Moderne biotechnologie eindversie nov 2010

Moderne biotechnologie
6 vwo
Van cel naar fabriek
1
COLOFON
Het ontwikkelteam:
Ingeborg de Kooter, Christelijk Lyceum te Delft
Daan Robeerst, student LST, TU Delft
Sander Haemers, Stanislas College te Pijnacker
Juleke van Rhijn, Coornhert-gymnasium te Gouda (tevens eindredactie)
Dirk Hillenga, Grotius College te Delft
Coach: Aonne Kerkstra, TU Delft
Dank aan de volgende deskundigen, die een belangrijke inbreng hadden bij het maken van de
module:
Dr. Olav Sliekers,
Purac te Gorichem
Drs. Willem Buitelaar,
DuPont te Dordrecht
Prof.Dr.Ir.Sef Heijnen verbonden aan het Kluyver Centre van de TU Delft
© 2010 De Vereniging van de Nederlandse Chemische Industrie (VNCI), Den Haag.
Het auteursrecht op dit onderwijsmateriaal voor Nieuwe Scheikunde berust bij de VNCI te Den Haag.
De VNCI is derhalve de rechthebbende zoals bedoeld in de hieronder vermelde creative commons licentie.
Hoewel het onderwijsmateriaal met zorg is samengesteld, is het mogelijk dat deze onjuistheden en/ of
onvolledigheden bevatten. De VNCI aanvaardt derhalve geen enkele aansprakelijkheid voor enige schade, voortkomend uit (het gebruik van) dit materiaal.
Voor dit onderwijsmateriaal geldt een Creative Commons Naamsvermelding-Niet-Commercieel-Gelijk
delen 3.0 Nederland licentie http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/nl/
Aangepaste versies hiervan mogen alleen verspreid worden indien het in het colofon vermeld wordt dat
het een aangepaste versie betreft, onder vermelding van de naam van de auteur van de wijzingen.
VNCI, Den Haag, november 2010
2
Inhoudsopgave
Hoofdstuk 1 – Inleiding
Hoofdstuk 2 – Bacteriën
Hoofdstuk 3 – De cel als fabriek
Blz.
4
7
12
Hoofdstuk 4 – Klassieke biotechnologie: de melkzuurfabriek
26
Hoofdstuk 5 – Moderne biotechnologie: de productie van 1,3-propaandiol
58
Hoofdstuk 6 – Gibbs energie
86
Hoofdstuk 7 - Gibbs energie en de dissimilatie van glucose
95
3
Hoofdstuk 1 – Inleiding
De bacterie als fabriek: biotechnologie op micro- en macroschaal
In winkels zie je steeds vaker producten met het woord “biologisch” op de verpakking. Hierdoor lijkt het wel of het maken van
biologische producten iets van deze tijd is. Maar dat is bepaald
niet het geval. Al in de jonge steentijd, zo’n 10.000 jaar geleden, maakte de mens gebruik van bacteriën, schimmels en
gisten om brood, bier, yoghurt en kaas te maken. De productie
van deze voedingsmiddelen met micro-organismen noemen we
daarom klassieke biotechnologie.
Wetenschappers bekijken bacteriën en schimmels tegenwoordig als kleine fabriekjes die je kunt gebruiken om allerlei
stoffen te produceren. Van nature maken micro-organismen al
veel bruikbare stoffen. Maar dat doen ze meestal in hele kleine
hoeveelheden. Om te bereiken dat ze meer gaan maken of
zelfs hele nieuwe stoffen gaan produceren moet je microorganismen aanpassen.
In de 21e eeuw zullen micro-organismen compleet hergeprogrammeerd of zelfs volledig geconstrueerd worden om zo door
de mens gemaakte microfabrieken te vormen.
De productie van stoffen met deze genetisch gemodificeerde
micro-organismen noemen we moderne biotechnologie.
In de moderne biotechnologie wordt veel gebruik gemaakt van
Figuur 1:Biologische yoghurt
productieprocessen zoals fermentatie en biokatalyse. Fermentatie is het gebruiken van micro-organismen om basisgrondstoffen zoals suikers om te zetten in bruikbare producten als ethanol of melkzuur.
Biokatalyse is het gebruiken van enzymen om een industrieel proces te versnellen.
In deze module over biotechnologie gaan we kijken naar de productie van melkzuur, als
voorbeeld van een productieproces uit de klassieke biotechnologie. De productie van 1,3propaandiol wordt het voorbeeld uit de moderne biotechnologie.
Om beide processen te kunnen begrijpen wordt in hoofdstuk 2 eerste de stof over bacteriën
herhaald. Er wordt ingezoomd op de bacteriecel. Voor leerlingen met een N&G profiel is dit
herhaalstof.
In hoofdstuk 3 wordt de cel als fabriek behandeld met de belangrijkste biosynthetische routes. En hoe zit het met de energievoorziening in de cel?
Klassieke biotechnologie: Melkzuurproductie
Melkzuur is de triviale naam voor 2 hydroxypropaanzuur.
De grote uitdaging is om melkzuurbacteriën grote hoeveelheden melkzuur te laten produceren en het melkzuur zuiver
in handen te krijgen. Je zult ontdekken dat daar een behoorlijke hoeveelheid chemische technologie voor nodig is.
Figuur 2: Melkzuurbacteriën
4
Melkzuur is de grondstof (het monomeer) voor de productie van polymelkzuur (PLA). PLA
(polylactic-acid) is een bioplastic dat wordt gebruikt voor veel verschillende doeleinden zoals
draad, schroeven en pinnen voor chirurgie, plastic tasjes en kleding. PLA wordt gemaakt van
natuurlijk melkzuur, een product van melkzuurbacteriën. Het is een biodegradeerbaar polymeer. (www.purac.com )
Figuur 3: Bioplastic schroeven en pinnen van PLA worden gebruikt in de chirurgie
Contextvragen
1. Hoe kunnen bacteriën melkzuur maken?
2. Op welk manieren krijg je zuiver melkzuur?
3. Hoe verloopt op industriële schaal de productie van
PLA?
Moderne biotechnologie: productie van 1,3-propaandiol
Wetenschappers gingen op zoek naar een organisme dat zowel 1,3propaandiol produceert, als glucose kan gebruiken voor zijn cellulaire
processen. Deze micro-organismen waren er echter niet. Daarom
heeft men de bacterie Escherichia coli (E.coli) genetisch zo gemodificeerd dat de nieuwe stam 1,3-propaandiol uit glucose kan maken. In
het DNA van E.coli moesten dus een aantal veranderingen worden
gemaakt, zodat de bacterie met behulp van de biosynthetische routes die het van oorsprong al had, 1,3-propaandiol kan maken. Wetenschappelijk heet dit metabolic engineering.
1,3-propaandiol is de grondstof (het monomeer) voor de productie
van het polymeer Sorona. Sorona is een polymeer die veel gebruikt
wordt in de textielindustrie voor de productie van (sport)kleding en
vloerbedekking.
Figuur 4: wedstrijd badpak
gemaakt van Sorona
www2.dupont.com/Sorona/
en_US/
Contextvragen
4. Hoe gaat de metabolic engineering van E.coli?
5. Op welk manier krijg je zuiver 1,3-propaandiol?
6. Hoe verloopt op industriële schaal de productie van
Sorona?
5
Gibbs energie
Voor biologen en chemici is het energieverschil van een reactie die verloopt bij constante
temperatuur en constante druk een belangrijke grootheid. Het verschil van energie bij deze
omstandigheden bepaalt namelijk of reacties spontaan kunnen verlopen en bij evenwichtsreacties bepaalt het de ligging van het evenwicht. Deze energie wordt de Gibbs energie (G)
genoemd. De rol van de Gibbs energie in de regulatie van de biosynthetische routes in de
cel is erg belangrijk.
Gibbs Energie is voor jullie één van de nieuwe vakbegrippen die in dit hoofdstuk behandeld
worden.
Slot
Bovenstaande onderwerpen komen aan de orde in een module waarin biologie, natuurkunde
en scheikunde samenvloeien. Een lessenserie waarin je anders leert te kijken naar microorganismen en je de fascinerende wereld van de snelst groeiende tak van de chemische
industrie leert kennen: de moderne biotechnologie!
6
Hoofdstuk 2
Bacteriën
Biotechnologen werken onder andere met bacteriën. Ze selecteren uit de vele verschillende
bacteriën de meest geschikte bacterie voor een bepaald productieproces of ze proberen een
bacterie genetisch aan te passen zodat deze gaat doen wat de biotechnologen willen. Voordat we hier dieper op ingaan bekijken we hoe een bacterie eruit ziet.
Organismen bestaan uit een of meerdere cellen, de kleinste fundamentele eenheid van leven. Er zijn eencellige organismen zoals bacteriën en gisten en er zijn meercellige organismen zoals de mens. Het volwassen lichaam van een mens bestaat uit zo’n 50 miljard cellen.
Er wordt onderscheid gemaakt tussen twee typen cellen: prokaryoten en eukaryoten.
Bij de cellen van prokaryoten ligt het DNA los in de cel en is niet verpakt in een celkern.
Voorbeelden van prokaryoten zijn bacteriën.
Eukaryoten zijn cellen met een celkern, waarin zich het DNA bevindt, en in de cel nog andere celstructuren met een bepaalde functie (organellen). Meercellige organismen zoals mensen en dieren zijn eukaryoot, maar er zijn ook eencellige eukaryoten zoals gisten.
Bacteriecel
Er zijn vele soorten bacteriën die je overal terug vindt. Ze komen los in de natuur voor maar
ook binnen in organismen. Er zijn nuttige bacteriën, zoals de bacteriën in de menselijke darmen en bacteriën die ziekten veroorzaken.
De grootte van een bacteriecel varieert
van 0,0001 tot 0,02 mm. Het meest voorkomende gemiddelde is 0,001 mm, duizend keer zo klein als een millimeter. Met
het blote oog kan je ze daarom niet zien.
Alleen onder een microscoop met een
1000 keer vergroting zijn ze zichtbaar.
Bacteriën zijn daarmee de kleinste organismen die nog met een lichtmicroscoop
zijn waar te nemen.
Alle soorten bacteriën planten zich voort
door te delen. Een moedercel splitst zich
in tweeën in twee dochtercellen. Hierbij
wordt de inhoud van de moedercel eerlijk
verdeeld zodat de inhoud van de twee
dochtercellen hetzelfde is als van de moedercel.
Figuur 1: Een bacteriecel van dichtbij bekeken
Celwand
De celwand van bacteriën bestaat uit polysachariden en zorgt voor extra stevigheid van de
cel. Aan de binnenzijde van de celwand bevindt zich tegen de celwand aan het celmembraan, ook wel plasmamembraan geheten. Binnenin de cel bevindt zich het cytoplasma met
het DNA, de plasmiden en de ribosomen.
7
DNA
Het DNA van een bacterie bevindt zich los in de cel en bestaat uit het DNA van de chromosomen en uit het DNA van één of meerdere plasmiden.
