafieken ....................................................................................................................................x Lijst met tabellen ......................................................................................................................................x Samenvatting........................................................................................................................................... xi Abstract .................................................................................................................................................. xii Inleiding ................................................................................................................................................... 1 I Literatuurstudie ............................................................................................................................... 2 1 Inleiding ........................................................................................................................................... 2 2 Verschillende doorvoertoestellen ................................................................................................... 3 2.1 Tissue-Tek VIP E-300 (SAKURA) ............................................................................................... 3 2.1.1 Principe ............................................................................................................................ 3 2.1.2 Eigenschappen................................................................................................................. 5 2.2 ASP 300 S (LEICA)..................................................................................................................... 6 2.2.1 Principe ............................................................................................................................ 6 2.2.2 Eigenschappen................................................................................................................. 7 2.3 TISPA Processor I (TISPA MEDICAL) ......................................................................................... 8 2.3.1 Principe ............................................................................................................................ 8 2.3.2 Eigenschappen............................................................................................................... 11 3 Vergelijking .................................................................................................................................... 12 II Experimenteel studie .................................................................................................................... 13 1 Prijsberekening .............................................................................................................................. 13 2 1.1 ASP ......................................................................................................................................... 13 1.2 TISPA Processor I ................................................................................................................... 17 1.3 Bespreking ............................................................................................................................. 20 Doorvoertesten ............................................................................................................................. 21 2.1 Test 1, 2, 3 ............................................................................................................................. 21 2.1.1 Inleiding ......................................................................................................................... 21 2.1.2 Test 1 ............................................................................................................................. 22 2.1.3 Test 2 ............................................................................................................................. 22 2.1.4 Test 3 ............................................................................................................................. 23 iv 2.1.5 Resultaten + bespreking ................................................................................................ 24 2.1.5.1 Colon spierlaag .......................................................................................................... 24 2.1.5.2 Colon mucosa ............................................................................................................ 26 2.1.5.3 Vetweefsel ................................................................................................................. 28 2.1.5.4 Prostaat ..................................................................................................................... 30 2.1.5.5 Schildklier .................................................................................................................. 32 2.1.5.6 Nier ............................................................................................................................ 34 2.1.5.7 Baarmoederhals ........................................................................................................ 35 2.1.5.8 Tonsillen .................................................................................................................... 36 2.1.5.9 Huid ........................................................................................................................... 37 2.1.5.10 2.2 Lever ...................................................................................................................... 38 Krimptest ............................................................................................................................... 39 2.2.1 Materiaal ....................................................................................................................... 39 2.2.2 Methode ........................................................................................................................ 39 2.2.2.1 Weefselafmetingen voor het doorvoeren................................................................. 41 2.2.2.2 Weefselafmetingen na het doorvoeren .................................................................... 41 2.2.3 2.2.3.1 Berekeningen............................................................................................................. 42 2.2.3.2 Maag .......................................................................................................................... 45 2.2.3.3 Schildklier .................................................................................................................. 47 2.2.3.4 Tonsil ......................................................................................................................... 48 2.2.4 2.3 Resultaten...................................................................................................................... 42 Besluit ............................................................................................................................ 49 Doorvoertest voor kleine biopten ......................................................................................... 50 2.3.1 Materiaal ....................................................................................................................... 50 2.3.2 Methode ........................................................................................................................ 50 2.3.3 Resultaten + bespreking ................................................................................................ 52 2.4 2.3.3.1 Colon.......................................................................................................................... 52 2.3.3.2 Maag .......................................................................................................................... 53 Immunohistochemische kleuring .......................................................................................... 54 2.4.1 Materiaal ....................................................................................................................... 54 2.4.2 Methode ........................................................................................................................ 54 2.4.3 Resultaten + bespreking ................................................................................................ 56 2.4.3.1 ER kleuring ................................................................................................................. 56 2.4.3.2 PR kleuring ................................................................................................................. 57 2.4.3.3 Her2/Neu kleuring ..................................................................................................... 58 2.4.3.4 Her2/SISH kleuring .................................................................................................... 59 v 2.4.3.5 III Ki-67 kleuring ............................................................................................................. 60 Besluit ............................................................................................................................................ 61 Referenties ............................................................................................................................................ 62 Bijlagen .................................................................................................................................................. 63 vi Lijst met afkortingen AL: Antilichaam ASP: Advanced Smart Processor ER: Oestrogeen receptor FNAC: Fijne Naald Aspiratie Cytologie Gem.: Gemiddelde HE: Hematoxyline-eosine Her2: Human Epidermal growth factor Receptor 2 OLV: Onze-Lieve-Vrouw PR: Progesteron receptor SISH: Silver In Situ Hybridization UMCG: Universitair Medisch Centrum Groningen VIP: Vacuüm Infiltration Processor vii Lijst met figuren Figuur 1 Tissue-Tek VIP E300 (SAKURA) .................................................................................................. 3 Figuur 2 ASP 300 S (LEICA)....................................................................................................................... 6 Figuur 3 TISPA Processor I (TISPA MEDICAL) ........................................................................................... 8 Figuur 4 Werkingsprincipe TISPA Processor I ........................................................................................ 