Het chromosomaal DNA en het DNA van de plasmiden vormen samen het genetisch materiaal van een bacterie. Hierop liggen verschillende genen die gebruikt worden om eiwitten te
maken. Ieder gen bevat de code voor een ander eiwit. Een cel heeft niet evenveel van ieder
eiwit nodig. Wanneer een gen gebruikt wordt om een eiwit te maken, zeggen we dat het gen
tot expressie komt. Om de hoeveelheid eiwit in een cel te beïnvloeden zal het dus belangrijk
zijn om de expressie van een gen te kunnen beïnvloeden. Dit doet een cel door de expressie
van een gen te reguleren: genregulatie.
De genregulatie bepaalt of en hoeveel er van ieder eiwit wordt gemaakt. Deze regulatie gebeurt door regulatie-eiwitten. Vaak zal een bepaalde concentratie van een eiwit gewenst zijn.
Wanneer er genoeg van dit eiwit aanwezig is, zal er een regulatie-eiwit zijn dat ervoor zorgt
dat er niet nog meer van het bepaalde eiwit wordt geproduceerd.
Plasmiden
Plasmiden zijn kleine ringvormige stukken DNA, die bacteriën onderling kunnen uitwisselen.
De plasmiden worden door biotechnologen gebruikt om de genetische informatie van een
ander organisme op te slaan. De plasmide bevat dan een stukje DNA van een ander organisme.
Flagellen
De flagellen zijn lange eiwitdraden die verankerd zijn in de celwand en die voor de beweeglijkheid van bacteriën kunnen zorgen.
Pili
Pili hebben geen invloed op de beweeglijkheid, zij zorgen er voor dat een (aerobe) bacterie
aan de oppervlakte van een vloeistof blijft. Bacteriën kunnen met hun pili samen een velletje
vormen en op die manier gebruik maken van de beschikbare zuurstof aan de oppervlakte.
Ribosomen
Op de ribosomen vindt de eiwitsynthese plaats. Heel beknopt komt het er op neer dat een
soort werkkopie van het DNA, namelijk het RNA, op de ribosomen wordt vertaald in een keten van aminozuren, dat wil zeggen een eiwitmolecuul.
Vragen
1. Leg uit hoe een bacterie resistent kan worden voor een bepaald antibioticum.
2. Hoe komt het dat biotechnologen graag met prokaryoten werken?
Celmembraan
Om goed te kunnen functioneren moet de cel zorgen voor een gecontroleerd intern milieu.
Als bij een reactie in de cel doorlopend beginstoffen worden aangevoerd en reactieproducten
worden afgevoerd ontstaat een situatie, waarbij de reactie verloopt terwijl de concentraties
van de reagerende stoffen toch constant blijven. Dit wordt steady-state genoemd. In cellen
komen veel steady-state processen voor. Het vermogen van een organisme om het interne
milieu, waarin deze steady-state processen constant te houden noemen we homeostase.
Bij het constant houden van het interne milieu speelt het celmembraan een belangrijke rol.
Voor een bacterie betekent dit eveneens, dat de concentraties van stoffen binnen de cel
constant gehouden worden. De omgeving waarin de bacterie zich bevindt, speelt hierbij een
belangrijke rol. Eventuele beperkingen in het interne milieu moeten met behulp van de omgeving aangepast kunnen worden. Voldoet de omgeving niet aan de eisen, dan zullen bacteriën niet of niet zo goed groeien of zelfs dood gaan. Omgekeerd kunnen gunstige omge8
vingsfactoren de groei en vermenigvuldiging weer stimuleren. Factoren die hierbij een rol
spelen zijn de temperatuur, pH, osmotische waarde en zuurstofspanning.
Bouw van het celmembraan
Het celmembraan is een dubbellaag van fosfolipiden, die ervoor zorgt dat niet alle moleculen
en ionen zomaar de cel in en uit kunnen.
Figuur 2: Het celmembraan bestaat uit fosfolipiden (4), suikers (3) en verschillende soorten eiwitten (1, 2 en 5)
http://www.youtube.com/watch?v=Qqsf_UJcfBc
De fosfolipiden zorgen voor zo’n dubbellaag doordat de hydrofiele 'fosfaatkoppen" zich naar
de buitenkanten van het celmembraan richten (naar de waterkanten) en de hydrofobe vetzuurstaarten zich naar de binnenkant van het membraan richten. Deze fosfolipiden zijn
voortdurend in beweging en vormen dus geen starre structuur.
( zie animatie celmembraan )
In het celmembraan zitten naast fosfolipiden veel grote eiwitten, die door het membraan steken (zie figuur 2). Deze zijn belangrijk voor bepaalde processen in de cel en zijn vaak betrokken bij het doorlaten van voedingsstoffen voor de cel en van producten uit de cel.
Figuur 3: Een fosfolipide heeft een hydrofiele fosfaatkop en een hydrofobe
vetzuurstaart. Binas tabel 67 B3.
Transport via het celmembraan
In de cel vinden verschillende reacties plaats. Voor deze reacties zijn stoffen nodig, daarnaast ontstaan er reactieproducten. Om de concentratie van stoffen in de cel constant te
houden zal er daarom transport van stoffen nodig zijn. Stoffen moeten de cel in en uit kunnen. Omdat het celmembraan stoffen door kan laten, kunnen essentiële stoffen als glucose
9
en vetten de cel in, blijven de benodigde stoffen in de cel en kunnen (afval)producten de cel
uit.
Passief transport
Zoals eerder besproken is het celmembraan een dubbellaag van fosfolipiden met hydrofiele
koppen aan de buitenkant en hydrofobe staarten naar binnen gericht. Hierdoor is het niet
voor iedere stof mogelijk om gemakkelijk de cel in of uit te gaan. Stoffen die uit kleine ongeladen moleculen bestaan zoals de gassen CO2, O2 en N2 en bijvoorbeeld ethanol kunnen het
celmembraan passief passeren. De drijvende kracht bij dit transport is het verschil in concentratie van deze stoffen binnen in de cel en buiten de cel. Dit transport gaat door totdat aan
beide zijden van het membraan de concentraties van de stoffen gelijk zijn.
Dit transport kost de cel geen energie en wordt daarom passief transport genoemd. Omdat
de stoffen letterlijk door het membraan gaan spreken we bij passief transport over transport
door het membraan.
Figuur 4: Actief en passief transport over het celmembraan, zie ook de animatie
http://www.bioplek.org/animaties/cel/membraan2.html
Actief transport
Stoffen die uit grote moleculen of ionen bestaan kunnen vaak alleen actief over het membraan getransporteerd worden. Dit transport gebeurt door transporteiwitten in het membraan.
Voor actief transport is energie nodig. We spreken in dit geval van transport over het membraan. Naast energie voor het transport, heeft een cel energie nodig voor processen binnen
de cel en om te groeien. De meeste bacteriën halen deze energie uit de enzymatische afbraak van voedingsstoffen.
http://www.youtube.com/watch?v=STzOiRqzzL4
10
Omdat ionen niet passief over het membraan getransporteerd kunnen worden is het ook
mogelijk, dat er een ladingverschil kan ontstaan tussen de binnen- en de buitenkant van een
cel. Dit ladingverschil is één van de manieren van energieopslag door een cel, een andere is
de stof ATP (adenosine trifosfaat). Deze energie wordt gebruikt voor verschillende processen
in de cel, waaronder dus het actieve transport over het membraan.
Vragen
3. Leg uit waarom er voor homeostase actief en passief transport nodig zijn.
4. Wat heeft een cel nodig voor actief transport?
5. Wanneer spreekt men van transport over het membraan?
Wat je nu moet weten
•
Bouw bacteriecel
o Celwand
o DNA
o Plasmiden
o Flagellen
o Pili
• Celmembraan
o Bouw
o Passief transport
o Actief transport
11
Hoofdstuk 3
Cel als fabriek
3.1 Bacteriën
Bacteriën vormen een grote groep van microorganismen die uit slechts één cel bestaan. De
grootte van een bacteriecel varieert, maar gemiddeld zijn bacteriën een paar micrometer
lang, een factor 10 kleiner dan overige celtypen.
Je hebt daarom een lichtmicroscoop nodig om
ze te kunnen zien, maar zelfs dat is meestal niet
voldoende; een elektronenmicroscoop volstaat
beter. Er zijn vele soorten bacteriën met allerlei
vormen: bolletjes, staafjes, kommavormig en
spiralen. Bacteriën zijn veelzijdig, ze kunnen
onder bijna alle mogelijke omstandigheden leven. Ze komen overal in de natuur voor: van
diep in de bodem tot in hoge lagen van de atmosfeer, van in het ijs op Antarctica tot in kokendhete waterbronnen op de bodem van de
oceanen. Zelfs binnen in planten en in dieren
leven ze. Men schat dat er op de aarde ongeFiguur 1: Bacteriën hebben verschillende vormen
veer 5×1030 bacteriën voorkomen: in één gram
grond leven gemiddeld al zo’n 40 miljoen bacteriën.
In ieder mens bevinden zich ongeveer 1 kg bacteriën die bijdragen aan de spijsvertering en
afweer van ons lichaam.
Door de veelzijdigheid van bacteriën zijn ze heel geschikt om allerlei stoffen te produceren.
Vaak doen ze dat al van nature, maar dan maken ze over het algemeen maar heel weinig
van die stof. Biotechnologen zoeken daarom tussen de vele verschillende bacteriën die er
zijn naar de meest geschikte voor een bepaald productieproces. Daarna passen ze de uitgekozen bacterie aan zodat deze doet wat ze willen, zo maken ze van de bacterie als het ware
een fabriek in het klein. Om duidelijk te maken hoe biotechnologen een bacterie als een kleine fabriek kunnen gebruiken gaan we eerst wat beter naar een bacterie kijken. Daarbij kunnen de volgende vragen helpen:
•
•
•
•
Hoe deelt een bacterie?
Waaruit bestaat een bacterie?
Wat heeft een bacterie nodig om te leven?
Hoe kan een bacterie zo veel verschillende stoffen maken?
Om stoffen te kunnen produceren zijn er heel veel bacteriën nodig. Die bacteriën moeten dus
eerst groeien. Alle soorten bacteriën planten zich voort door te delen. Een cel splitst zich in
twee dochtercellen waarbij de inhoud van de moedercel eerst wordt verdubbeld en daarna
verdeeld wordt over de dochtercellen.
12
Bacteriën hebben een vrij eenvoudige bouw (zie figuur 2). Het inwendige van een bacterie
bestaat uit cytoplasma met onder andere het cirkelvormig DNA, dat los in het cytoplasma
drijft (dat maakt bacteriën zo geschikt voor biotechnologische toepassingen, in tegenstelling
tot eencellige organismen, plantaardige en dierlijke cellen waar DNA in een kern “verstopt”
zit). Het cytoplasma wordt omgeven door een celmembraan. Bij de meeste bacteriesoorten
zit hier omheen een celwand op basis van peptidoglycan. Veel bacteriën kunnen om de celwand nog een kapsel of een slijmlaag hebben. Bacteriën kunnen verder uitsteeksels hebben
aan de buitenkant in de vorm van flagellen (zweepstaarten) en/of pili (haren).
Figuur 2: Een bacteriecel van dichtbij bekeken
Hoewel een bacterie een eenvoudig organisme is, bestaat het toch uit honderden verschillende stoffen. De hoofdbestanddelen van een bacterie zijn naast water: eiwitten, polysacchariden, vetten en de nucleïnezuren DNA en RNA (zie tabel 1). De meeste van deze stoffen
zijn polymeren, grote moleculen die gemaakt worden uit kleinere moleculen. Om deze polymeren en andere stoffen te maken, heeft een bacterie de juiste bouwstenen nodig. Bacteriën
halen deze bouwstenen uit allerlei voedingsstoffen. Ze breken die voedingsstoffen af tot een
gering aantal soorten eenvoudige moleculen. Deze moleculen vormen dan de grondstoffen
waaruit de bacterie allerlei producten kan maken ten behoeve van zichzelf.
13
Tabel 1: Globale chemische samenstelling van een snel delende bacteriecel (E.coli)
Stof
%-natgewicht
Verschillende soorten moleculen per cel
Water
70
1
DNA
1
1
RNA
6
1050
Nucleotiden en metabolieten
0,8
200
Eiwitten
15
2000-3000
Aminozuren en metabolieten
0,8
100
Polysacchariden
3
200
Vetten en metabolieten
2
50
Zouten en spoorelementen
1
20
0,4
200
Overige
Om bacteriën de juiste voedingsstoffen te geven kijkt men meestal naar hoeveel en welke
elementen in een bacterie voorkomen ( tabel 2). Op basis hiervan kiest men verschillende
voedingsbronnen die men aangeeft als C-bron, N-bron etc. De meeste stoffen die men gebruikt bevatten een combinatie van deze noodzakelijke elementen.
Tabel 2: Belangrijke elementen en hun bronnen voor bacteriën
Element
%-drooggewicht
Bron
C
50
Organische verbindingen of CO2
O
20
H2O, CO2, O2 en organische verbindingen
N
14
NH3, NO3, N2 en organische verbindingen
H
8
H2O, organische verbindingen
P
3
anorganische fosfaten (PO43-)
S
1
SO4, H2S, S, organische zwavelverbindingen
K
1
Kaliumzouten
Mg
0.5
Magnesiumzouten
Ca
0.5
Calciumzouten
Fe
0.2
IJzerzouten
14
3.2 Biosynthetische routes
Voor het afbreken van de voedingsstoffen en het vormen van alle benodigde moleculen maken bacteriën gebruik van reacties die gekatalyseerd (versneld) worden door enzymen.
Doordat het product van het ene enzym het substraat van het volgende enzym is, zijn deze
reacties aan elkaar gekoppeld. Zo worden biosynthetische routes gevormd die soms heel
eenvoudig zijn, maar meestal vertakt zijn doordat het tussenproduct van een route het startpunt vormt voor een andere route (zie figuur 3).
Figuur 3: Biosynthetische routes. 1. Enkelvoudig proces; 2. Lineaire route; 3. Vertakte route.
Samen vormen alle biosynthetische routes in een bacterie een netwerk van processen. Het
geheel van deze chemische processen die nodig zijn om het leven in stand te houden noemen we het metabolisme.
Soorten vragen
Staat ergens in de module uitgelegd of verwijst naar het antwoord van een andere vraag.
Opzoeken op Internet of in chemiekaarten.
Herhaling scheikunde kennis
Vragen
1. Wat zijn de vijf basisfuncties van het metabolisme? 2. De stof acetyl-CoA (zie figuur 4, na pyruvaat) is een belangrijke stof in het metabolisme. Het kan gevormd worden uit suikers, aminozuren en vetten. Via welk proces
worden vetten afgebroken tot acetyl-CoA? 15
Figuur 4: Biosynthetische routes vormen een netwerk waardoor uit een klein aantal grondstoffen heel veel producten gevormd kunnen worden. Hier
krijgt de bacterie glucose als C-bron. De gele route geeft de afbraak tot lactaat aan. (.
, stoffen;
, route tussen twee stoffen)
16
Hoewel het geheel aan chemische processen dat in een bacterie plaatsvindt heel complex
lijkt, is het totaal aantal reacties toch veel kleiner dan je zou verwachten. In figuur 4 is een
dergelijk netwerk van een aantal routes aangegeven met als startpunt het molecuul glucose
dat vaak wordt gebruikt als C-bron. Een bacterie kan energie halen uit glucose door het af te
breken tot bijvoorbeeld ethanol of lactaat/melkzuur (gele route). Maar de bacterie kan glucose ook gebruiken voor het maken van zetmeel of peptidoglycan (aangegeven met rood).
Je kunt dit netwerk van biosynthetische routes het best vergelijken met het alle leidingen die
door een fabriek lopen. Via die leidingen worden allerlei stofstromen aan elkaar gekoppeld
en uit een gering aantal stoffen veel verschillende eindproducten gemaakt (figuur 5). Natuurlijk moet de bacterie er wel voor zorgen dat het de stoffen maakt die het nodig heeft. In de
bacterie vindt een netwerk van chemische processen plaats die heel nauwkeurig worden
gereguleerd. Net als men in een chemische fabriek afsluiters en kleppen gebruikt om de juiste stoffen samen te voegen en de gewenste producten te maken.
Figuur 5: Een netwerk van leidingen in een chemische fabriek.
Vragen
3. In figuur 4 zie je bovenaan in het midden histidine staan. Via welke twee routes kun je
deze stof maken?
4. Uit figuur 4 blijkt dat er veel processen in de bacterie aan elkaar gekoppeld zijn, er
kunnen blijkbaar allerlei stoffen ontstaan uit glucose of een ander voedingsmiddel.
Stel; je geeft een bacterie maar een beperkte hoeveelheid glucose. Hoe zorgt deze
bacterie er dan voor dat er genoeg energie uit de glucose wordt vrijgemaakt, maar
dat er ook voldoende peptidoglycan gemaakt wordt voor de celwand of andere stoffen die hij nodig heeft?
5. Onder welke omstandigheden denk je dat een bacterie zetmeel gaat vormen?Tip:
zoek eerst op wat de functie is van zetmeel en bedenk dan waarom een bacterie zo’n
stof maakt!
17
3.3 Energie voorziening van de cel
Energiedragers: betaalmiddelen in de cel
Een bacterie heeft voor het afbreken en vormen van stoffen en het uitvoeren van allerlei processen energie nodig. Deze energie haalt de bacterie meestal uit de afbraak van organische
moleculen zoals glucose. Om de energie die vrijkomt bij de afbraak van deze stoffen te benutten, maken bacteriën gebruik van zogenaamde energiedragers. Deze energiedragers zijn
moleculen waarin energie kan worden opgeslagen of waaruit energie kan worden vrijgemaakt. Je kunt deze energiedragers het best vergelijken met een betaalmiddel: geld. Het zou
heel onhandig zijn wanneer je bij de bakker met ander geld moet betalen dan bij de slager,
en nog weer met ander geld bij de supermarkt. Als je ergens geld voor krijgt, wil je dat geld
het liefst overal kunnen gebruiken om voor iets te betalen. Daarom gebruikt de bacterie maar
een klein aantal energiedragers die het bij veel processen die energie kosten weer kan gebruiken.
Twee belangrijke zaken die energiedragers in de cel kunnen leveren zijn Gibbs energie en
elektronen. Gibbs energie is de bruikbare energie die bij reacties uit moleculen gehaald kan
worden, later in deze module gaan we verder in op de Gibbs energie. Elektronen zijn nodig
voor het laten verlopen van redoxreacties in de cel. Gibbs energie en elektronen kun je niet
oplossen in water, daarvoor heb je dragers nodig. Dus als er voldoende Gibbs energie vrijkomt bij een reactie dan wordt het op een drager gezet. Als er bij een andere reactie juist
Gibbs energie nodig is dan wordt het van de drager afgehaald. Dit geldt natuurlijk ook voor
elektronen. Ook hier zijn dragers nodig die de elektronen transporteren.
ATP: de drager van Gibbs energie
In de cel is adenosinetrifosfaat (ATP, figuur 6) de belangrijkste drager van de Gibbs energie.
ATP wordt gebruikt in vrijwel alle levensprocessen die energie kosten, zoals de synthese van
organische moleculen en het transporteren van stoffen door het celmembraan de cel in en
uit.
Bij de hydrolyse van ATP in adenosinedifosfaat (ADP) en fosfaat (HPO42- , dit is een anorganische fosfaatgroep weergegeven met het symbool Pi) komt onder standaardomstandigheden 30,5 kJ/mol aan energie vrij.
Figuur 6: ATP in geïoniseerde toestand
ATP4- + H2O ADP3- + HPO42- + H+
-31 kJ mol-1
18
Verschillende factoren zorgen voor een groot verschil in Gibbs energie tussen ATP enerzijds
en ADP + Pi anderzijds:
• De negatief geladen zuurstofatomen in de fosfaatgroepen van ATP en ADP stoten elkaar af. Deze afstoting is kleiner in ADP dan in ATP.
• De producten van de hydrolyse van ATP, ADP en HPO42- (Pi), zijn beter oplosbaar
dan ATP. Wanneer ionen goed oplosbaar zijn, wordt er door hydratatie een watermantel gevormd die de afstoting tussen de ionen vermindert. Dit is de belangrijkste
factor die zorgt voor het grote verschil in Gibbs energie tussen ATP en ADP + Pi.
ADP kan door nog een fosfaatgroep af te splitsen verder omgezet worden naar adenosinemonofosfaat (AMP), waarbij weer 30,5 kJ/mol vrijkomt.
Vragen
6. De molecuulformule van ATP is C10H16N5O13P3. In de biosynthese en de biochemie
kom je vaak afkortingen en triviale namen van stoffen tegen ook in reactievergelijkingen. Waarom maakt de biochemie vaak gebruik van afkortingen en triviale namen?
7. Net als de meeste andere stoffen maakt de cel op meer dan één manier gebruik van
ATP. Noem een paar toepassingen van ATP in de cel?
8. Geef de reactie voor de hydrolyse van ADP tot AMP en fosfaat.
9. Vaak wordt er gezegd dat de binding tussen de fosfaatgroepen van ATP veel energie
bevat. Hierdoor ontstaat de indruk dat er bij het verbreken van deze bindingen energie vrijkomt. Waarom is dit onjuist?
NADH de drager van elektronen
Op verschillende plekken in de cel vinden
reductie- en oxidatiereacties plaats.
Elektronen moeten worden overgedragen
tussen redox-reacties, maar electronen
kun je niet oplossen in water. Daarom gebruikt de cel Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NADH, (figuur 7 en Binas tabel
67F) als drager van elektronen.
De gereduceerde vorm van NADH, NAD+,
kan van een donormolecuul (RH2) twee
waterstofatomen opnemen. Hierbij worden
NADH en een proton gevormd:
NAD+ + RH2 NADH + H++ R
De oxidatie van NADH verloopt via de volgende reactie:
NADH NAD+ +H+ + 2 eNADH kan dus twee elektronen en H+
overdragen tussen verschillende processen.
Figuur 7: NADH in geïoniseerde toestand.
19
Tabel 3: Betaalmiddelen en de bijbehorende energiedragers.