10 Figuur 5 Test 1; Colon spierlaag; ASP; HE 10x ....................................................................................... 24 Figuur 6 Test 1; Colon spierlaag; TISPA; HE 10x .................................................................................... 24 Figuur 7 Test 2; Colon spierlaag; ASP; HE 10x ....................................................................................... 24 Figuur 8 Test 2; Colon spierlaag; TISPA; HE 10x .................................................................................... 24 Figuur 9 Test 3; Colon spierlaag; ASP; HE 10x ....................................................................................... 24 Figuur 10 Test 3; Colon spierlaag; TISPA; HE 10x .................................................................................. 24 Figuur 11 Test 1; Colon mucosa; ASP; HE 40x ....................................................................................... 26 Figuur 12 Test 1; Colon mucosa; TISPA; HE 40x .................................................................................... 26 Figuur 13 Test 2; Colon mucosa; ASP; HE 40x ....................................................................................... 26 Figuur 14 Test 2; Colon mucosa; TISPA; HE 40x .................................................................................... 26 Figuur 15 Test 3; Colon mucosa; ASP; HE 40x ....................................................................................... 26 Figuur 16 Test 3; Colon mucosa; TISPA; HE 40x .................................................................................... 26 Figuur 17 Test 1; Vetweefsel; ASP; HE 10x ............................................................................................ 28 Figuur 18 Test 1; Vetweefsel; TISPA; HE 10x ......................................................................................... 28 Figuur 19 Test 2; Vetweefsel; ASP; HE 10x ............................................................................................ 28 Figuur 20 Test 2; Vetweefsel; TISPA; HE 10x ......................................................................................... 28 Figuur 21 Test 3; Vetweefsel; ASP; HE 10x ............................................................................................ 28 Figuur 22 Test 3; Vetweefsel; TISPA; HE 10x ......................................................................................... 28 Figuur 23 Test 1; Prostaat; ASP; HE 40x ................................................................................................ 30 Figuur 24 Test 1; Prostaat; TISPA; HE 40x ............................................................................................. 30 Figuur 25 Test 2; Prostaat; ASP; HE 40x ................................................................................................ 30 Figuur 26 Test 2; Prostaat; TISPA; HE 40x ............................................................................................. 30 Figuur 27 Test 3; Prostaat; ASP; HE 40x ................................................................................................ 30 Figuur 28 Test 3; Prostaat; TISPA; HE 40x ............................................................................................. 30 Figuur 29 Test 1; Schildklier; ASP; HE 40x ............................................................................................. 32 Figuur 30 Test 1; Schildklier; TISPA; HE 40x .......................................................................................... 32 Figuur 31 Test 2; Schildklier; ASP; HE 40x ............................................................................................. 32 Figuur 32 Test 2; Schildklier; TISPA; HE 40x .......................................................................................... 32 Figuur 33 Test 3; Schildklier; ASP; HE 40x ............................................................................................. 32 Figuur 34 Test 3; Schildklier; TISPA; HE 40x .......................................................................................... 32 Figuur 35 Test 1; Nier; ASP; HE 40x ....................................................................................................... 34 viii Figuur 36 Test 1; Nier; TISPA; HE 40x .................................................................................................... 34 Figuur 37 Test 3; Nier; ASP; HE 40x ....................................................................................................... 34 Figuur 38 Test 3; Nier; TISPA; HE 40x .................................................................................................... 34 Figuur 39 Test 1; Baarmoederhals; ASP; HE 40x ................................................................................... 35 Figuur 40 Test 1; Baarmoederhals; TISPA; HE 40x ................................................................................ 35 Figuur 41 Test 1; Tonsillen; ASP; HE 40x ............................................................................................... 36 Figuur 42 Test 1; Tonsillen; TISPA; HE 40x ............................................................................................ 36 Figuur 43 Test 1; Huid; ASP; HE 40x ...................................................................................................... 37 Figuur 44 Test 1; Huid; TISPA; HE 40x ................................................................................................... 37 Figuur 45 Test 3; Lever; ASP; HE 40x ..................................................................................................... 38 Figuur 46 Test 3; Lever; TISPA; HE 40x .................................................................................................. 38 Figuur 47 Macropath D toestel - Milestone srl ..................................................................................... 39 Figuur 48 Krimptest; Maag; links: ASP; rechts: TISPA; HE ..................................................................... 45 Figuur 49 Krimptest; Maag; ASP; HE 2x ................................................................................................. 45 Figuur 50 Krimptest; Maag; TISPA; HE 2x .............................................................................................. 45 Figuur 51 Krimptest; Maag; ASP; HE 10x............................................................................................... 45 Figuur 52 Krimptest; Maag; TISPA; HE 10x ............................................................................................ 45 Figuur 53 Krimptest; Schildklier; links: ASP; rechts: TISPA; HE ............................................................. 47 Figuur 54 Krimptest; Schildklier; ASP; HE 20x ....................................................................................... 47 Figuur 55 Krimptest; Schildklier; TISPA; HE 20x .................................................................................... 47 Figuur 56 Krimptest; Tonsil; links: ASP; rechts: TISPA; HE .................................................................... 48 Figuur 57 Krimptest; Tonsil; ASP; HE 20x .............................................................................................. 48 Figuur 58 Krimptest; Tonsil; TISPA; HE 20x ........................................................................................... 48 Figuur 59 Colon in papier; TISPA; HE 40x .............................................................................................. 52 Figuur 60 Colon in metalen zeef; TISPA; HE 40x ................................................................................... 52 Figuur 61 Colon in agar; TISPA; HE 40x ................................................................................................. 52 Figuur 62 Maag in papier; TISPA; HE 40x .............................................................................................. 53 Figuur 63 Maag in metalen zeef; TISPA; HE 40x .................................................................................... 53 Figuur 64 Maag in agar; TISPA; HE 40x.................................................................................................. 53 Figuur 65 Borst; ASP; ER 40x ................................................................................................................. 56 Figuur 66 Borst; TISPA; ER 40x .............................................................................................................. 56 Figuur 67 Borst; ASP; PR 40x ................................................................................................................. 57 Figuur 68 Borst; TISPA; PR 40x .............................................................................................................. 57 Figuur 69 Borst; ASP; Her2/Neu 40x ..................................................................................................... 58 Figuur 70 Borst; TISPA; Her2/Neu 40x .................................................................................................. 58 Figuur 71 Borst; ASP; Her2/SISH 40x ..................................................................................................... 59 Figuur 72 Borst; TISPA; Her2/SISH 40x .................................................................................................. 59 Figuur 73 Borst; ASP; Ki-67 40x ............................................................................................................. 60 ix Figuur 74 Borst; TISPA; Ki-67 40x .......................................................................................................... 60 Lijst met grafieken Grafiek 1 Superkritische fase................................................................................................................. 11 Lijst met tabellen Tabel 1 Volgorde van de reagentia in het VIP E300 doorvoertoestel ..................................................... 4 Tabel 2 Voorbeeld programmering van het VIP E300 toestel ................................................................. 5 Tabel 3 Volgorde van de reagentia in het ASP 300 S doorvoertoestel ................................................... 7 Tabel 4 Vergelijking tussen de doorvoertoestellen (VIP E300/ASP 300S/TISPA Processor I) ............... 12 Tabel 5 Logboek januari - februari ASP 300S ........................................................................................ 13 Tabel 6 Resultaat kostberekening per doorgevoerde cassette TISPA & ASP ........................................ 20 Tabel 7 Programma's beschikbaar op TISPA Processor I....................................................................... 22 Tabel 8 Overzicht van gebruikte weefselfragmenten voor de krimptest ............................................. 40 Tabel 9 Overzicht resultaten van de krimptest ..................................................................................... 43 x Samenvatting In de histologie worden afgenomen weefsels gefixeerd, ontwaterd en doordrongen met paraffine zodat hun oorspronkelijk structuur intact blijft. Hiervoor wordt een doorvoertoestel gebruikt. Door de jaren heen wordt er vooral gebruik gemaakt van een doorvoertoestel dat xyleen bevat. Ook het laboratorium Pathologische Ontleedkunde van het OLV Aalst bezit zo’n toestel. Het labo is op zoek naar een nieuw doorvoertoestel om een verouderd conventioneel toestel (Tissue Tek VIP E300) te vervangen. Sinds kort is er een nieuw toestel ontwikkeld dat xyleenvrij en sneller werkt. Het werkt sneller doordat er geen reinigingsstap nodig is tussen 2 processen. I.p.v. xyleen wordt er gebruik gemaakt van superkritische CO2. De twee toestellen worden vergeleken, hierbij wordt er gekeken naar het verbruik/kostprijs, de kwaliteit van de coupes met een HE- en immunohistochemische kleuring, het krimppercentage van de weefsels na doorvoeren, en de kwaliteit van kleine biopten doorgevoerd in beide toestellen. Voor de prijsberekening wordt er gekeken naar het verbruik aan reagentia en paraffine van elk toestel. Dit wordt herrekend naar de kostprijs per doorgevoerde cassette. Voor de testen met de HE- en immunohistochemische kleuringen worden 2 weefselfragmenten afgenomen van eenzelfde orgaan. Deze worden in aparte cassettes gestoken en vervolgens wordt de ene doorgevoerd in de ASP (met xyleen), terwijl de andere wordt doorgevoerd in de TISPA (xyleenvrij). Na het doorvoeren worden er coupes gemaakt en gekleurd (HE of immunohistochemisch) en beoordeeld op kwaliteit. Bij de immunohistochemische kleuringen wordt er vooral gelet op hoe sterk de cellen worden aangekleurd en of alles wat moet aankleuren ook wordt aangekleurd. Een andere test bespreekt het krimppercentage na het doorvoeren. Hierbij worden de weefsels voor en na het doorvoeren gemeten en wordt vervolgens het krimppercentage berekend. Als laatst worden er ook kleine biopten doorgevoerd door de 2 toestellen. Deze worden getest door deze op verschillende manieren in de cassettes te steken, dit kan in een papier, een metalen zeef of in agar. xi Abstract The histology sample tissues are fixed, dehydrated and impregnated with paraffin so that their original structure remains intact. For this purpose, a processor is used. Through the years, there will be mainly made a processor that includes xylene. Also the laboratory of pathological sciences of OLV Aalst owns such a processor. The lab is looking for a new processor extension to be replaced, currently it is an outdated processor (Tissue Tek VIP E300). Recently, a new processor has been developed, which is xylene free and works faster. It works faster because there is no cleaning step required between 2 cycles. Instead of the xylene, a supercritical CO2 is used in the processor. The two processors have been compared, this comparison will look at the consumption/cost, the quality of the sections with HE and immunohistochemical staining, the shrinkage of the tissue after processing, and the quality of small biopsies carried out in both processors. For the price calculation we will look at the consumption of reagents and paraffin of each processor. This is calculated to the cost for each cassette that is implemented. For the tests with the HE and immunohistochemical staining, 2 tissue fragments are taken from the same organ. There are inserted into separate cassettes and one is implemented in the ASP (using xylene), while the other is processed in the TISPA (xylene-free). Afterwards sections have been made and are stained (HE, immunohistochemical) and finally assessed for quality. In immunohistochemical staining the quality depends on how strong the cells are stained and if the cells that needs to be stained, also has been stained. Another test examines the shrinkage rate after processing. Here, the tissue before and after the processing is measured and the shrinkage percentage is then calculated. Last there are also small biopsies processed by the two processors. There are tested by stabbing in different ways, this can be done in the cassettes in a paper, a metal screen, or in agar. xii Inleiding Jaren lang wordt er gebruik gemaakt van klassieke doorvoertoestellen die verschillende reagentia verbruiken, zoals xyleen, ethanol en methanol. De laatste jaren worden om ecologische en gezondheidsredenen steeds meer doorvoertoestellen ontwikkeld die minder producten verbruiken. Ook kunnen deze toestellen sneller processen. Zo kunnen weefsels worden doorgevoerd m.b.v. microgolven of door gebruik te maken van vervangproducten voor xyleen, zoals isopropanol. Recent werd er een nieuw toestel ontwikkeld die weefsels kan doorvoeren zonder gebruik te maken van toxische reagentia, maar door gebruik te maken van superkritische CO2. De Tispa processor I werd ontwikkeld in het toenmalig Academisch ziekenhuis Groningen, nu het UMCG. In 2002 heeft Erik Bleuel, laborant in het pathologie labo van het UMCG, een artikel gelezen over superkritische CO2 in een wetenschappelijk tijdschrift. Hij begon zich af te vragen of het ook een vervanger zou kunnen zijn van xyleen, wat veel wordt gebruik in pathologische labo’s. Hij kreeg van het ziekenhuis toestemming om gezamenlijk met de TU Delft verder onderzoek te doen. Via de TU Delft kwamen ze in contact met FeyeCon BV in Weesp dat gespecialiseerd is in specifieke toepassingen voor CO2. Die samenwerking heeft geleid tot het eerste demonstratiemodel voor de Tispa Processor die gebruik maakt van CO2. Op basis van dit model is de toepassing gepatenteerd door het UMCG. Tispa Medical is opgericht door o.a. het UMCG en FeyeCon met als doel deze gepatenteerde oplossing verder te ontwikkelen tot een medisch apparaat. Ik heb de opdracht gekregen een klassiek doorvoertoestel (ASP) te vergelijken met een xyleenvrij doorvoertoestel (TISPA). Het doel van dit onderzoek is om na te gaan of de TISPA evengoed of beter werkt dan de ASP. In het labo pathologische ontleedkunde van Aalst zijn ze namelijk op zoek naar een vervangtoestel voor de VIP, een klassiek doorvoertoestel. 1 I Literatuurstudie 1 Inleiding In het labo pathologische ontleedkunde worden weefsels (histologie) en cellen (cytologie) onderzocht. Een derde deel zijn aanvullende technieken, die worden toegepast op cytologische en histologische preparaten. Deze technieken zijn de histochemie, immuunhistochemie en moleculaire technieken. De cytologie is opgedeeld in 2 soorten, nl. de niet-gynaecologische en de cervicovaginale cytologie. Cytologie is het onderzoek van cellen. De niet-gynaecologische cytologie wordt bepaald op cellen uit vochten. Dit kunnen uitscheidingen zijn door het lichaam of puncties en aspiraten uit holten (pleuravocht, cysten, bronchusaspiraat,…). Verder kunnen de cellen ook afkomstig zijn uit puncties of aspiraten van vaste weefsels/tumoren (FNAC of fijne naald aspiratie cytologie). De cervicovaginale cytologie wordt bepaald op cervicovaginale uitstrijken. Standaard worden de stalen voor cytologie gefixeerd in alcohol of Cytorich. Van deze suspensie wordt een dunnelaag cytologie vervaardigd en automatisch gekleurd via de Papanicolau-methode. Ten slotte komen er ook uitgestreken glaasjes toe in het labo die gekleurd moeten worden. In de histologie wordt de aard van het weefsel onderzocht, dit kan normaal, ontstekings- of tumorweefsel zijn. Alle weefsels worden gefixeerd in formaldehyde 4%. Een optimale fixatie duurt standaard tussen 6 en 48 uur. Voor borstweefsel is dit tussen 6 en 72 uur. Deze fixatietijd wordt vereist om de aanvullende immunohistochemische en moleculaire testen onder gestandaardiseerde omstandigheden uit te voeren. Voor of tijdens de fixatie wordt het weefsel macroscopisch geëvalueerd en beschreven. Voordat de weefsels worden doorgevoerd moeten ze versneden worden in stukken van maximum 4 mm dik. Deze weefselfragmenten worden in cassettes gestoken en vervolgens in het doorvoertoestel geplaats. Hier worden de weefsel ontwaterd en geïmpregneerd met paraffine. Omdat paraffine evenwel niet oplosbaar is in water, wordt het water in de weefsels eerst vervangen door alcohol. In de klassieke doorvoertoestellen, zoals VIP en ASP, wordt de alcohol dan vervangen door xyleen. Vermits paraffine oplosbaar is in xyleen, worden de weefsels dan doordrongen met paraffine. Na het doorvoeren worden de weefsels ingebed in paraffineblokken waarna deze worden versneden in weefselcoupes. De coupes worden daarna gekleurd, afgedekt en microscopisch beoordeeld door de patholoog. Deze stelt een diagnose en maakt een verslag op van wat hij heeft waargenomen. Dit verslag wordt doorgestuurd naar de aanvragende arts. De coupes en de blokken worden bewaard in een archiefruimte. 2 2 Verschillende doorvoertoestellen 2.1 Tissue-Tek VIP E-300 (SAKURA) Figuur 1 Tissue-Tek VIP E300 (SAKURA) 2.1.1 Principe Dit toestel wordt gebruikt om weefsels door te voeren: fixeren, dehydrateren en vervolgens impregneren met paraffine. De VIP is een gesloten systeem waardoor nauwelijks reagensdampen vrijkomen. In de retortkamer worden alle biopsies (in cassettes) in een rek geplaatst. De weefsels blijven gedurende de hele cyclus in deze kamer. De reagentia worden door middel van druk en vacuüm in en uit de retortkamer gepompt. De paraffine bevindt zich in andere containers dan de reagentia. Maar het mechanisme om de paraffine in de retort te brengen is dezelfde als bij de reagentia. (Sakura) 3 Hieronder wordt de volgorde van de reagentia die worden ingebracht weergegeven: Tabel 1 Volgorde van de reagentia in het VIP E300 doorvoertoestel Container 1 Inhoud 2 3 4 5 6 7 Formol 4% gebufferd Methanol pH7 Methanol Methanol Methanol Methanol Methanol Container 8 9 10 11 12 13 14 Inhoud Xyleen Xyleen Xyleen X-solve Isopropanol Water Actief Kool Formaldehyde 4% pH7: Dit zorgt ervoor dat het weefsel nog verder wordt gefixeerd vooraleer het doorvoerprogramma effectief start. Methanol: Methanol is de eerste stap in de dehydratatie. Methanol gaat het water vervangen in de weefsels. Xyleen: Xyleen wordt gebruikt als intermedium. Xyleen gaan de methanol vervangen in de weefsels. Paraffine: Xyleen in de weefsels wordt vervangen door paraffine. X-solve, isopropanol, water en actieve kool: Deze reagentia worden gebruikt tijdens de cleaningcyclus. Schematisch: 4 De programmering van het toestel kan zelf worden ingesteld. Hieronder wordt er een voorbeeld weergegeven van hoe het toestel in een routinelabo kan worden ingesteld: Tabel 2 Voorbeeld programmering van het VIP E300 toestel 2.1.2 Eigenschappen → → → → → Capaciteit van 300 cassettes 9 verschillende programma’s programmeerbaar Bevat geen roerder in retort Bevat een overloop beveiliging Alarmfunctie met koppeling telefoon 5 2.2 ASP 300 S (LEICA) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Figuur 2 ASP 300 S (LEICA) 18. 