Betaalmiddel
Energiedrager
Geladen vorm
Gibbs energie
ADP + Pi
ATP
Elektron
NAD+
NADH
Vragen
10. Niet alleen in bacteriën maar ook in onze cellen wordt NADH gebruikt voor de overdracht
van elektronen. Waarom is NAD+ zo geschikt als elektronenacceptor en NADH als elektronendonor?
20
Hoe maakt een bacterie ATP en NADH?
Een bacterie kan ATP en NADH maken door o.a. glucose af te breken, dit wordt ook wel de dissimilatie van glucose genoemd. Deze dissimilatie gaat, afhankelijk van de beschikbaarheid van
zuurstof, via verschillende routes (figuur 8).
• De aerobe afbraak van glucose gaat via drie opeenvolgende biosynthetische routes:
o de glycolyse,
o de citoenzuurcyclus,
o de oxidatieve fosforylering (ademhalingsketen).
• De anaerobe afbraak van glucose verloopt via 2 routes:
o de glycolyse
o de fermentatie, de omzetting van glucose met behulp van micro-organismen
Figuur 8: De afbraak van glucose met zuurstof (aeroob) en zonder zuurstof (anaeroob). Wat
betreft ATP en NADH zijn alleen de plaatsen waar het gevormd en verbruikt wordt aangegeven.
Vraag
11. Onder welke omstandigheden wordt er in onze spiercellen lactaat gevormd?
21
De glycolyse
De eerste route voor de afbraak van glucose heet dus de glycolyse ( zie hiervoor ook Binastabel
68). Voor de glycolyse is geen zuurstof nodig en daarom maakt deze route onderdeel uit van zowel
de aerobe als de anaerobe afbraak van glucose. Nadat glucose in de cel is opgenomen wordt het
via de glycolyse omgezet in twee moleculen pyruvaat (CH3COCOO-). Biologen noemen pyruvaat
meestal pyrodruivenzuur, afgekort pdz.
De glycolyse bestaat uit 10 stappen die je kunt splitsen in twee delen.
1. Eerst worden er 2 moleculen ATP verbruikt om fructose-1,6-bifosfaat te maken (stap 1 t/m
3).
2. Tijdens het volgende deel van de glycolyse wordt 2 glyceraldehyde-3-fosfaat omgezet in 2
pyruvaat waarbij er 4 ATP en 2 NADH gevormd worden (stap 6 t/m 10).
De totaalreactie van de glycolyse is:
C6H12O6 + 2 NAD+ + 2 HPO42- + 2 ADP3- 2 CH3COCOO- + 2NADH + 2ATP4- + 2H2O + 2H+
Figuur 9: De 10 stappen van de glycolyse. Bij de moleculen is alleen het aantal C-atomen (zwarte bolletjes)
en de posities van de fosfaatgroepen (gele P) weergegeven.
22
Aerobe afbraak van glucose
Na de glycolyse volgen nog twee routes: de citroenzuurcyclus en de oxidatieve fosforylering.
Voordat de citroenzuurcyclus kan worden begonnen moet pyruvaat/pyrodruivenzuur worden aangepast. Eerst wordt de carboxylgroep van pyruvaat afgehaald en dit verdwijnt als koolstofdioxide,
deze stap noemt men dan ook decarboxylering. Ook bevat het molecuul energie in de vorm van
elektronen, die elektronen worden opgenomen door NAD+ waardoor er NADH gevormd wordt. De
derde aanpassing is het koppelen van een speciaal molecuul, Coenzym-A (CoA) aan de overgebleven acetylgroep waardoor er acetyl-CoA ontstaat.
De citroenzuurcyclus bestaat uit 8 stappen, in die stappen wordt acetyl-CoA omgezet in 2 koolstofdioxide moleculen. Per keer wordt in de cyclus 1 ATP gemaakt, maar de meeste energie gaat via
elektronenoverdracht naar NAD+ en FAD (FAD is de afkorting van flavine adenine dinucleotide,
een stof die net als NAD+ als drager van elektronen functioneert, de geladen vorm is FADH2).
De tijdens de glycolyse en citroenzuurcyclus gevormde NADH is de beginstof voor de laatste grote
stap in de vorming van energie uit glucose: de oxidatieve fosforylering. NADH geeft de opgeslagen
electronen af aan enzymen in de celmembraan. Hierna wordt via een serie redoxreacties zuurstof
gereduceerd tot water. Hierdoor kunnen deze enzymen de energie uit NADH gebruiken om protonen van binnen de cel naar buiten te transporteren. Op deze manier ontstaat er een verschil in de
concentratie van protonen in de cel en buiten de cel (in de cel is de pH hoger dan buiten de cel!).
Dit concentratieverschil kan de bacterie (of een andere levende cel) gebruiken voor de synthese
van ATP door het enzym ATP-synthetase.
De reacties voor de aerobe omzetting van glucose zijn:
Glycolyse
C6H12O6 + 2 NAD+ + 2 HPO42- + 2 ADP3 2 CH3COCOO- + 2 NADH + 2 H+ + 2 ATP4- + 2 H2O
Decarboxylering
2 CH3COCOO- + 2 HSCoA + 2 NAD+ 2 Acetyl-S-CoA + 2 NADH + 2 CO2
Citroenzuurcyclus
2 Acetyl-S-CoA + 6 NAD+ + 2 FAD + 2 ADP3- + 2 HPO42- + 4 H2O
2 HSCoA + 6 NADH + 2 FADH2 + 4 H+ + 2 ATP4- + 4 CO2
Oxidatieve fosforylering
2 NADH + O2 +2 H+ 2 H2O + 2 NAD+
2 FADH2 + O2 2 H2O + 2 FAD
Per NADH wordt er maximaal 3 ATP gevormd en per FADH2 2 ATP. Aangezien er tijdens de glycolyse, decarboxylering en citroenzuurcyclus 10 NADH en 2 FADH2 gevormd worden, levert de
oxidatieve fosforylering in totaal 34 ATP op.
De totaalreactie van de aerobe dissimilatie van glucose is:
C6H12O6 + 6 O2 + 38 ADP3- + 38 Pi 6CO2 + 6 H2O + 38 ATP4Vragen
12. Leg uit waarom tijdens de eerste stap in de glycolyse een fosfaatgroep aan glucose wordt
gekoppeld?
13. Leg uit waarom chemici het over pyruvaat hebben en niet over pyrodruivenzuur zoals biologen?
14. Wat is het belangrijkste verschil in reactiemechanisme tussen de verbranding van glucose
en de aerobe dissimilatie van glucose? 23
Anaerobe afbraak van glucose
Als er geen zuurstof aanwezig is, vindt de afbraak van organische moleculen plaats door middel
van fermentatie (gisting). Omdat er geen zuurstof nodig is voor de glycolyse verloopt de afbraak
van glucose zonder zuurstof ook via deze route. Het gevormde pyruvaat wordt hierna omgezet in
koolstofdioxide, lactaat, ethanol of andere alcoholen en carbonzuren.
De reactie voor de vorming van lactaat uit pyruvaat is:
CH3COCOO- + NADH + H+ CH3CHOHCOO- + NAD+
De totaalreactie van de anaerobe dissimilatie van glucose tot lactaat is:
C6H12O6 + 2 ADP3- + 2 HPO42- 2 CH3CHOHCOO- + 2 ATP4- + 2 H2O
De energieopbrengst van de anaerobe afbraak van glucose is dus veel lager dan van de aerobe
afbraak!
Vraag
15. Bereken het verschil in energieopbrengst tussen de anaerobe en aerobe dissimilatie van
glucose in kJ per mol glucose.
3.4 Basisprincipes in de biosynthese
In dit hoofdstuk zijn een aantal basis principes van de biosynthese behandeld aan de hand van de
afbraak van glucose. Deze basis principes of beter gezegd algemene regels gelden niet alleen
voor de biosynthetische routes die je nu geleerd hebt, maar kun je veel breder toepassen. De volgende regels kun je algemeen toepassen:
• Bijna alle processen in levende organismen spelen zich af in water en dus in oplossingen
• Voor niets gaat de zon op geldt ook voor alle biosynthetische processen. Voor het maken
van allerlei stoffen moet betaald worden. In de biosynthese wordt gebruik gemaakt van algemene betaalmiddelen. Als je energie nodig hebt moet je ATP verbruiken, als je elektronen nodig hebt kun je gebruik maken van NADH.
• Biosynthetische processen mogen niet spontaan verlopen en er mag niet zo maar ATP of
NADH gevormd of verbruikt worden. Daarom gelden er basisprincipes voor de regulering
van activiteiten. De Gibbs energie speelt hierbij altijd een belangrijke rol.
In de chemische industrie moeten de wetenschappers die productieprocessen ontwerpen rekening
houden met deze basisprincipes.
De komende twee hoofdstukken worden er twee productieprocessen besproken:
• Melkzuur productie als voorbeeld uit de klassiek biotechnologie. De grote uitdaging is om
melkzuurbacteriën grote hoeveelheden melkzuur te laten produceren en het melkzuur zuiver in handen te krijgen.
• De productie van 1,3-propaandiol, een voorbeeld van moderne biotechnologie uit de 21e
eeuw. In eerste instantie waren er geen micro-organismen die deze stof kunnen maken.
Daarom heeft men de bacterie Escherichia coli (E.coli) genetisch zo gemodificeerd dat de
nieuwe stam 1,3-propaandiol uit glucose kan produceren. Na de fermentatie vinden er een
aantal zuiveringstappen plaats om het product in handen te krijgen.
24
Wat je nu moet weten
•
Metabolisme
o Vijf basisfuncties
• Energievoorziening van de cel
o ATP
o NADH
o Actief transport
• Dissimilatie van glucose
o Aerobe afbraak
Glycolyse
Citroenzuurcyclus
Oxidatieve fosforylering
o Anaerobe afbraak
Glycolyse
Fermentatie
25
Hoofdstuk 4
Klassieke biotechnologie: de melkzuurfabriek
Melkzuur
Eigenschappen
Melkzuur is de triviale naam voor 2-hydroxypropaanzuur. Melkzuur is in zuivere vorm een witte
vaste stof met een smeltpunt van 53 0C. Een melkzuurmolecuul bevat een asymmetrisch koolstofatoom en van melkzuur komen daarom twee optische isomeren voor, linksdraaiend melkzuur en
rechtsdraaiend melkzuur. Zie voor het onderwerp optische isomerie de website
www.contextchemie.nl.
Melkzuur behoort tot de carbonzuren en is dus een zwak zuur. De geconjugeerde base van melkzuur heet lactaat ion.
Het lactaat ion kan met metaalionen lactaatzouten vormen. Van deze lactaatzouten is calciumlactaat matig oplosbaar en zouten met andere metaalionen, bijvoorbeeld zink, zijn meestal slecht oplosbaar.
Toepassingen
Melkzuur en lactaten kennen veel toepassingen, vooral in de levensmiddelen-, cosmetische-, farmaceutische- en medische industrie. De productie groeide van circa 10.000 ton per jaar in 1960 tot
meer dan 500.000 in 2009.
Figuur 1: Toepassingen van melkzuur. Zie ook www.purac.com (applications)
Omdat een melkzuurmolecuul zowel een carboxyl-groep als een hydroxyl-groep bevat, kan er
onder bepaalde omstandigheden polycondensatie optreden. Er ontstaat dan polymelkzuur.
Polymelkzuur met een hoog moleculair gewicht heeft de mechanische eigenschappen die vereist
zijn voor toepassingen zoals hechtdraad, vezels voor beschadigde pezen en kruisbanden, of materialen voor het herstellen van botfracturen en sportblessures. Voorbeelden hiervan zijn schroeven
26
voor het vastzetten van een nieuwe kruisband in de knie of ‘weerhaakjes’ voor reparatie van een
gescheurde meniscus. Een niet-medische toepassing is de vervanging van plastics, die op basis
van aardolie zijn gemaakt. In 1997 is Cargill Dow ontstaan, gericht op productie op grote schaal
van polymelkzuur voor afbreekbare plastics, coatings en verpakkingsmateriaal.
Vragen
1. Geef de structuurformules van melkzuur en zijn geconjugeerde base.
2. Geef in de structuurformule van melkzuur met een sterretje het asymmetrische koolstof
atoom aan.
Experiment: Productie van melkzuur door melkzuurbacteriën.
Vraag het werkblad productie van melkzuur door melkzuurbacteriën.
4.1 Synthese van melkzuur
Het gegeven dat melkzuurbacteriën melkzuur kunnen produceren, wordt al eeuwen gebruikt in de
productie van yoghurt en zuurkool. Maar kun je deze bacteriën ook gebruiken om zuiver melkzuur
te produceren in plaats van melkzuur chemisch te synthetiseren?
De meest gebruikte chemische synthese route voor de productie van melkzuur is via de hydrolyse
van 2-hydroxypropaannitril (CH3CHOHCN) m.b.v. een oplossing van zwavelzuur. Het
2-hydroxypropaannitril dat hiervoor nodig is, wordt gevormd uit waterstofcyanide en ethanal. De
grondstof voor ethanal is aardolie.
Vragen
3. Geef de reactievergelijking in structuurformules voor de vorming van 2-hydroxypropaannitril
uit waterstofcyanide en ethanal.
4. Geef de reactievergelijking in structuurformules voor de hydrolyse van 2hydroxypropaannitril waarbij een molecuul melkzuur en een ammoniumion gevormd wordt.
De chemische synthese levert een mengsel waarin beide optische isomeren van melkzuur evenveel voorkomen. Vooral bij het gebruik in voedingsmiddelen en medicijnen is dit bezwaarlijk omdat
linksdraaiend melkzuur allergieën kan veroorzaken. Veel soorten melkzuurbacteriën maken alleen
rechtsdraaiend melkzuur, dit is dus een duidelijk punt in het voordeel van de bacteriële productie.
Een ander voordeel van het gebruik van melkzuurbacteriën is dat ze glucose als grondstof gebruiken. Meestal is glucose van plantaardige oorsprong en is dus een hernieuwbare grondstof die niet
uitgeput raakt.
De grote uitdaging is om melkzuurbacteriën grote hoeveelheden melkzuur te laten produceren en
het melkzuur zuiver in handen te krijgen. Dit hoofdstuk laat zien dat daar een behoorlijke hoeveelheid chemische technologie voor nodig is.
Vragen
5. Wat zijn de afvalstoffen bij de chemische synthese van melkzuur?
6. Hoe komt het dat de melkzuur die door bacteriën wordt gemaakt vaak stereospecifiek is?
27
4.2 Melkzuurfabriek
In het vorige hoofdstuk heb je gezien dat glucose in een zuurstofarm milieu door bacteriën wordt
omgezet in melkzuur of ethanol.
Figuur 4 uit hoofdstuk 3 laat zien dat om van glucose melkzuur (lactaat) te maken eerst de horizontale “hoofdroute” gevolgd moet worden tot pyruvaat. Dit is zoals je geleerd hebt de glycolyse. Pyruvaat wordt via fermentatie omgezet in lactaat.
Om zoveel mogelijk van het gewenste melkzuur te maken heb je heel veel melkzuurbacteriën nodig. Bacteriën vermenigvuldigen zich door middel van deling. Dit gebeurt gecontroleerd in een zogenaamde fermentor. Dit is een apparaat waarin de temperatuur, de pH, de toevoer van zuurstof
en de toevoer van voedingsstoffen gemeten, geregeld en bewaakt kunnen worden. Er zijn fermentoren voor proeven in laboratoria waar één tot tientallen liters vloeistof in kunnen voor onderzoek.
Maar bedrijven die een stof produceren doen dit op grote schaal en gebruiken fermentoren waar
wel 500.000 liter in kan!
Figuur 2:
Links een afbeelding van een grote industriële fermentor. Rechts de verschillende fasen van bacteriegroei
De groeicurve van bacteriën heeft 4 fasen.
A. De aanpassingsfase; als bacteriën in een medium komen duurt het even voordat de
bacteriecellen kunnen gaan delen. Een medium is de vloeistof/suspensie waarin bacteriën
groeien, deze bevat alle voedingsstoffen die bacteriën nodig hebben. De groei komt dus
langzaam op gang.
B. De groeifase; na de aanpassingsfase gaan de bacteriecellen met optimale snelheid delen.
C. De stationaire fase; in deze fase is er geen groei of afname van de hoeveelheid bacteriecellen. De totale hoeveelheid bacteriecellen blijft dus gelijk. Als de bacteriën in de stationaire fase zijn gekomen gaan ze melkzuur produceren.
D. De drie groeifasen worden gevolgd door de afstervingsfase. Het groeien gaat niet eindeloos door. Als de voedingstoffen op zijn of bepaalde bacteriële producten zich ophopen,
stopt de groei.
Vragen
7. Bestudeer in figuur 4 van hoofdstuk 3 de biosynthetische routes. Welke routes zijn belangrijk als de cel aan het groeien en of delen is?
Tip: bedenk wat de belangrijke bouwstenen van de celwand en het cytoplasma zijn, zie figuur 2 en bladzijde 1 en 2 van hoofdstuk 3.
8. Waarom laat men bacteriën pas in de stationaire fase melkzuur produceren en niet ook in
de groeifase?
Melkzuur wordt geproduceerd door middel van een batch- of een fed-batch proces. Een batch reactor is een gesloten, goed gemengd vat. Een productiecyclus wordt gestart door alle grondstoffen
en de bacteriën in de reactor te brengen. Tijdens een productiecyclus, ook wel batch genoemd,
worden geen stoffen aan- of afgevoerd, behalve eventueel zuurstof en/of stoffen om de pH aan te
passen.
28
Tijdens een batch proces is, als gevolg van de reacties die plaatsvinden tijdens het proces, sprake
van continu veranderende concentraties van de diverse stoffen, dus een continu veranderende
omgeving. Dit heeft ten gevolge dat de melkzuurproductie niet maximaal is.
Daarom wordt voor de productie van melkzuur gebruik gemaakt van een fed-batch proces. Bij een
fed- batch reactor is er, anders dan bij de batch reactor, sprake van een instroom van stoffen tijdens het proces.
Figuur 3: Links een schematische voorstelling van een batch reactor en rechts van een fed-batch reactor
De reactor wordt gevuld met bacteriën en medium. Dit medium bevat behalve de glucose oplossing (het substraat) ook voedingsstoffen die de bacterie nodig heeft om te groeien en te overleven
zoals stikstofbronnen, vitamines, aminozuren en metaalionen. Tijdens de groeifase (B) gebruiken
de bacteriën glucose en voedingsstoffen. Als de optimale hoeveelheid bacteriën is gevormd gaat
er een toenemend tekort aan voedingsstoffen ontstaan. Een deel van de bacteriën sterft daardoor
af. Dit is het begin van de stationaire fase (C). Het aantal bacteriën dat in deze fase afsterft, is
even groot als het aantal bacteriën dat gevormd wordt.
Om de bacteriën optimaal te laten produceren worden gedurende de stationaire fase gedoseerd
glucose (substraat) en één of meer voedingscomponenten toegevoegd. De concentraties van de in
de reactor aanwezige stoffen zijn daardoor minder aan veranderingen onderhevig en dit resulteert
in een grotere melkzuur productie.
Bij de productie van melkzuur wordt het medium steeds zuurder. De bacteriën kunnen hier niet
goed tegen. Vaak wordt daarom calciumcarbonaat toegevoegd als buffer. Mocht de pH erg wisselen, dan kan er tijdens het proces een zuur of een base worden toegevoegd. Als er zoveel melkzuur in het mengsel zit, dat de leefomstandigheden voor de bacterie heel ongunstig worden, begint
de afstervingsfase (D). Dat is het einde van het fed-batch proces.
Na dit fermentatieproces heb je een vloeistof waarin zich melkzuur, medium en bacteriën bevinden. Het medium en de bacteriën zullen eerst van het melkzuur gescheiden moeten worden.
4.3 Zuivering melkzuur
Na fermentatie zijn er verschillende mogelijkheden om het melkzuur te scheiden van het fermentatie mengsel. Meestal wordt de productie van melkzuur gestopt door het verhogen van de zuurgraad m.b.v. calciumcarbonaat tot pH =10, gevolgd door verhitten. De hoge pH doodt de bacteriën,
de combinatie van hoge temperatuur en hoge pH breekt overgebleven suikers af. De calciumionen
laten de eiwitten en cellen samenklonteren zodat ze sneller neerslaan. Verhitten zorgt ook voor het
neerslaan van een eventuele overmaat aan calciumcarbonaat. Na verhitten wordt het fermentatiemengsel gefiltreerd.
29
Vraag
9. Noem 4 stoffen die in ieder geval in het residu aanwezig zullen zijn. Kijk even naar de samenstelling van de cel in hoofdstuk 2.
Blokschema melkzuurproductie
Het filtraat van het fermentatiemengsel bevat een lage concentratie melkzuur en nog allerlei andere stoffen. Voor de meeste toepassingen moet de concentratie melkzuur verhoogd worden en verder gezuiverd worden. In figuur 4 staan de blokschema’s van vijf routes voor het zuiveren van het
melkzuur. In elk schema staan de belangrijkste bewerkingen in blokken gegeven en de stofstromen zijn de pijlen tussen de blokken. Voor de productie van glucose uit ruwe grondstoffen is in de
figuur route -1 opgenomen.
Opdracht Zuivering melkzuur
Maak een groepje van 3 of 4 personen en kies een route die je nader gaat bestuderen.
In deze opdracht zijn jullie samen een chemisch adviesbureau dat moet adviseren over een te kiezen scheidingsroute voor een nieuw te bouwen melkzuurfabriek. Maak de vragen bij de route en
bereid daarna een presentatie voor van maximaal 5 minuten waarin je de directie (de rest van de
klas) uitlegt hoe de door jullie gekozen scheidingsroute werkt. De antwoorden van de vragen bij de
route moeten in je presentatie voorkomen.
Het laatste gedeelte van de les worden de voor- en nadelen van de verschillende routes besproken.
Soorten vragen
Staat ergens in de module uitgelegd of verwijst naar het antwoord van een andere vraag.