19. 20. 21. 22. 23. Basisapparaatinfiltratie module Basisapparaatreagensmodule Deksel paraffinebaden Deksel retorten Beeldscherm Klapdeksel apparaatconsole Apparaatconsole Printerpoort Aansluiting voor lokaal alarm Aansluiting voor afstand alarm Diskettestation Seriële interface Koolstoffilter Condens container Reagenscontainer 16. Lekbak 17. Paraffineafvoer opening Reagens vulopening Retort Paraffinebaden Cassettemand Deksel voor cassettemand Slingerschot 2.2.1 Principe Ook dit toestel wordt gebruikt om weefsels door te voeren: fixeren en dehydrateren. Uiteindelijk worden de weefsels ook geïmpregneerd met paraffine. De ASP is een gesloten modulaire weefseldoorvoerprocessor waardoor bijna geen reagensdampen vrijkomen. De ASP bevat net als de VIP een retortkamer waarin een rek met de cassettes wordt geplaatst. De reagentia en de paraffine worden telkens naar de retortkamer gepompt en vervolgens terug naar hun opslagcontainer. (Leica) 6 Hieronder wordt de volgorde van de reagentia die worden ingebracht weergegeven: Tabel 3 Volgorde van de reagentia in het ASP 300 S doorvoertoestel Container 1 2 3 4 5 6 7 Inhoud Formol 4% gebufferd pH7 Ethanol 80% Ethanol 80% Methanol Methanol Methanol Methanol Container 8 9 10 11 12 13 14 Inhoud Condens Xyleen Xyleen Xyleen Xyleen cleaning Isopropanol Isopropanol cleaning cleaning Formaldehyde 4% pH 7: Dit zorgt ervoor dat het weefsel nog verder wordt gefixeerd vooraleer het doorvoerprogramma effectief start. Ethanol 80%: Ethanol is de eerste stap in de dehydratatie. M.b.v. een gradiënt vervangt de ethanol het water in de weefsels. Methanol: Methanol is de volgende stap in de dehydratatie. Methanol gaat het water verder vervangen in de weefsels. Xyleen: Xyleen wordt gebruikt als intermedium. De xyleen gaat de alcohol in de weefsels vervangen. Paraffine: De xyleen in de weefsels wordt vervangen door paraffine. 2.2.2 Eigenschappen → → → → → Capaciteit van 300 cassettes 15 verschillende programma’s programmeerbaar Het vervangen van de reagentia kan ook via automatische pompen gebeuren Bevat roerder in retort Alarmfunctie met koppeling telefoon 7 2.3 TISPA Processor I (TISPA MEDICAL) Figuur 3 TISPA Processor I (TISPA MEDICAL) 2.3.1 Principe De TISPA gebruikt superkritische CO2 om de weefsels te dehydrateren en om paraffine in de weefsels in te brengen. Eerst wordt het weefsel ondergebracht in een mengsel van superkritische CO2 en ethanol om het aanwezige water te vervangen. Vervolgens wordt het water/ethanol mengsel verwijderd door een continue flow van superkritische CO2. Stapsgewijs wordt de superkritische CO2 in het weefsel vervangen door paraffine. Nadat paraffine is binnengedrongen in het weefsel zal de druk verlaagd worden. Het CO2-gehalte wordt gelijkmatig verlaagd. (TISPA Medical, 2012) 8 9 Figuur 4 Werkingsprincipe TISPA Processor I (TISPA Medical, 2012) 10 Superkritische CO2: Koolstofdioxide wordt vaak gebruikt in zijn superkritische fase. Om deze fase te bereiken moet de druk hoger zijn dan 73 bar en moet de temperatuur hoger zijn dan 31 °C. Grafiek 1 Superkritische fase (Wikipedia afbeeldingen, 2013) Een superkritische vloeistof wordt gedefinieerd als een substantie waarbij zowel de druk als de temperatuur boven de kritische waarden liggen. Deze vloeistof bezit de eigenschappen van zowel een gas als van een vloeistof. De CO2 die gebruikt wordt in de TISPA Processor I is dezelfde CO2 als gebruikt in bv. spuitwater en is afkomstig van het terugwinnen uit andere industriële processen. Deze CO2 draagt dus niet bij aan het broeikaseffect. 2.3.2 Eigenschappen → 50 cassettes/rek x 2 reactoren = capaciteit van 100 cassettes/run → Doorvoertijd: 4,5 u ( dikte weefsel 4 mm MAX) 2,5 u (dikte weefsel < 4 mm) → Zuivere ethanol: 2,5 l nodig voor 1 run → Paraffine: 100-200 g nodig voor 1 run → Superkritische CO2. Doordat CO2 een gevaarlijk gas is als deze in hoge concentraties aanwezig is in een kleine afgesloten ruimte, bevat het toestel ook veiligheidssensoren. Wanneer de concentratie CO2 in de omgeving te hoog is, slaat het toestel in alarm en stopt de run onmiddellijk. 11 3 Vergelijking Tabel 4 Vergelijking tussen de doorvoertoestellen (VIP E300/ASP 300S/TISPA Processor I) Tissue-Tek VIP E-300 Cleancycles Noodzakelijk Reagentia ASP 300S Noodzakelijk TISPA Processor I Niet nodig → Gebufferde formol 4% → Gebufferde formol 4% → Zuivere ethanol → Methanol → Ethanol 80% → superkritische CO2 → Xyleen → Methanol → Paraffine → X-solve → Xyleen → Isopropanol → Isopropanol → Water → Paraffine → Actieve kool → Paraffine Max. # Cassettes 300 240 – 300 100 Tijd/cyclus Overnacht 10h, ook mogelijk voor speciale programma’s voor kleine biopten Overnacht 10h, ook mogelijk voor speciale programma’s voor kleine biopten 1 u 30 min XS 2 u 20 min SMALL 3 u 30 min LARGE 4 u 10 min XL Afhankelijk van grootte van de weefsels Fixatie in toestel Mogelijk Mogelijk Niet mogelijk 12 II Experimenteel studie 1 Prijsberekening 1.1 ASP De ASP bevat 2 containers ethanol, 5 containers methanol, 3 containers xyleen en 3 paraffinebaden. Voor het verversen van de reagentia wordt er een doorschuifsysteem toegepast. Bvb. methanol doorschuifsysteem: Container 1 is de oudste, minste geconcentreerde methanol. Container 5 is de nieuwste, meest geconcentreerde methanol. Container 1 wordt vervangen door container 2, 2 door 3, 3 door 4, 4 door 5 en in container 5 wordt er zuiver/nieuw solvent geplaatst. Dit doorschuifsysteem wordt ook toegepast op de andere reagentiacontainers. Tabel 5 Logboek januari - februari ASP 300S DATUM WERK HOEVEELHEID 6/jan BIDON 2 ETHANOL 80% VERVANGEN 4L ETHANOL 99,8% + 1L WATER 6/jan ISOPROPANOL 1 CLEANCYCLES VERVANGEN 5L 6/jan ISOPROPANOL 2 CLEANCYCLES VERVANGEN 5L 8/jan FORMALDEHYDE 4% VERVANGEN 5L 8/jan BIDON 6 METHANOL VERVANGEN 5L 9/jan BIDON 9 XYLEEN VERVANGEN 5L 14/jan BIDON 10 XYLEEN VERVANGEN 5L 14/jan PARAFFINEBAD 2 VERVANGEN 4,3L / 4KG 15/jan BIDON 3 ETHANOL 80% VERVANGEN 4L ETHANOL 99,8% + 1L WATER 16/jan FORMALDEHYDE 4% VERVANGEN 5L 20/jan BIDON 7 METHANOL VERVANGEN 5L 22/jan BIDON 2 ETHANOL 80% VERVANGEN 5L 22/jan BIDON 8 XYLEEN VERVANGEN 5L 13 22/jan PARAFFINEBAD 1 VERVANGEN 4,3L / 4KG 22/jan ISOPROPANOL 1 CLEANCYCLES VERVANGEN 5L 22/jan ISOPROPANOL 2 CLEANCYCLES VERVANGEN 5L 22/jan XYLEEN CLEANCYCLES VERVANGEN 5L 24/jan FORMALDEHYDE 4% VERVANGEN 5L 29/jan PARAFFINEBAD 3 VERVANGEN 4,3L / 4KG 30/jan BIDON 3 ETHANOL 80% VERVANGEN 4L ETHANOL 99,8% + 1L WATER 30/jan BIDON 5 METHANOL VERVANGEN 5L 31/jan BIDON 4 METHANOL VERVANGEN 5L 31/jan BIDON 9 XYLEEN VERVANGEN 5L 5/feb FORMALDEHYDE 4% VERVANGEN 5L 5/feb ISOPROPANOL 1 CLEANCYCLES VERVANGEN 5L 5/feb ISOPROPANOL 2 CLEANCYCLES VERVANGEN 5L 7/feb BIDON 10 XYLEEN VERVANGEN 5L 10/feb BIDON 2 ETHANOL 80% VERVANGEN 5L 10/feb BIDON 6 METHANOL VERVANGEN 5L 10/feb XYLEEN CLEANCYCLES VERVANGEN 5L 11/feb PARAFFINEBAD 2 VERVANGEN 4,3L / 4KG 13/feb FORMALDEDYDE 4% VERVANGEN 5L 13/feb PARAFFINEBAD 3 VERVANGEN 4,3L / 4KG 18/feb BIDON 8 XYLEEN VERVANGEN 5L 21/feb BIDON 7 METHANOL VERVANGEN 5L 21/feb ISOPROPANOL 1 CLEANCYCLES VERVANGEN 5L 21/feb ISOPROPANOL 2 CLEANCYCLES VERVANGEN 5L 24/feb FORMALDEHYDE 4% VERVANGEN 5L 26/feb BIDON 2 ETHANOL 80% VERVANGEN 5L 26/feb PARAFFINEBAD 3 VERVANGEN 4,3L / 4KG 26/feb XYLEEN CLEANCYCLES VERVANGEN 5L 27/feb BIDON 9 XYLEEN VERVANGEN 5L Paraffine: Verbruik maand januari 12 kg 3 x 4 kg paraffine = 3 x 16,90 = € 50,70 Verbruik maand februari 12 kg 3 x 4 kg paraffine = 3 x 16,90 = € 50,70 14 Formaldehyde 4%: Verbruik maand januari 15 l x 5 l formaldehyde 4% = 3 x 2,95 = € 8,85 Verbruik maand februari 15 l Ethanol: 3 x 5 l formaldehyde 4% = 3 x 2,95 = € 8,85 Verbruik maand januari 12 l 3 x 4 l ethanol = 3 x 9,34 = € 28,02 Verbruik maand februari 8 l 2 x 4 l ethanol = 2 x 9,34 = € 18,68 Methanol: Verbruik maand januari 20 l 4 x 5 l methanol = 4 x 4,95 = € 19,80 Verbruik maand februari 10 l 2 x 5 l methanol = 2 x 4,95 = € 9,90 Xyleen: Verbruik maand januari 25 l 5 x 5 l xyleen = 5 x 8,48 = € 42,40 Verbruik maand februari 25 l 5 x 5 l xyleen = 5 x 8,48 = € 42,40 Isopropanol: Verbruik maand januari 20 l 4 x 5 l isopropanol = 4 x 8,90 = € 35,60 Verbruik maand februari 20 l 4 x 5 l isopropanol = 4 x 8,90 = € 35,60 Afvalverwerking: Januari: € 176,68 Februari: € 176,68 Totaal maand januari: € 50.70 € 8.85 € 28.02 € 19.80 € 42.40 € 35.60 € 176,68 ------------€ 362,05 15 Totaal maand februari: € 50,70 € 8,85 € 18,68 € 9,90 € 42,40 € 35,60 € 176,68 ------------€ 342,81 Prijs per cassette: Aantal cassettes maand januari: 1877 € 362,05 / 1877 = € 0,19 Aantal cassettes maand februari: 1788 342,81 / 1788 = € 0,19 16 1.2 TISPA Processor I De TISPA Processor I gebruikt bij elke run verse reagentia. De reagentia worden, na elke run, naar de wastebidon gestuurd. De wastebidon bevat uiteindelijk een mengeling van ethanol en paraffine. De firma Tispa Medical had een kostprijs berekening uitgevoerd. Dit wordt vergeleken met deze prijsberekening. Paraffine: Dagelijks wordt er gecontroleerd of er nog voldoende aanwezig is in het toestel. Wanneer er reagentia ontbreekt, zal het toestel niet opgestart kunnen worden. Het toestel moet dan met de nodige reagentia bijgevuld worden. Om de maand wordt de paraffinetank eens volledig leeg gemaakt en wordt deze opnieuw gevuld met nieuwe vloeibare paraffine. Er wordt 100200g paraffine verbruikt per run. Dichtheid paraffine: 0,85 g/cm3 Capaciteit paraffinetank in het toestel: 5,0l = 5000 cm3 Dus aantal paraffine in tank: 4250 g = 4,250 kg ≈ 4 kg Prijs aankoop per zak van 15 kg: € 63,50 Prijs aankoop per 4 kg: € 16,90 Verbruik 2 weken in januari: 2,6 L = 2600 cm3 2600 x 0,85 = 2210 g = 2,210 kg € 9,34 Verbruik per maand: € 18,68 TISPA Medical: € 4,00 per 100 cassettes € 0,008 per cassette Ethanol: Dagelijks wordt er gecontroleerd of er nog voldoende aanwezig is in het toestel. Wanneer er niet meer voldoende aanwezig is, geeft het toestel hiervoor een melding. Het toestel kan dan niet opgestart worden. Het toestel start niet wanneer er minder dan 2,7l ethanol aanwezig is in het toestel. Er wordt tussen 1,2 en 2,4l ethanol verbruikt per run. Ethanol om de 5 cycli vervangen Capaciteit ethanoltank in het toestel: 10,0 l Prijs aankoop per bidon van 5,0l: € 11,67 Prijs aankoop per 10,0l: € 23,34 17 Verbruik 2 weken in januari: 35 L 3,5 x 10 L 3,5 x 23,34 = € 81,69 Verbruik per maand: € 163,38 TISPA Medical: € 5,10 per 100 cassettes € 0,082 per cassette CO2: Dagelijks wordt er gecontroleerd of er nog voldoende aanwezig. Er zijn 2 flessen gekoppeld aan het toestel. Wanneer de eerste leeg is wordt de tweede automatisch ingezet. Prijs aankoop per fles: € 16.36 Verbruik 2 weken in januari: 7 flessen 7 x 16,36 = € 114,52 Verbruik per maand: € 289,04 TISPA Medical: € 1,00 per 100 cassettes € 0,083 per cassette Waste verwerking: Dagelijks wordt er gecontroleerd of de wastetank niet te vol zit. Indien er meer dan 7l in zit zal het toestel niet starten en geeft het toestel een melding dat de wastetank moet worden vervangen. De wastetank heeft een totaal volume van 10,0l. Verbruik 2 weken in januari: 2 bidons waste = 30 kg 420 euro / ton afval € 12,6 Verbruik per maand: € 25,20 TISPA Medical: € 3,00 per 100 cassettes Totaal per maand: € 18,68 € 163,38 € 289,04 € 25,20 --------------€ 496,30 18 Prijs per cassette per maand: Aantal cassettes: 692 € 496,30 / 692 = € 0,72 Uiteraard kan er uit deze berekening geen correct besluit worden getrokken. Het toestel is niet met zijn volledige capaciteit gebruikt geweest. Er kunnen 100 cassettes per run worden doorgevoerd, dit is nooit gebeurt. Er werden telkens minder dan 50 cassettes/run doorgevoerd. Prijs volgens TISPA Medical: Cassesstes / year Fixed cost per cassette 120 000 € 0,22 100 000 € 0,27 80 000 € 0,33 60 000 € 0,44 40 000 € 0,66 19 1.3 Bespreking Tabel 6 Resultaat kostberekening per doorgevoerde cassette TISPA & ASP Prijs per doorgevoerde cassette (€) ASP 300 0,19 TISPA Processor I 0,72 TISPA Processor I (volgens TISPA Medical) 0,22 – 0,66 Na de berekeningen van de kosten van het verbruik van de 2 toestellen blijkt dat de TISPA Processor I meer kost per doorgevoerde cassette. Toch moet dit besluit met een korreltje zout genomen worden. Er zijn niet evenveel cassettes doorgevoerd met de TISPA als met de ASP. De runs van de ASP bevatten meer cassettes dan de runs van de TISPA. Gemiddeld werden 103 cassettes per run doorgevoerd met de ASP. Met de TISPA is dit gemiddelde 22. Verder is er een verschil in verbruik van reagentia. De ASP doorloopt verschillende runs met dezelfde reagentia. De TISPA gebruikt bij elke run verse reagentia. Hierdoor ligt het verbruik bij de TISPA hoger. Beide toestellen verbruiken ethanol, maar in de ASP wordt deze verdund gebruikt terwijl de ethanol die gebruikt wordt in de TISPA puur (99,8%) is. Ook wordt er in de TISPA Processor I steeds gebruik gemaakt van verse paraffine. De paraffine die overbodig wordt ingevoerd in de vaten, wordt naar de waste gestuurd. Bij de ASP wordt deze paraffine gerecycleerd en verbruikt bij de volgende runs. 20 2 Doorvoertesten 2.1 Test 1, 2, 3 2.1.1 Inleiding Het labo bevat 2 doorvoertoestellen, de VIP en de ASP. De VIP zou moeten vervangen worden. Er moet een keuze gemaakt worden tussen een klassiek doorvoertoestel die toxische producten verbruikt en een nieuwer doorvoertoestel die het gebruik van toxische producten tot een minimum beperkt of zelfs helemaal zonder toxische producten werkt. In deze test willen we het klassieke doorvoertoestel, ASP, van de dienst vergelijken met de TISPA. We willen de gebruiksvriendelijkheid en het verbruik van de reagentia vergelijken. Het meest doorslaggevende argument is evenwel de kwaliteit van het doorgevoerde materiaal. Daarom worden weefsels doorgevoerd op de ASP en TISPA die eenzelfde fixatieduur hebben. Enkel weefsel gepreleveerd van grote resectiestukken worden doorgevoerd met de 2 toestellen en vervolgens vergeleken. Welke weefsel doorgevoerd worden bij de verschillende testen, was afhankelijk van het aanbod. 3 doorvoertesten werden uitgevoerd, telkens werd hetzelfde materiaal en dezelfde werkmethode toegepast. Materiaal: Cassettes + deksels Weefselprelevementen TISPA Processor I + reagentia ASP 300 Leica + reagentia Ethanol 70 % Methode: De grote weefselstukken worden zodanig versneden dat er een zo globaal mogelijk beeld kan verkregen worden uit één coupe. Er moet op gelet worden dat de weefsels niet te dik versneden worden zodat het doorvoeren zo optimaal mogelijk kan verlopen. De kleine weefselfragmentjes worden in papiertjes verpakt in de cassettes. Dit wordt gedaan om te voorkomen dat de kleine fragmenten door de opening in de cassette heen vallen. Wanneer de biopten extreem klein zijn, worden deze gekleurd met Chinese inkt om ze na het doorvoeren gemakkelijker terug te vinden. Elk soort weefsel wordt in verschillende cassettes gestoken met subnummers. Enkele cassettesubnummers gaan doorgevoerd worden met de TISPA Processor I en de rest wordt doorgevoerd met de ASP. Voordat de weefsels worden doorgevoerd, worden ze bewaard/gefixeerd in formaldehyde 4 %. 21 2.1.2 Test 1 2 programma’s van de TISPA werden gebruikt voor het doorvoeren. Voor de grote macroscopische weefselfragmenten werd het programma XL gebruikt en voor de kleine macroscopische weefselfragmenten werd het SMALL programma gebruikt. De weefsels bevinden zich in het toestel bij een temperatuur tussen 0 – 65 °C en bij een druk tussen 0 – 150 bar gedurende het doorvoeren. Details over de programma’s zijn niet gekend. Tabel 7 Programma's beschikbaar op TISPA Processor I Programma Weefselafmetingen Tijd XS Naald biopten 1 u 30 min 1 mm x 1 mm x 1 cm SMALL Klein chirurgisch materiaal 2 u 20 min 2 mm x 2 mm x 1 cm LARGE Standaard mix weefsels 3 u 30 min 4 mm x 2 cm x 2 cm XL Moeilijk weefsel 4 u 10 min 4 mm x 2 cm x 2 cm Programma XL: Tijd in ethanol: ? Tijd in CO2: ? Tijd in paraffine: ? Programma SMALL: Tijd in ethanol: ? Tijd in CO2: ? Tijd in paraffine: ? 2.1.3 Test 2 De resultaten van de weefselcoupes in test 1, na het doorvoeren met de TISPA, voldeden niet aan de verwachtingen. Hierdoor werden de programma’s van de TISPA Processor I, XL en SMALL, aangepast door de firma. De ethanol wordt nu in 4 cycli door het weefsel gestuurd i.p.v. in 2 langere cycli. De hoeveelheid ethanol dat verbruikt wordt blijft gelijk. 22 2.1.4 Test 3 Doordat de resultaten van ‘Test 1’ en ‘Test 2’ niet optimaal waren, werd er een kleine verandering aangebracht aan de werkwijze. De weefsels werden vermoedelijk niet voldoende ontwaterd waardoor er scheuren/gaten in de weefselcoupes zichtbaar waren. Dit zou o.a. kunnen te wijten zijn aan de papiertjes in de cassettes die teveel water vasthouden wanneer ze worden bewaard in formaldehyde 4 %. Als mogelijke oplossing hiervoor werd er getest of er betere resultaten worden bereikt wanneer de cassettes, voor het doorvoeren, kort worden ondergedompeld in 70 % ethanol. Dit zou het water uit de papiertjes verwijderen. Hiervoor werd er dus ethanol 70 % gemaakt: 350 ml ethanol 99,8 % + 150 ml gedestileerd water De subnummers die worden doorgevoerd met de TISPA Processor I worden uit de pot met formaldehyde 4 % verwijderd en afgedroogd. Vervolgens worden deze gedurende 5 min in een pot met ethanol 70 % gestoken. Na 5 min worden de cassettes opnieuw goed afgedroogd en doorgevoerd met de TISPA Processor I. 23 2.1.5 Resultaten + bespreking 2.1.5.1 Colon spierlaag Figuur 5 Test 1; Colon spierlaag; ASP; HE 10x Figuur 6 Test 1; Colon spierlaag; TISPA; HE 10x Figuur 7 Test 2; Colon spierlaag; ASP; HE 10x Figuur 8 Test 2; Colon spierlaag; TISPA; HE 10x Figuur 9 Test 3; Colon spierlaag; ASP; HE 10x Figuur 10 Test 3; Colon spierlaag; TISPA; HE 10x 24 Bespreking: De foto’s tonen de spierlaag van een colon, links (fig. 5, 7, 9) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 6, 8, 10) in de TISPA. Na test 1 is het opvallend dat het weefsel doorgevoerd door de TISPA meer scheuren vertoont dan het weefsel doorgevoerd door de ASP. Dit was reeds opgevallen tijdens het snijden van de coupes. De weefsels uit de TISPA hadden een hardere structuur, men vermoedt dat dit aanleiding geeft tot het scheuren van de weefsels. Ook na test 2 worden de scheuren waargenomen bij de weefsels uit de TISPA. Bij test 3, waarbij het weefsel werd ondergedompeld in ethanol 70% voor het doorvoeren, zijn er minder scheuren aanwezig. Algemeen wordt vastgesteld dat de kleurintensiteit van de weefsels uit de TISPA hoger is dan die uit de ASP. 25 2.1.5.2 Colon mucosa Figuur 11 Test 1; Colon mucosa; ASP; HE 40x Figuur 12 Test 1; Colon mucosa; TISPA; HE 40x Figuur 13 Test 2; Colon mucosa; ASP; HE 40x Figuur 14 Test 2; Colon mucosa; TISPA; HE 40x Figuur 15 Test 3; Colon mucosa; ASP; HE 40x Figuur 16 Test 3; Colon mucosa; TISPA; HE 40x 26 Bespreking: De foto’s tonen de mucosa van een colon, links (fig. 11, 13, 15) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 12, 14, 16) in de TISPA. In de mucosa is quasi geen verschil op te merken na doorvoeren met ASP of TISPA. De kwaliteit is gelijk. Wel kleurt de coupe na doorvoeren in de TISPA intenser aan. Verder is het kerndetail van de cellen na doorvoeren in de ASP beter zichtbaar dan na doorvoeren in de TISPA, dit verschil is echter miniem. 27 2.1.5.3 Vetweefsel Figuur 17 Test 1; Vetweefsel; ASP; HE 10x Figuur 18 Test 1; Vetweefsel; TISPA; HE 10x Figuur 19 Test 2; Vetweefsel; ASP; HE 10x Figuur 20 Test 2; Vetweefsel; TISPA; HE 10x Figuur 21 Test 3; Vetweefsel; ASP; HE 10x Figuur 22 Test 3; Vetweefsel; TISPA; HE 10x 28 Bespreking: De foto’s tonen het vetweefsel, links (fig. 17, 19, 21) doorgevoerd in de ASP en recht (fig. 18, 20, 22) doorgevoerd in de TISPA. Het vetweefsel na doorvoeren in de TISPA snijdt moeilijker. Microscopisch is het vetweefsel beschadigd. De vetcellen zijn geruptureerd/opengesprongen wat resulteert in een sterk wisselende diameter. Dit is minder het geval bij het vetweefsel doorgevoerd in de ASP. Algemeen snijdt het vetweefsel zeer moeilijk, onafhankelijk van het gebruikte doorvoertoestel. Dit is met de ervaring ondervonden. 29 2.1.5.4 Prostaat Figuur 23 Test 1; Prostaat; ASP; HE 40x Figuur 24 Test 1; Prostaat; TISPA; HE 40x Figuur 25 Test 2; Prostaat; ASP; HE 40x Figuur 26 Test 2; Prostaat; TISPA; HE 40x Figuur 27 Test 3; Prostaat; ASP; HE 40x Figuur 28 Test 3; Prostaat; TISPA; HE 40x 30 Bespreking: De foto’s tonen de klierbuizen van een prostaat, links (fig. 23, 25, 27) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 24, 26, 28) doorgevoerd in de TISPA. De prostaatklierbuizen tonen geen verschil. Ook hier valt het op dat de coupe na doorvoeren in de TISPA intenser aankleurt. 