Opzoeken op Internet of in chemiekaarten.
Herhaling scheikunde kennis.
30
Figuur 4: Blokschema voor de melkzuur productie volgens het fed-batch proces. In het blokschema staan de belangrijkste bewerkingen in de blokken aangegeven en de stofstromen zijn de pijlen tussen de blokken. De route begint bij 0 (glucose). De routes 1 t/ 5 zijn de verschillende methodes die gebruikt worden
om het melkzuur te zuiveren. Route -1 wordt gevolgd indien er ruwe grondstoffen gebruikt worden
31
Route -1
Figuur 5: blokschema route -1
Vragen bij route -1
De prijs van technisch zuiver melkzuur (± 90%) wordt voor 65% tot 80% bepaald door de
prijs van de grondstof. Vooral voor toepassingen in de chemische bulk chemie is het erg
belangrijk dat de grondstoffen goedkoop zijn. Daarom wordt er op dit moment veel onderzoek gedaan naar de mogelijkheid om ruwe grondstoffen uit de landbouw en voedingsindustrie te gebruiken als grondstof. Naast de prijs is het ook belangrijk dat de grondstof niet te
veel restafval geeft en dat de grondstoffen redelijk zuiver zijn. Ook is het van belang dat
grondstoffen het hele jaar beschikbaar zijn.
1. Leg uit of bij de productie van medicijnen de prijs van de grondstof erg belangrijk of
minder belangrijk is. /
2. Leg uit waarom het belangrijk is dat een grondstof het hele jaar te verkrijgen is. Welke van de grondstoffen in tabel 1 zijn dat? /
In de meeste van de grondstoffen in tabel 1 zijn opgebouwd uit cellulose en/of zetmeel
Deze stoffen moeten eerst omgezet worden in glucose voordat ze gebruikt kunnen worden
in de melkzuur productie.
3. Welke grondstoffen leveren cellulose en welke zetmeel? /
Tabel 1:recent onderzochte bacteriesoorten en ruwe grondstoffen
Ruwe grondSoort bacterie
stof
Lactobacillus delbrueckii
1
Melasse
Enterococcus faecalis RKY1
2
Lactobacillus paracasei No. 8
3
Rogge
Lactobacillus paracasei No. 8
4
Gierst
Lactobacillus lactis ssp, lactis ATCC 19435
5
Tarwe
Enterococcus faecalis RKY1
6
Enterococcus faecalis RKY1
7
Maïs
Lactobacillus amylovorus ATCC 33620
8
Lactobacillus amylovorus ATCC 33620
9
Cassave
Lactobacillus amylovorus ATCC 33620
10 Aardappel
Lactobacillus sp, RKY2
11 Rijst
Lactobacillus casei NRRL B-441
12 Gerst
Lactobacillus amylophilus GV6
13
1
Lactobacillus corniformis ssp, Torquens ATCC
14 Cellulose
25600
2
Rhizopus sp, MK-96-1196
15 Corncob
Lactobacillus corniformis ssp, Torquens ATCC
16 Papierafval
25600
Rhizopus oryzae NRRL 395
17
Lactobacillus delbrueckii NRRl B-445
18 Hout
Enterococcus faecalis RKY1
19
Lactobacillus helveticus R211
20 Wei
Lactobacillus casei NRRL B-441
21
1- stro, zemelen, maïsstengels etc,
2- maïskolven zonder maïskorrels
Opbrengst
-1
(gL )
90,0
95,7
84,5
106,0
106,0
102,0
63,5
10,1
4,8
4,2
129,0
162,0
27,3
24,0
Productiesnelheid
-1 -1
(gL h )
3,8
4,0
2,4
3,5
1,0
4,8
0,5
0,8
0,2
0,1
2,9
3,4
0,3
0,5
24,0
23,1
0,3
0,5
49,1
108,0
93,0
66,0
46,0
0,7
0,9
1,7
1,4
4,0
32
Uit zetmeel en cellulose bevattende grondstoffen moet eerst door hydrolyse de glucose vrijgemaakt worden.
Dit kan met geconcentreerd zwavelzuur of door verhitten, maar een energiezuiniger en
schonere methode is om met behulp van enzymen de cellulose en/of het zetmeel af te breken. Zie Binas tabel 82H.
4. Welke enzym kan gebruikt worden om zetmeel om te zetten in glucose? /
5. Welke enzym kan gebruikt worden om cellulose om te zetten in glucose? /
Wei is een restproduct van de productie van kaas. Het bevat onder andere lactose, eiwitten
en vetten
6. Uit welke van de hierboven genoemde drie stoffen kan je glucose maken? Welk enzym is daarvoor nodig? /
7. Is wei een geschikte grondstof voor de productie van melkzuur? Baseer je conclusie
op prijs, beschikbaarheid, zuiverheid, oplosbaarheid en hoeveelheid restafval. /
Uit ethische en economische overwegingen is het niet wenselijk om gebruik te maken van
grondstoffen, die ook belangrijk zijn voor de voedselproductie.
Tabel 1 geeft voor een aantal grondstoffen de opbrengst aan melkzuur in gram per liter medium en de productiesnelheid in gram per liter medium per uur.
8. Welke 5 grondstoffen leveren het meeste melkzuur per liter medium? 9. Welke van in vraag 8 gevonden 5 grondstoffen is geen belangrijke voedingsstof?
Wat is het belangrijke nadeel van deze grondstof? Een andere studie laat zien welke optische isomeer van melkzuur gemaakt wordt en of de
melkzuurbacteriën homofermenterend of heterofermenterend zijn. Homofermentatieve melkzuurbacteriën produceren alleen melkzuur uit maltose of glucose in anaërobe omstandigheden. Heterofermentatieve melkzuurbacteriën produceren naast melkzuur ook ethanol en
CO2 uit allerlei hexosen. In de tabel wordt voor de twee optische isomeren van melkzuur de
aanduiding D of L gebruikt. De groepen rond het asymmetrisch koolstofatoom kunnen ruimtelijk gezien op twee manieren gerangschikt zijn. Vaak wordt in dit verband van de D- en Lconfiguratie gesproken. Zie voor dit onderwerp www.contextchemie.nl.
Als in de tabel DL staat betekent dit dat de bacteriën een racemisch mengsel produceren.
Tabel 2: recent onderzochte melkzuur bacteriën
Lactobacillus
HomoHeterofermenterend fermenterend
L. delbrueckii
+
L. lactis
+
L. bulgaricus
+
L. casei
+
L. plantarum
+
L. curvatus
+
L. brevis
+
L. fermentum
+
Sporolactobacillus
S. inulinus
+
Streptococcus
S. faecalis
+
S. cremoris
+
S. lactis
+
Leuconostoc
L. mesenteroides
+
L. dextranicum
+
Melkzuur
isomeer
D
D
D
L
DL
DL
DL
DL
D
L
L
L
D
D
33
Omdat D-melkzuur allergieën kan veroorzaken, wordt in medicijnen en cosmetica alleen
L-melkzuur gebruikt.
10. Welke ruwe grondstof kan gebruikt worden voor de productie van L-melkzuur?
Combineer hiervoor de gegevens uit de tabellen 1 en 2. 11. Als grondstof voor een kleurstof in LCD schermen voor kleurentelevisies wordt Dmelkzuur gebruikt. Welke ruwe grondstoffen kunnen hiervoor gebruikt worden? 12. Bereid een les voor waarin je de voor en nadelen van het gebruik van verschillende
grondstoffen toelicht. Kies daarna de (volgens jullie) optimale grondstof, zoek uit
welk enzym daarvoor nodig is.
13. Geef bij de pijlen tussen de blokken aan welke stoffen er worden vervoerd. 34
Route 1
Figuur 6: blokschema route 1
Vragen bij route 1
In blok 1.1 wordt kalk aan het fermentatiemengsel toegevoegd om de pH te verhogen.
1. Geef de naam en de formule van de stof die met de triviale naam kalk wordt bedoeld? 2. Leg met behulp van een reactievergelijking uit waarom de pH van het mengsel stijgt
door het toevoegen van kalk. 3. Geef de reactievergelijking voor het ontstaan van een neerslag bij verhitten. 4. Welke stof(fen) zit(ten) er in het residu van blok 1.1?
Voor het goed verlopen van de processen in blok 1.2 is de pH belangrijk. De pH van het
filtraat uit blok 1.1 is ongeveer 10 en moet verlaagd worden om zo veel mogelijk lactaat weer
om te zetten in melkzuur. In dit blok moet ook de eventuele overmaat aan Ca2+ ionen verwijderd worden.
5. Welke stof kan je gebruiken om de pH te verlagen? Tip: bedenk daarbij of deze stof
in je eindproduct terechtkomt. 6. Welke stof zal in het residu aanwezig zijn?
7. De pKz van melkzuur is 3,95. Bereken de verhouding melkzuur : lactaat-ion bij pH =
pKz.
8. Bereken bij welke pH de verhouding melkzuur : lactaat-ion gelijk is aan 9 : 1.
In blok 1.2 wordt diisopropylether gebruikt voor de extractie van melkzuur uit het mengsel.
9. Geef de structuurformule en de systematische naam van diisopropylether 10. Is diisopropylether een veilige stof om mee te werken? Om te weten welke gevolgen
blootstelling aan deze stof kan hebben ga je naar de site met Ïnternational Chemical
Safety Cards http://www.cdc.gov/niosh/ipcs/dutch.html 11. Leg uit waarom diisopropylether een geschikt extractiemiddel is om melkzuur uit water te extraheren. 12. Leg uit waarom het lactaat-ion niet goed oplost in diisopropylether. Licht je antwoord
toe. In blok 1.3 moet het mengsel van melkzuur en diisopropylether weer gescheiden worden.
Daarvoor wordt gebruik gemaakt van tegenstroomwassen.
13. a. Wat verstaan we onder tegenstroomwassen. b. Leg uit waarom melkzuur van de diisopropyletherstroom naar de waterstroom
gaat.
c. Leg met behulp van een tekening uit hoe je een tegenstroomopstelling zou kunnen bouwen m.b.v. practicumspullen op school. Tip: denk aan een gaswasflesje.
14. Geef bij de pijlen tussen de blokken aan welke stoffen er worden vervoerd. 35
Route 2
Figuur 7: blokschema route 2
Vragen bij route 2
In blok 2.2 wordt gesproken van extractie. Voor de extractie van melkzuur wordt bijv. trioctylamine, N(C8H17)3, toegevoegd aan heptaan. Trioctylamine, een tertiaire amine, is dus
een hulpstof bij de extractie.
1. Geef de structuurformule van trioctylamine en heptaan. 2. Leg uit waarom heptaan geen geschikt extractiemiddel is voor melkzuur? 3. Leg uit waarom trioctylamine goed oplost in heptaan. 4. Trioctylamine kan net als NH3 in water als base reageren. Laat dit zien m.b.v. een
reactievergelijking. Tijdens de extractie in blok 2.2 vindt er een reactie plaats waarbij een organisch zout wordt
gevormd. Een organisch zout is een zout waarin het positieve metaalion is vervangen door
een positief organisch ion. Voor deze techniek wordt vaak de term reactieve extractie gebruikt.