31 2.1.5.5 Schildklier Figuur 29 Test 1; Schildklier; ASP; HE 40x Figuur 30 Test 1; Schildklier; TISPA; HE 40x Figuur 31 Test 2; Schildklier; ASP; HE 40x Figuur 32 Test 2; Schildklier; TISPA; HE 40x Figuur 33 Test 3; Schildklier; ASP; HE 40x Figuur 34 Test 3; Schildklier; TISPA; HE 40x 32 Bespreking: De foto’s tonen schildklierfollikels, links (fig. 29, 31, 33) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 30, 32, 34) doorgevoerd in de TISPA. Bij test 1 tonen de follikelcellen en de kernen geen verschil. Het colloïd is na doorvoeren in de TISPA gescheurd. In andere zones zijn de details van de kernen en cellen na doorvoeren in de TISPA niet meer te herkennen. Het colloïd heeft een amorf aspect. Test 2 is vergelijkbaar met test 1. Bij test 3 is juist zoals in de vorige testen de kwaliteit in de schildklier sterk wisselend. In de meeste zones is de kwaliteit gelijk aan de ASP. Het colloïd is wel meestal gescheurd. In andere gebieden is het colloïd interpreteren en zien de cellen kleiner/gekrompen met een kleine donkere kern. We zien hier geen cel- of kerndetail. 33 2.1.5.6 Nier Figuur 35 Test 1; Nier; ASP; HE 40x Figuur 36 Test 1; Nier; TISPA; HE 40x Figuur 37 Test 3; Nier; ASP; HE 40x Figuur 38 Test 3; Nier; TISPA; HE 40x Bespreking: De foto’s tonen nierweefsel, links (fig. 35 en 37) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 36 en 38) doorgevoerd in de TISPA. De glomeruli van de nieren zijn in de TISPA meer gekrompen. De kleurintensiteit is wel hoger. Dit is het geval zowel bij test 1 als test 3. 34 2.1.5.7 Baarmoederhals Figuur 39 Test 1; Baarmoederhals; ASP; HE 40x Figuur 40 Test 1; Baarmoederhals; TISPA; HE 40x Bespreking: De foto’s tonen het Malpighiaansepitheel van een baarmoederhals, links (fig. 39) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 40) doorgevoerd in de TISPA. Een deel van de baarmoederhals wordt afgelijnd door een niet-keratiniserend, meerlagig Malpighiaansepitheel. In vergelijking met de ASP is dit na doorvoeren in de TISPA samengedrukt/gekrompen/platgevallen. Het weefsel kleurt wel intenser aan na doorvoeren in de TISPA. 35 2.1.5.8 Tonsillen Figuur 41 Test 1; Tonsillen; ASP; HE 40x Figuur 42 Test 1; Tonsillen; TISPA; HE 40x Bespreking: De foto’s tonen het Malpighiaansepitheel van een tonsil, links (fig. 41) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 42) doorgevoerd in de TISPA. De tonsil wordt afgelijnd door een niet-keratiniserend meerlagig Malpighiaansepitheel. Dit is, zoals bij de baarmoederhals, gekrompen/samengedrukt na doorvoeren in de TISPA. Het weefsel uit de TISPA kleurt wel intenser aan. 36 2.1.5.9 Huid Figuur 43 Test 1; Huid; ASP; HE 40x Figuur 44 Test 1; Huid; TISPA; HE 40x Bespreking: Beide foto’s tonen de huid van een borst, doorgevoerd in de ASP (fig. 43) en in de TISPA (fig. 44). Het keratiniserend meerlagig Malpighiaansepitheel toont geen verschil. De kwaliteit is gelijk. Opvallend is wel dat het weefsel uit de TISPA een intensere kleur vertonen op de HE coupe. 37 2.1.5.10 Lever Figuur 45 Test 3; Lever; ASP; HE 40x Figuur 46 Test 3; Lever; TISPA; HE 40x Bespreking: Beide foto’s tonen het leverweefsel aan met daarin een vene, doorgevoerd in de ASP (fig. 45) en in de TISPA (fig. 46). Aan de levercellen is geen verschil op te merken na doorvoeren met ASP of TISPA. De kwaliteit is gelijk. 38 2.2 Krimptest Bij de vorige testen werd er opgemerkt dat sommige weefsels of delen van de weefsels na het doorvoeren zijn gekrompen. Het krimpen is een normaal effect tijdens fixatie en doorvoeren. De graad van krimpen is afhankelijk van het weefsel. In deze test willen we nagaan of de weefsels in dezelfde mate krimpen in de ASP als in de TISPA. 2.2.1 Materiaal Cassettes + deksels Macropath D (Milestone srl) Figuur 47 Macropath D toestel - Milestone srl Versneden weefsels Rekentoestel 2.2.2 Methode Van meerdere weefsels worden 2 biopten genomen en in 2 cassettes gestoken. Eén cassette wordt doorgevoerd in de ASP, en de andere in de TISPA. Voor en na het doorvoeren worden de cassettes met de weefsels gefotografeerd. De weefsels worden voor en na doorvoeren gemeten. Het krimppercentage in beide doorvoertoestellen wordt berekend. 39 Tabel 8 Overzicht van gebruikte weefselfragmenten voor de krimptest CASSETTE NUMMER WEEFSEL 1 PLACENTA + NAVELSTRENG 2 BLAAS 3 MAAG + TUMOR 4 MAAG + TUMOR 5 WIPPLE DUODENUM 6 WIPPLE PANCREAS 7 BORST 8 TESTIS 9 PROSTAAT 10 RECTUM 11 BAARMOEDER MET MYOMEN 12 LONG 13 PLACENTA + NAVELSTRENG 14 RECTUM 15 BORST 16 LEVER METASTASE 17 LEVER NORMAAL 18 SPIER 19 SPIER 20 NIER TUMOR 21 NIER NORMAAL 22 BIJNIER 23 SCHILDKLIER 24 SCHILDKLIER 25 SLOKDARM 26 MAAG 27 GALBLAAS 28 GALBLAAS 29 TONSILLEN 30 BAARMOEDER 31 APPENDIX 32 TONSILLEN 40 2.2.2.1 Weefselafmetingen voor het doorvoeren Werkwijze: Voordat de weefsels worden doorgevoerd, worden de afmetingen hiervan genomen. Dit wordt m.b.v. het Macropath toestel uitgevoerd. Dit is een digitale fotocamera waarmee extra functies kunnen uitgevoerd worden, zoals afmetingen nemen, aantekeningen maken,… op de foto’s. De cassettes worden uit het fixatief gehaald waar ze voorlopig werden in bewaard. Het deksel wordt van de cassettes verwijderd en de cassettes worden onder de lens van het Macropath toestel gebracht. Er wordt 1 foto genomen per cassettenummer, dus zowel de cassette uit de ASP als de cassette uit de TISPA processor I worden op 1 foto gezet. Bvb: ASP 1 en TISPA 1. Nadat de foto’s van al de cassettenummers zijn genomen, worden de cassettes in het doorvoertoestel gebracht. Foto’s: Zie bijlage 1. 2.2.2.2 Weefselafmetingen na het doorvoeren Werkwijze: Nadat de weefsels zijn doorgevoerd, worden de afmetingen hiervan opnieuw genomen. De cassettes worden uit het doorvoertoestel gehaald en in een voorlopig paraffinebad bijgehouden terwijl er cassettenummer per cassettenummer een foto wordt genomen. Foto’s: Zie bijlage 2. 41 2.2.3 Resultaten 2.2.3.1 Berekeningen Cassette 1: Weefsel: Placenta + navelstreng ASP Percentage gekrompen (placenta): 23/29 x 100 = 79,31 % 20,69 % 16/19 x 100 = 84,21 % 15,79 % Gem. = 18,24 % gekrompen Percentage gekrompen (navelstreng): 12/13 x 100 = 92,31 % 7,69 % 13/16 x 100 = 81,25 % 18,75 % Gem. = 13,22 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen (placenta): 22/27 x 100 = 81,48 % 18,52 % 13/17 x 100 = 76,47 % 23,53 % Gem. = 21,03 % gekrompen Percentage gekrompen (navelstreng): 11/14 x 100 = 78,57 % 21,43 % 13/14 x 100 = 92,86 % 7,14 % Gem. = 14,29 % gekrompen Cassette 2 – 32: Zie bijlage 3. 42 Tabel 9 Overzicht resultaten van de krimptest Cassette Weefsel ASP % gekrompen TISPA % gekrompen 1 Placenta 18,24 21,03 navelstreng 13,22 14,29 2 Blaas 14,04 7,89 3 Maag + tumor 8,84 18,10 4 Maag + tumor 10,72 25,76 5 Wipple duodenum 25,31 31,37 6 Wipple pancreas 13,60 17,60 7 Borst 8,78 15,91 8 Testis 11,35 22,59 9 Prostaat 13,75 12,01 10 Rectum 16,46 10,66 11 Baarmoeder myomen 13,55 12,75 12 Long 14,98 20,74 13 Placenta + navelstreng 21,75 24,88 14 Rectum 15,38 13,35 15 Borst 11,33 15,39 16 Lever metastase 11,88 16,41 17 Lever normaal 12,34 12,88 18 Spier 16,25 20,49 19 Spier 16,61 16,50 20 Nier tumor 10,93 14,39 21 Nier normaal 15,77 18,41 22 Bijnier 16,27 7,58 23 Schildklier 23,64 31,23 24 Schildklier 24,35 28,12 25 Slokdarm 17,86 21,04 26 Maag 20,00 22,40 27 Galblaas 16,11 16,59 28 Galblaas 15,00 0,00 29 Tonsillen 18,62 21,54 43 Cassette Weefsel ASP % gekrompen TISPA % gekrompen 30 Baarmoeder 15,48 24,57 31 Appendix 22,62 31,12 32 Tonsillen 21,25 30,15 510,55 % / 32 600,08 % / 32 = 15,95 % = 18,75 % Minimum 8,78 % 0,00 % Maximum 25,31 % 31,37 % Gemiddelde Er werd gemerkt dat er bij sommige weefsels een grote variatie zit op het krimppercentage tussen ASP en TISPA. Van deze weefsels werd er een coupe genomen om na te gaan welke delen van het weefsel het meest zijn veranderd. De weefsel waarover het hier gaat zijn: maag, borst, testis, baarmoeder en tonsillen. 44 2.2.3.2 Maag Figuur 48 Krimptest; Maag; links: ASP; rechts: TISPA; HE Figuur 49 Krimptest; Maag; ASP; HE 2x Figuur 50 Krimptest; Maag; TISPA; HE 2x Figuur 51 Krimptest; Maag; ASP; HE 10x Figuur 52 Krimptest; Maag; TISPA; HE 10x 45 Bespreking: De foto’s tonen een weefselfragment van een maag, links (fig. 49 en 51) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 50 en 52) doorgevoerd in de TISPA. Met het blote oog is het al duidelijk zichtbaar dat de weefsels doorgevoerd in de TISPA meer zijn gekrompen dan deze in de ASP (fig. 48). Ook zien we dat het weefsel doorgevoerd in de TISPA meer beschadigd is. Verder is het ook op de microscopische beelden te zien dat de weefsels meer zijn gekrompen wanneer ze werden doorgevoerd in de TISPA. De slechte kwaliteit van het weefsel is uiteraard ook zichtbaar op de microscopische beelden. 46 2.2.3.3 Schildklier Figuur 53 Krimptest; Schildklier; links: ASP; rechts: TISPA; HE Figuur 54 Krimptest; Schildklier; ASP; HE 20x Figuur 55 Krimptest; Schildklier; TISPA; HE 20x Bespreking: De foto’s tonen follikelcellen van een schildklier, links (fig. 54) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 55) doorgevoerd in de TISPA. Met het blote oog kunnen we opnieuw al opmerken dat het weefsel doorgevoerd in de TISPA meer gekrompen en beschadigd is dan het weefsel doorgevoerd in de ASP (fig. 53). Verder blijkt deze bevinding ook uit de microscopische beelden. 47 2.2.3.4 Tonsil Figuur 56 Krimptest; Tonsil; links: ASP; rechts: TISPA; HE Figuur 57 Krimptest; Tonsil; ASP; HE 20x Figuur 58 Krimptest; Tonsil; TISPA; HE 20x Bespreking: De foto’s tonen het Malpighiaansepitheel van een tonsil, links (fig. 57) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 58) doorgevoerd in de TISPA. Opnieuw kunnen we opmerken dat het weefsel in de TISPA meer gaat krimpen. Door het overmatig krimpen gaat ook de kwaliteit van het weefsel achteruit. Dit is ook duidelijk merkbaar op de microscopische beelden. Het Malpighiaansepitheel wordt in de TISPA samengedrukt/afgeplat. Hierdoor zijn de cellen en de kernen vervormd en nietmeer beoordeelbaar. 48 2.2.4 Besluit Als er wordt gekeken naar het gemiddelde krimppercentage, algemeen kan er afgeleid worden dat de weefsels die worden doorgevoerd in de TISPA Processor I, meer gaan krimpen dan de weefsels die worden doorgevoerd in de ASP. Er is geen sprake van een enorm groot verschil. Het gemiddelde krimp percentage voor de ASP bedraagt 15,95 %. Het gemiddelde krimp percentage voor de TISPA Processor I bedraagt 18,75 %. Er is dus ongeveer 3 % verschil tussen beide doorvoersystemen. Als er gekeken wordt naar de verschillende weefsels afzonderlijk, zien we van sommige weefsels dat ze bij het doorvoeren met de TISPA bijna dubbel zoveel zijn gekrompen of meer dan 10 % meer zijn gekrompen t.o.v. de weefsels die zijn doorgevoerd met de ASP. Dit is het geval bij volgende weefselfragmenten: maag, borst, testis, baarmoeder, appendix en tonsillen. Vermoedelijk is het hogere krimp percentage een gevolg van het gebruik van nieuwe/verse ethanol. Dit in tegenstelling tot de ASP doorvoerprocessor, waar een alcohol gradiënt wordt gebruikt beginnende in een ethanol 80% bad. De firma Tispa Medical had dit experiment ook uitgevoerd. Uit hun onderzoek bleek dat het krimp percentage rond de 15 % is gelegen. Dit is vergelijkbaar met de resultaten die hier werden bekomen. Zie artikel: Solvent-free tissue processing using supercritical carbon dioxide (Bleuel, E.P., 2012). Zij hebben ook een verschil vastgesteld tussen de resultaten van de ASP na het verversen van de solventen en op het einde van de levenscyclus van de solventen, m.a.w. na 5 cycli. 