5. Geef de reactievergelijking voor de reactie die plaatsvindt in blok 2.2. /
6. Leg uit waarom dit organisch zout oplost in heptaan. Het verdelingsevenwicht van melkzuur, zowel in de lactaatvorm als in de zure vorm, over de waterfase en de
heptaanfase is gegeven door:
K=
[Melkzuur ]heptaan+trioctylamine
[Melkzuur ]water
De waarde van K wordt bepaald als functie van de pH.
De resultaten zijn weergeven in de grafiek hiernaast
met de waarde van K op de verticale as.
7. In welk pH gebied extraheer je de maximale
hoeveelheid melkzuur in blok 2.2? 8. Bereken het percentage melkzuur dat geëxtraheerd wordt bij pH = 2,5. 9. Leg nu uit waarom het filtraat uit blok 2.2 wordt
aangezuurd.
Figuur 8: De verdelingsconstante K voor
de verdeling van melkzuur over de waterfase en de heptaan+trioctylamine fase als
functie van de pH van de waterfase.
Na indampen in blok 2.3 wordt een zout gevormd. Bij de hoge temperatuur in blok 2.4 ontleedt dit zout in melkzuur en trioctylamine.
10. Zoek het kookpunt en smeltpunt van heptaan op. 11. Zoek het kookpunt en smeltpunt van trioctylamine op 12. Wat is het kookpunt en smeltpunt van melkzuur. 13. Bij welke temperatuur kan het mengsel van het oplosmiddel en het zout van melkzuur en trioctylamine in blok 2.3 gescheiden worden? 14. Geef van de reactie, die in blok 2.4 verloopt, de reactievergelijking.
36
15. Geef bij de pijlen tussen de blokken aan welke stoffen er worden vervoerd. 37
Route 3
Figuur 9: blokschema route 3
Vragen bij route 3
In blok 3.1 wordt kalk aan het fermentatiemengsel toegevoegd om de pH te verhogen.
1. Geef de naam en de formule van de stof die met de triviale naam kalk wordt bedoeld? 2. Leg met behulp van een reactievergelijking uit waarom de pH van het mengsel stijgt
door het toevoegen van kalk. 3. Geef de reactievergelijking voor het weer neerslaan van de overmaat aan kalk bij
verhitten. 4. Welke stof(fen) zit(ten) in het residu van blok 3.1. In blok 3.2 wordt methanol toegevoegd. In de reactor reageert melkzuur met methanol.
5. Geef van deze reactie de reactievergelijking in structuurformules. /
6. Geef de systematische naam van de gevormde stof.
7. Verwacht je dat het reactieproduct van blok 3.2 goed oplosbaar is in water? Licht je
antwoord toe! 8. Zal de reactie in blok 3.2 beter verlopen bij een hoge of bij een lage pH. Licht je antwoord toe. Bij het productieproces kan afhankelijk van het soort bacteriën dat gebruikt wordt, een van
de optische isomeren van melkzuur gevormd worden. Het is ook mogelijk dat de bacteriën
een racemisch mengsel produceren. Voor de twee optische isomeren van melkzuur wordt
de aanduiding D of L gebruikt. De groepen rond het asymmetrisch koolstofatoom kunnen
ruimtelijk gezien op twee manieren gerangschikt zijn. Men spreekt dan van de D- en Lconfiguratie van melkzuur. Zie voor dit onderwerp www.contextchemie.nl . DL betekent dat
de bacteriën een racemisch mengsel geproduceerd hebben. We gaan er bij dit proces vanuit
dat de gebruikte bacterie L-melkzuur produceert.
9. Wat zijn de kookpunten van het L-, DL- en D-melkzuur? Je kunt dit opzoeken op het
internet of in het Handbook of Chemistry and Physics. In moderne fabrieken worden blokken 3.2 en 3.3 samengevoegd. In dit geval spreken we
van reactieve destillatie.
10. Leg uit wat we onder reactieve destillatie verstaan. In blok 3.4 wordt het reactieproduct van blok 3.2 gehydrolyseerd (zie vraag 6).
11. Geef de reactievergelijking van deze hydrolyse. 12. Welke stof wordt toegevoegd om ervoor te zorgen dat deze hydrolyse volledig verloopt? 13. Bij welke pH zal deze hydrolyse optimaal verlopen? Licht je antwoord toe. /
14. Levert deze route gemakkelijk een verdunde of een geconcentreerde melkzuuroplossing? Licht je antwoord toe. /
15. Geef bij de pijlen tussen de blokken aan welke stoffen er worden vervoerd. 38
Route 4
Figuur 10: blokschema route 4
Vragen bij route 4
In blok 4.1 wordt kalk aan het fermentatiemengsel toegevoegd om de pH te verhogen.
1. Geef de naam en de formule van de stof die met de triviale naam kalk wordt bedoeld? 2. Leg met behulp van een reactievergelijking uit waarom de pH van het mengsel stijgt
door het toevoegen van kalk. 3. Geef de reactievergelijking voor het weer neerslaan van de overmaat aan kalk bij
verhitten. 4. Welke stof(fen) zit(ten) in het residu van blok 4.1. Het mengsel van stoffen dat van blok 4.1 naar blok 4.2 gaat wordt in blok 4.2 ingedampt.
Door het indampen ontstaan er zoutkristallen.
5. Geef de verhoudingsformule en de naam van het ontstane zout. /
In blok 4.3 wordt zwavelzuur toegevoegd om de vaste stof uit blok 4.2 om te zetten. Hierbij
verlopen er twee reacties na elkaar, waarbij onder andere de calciumionen neerslaan. Tevens wordt in dit blok actieve kool toegevoegd.
6. Geef de reactievergelijkingen van de twee reacties die plaatsvinden in blok 4.3. /
7. Welke stoffen worden in het algemeen verwijderd door het toevoegen van de actieve
kool.
8. Hoe heet deze methode en op welk principe berust deze methode? /
De oplossing uit blok 4.3 wordt in blok 4.4 opnieuw ingedampt. De kristallen in blok 4.2 worden dus in blok 4.3 opgelost om vervolgens in blok 4.4 opnieuw gevormd te worden. Deze
handeling wordt ook wel herkristallisatie genoemd.
9. Waarom wordt deze herkristallisatie uitgevoerd? 10. Geef de vergelijking van de reactie in blok 4.4. /
11. Hoe maakt men uit het eindproduct van deze route (Ca(C3H5O3)2) het melkzuur?
12. Geef bij de pijlen tussen de blokken aan welke stoffen er worden vervoerd. 39
Route 5
Figuur 11: blokschema route 5
Vragen bij route 5
In de figuur rechts staat een elektrodialyse cel afgebeeld. Als de twee
elektroden via een stroombron met elkaar worden verbonden gaat er
een elektrische stroom door de oplossing open.
1. Geef in de figuur aan naar welke richting de ionen gaan bewegen ten gevolge van de aangelegde bronspanning.
2. Naast de lading is er nog een andere eigenschap die bepaalt
hoe snel de ionen zich in de oplossing kunnen bewegen. Welke eigenschap van de ionen is dat? In de figuur rechts staat dezelfde cel maar nu zijn semi-permeabele
membranen voor de elektroden geplaatst. Deze membranen scheiden op grootte en op lading. De ionen moeten door de poriën heen
kunnen. Door elektrisch afstoting kunnen positief geladen ionen niet
door een positief geladen membraan en vice versa
3. Kunnen in de cel rechts de natriumionen de negatieve pool
bereiken? Licht je antwoord toe. 4. Kunnen de sulfaationen de positieve pool bereiken? Licht je
antwoord toe. 5. Kunnen natriumionen en sulfaationen op deze wijze volledig
van elkaar gescheiden worden? Licht je antwoord toe.
In de cel rechts is nu in de ruimte tussen de membranen het fermentatiemengsel uit blok 0.0 gebracht. De membranen zijn zo gemaakt
dat lactaat ionen deze kunnen passeren maar grotere negatief geladen ionen niet.
6. Geef in de figuur rechts aan hoe lactaat ionen, waterstofionen
en calcium ionen zich door de cel bewegen. /ι
7. Waarom is het bij deze scheidingsmethode niet noodzakelijk
om eerst suikers, bacteriëncellen en eiwitten uit het fermentatiemengsel te verwijderen? Figuur 12
Uit onderzoek blijkt ook dat als tijdens elektrodialyse ook de elektrolyse van water plaatsvindt de scheiding nog efficiënter verloopt. Er wordt dan meteen melkzuur verkregen i.p.v.
een lactaatzout
8. Geef de reactie van water aan de negatieve pool. 9. Geef de reactie van water aan de positieve pool. 10. Leg uit waarom nu meteen melkzuur gevormd wordt. /
11. Geef aan uit welke stoffen het neerslag bestaat. /
12. Geef bij de pijlen tussen de blokken aan welke stoffen er worden vervoerd. 40
4.4 Productie van polymelkzuur
Polymelkzuur
Polymelkzuur is het polymeer van melkzuur. Hieronder is een deel van een polymelkzuurmolecuul (PLA=poly lactic acid) weergegeven:
H O
H O
H O
O C C O C C O C C
CH3
CH3
CH3
n
Figuur 13: Een deel van een polymelkzuurmolecuul (PLA)
De materiaaleigenschappen van PLA zijn vergelijkbaar met die van polyetheen. PLA en polyetheen zijn allebei kleurloze thermoplasten met relatief lage smeltpunten. Net als bij polyetheen hangen de materiaaleigenschappen van PLA sterk af van de ketenlengte. Beide polymeren kunnen zowel in amorfe als kristallijne structuur () voorkomen. Dit verschil in
structuur heeft een groot effect op de smeltpunten. Het amorf of kristallijn zijn van PLA wordt
in hoge mate bepaald door de ruimtelijke structuur van de asymmetrische koolstofatomen in
de keten.
Het grote verschil tussen polyetheen en PLA is dat polymelkzuur in aanwezigheid van enzymen of bij hogere temperaturen gemakkelijk hydrolyseert. Het daarbij ontstane melkzuur
kan door aërobe organismen afgebroken worden tot koolstofdioxide en water. Wel is het zo
dat kristallijn PLA veel langzamer hydrolyseert dan amorf PLA.
Vraag
1. Verklaar waarom kristallijn PLA zoveel slechter biologisch afbreekbaar is dan amorf
PLA.
Productie polymelkzuur
Door polycondensatie kan polymelkzuur gevormd worden uit melkzuur
CH 3
+ n H2O
_
_
_
_
_
H O
C_ C_ O
_
_
_
_
_
_
H OH
_ _ __ O
n H C C C
OH
H H
_
n
Figuur 14: De polycondensatie van melkzuur tot PLA
De gemakkelijke hydrolyse van PLA suggereert al dat bovenstaande reactie omkeerbaar is
en dat het onder de meeste omstandigheden een evenwichtsreactie is. In de synthese van
PLA is het moeilijk om lange ketens te maken, omdat door de aanwezigheid van het gevormde water, de gevormde ketens weer gemakkelijk verbroken worden. Ook vormt het
mengsel van polymelkzuur en water een stroperig mengsel dat moeilijk te verwerken is.