49 2.3 Doorvoertest voor kleine biopten In de routine worden kleine macroscopische weefselfragmenten in papiertjes opgeborgen in de cassettes. Om te beletten dat ze tussen de gaatjes van de cassette vallen. Bij de TISPA Processor I werd dit ook gedaan. Hierbij werd er opgemerkt dat de weefselfragmentjes hard zijn en moeilijk kunnen worden gesneden. Hierdoor werd er een test uitgevoerd door de weefselfragmentjes op verschillende manier in de cassettes te steken. Er werden 5 biopten in papier gestoken, 5 biopten in een metalen zeef en 5 biopten in agar. De bedoeling hiervan is om na te gaan wat het effect is van deze verschillende manieren, op het resultaat. 2.3.1 Materiaal Cassettes + deksels Metalen zeven Papiertjes Agar Pincetten 2.3.2 Methode De kleine weefselfragmentjes worden met verschillende technieken opgeborgen in de cassettes. Sommigen worden opgeborgen in een papiertje, zoals in de routine. Anderen worden opgeborgen in een metalen zeef en de laatsten worden opgeborgen in agar. Vervolgens worden deze allemaal bewaard in formaldehyde 4% tot wanneer ze worden doorgevoerd. Metalen zeef: 50 Papier: Agar: Na het doorvoeren worden deze allemaal ingeblokt in paraffine. Om dan uiteindelijk in coupes gesneden te kunnen worden. De resultaten van de coupes worden geanalyseerd en besproken. 51 2.3.3 Resultaten + bespreking 2.3.3.1 Colon Figuur 59 Colon in papier; TISPA; HE 40x Figuur 60 Colon in metalen zeef; TISPA; HE 40x Figuur 61 Colon in agar; TISPA; HE 40x Bespreking: De foto’s tonen een weefselfragment van een colon, doorgevoerd in papier in de TISPA (fig. 59), doorgevoerd in een metalen zeef in de TISPA (fig. 60) en doorgevoerd in agar in de TISPA (fig. 61). Er wordt opgemerkt dat de kleurintensiteit bij de 3 figuren ongeveer hetzelfde is. Verder zijn er weinig verschillen merkbaar. Tijdens het inblokken van de weefsels werd er gemerkt dat bij de cassettes met agar, de agar helemaal was vervormd. Hieruit kan besloten worden dat de TISPA niet goed werkt in combinatie met agar. 52 2.3.3.2 Maag Figuur 62 Maag in papier; TISPA; HE 40x Figuur 64 Maag in agar; TISPA; HE 40x Figuur 63 Maag in metalen zeef; TISPA; HE 40x Bespreking: De foto’s tonen een weefselfragment van een maag, doorgevoerd in papier in de TISPA (fig. 62), doorgevoerd in een metalen zeef in de TISPA (fig. 63) en doorgevoerd in agar in de TISPA (fig. 64). De 3 figuren hebben dezelfde kwaliteit. Ook hier werd tijdens het inblokken van de weefsels opgemerkt dat de agar vervormd was. 53 2.4 Immunohistochemische kleuring Immunohistochemie is een techniek dat bepaalde bestanddelen lokaliseert in cellen m.b.v. specifieke antilichamen (AL) tegen deze bestanddelen. Deze techniek wordt gebruikt om een diagnose van abnormale cellen, zoals in tumoren, te stellen. Er zijn 2 manieren om een antilichaamantigeencomplex zichtbaar te maken. Er is een immunoperoxidasekleuring, hierbij wordt het AL verbonden aan een enzym (peroxidase) dat een kleurvormende reactie katalyseert. Daarnaast is er de immunofluorescentie, hierbij wordt het AL gemerkt met een fluorofoor. 2.4.1 Materiaal Cassette doorgevoerd met TISPA Cassette doorgevoerd met ASP Coupes van de cassettes Benchmark XT van de firma Ventana Medical Systems Microscoop Nikon Eclipse 80i 2.4.2 Methode 2 weefselbiopten van hetzelfde weefsel worden in aparte cassettes gestoken. De ene cassette wordt doorgevoerd in de ASP, terwijl de andere cassette wordt doorgevoerd in de TISPA. Vervolgens wordt er een dunne coupe gesneden van beide weefselbiopten. De coupe van het weefsel doorgevoerd in de ASP wordt tegen de matte zijde gelegd, het weefsel uit de TISPA aan de onderzijde van het draagglaasje. De volgende immunohistochemische kleuringen worden uitgevoerd: ER, Her2/Neu, Her2/SISH, Ki-67 en PR. ER: ER staat voor oestrogeen receptor. ER-alpha wordt aangetroffen in endometrium, borstklier, ovarium, hypothalamus en verwante tumoren. Het wordt gebruikt om de respons op hormonale therapie te voorspellen. Tumoren die zowel ER als PR tot expressie brengen reageren in 50-70% van de gevallen op anti-oestrogeen therapie. Ook wordt de ER en PR status gebruikt om de ziektevrije periode en overlevingskans van borstkanker patiënten te voorspellen. PR: PR staat voor progesteron receptor. De toepassing van deze test is dezelfde als die van de ER: diagnose van PR positieve tumoren en voorspelling van therapeutische respons van borstkanker patiënten. De ER en PR status wordt al meer dan 20 jaar gebruikt als indicator voor de kans op het aanslaan voor de hormonale therapie en als prognostische factor. Ongeveer 75% van de ER/PR positieve tumoren reageren op een anti-hormonale behandeling. ER+/PR- tumoren hebben een kleinere kans op respons op een endocriene 54 behandeling. De PR status van een tumor heeft dus een toegevoegde waarde aan de ER status. Her2/Neu: Her2/Neu staat voor Human Epidermal growth factor Receptor 2. Wordt gebruikt om overexpressie van Her2/Neu eiwit aan te tonen. Het eiwit is een receptor voor een epidermale groeifactor en wordt aangetroffen in agressieve tumoren. Deze tumoren komen in aanmerking voor een behandeling met trastuzumab (herceptine) therapie. In de meeste studies wordt de IH-expressie van Her2/Neu proteïne kwalitatief als 0,1,2 en 3+ gescoord. Indien de bepaling goed gekalibreerd is zijn de 0 en 1+ tumoren zelden geassocieerd met Her2-amplificatie (<1-2%) en/of therapeutische respons, terwijl bij een score van 3+ gen amplificatie in 90-100% van de gevallen voorkomt en daarbij de grootste kans op een respons bij een Herceptine therapie. Her 2/SISH: SISH (Silver In Situ Hybridization). Het bepaalt de Her2-gen amplificatie. Ki-67: De Ki-67 Labeling Index (LI) is een indicator voor de groeisnelheid. In vele tumoren correspondeert de groeisnelheid van de cellen met de tumorgraad en het klinisch verloop. 55 2.4.3 Resultaten + bespreking 2.4.3.1 ER kleuring Figuur 65 Borst; ASP; ER 40x Figuur 66 Borst; TISPA; ER 40x Bespreking: De foto’s tonen een weefselfragment van een borst, links (fig. 68) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 69) doorgevoerd in de TISPA. De ER-kleuring kleurt de kernen van de tumorale cellen aan. De kleuring kan negatief, sterk of zwak positief zijn. De intensiteit van aankleuring in de kernen is hoger na doorvoeren in TISPA. Verder zijn er weinig verschillen merkbaar. 56 2.4.3.2 PR kleuring Figuur 67 Borst; ASP; PR 40x Figuur 68 Borst; TISPA; PR 40x Bespreking: De foto’s tonen een weefselfragment van een borst, links (fig. 70) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 71) doorgevoerd in de TISPA. De PR-kleuring kleurt de kernen aan van tumorale cellen. Opnieuw is het merkbaar dat de kleurintensiteit hoger is in weefsel uit de TISPA. 57 2.4.3.3 Her2/Neu kleuring Figuur 69 Borst; ASP; Her2/Neu 40x Figuur 70 Borst; TISPA; Her2/Neu 40x Bespreking: De foto’s tonen een weefselfragment van een borst, links (fig. 72) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 73) doorgevoerd in de TISPA. De Her2/Neu kleuring kleurt de membranen aan van tumorale cellen. Het is duidelijk merkbaar dat de intensiteit hoger is bij het weefsel uit de TISPA. Verder zijn er geen verschillen merkbaar, de kwaliteit is op beide figuren gelijk. 58 2.4.3.4 Her2/SISH kleuring Figuur 71 Borst; ASP; Her2/SISH 40x Figuur 72 Borst; TISPA; Her2/SISH 40x Bespreking: De foto’s tonen een weefselfragment van een borst, links (fig. 74) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 75) doorgevoerd in de TISPA. De Her2/SISH kleuring kleurt het chromosoom 17 en het Her2-gen aan in de kernen. Er zijn geen verschillen merkbaar tussen de 2 verschillende doorvoermethodes. 59 2.4.3.5 Ki-67 kleuring Figuur 73 Borst; ASP; Ki-67 40x Figuur 74 Borst; TISPA; Ki-67 40x Bespreking: De foto’s tonen een weefselfragment van een borst, links (fig. 76) doorgevoerd in de ASP en rechts (fig. 77) doorgevoerd in de TISPA. De Ki-67 kleuring kleurt de kernen aan van de tumorale cellen. Er zijn geen verschillen merkbaar tussen de 2 doorvoermethodes. Het percentage dat aankleurt kan sterk verschillen van regio tot regio binnen eenzelfde tumor. 60 III Besluit Na deze vergelijkende studie kan er vastgesteld worden dat de kwaliteit van de twee toestellen vergelijkbaar is. Bij de eerste test van de TISPA was het wel duidelijk dat de kwaliteit niet optimaal was. Na enkele aanpassingen door de firma kon besloten worden dat de kwaliteit van beide toestellen vergelijkbaar was. Of het toestel, TISPA Processor I, gaat aangeschaft worden? Dit is een moeilijke vraag. Kwalitatief is er geen of weinig verschil, maar het voordeel van de TISPA is dat er geen gebruik wordt gemaakt van toxische solventen en dat de weefsels sneller kunnen worden doorgevoerd. Ook wordt er steeds nieuwe reagentia gebruikt bij elke doorvoercyclus, waardoor het hele proces is gestandaardiseerd, t.t.z. dat de weefsels steeds in dezelfde omstandigheden worden doorgevoerd. Het nadeel van de TISPA Processor I is dat het toestel een beperkte capaciteit heeft. Het zou in de toekomst niet kunnen gebruikt worden als back-up toestel voor de andere twee toestellen (VIP en ASP). Na veel wikken en wegen is er nog geen beslissing genomen of het toestel wordt aangekocht of niet. De firma TISPA Medical is nog volop aan het sleutelen aan het toestel. Het labo pathologische ontleedkunde van het OLV Aalst zal in de toekomst het toestel nog verder testen nadat de firma nieuwe aanpassingen aanbrengt. Verder heeft de firma een simulatie opgemaakt waaruit blijkt dat de TISPA goedkoper is dan een klassiek doorvoertoestel wanneer de capaciteit volledig wordt benut. Dit is niet getest geweest omdat het niet mogelijk is om alle stalen van de routine te processen in de TISPA Processor I. Wel werd de capaciteit van de ASP volledig benut en hieruit blijkt wel dat de ASP goedkoper is dan de opgemaakte prijssimulatie van de TISPA Processor I. De keuze tussen de TISPA Processor I en een klassiek doorvoertoestel zal in de toekomst zeer moeilijk zijn. 61 Referenties Bancroft, J.D. (2008). Theory and Practive of Histological Techniques. Geraadpleegd op 24 januari via http://books.google.be/books?id=Dhn2KispfdQC&pg=PA88&lpg=PA88&dq=tissue+processin g+principle&source=bl&ots=JyrzduVBA4&sig=9Ugu_x027hCI0kVrMbJAY2ilLA&hl=nl&sa=X&ei=1g3dUvPYFdKo0AWex4DwCQ&ved=0CCgQ6AEwAQ#v=onep age&q&f=false. Bleuel E.P., Roebers T. P. C., Schulting E., den Dunnen W. F. A. (2012). Solvent-free tissue processing using supercritical carbon dioxide. Histopathology. Geraadpleegd op 7 januari 2014 via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23171306. Ginty, P.J., Howard, D., Rose, F.R.A.J., Whitaker, M.J., Barry, J.J.A., Tighe, P., Mutch, S.R., Serhatkulu, G., Oreffo, R.O.C., Howdle, S.M., Shakesheff, K.M. (2006). Mammalian cell survival and processing in supercritical CO2, 103, nr. 19, pp. 7426 – 7431. Geraadpleegd op 24 januari via http://www.pnas.org/content/103/19/7426.full. Tispa Medical (2012). Geraadpleegd op 8 januari 2014 via http://www.tispamedical.com. Troubleshooting Problems in Processing, Staining (1999). Geraadpleegd op 25 februari via http://laboratory-manager.advanceweb.com/Article/Troubleshooting-Problems-inProcessing-Staining.aspx. Stevens, A, Lowe J. (1997). Histologie van de mens. (2e druk). Houten: Bohn Stafleu Van Loghum. Stoffels, P. (2012). TISPA Medical – Instructions for use TISPA Processor I. TISPA Medical B.V. Stoffels, P., Smits, P.J. (2012). Snel en milieuvriendelijk weefsel prepareren – het einde van xyleen. Programma Milieu en Technologie, SenterNovem. What happens to your tissue specimen in pathology (2010). Geraadpleegd op 17 februari via http://pathology.jhu.edu/department/patients/pathreport.cfm. 62 Bijlagen Bijlage 1 Bijlage 2 Bijlage 3 Cassette 2: Weefsel: Blaas ASP Percentage gekrompen: 25/27 x 100 = 92,59 % 7,41 % 7/9 x 100 = 77,78 % 22,22 % 28/32 x 100 = 87,50 % 12,50 % Gem. = 14,04 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 24/28 x 100 = 85,71 % 14,29 % 29/32 x 100 = 90,63 % 9,37 % 9/9 x 100 = 100 % 0,0 % Gem. = 7,89 % gekrompen Cassette 3: Weefsel: Maag + tumor ASP Percentage gekrompen: 17/18 x 100 = 94,44 % 5,56 % 29/33 x 100 = 87,88 % 12,12 % Gem. = 8,84 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 15/19 x 100 = 78,95 % 21,05 % 28/33 x 100 = 84,85 % 15,15 % Gem. = 18,10 % gekrompen Cassette 4: Weefsel: Maag + tumor ASP Percentage gekrompen: 11/13 x 100 = 84,62 % 15,38 % 31/33 x 100 = 93,94 % 6,06 % Gem. = 10,72 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 8/12 x 100 = 66,67 % 33,33 % 27/33 x 100 = 81,82 % 18,18 % Gem. = 25,76 % gekrompen Cassette 5: Weefsel: Wipple duodenum ASP Percentage gekrompen: 12/17 x 100 = 70,59 % 29,41 % 26/33 x 100 = 78,79 % 21,21 % Gem. = 25,31 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 12/17 x 100 = 70,59 % 29,41 % 22/33 x 100 = 66,67 % 33,33 % Gem. = 31,37 % gekrompen Cassette 6: Weefsel: Wipple pancreas ASP Percentage gekrompen: 17/19 x 100 = 89,47 % 10,53 % 30/36 x 100 = 83,33 % 16,67 % Gem. = 13,60 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 15/18 x 100 = 83,33 % 16,67 % 22/27 x 100 = 81,48 % 18,52 % Gem. = 17,60 % gekrompen Cassette 7: Weefsel: Borst ASP Percentage gekrompen: 24/27 x 100 = 88,89 % 11,11 % 29/31 x 100 = 93,55 % 6,45 % Gem. = 8,78 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 21/25 x 100 = 84,00 % 16,00 % 23/27 x 100 = 85,19 % 15,81 % Gem. = 15,91 % gekrompen Cassette 8: Weefsel: Testis ASP Percentage gekrompen: 5/5 x 100 = 100 % 0,00 % 27/33 x 100 = 81,82 % 18,18 % 10/12 x 100 = 83,33 % 16,67 % 17/19 x 100 = 89,47 % 10,53 % Gem. = 11,35 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 9/12 x 100 = 75,00 % 25,00 % 17/23 x 100 = 73,91 % 26,09 % 5/6 x 100 = 83,33 % 16,67 % Gem. = 22,59 % gekrompen Cassette 9: Weefsel: Prostaat ASP Percentage gekrompen: 22/26 x 100 = 84,62 % 15,38 % 29/33 x 100 = 87,88 % 12,12 % Gem. = 13,75 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 24/27 x 100 = 88,89 % 11,11 % 27/31 x 100 = 87,10 % 12,90 % Gem. = 12,01 % gekrompen Cassette 10: Weefsel: Rectum ASP Percentage gekrompen: 26/29 x 100 = 89,66 % 10,34 % 26/33 x 100 = 78,79 % 21,21 % 6/7 x 100 = 85,71 % 14,29 % 4/5 x 100 = 80,00 % 20,00 % Gem. = 16,46 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 24/29 x 100 = 82,76 % 17,24 % 27/31 x 100 = 87,10 % 12,90 % 5/5 x 100 = 100 % 0,00 % 7/8 x 100 = 87,50 % 12,50 % Gem. = 10,66 % gekrompen Cassette 11: Weefsel: Baarmoeder met myomen ASP Percentage gekrompen: 18/23 x 100 = 78,26 % 21,74 % 16/18 x 100 = 88,89 % 11,11 % 19/22 x 100 = 86,36 % 13,64 % 12/13 x 100 = 92,31 % 7,69 % Gem. = 13,55 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 21/25 x 100 = 84,00 % 16,00 % 14/16 x 100 = 87,50 % 12,50 % 18/20 x 100 = 90,00 % 10,00 % 14/16 x 100 = 87,50 % 12,50 % Gem. = 12,75 % gekrompen Cassette 12: Weefsel: Long ASP Percentage gekrompen: 24/28 x 100 = 85,71 % 12,09 % 23/28 x 100 = 82,14 % 17,86 % Gem. = 14,98 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 23/27 x 100 = 85,19 % 14,81 % 22/30 x 100 = 73,33 % 26,67 % Gem. = 20,74 % gekrompen Cassette 13: Weefsel: Placenta + navelstreng ASP Percentage gekrompen: 21/28 x 100 = 75,00 % 25,00 % 19/23 x 100 = 82,61 % 17,39 % 11/13 x 100 = 84,62 % 15,38 % 9/11 x 100 = 81,82 % 18,18 % 9/11 x 100 = 81,82 % 18,18 % 7/11 x 100 = 63,64 % 36,36 % Gem. = 21,75 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 22/28 x 100 = 78,57 % 21,43 % 16/21 x 100 = 76,19 % 23,81 % 12/14 x 100 = 85,71 % 14,29 % 10/12 x 100 = 83,33 % 16,67 % 10/13 x 100 = 76,92 % 23,08 % 5/10 x 100 = 50,00 % 50,00 % Gem. = 24,88 % gekrompen Cassette 14: Weefsel: Rectum ASP Percentage gekrompen: 23/28 x 100 = 82,14 % 17,86 % 27/31 x 100 = 87,10 % 12,90 % Gem. = 15,38 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 23/26 x 100 = 88,46 % 11,54 % 28/33 x 100 = 84,85 % 15,15 % Gem. = 13,35 % gekrompen Cassette 15: Weefsel: Borst ASP Percentage gekrompen: 23/26 x 100 = 88,46 % 11,54 % 24/27 x 100 = 88,89 % 11,11 % Gem. = 11,33 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 23/26 x 100 = 88,46 % 11,54 % 21/26 x 100 = 80,77 % 19,23 % Gem. = 15,39 % gekrompen Cassette 16: Weefsel: Lever metastase ASP Percentage gekrompen: 20/23 x 100 = 86,96 % 13,04 % 25/28 x 100 = 89,29 % 10,71 % Gem. = 11,88 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 22/27 x 100 = 81,48 % 18,52 % 24/28 x 100 = 85,71 % 14,29 % Gem. = 16,41 % gekrompen Cassette 17: Weefsel: Lever normaal ASP Percentage gekrompen: 19/21 x 100 = 90,48 % 9,52 % 28/33 x 100 = 84,85 % 15,15 % Gem. = 12,34 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 19/22 x 100 = 86,36 % 13,64 % 29/33 x 100 = 87,88 % 12,12 % Gem. = 12,88 % gekrompen Cassette 18: Weefsel: Spier ASP Percentage gekrompen: 20/25 x 100 = 80,00 % 20,00 % 28/32 x 100 = 87,50 % 12,50 % Gem. = 16,25 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 21/27 x 100 = 77,78 % 22,22 % 26/32 x 100 = 81,25 % 18,75 % Gem. = 20,49 % gekrompen Cassette 19: Weefsel: Spier ASP Percentage gekrompen: 22/25 x 100 = 88,00 % 12,00 % 26/33 x 100 = 78,79 % 21,21 % Gem. = 16,61 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 23/27 x 100 = 85,19 % 14,81 % 27/33 x 100 = 81,82 % 18,18 % Gem. = 16,50 % gekrompen Cassette 20: Weefsel: Nier tumor ASP Percentage gekrompen: 24/25 x 100 = 96,00 % 4,00 % 23/28 x 100 = 82,14 % 17,86 % Gem. = 10,93 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 23/26 x 100 = 88,46 % 11,54 % 24/29 x 100 = 82,76 % 17,24 % Gem. = 14,39 % gekrompen Cassette 21: Weefsel: Nier normaal ASP Percentage gekrompen: 24/28 x 100 = 85,71 % 14,29 % 24/29 x 100 = 82,76 % 17,24 % Gem. = 15,77 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 22/26 x 100 = 84,62 % 15,38 % 22/28 x 100 = 78,57 % 21,43 % Gem. = 18,41 % gekrompen Cassette 22: Weefsel: Bijnier ASP Percentage gekrompen: 19/23 x 100 = 82,61 % 17,39 % 28/33 x 100 = 84,85 % 15,15 % Gem. = 16,27 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 24/24 x 100 = 100 % 0,00 % 28/33 x 100 = 84,85 % 15,15 % Gem. = 7,58 % gekrompen Cassette 23: Weefsel: Schildklier ASP Percentage gekrompen: 20/25 x 100 = 80,00 % 20,00 % 24/33 x 100 = 72,73 % 27,27 % Gem. = 23,64 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 17/23 x 100 = 73,91 % 26,09 % 21/33 x 100 = 63,64 % 36,36 % Gem. = 31,23 % gekrompen Cassette 24: Weefsel: Schildklier ASP Percentage gekrompen: 21/27 x 100 = 77,78 % 22,22 % 25/34 x 100 = 73,53 % 26,47 % Gem. = 24,35 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 20/27 x 100 = 74,07 % 25,93 % 23/33 x 100 = 69,70 % 30,30 % Gem. = 28,12 % gekrompen Cassette 25: Weefsel: Slokdarm ASP Percentage gekrompen: 22/28 x 100 = 78,57 % 21,43 % 24/28 x 100 = 85,71 % 14,29 % Gem. = 17,86 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 23/27 x 100 = 85,19 % 14,81 % 24/33 x 100 = 72,73 % 27,27 % Gem. = 21,04 % gekrompen Cassette 26: Weefsel: Maag ASP Percentage gekrompen: 16/20 x 100 = 80,00 % 20,00 % 24/30 x 100 = 80,00 % 20,00 % Gem. = 20,00 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 14/18 x 100 = 77,78 % 22,22 % 24/31 x 100 = 77,42 % 22,58 % Gem. = 22,40 % gekrompen Cassette 27: Weefsel: Galblaas ASP Percentage gekrompen: 18/22 x 100 = 81,82 % 18,18 % 17/21 x 100 = 80,95 % 19,05 % 8/9 x 100 = 88,89 % 11,11 % Gem. = 16,11 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 22/24 x 100 = 91,67 % 8,33 % 20/25 x 100 = 80,00 % 20,00 % 11/14 x 100 = 78,57 % 21,43 % Gem. = 16,59 % gekrompen Cassette 28: Weefsel: Galblaas ASP Percentage gekrompen: 5/6 x 100 = 83,33 % 16,67 % 8/10 x 100 = 80,00 % 20,00 % 11/12 x 100 = 91,67 % 8,33 % Gem. = 15,00 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 8/8 x 100 = 100 % 0,00 % 10/10 x 100 = 100 % 0,00 % 17/17 x 100 = 100 % 0,00 % Gem. = 0,00 % gekrompen Cassette 29: Weefsel: Tonsillen ASP Percentage gekrompen: 12/15 x 100 = 80,00 % 20,00 % 24/29 x 100 = 82,76 % 17,24 % Gem. = 18,62 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 10/13 x 100 = 76,92 % 23,08 % 20/25 x 100 = 80,00 % 20,00 % Gem. = 21,54 % gekrompen Cassette 30: Weefsel: Baarmoeder ASP Percentage gekrompen: 20/24 x 100 = 83,33 % 16,67 % 24/28 x 100 = 85,71 % 14,29 % Gem. = 15,48 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 15/20 x 100 = 75,00 % 25,00 % 22/29 x 100 = 75,86 % 24,14 % Gem. = 24,57 % gekrompen Cassette 31: Weefsel: Appendix ASP Percentage gekrompen: 5/6 x 100 = 83,33 % 16,67 % 5/7 x 100 = 71,43 % 28,57 % 6/7 x 100 = 85,71 % 14,29 % 5/7 x 100 = 71,43 % 28,57 % 6/7 x 100 = 85,71 % 14,29 % 6/9 x 100 = 66,67 % 33,33 % Gem. = 22,62 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 6/7 x 100 = 85,71 % 14,29 % 6/7 x 100 = 85,71 % 14,29 % 5/7 x 100 = 71,43 % 28,57 % 5/8 x 100 = 62,50 % 37,50 % 5/7 x 100 = 71,43 % 28,57 % 5/8 x 100 = 62,50 % 37,50 % 5/7 x 100 = 71,43 % 28,57 % 5/7 x 100 = 71,43 % 28,57 % Gem. = 31,12 % gekrompen Cassette 32: Weefsel: Tonsillen ASP Percentage gekrompen: 12/16 x 100 = 75,00 % 25,00 % 13/16 x 100 = 81,25 % 18,75 % 12/15 x 100 = 80,00 % 20,00 % Gem. = 21,25 % gekrompen TISPA Percentage gekrompen: 13/17 x 100 = 76,47 % 23,53 % 10/16 x 100 = 62,50 % 37,50 % 12/17 x 100 = 70,59 % 29,41 % Gem. = 30,15 % gekrompen