Experiment: Productie polymelkzuur
Vraag het werkblad productie polymelkzuur aan bij je docent en maak ook de vragen bij de
proef
41
Voor de synthese van PLA met goede materiaaleigenschappen is het belangrijk te voorkomen dat de terugreactie plaatsvindt. Voor de industriële productie van PLA worden op dit
moment daarvoor twee methoden gebruikt:
I) In de eerste methode wordt melkzuur eerst omgezet in een dilactide Het dilactide wordt
vervolgens gepolymeriseerd tot PLA. Het dilactidemolecuul is op te vatten als een veresteringsproduct, dat is ontstaan uit twee melkzuurmoleculen. (zie figuur 15)
II) In de tweede methode wordt zoveel mogelijk water aan het reactiemengsel ontrokken
waardoor de terugreactie niet meer kan plaatsvinden.
Figuur 15: De structuurformule van het dilactide ook vaak lactide genoemd.
Opdracht Productie van PLA
Er moet een keuze gemaakt worden tussen een productieproces gebaseerd op de directe
polymerisatie van melkzuur of het productieproces via dilactide.
In figuur 16 staan de blokschema’s van de twee routes voor de productie van polymelkzuur,
PLA. In elk schema staan de belangrijkste bewerkingen in blokken gegeven en de stofstromen zijn de pijlen tussen de blokken.
Maak groepjes van 3 of 4 personen en kies een route
Maak de vragen bij de route en bereid daarna een presentatie voor van maximaal 5 minuten
waarin je de directie (de rest van de klas) uitlegt hoe de door jullie gekozen productie route
werkt. Daarbij is het belangrijk te beseffen dat elke stap in een productieproces geld kost, je
moet dus goed uitleggen waarom alle stappen aanwezig zijn. De antwoorden van de vragen
bij de route moeten ook in je presentatie voorkomen.
Het laatste gedeelte van de les worden de voor- en nadelen van de verschillende routes en
grondstoffen besproken.
Staat ergens in de module uitgelegd of verwijst naar het antwoord van een andere vraag.
.Opzoeken op Internet of in chemiekaarten.
Herhaling scheikunde kennis
42
Blokschema voor de productie van PLA (polymelkzuur).
Figuur 16: Blokschema met twee productieprocessen voor de productie van PLA. In het blokschema
staan de belangrijkste bewerkingen in de blokken aangegeven en de stofstromen zijn de pijlen tussen
de blokken.
43
Route 6
Figuur 17: De productie van PLA via dilactide.
Vragen bij route 6
Deze route is ontwikkeld door Cargill DOW LLC in 1995 als een oplosmiddelvrije productie
route voor hoog molecuulgewicht PLA (dus lange ketens). De productie vindt sinds 2002
plaats bij NatureWorks LLC. De essentie van deze productieroute is dat in blok 6.2 laag molecuulgewicht PLA gevormd wordt. Dit PLA wordt in blok 6.4 afgebroken tot dilactides, welke
weer als monomeer gebruikt worden voor de vorming van hoog molecuulgewicht PLA. De
vloeibare PLA, die ontstaat in blok 6.6, kan direct in een spuitgietmachine of extruder tot het
uiteindelijke product verwerkt worden.
In blok 6.2 wordt laag molecuulgewicht PLA gevormd.
1. Geef de reactievergelijking in structuurformules van de reactie die plaatsvindt in blok
6.2. 2. Leg aan de hand van de reactievergelijking uit vraag 1 uit waarom in blok 6.1 zoveel
mogelijk water uit het beginproduct, het ruwe melkzuur, wordt verwijderd. / Water en melkzuur vormen samen een azeotroop mengsel.
3. Zoek op wat een azeotroop mengsel is. Leg uit waarom het niet mogelijk is om in
blok 6.1 het water volledig uit het ruwe melkzuur te verwijderen. .
De stoffen uit blok 6.2 gaan naar blok 6.3 voor een azeotrope destillatie.
4. Welke stoffen zitten in het mengsel, dat van blok 6.2 naar blok 6.3 gaat?
5. Leg uit wat azeotrope destillatie is en wat de rol is van deze destillatie in dit blok is.
In blok 6.4 wordt het laag molecuulgewicht PLA afgebroken tot dilactide.
6. Geef de reactievergelijking in structuurformules van de reactie in blok 6.4. Het in blok 6.4 ontstane mengsel wordt in blok 6.5 via gefractioneerde destillatie gescheiden.
7. Leg uit wat gefractioneerde destillatie is. .
8. Leg uit waarom bij gefractioneerde het dilactide in gasfase gebracht moet worden.
9. Zoek het kookpunt op van het dilactide. Bij welke druk wordt het kookpunt bereikt?
Wat betekent dit voor de procesomstandigheden in blok 6.5? /
44
Het gebruik van oplosmiddelen wordt vermeden door de polymerisatie in blok 6.6 in gesmolten dilactide uit te voeren.
10. Zoek het smeltpunt op van dilactide. Is dit ook de reactietemperatuur in blok 6.6? Leg
je antwoord uit. /.
11. Geef de reactievergelijking van de reactie, die in blok 6.6 verloopt. 12. Waarom kunnen nu wel lange PLA ketens gevormd worden? 13. Als katalysator 2 wordt vaak tinoctalaat gebruikt. Waar blijft deze katalysator na de
reactie?
14. Geef bij de pijlen tussen de blokken aan welke stoffen in welke fase er worden vervoerd. .
45
Route 7
Figuur 18: De productie van PLA via directe polycondensatie
Vragen bij route 7
In Japan is bij Mitsui Toastu Chemicals een route ontwikkeld voor de vorming van hoog molecuulgewicht PLA. In een enkele reactie, er wordt dus niet eerst laag molecuulgewicht PLA
geproduceerd. Dit is een batch proces.
In blok 7.2 wordt het hoog molecuulgewicht PLA gevormd. De polymerisatie reactie verloopt
in het oplosmiddel difenylether.
1. Geef de reactievergelijking in structuurformules van de evenwichtsreactie die plaatsvindt in blok 7.2. 2. Hoe wordt de hydrolyse van de gevormde PLA voorkomen? , 3. Waarom wordt zoveel mogelijk water aan het ruwe melkzuur ontrokken? , 4. De droger is een grote pijp gevuld met een moleculaire zeef, waardoor het melkzuur/water mengsel gepompt wordt. Leg uit, hoe de moleculaire zeef het water verwijderd. 5. Welke drie stofeigenschappen maken difenylether tot een goed oplosmiddel voor de
polymerisatie? //
De polymerisatie reactie in blok 7.2 verloopt vrij langzaam. De reactietijd is soms meer dan
24 uur. De reactie wordt nog versneld door een katalysator toe te voegen, waarvoor tin poeder of tinoctalaat gebruikt wordt. Temperatuur verhogen zou de reactie nog verder kunnen
versnellen, maar bij temperatuurverhoging wordt de hydrolyse reactie meer versneld dan de
polymerisatie reactie.
6. Geef twee redenen waarom toch gekozen wordt voor een vrije hoge reactietemperatuur van 150°C. /
In blok 7.3 wordt het reactiemengsel uit blok 7.2 geëxtraheerd met chloroform.
7. Welk stof zal zeker in het residu van blok 7.3 aanwezig zijn? .
In blok 7.4 wordt de oplossing van PLA in chloroform gemengd met een veel groter volume
ethanol waardoor het PLA kristalliseert.
8. Verklaar het verschil in oplosbaarheid van PLA in ethanol en chloroform. Gebruik
voor de verklaring Binas tabel 55. ,
9. Leg uit waarom de PLA uit blok 7.2 eerst in blok 7.3 wordt geëxtraheerd in chloroform voordat men het kristalliseert m.b.v. ethanol. .
Het patent waarop dit blokschema gebaseerd is, zegt niets over het recyclen van de gebruikte oplosmiddelen.
46
10. Uit welke stoffen bestaat het filtraat van blok 7.5 ?
11. Zoek de kookpunten op van difenylether, chloroform en ethanol. 12. Geef in het blokschema met pijlen aan hoe de gebruikte oplosmiddelen hergebruikt
kunnen worden in het productieproces. Geef ook duidelijk aan welke extra processtappen daarvoor nodig zijn.
13. Geef bij alle pijlen tussen de blokken aan welke stoffen in welke fase er worden vervoerd. Opdracht plastic zakken voor India
In India is het gebruik van op aardolie gebaseerde plastic zakken verboden. Biologische
afbreekbare, uit biomassa geproduceerde zakken, zijn wel toegestaan.
Vraag aan je docent het werkblad Plastic zakken voor India
Combineer de routes uit de opdrachten uit paragrafen 4.3 en 4.4 zodanig dat op een zo
groen mogelijk manier PLA wordt geproduceerd. Gebruik daarbij een non-food grondstof en
kies voor een snel afbreekbare PLA.
Geef het complete blokschema, maak een lijst van alle gebruikte chemicaliën en toets het
proces aan de principes opgesteld voor de groene chemie. (zie werkblad)
Meer informatie over groene chemie vind je op:
http://www.scheikundeinbedrijf.nl/Les/index.rails?id=16&module_id=6
47
4.5 Oefenopgaven
Opgave 1: De productie van calciumlactaat
Calciumlactaat wordt in de cosmetische industrie gebruikt als pH-regulator. Voor een huidcrème
fabriek in Ommen is jaarlijks 600 ton zuiver calciumlactaat nodig. Literatuur onderzoek laat
zien dat de melkzuurbacterie Lactobacillus delbrueckii melasse in redelijke grote snelheid
en met hoge opbrengst kan omzetten in D-melkzuur dat vervolgens weer in calciumlactaat
kan worden omgezet. Melasse is een bijproduct van de productie van kristalsuiker en door
de aanwezigheid van een grote suikerfabriek in Groningen ruim beschikbaar.
Melasse bestaat ongeveer voor 50% uit sacharose dat in water gemakkelijk hydrolyseert tot
twee moleculen glucose. De glucose wordt vervolgens door Lactobacillus delbrueckii omgezet in melkzuur.
1. Laat m.b.v. reactievergelijkingen zien dat per molecuul sacharose vier moleculen
melkzuur gevormd worden.
2. Hoeveel gram melkzuur wordt er per gram glucose gevormd?
In de praktijk wordt glucose met een efficiëntie van 92% (gram melkzuur per gram glucose)
omgezet in melkzuur. Dit melkzuur wordt daarna omgezet in calciumlactaat.
3. Bereken hoeveel ton melasse nodig is voor de jaarproductie van 600 ton calciumlactaat. Neem aan dat in het productieproces melkzuur volledig wordt omgezet in calciumlactaat.
Besloten is om met behulp van een fed-batch reactor het melkzuur te produceren. De benodigde grootte van de fermentor hangt af van de groeisnelheid van Lactobacillus delbrueckii ,
de tijdsduur van de stationaire fase en de snelheid waarmee Lactobacillus delbrueckii glucose omzet. Laboratorium experimenten lieten zien dat de groeisnelheid en productie optimaal zijn bij een temperatuur van 42°C en pH = 6,0. Hieronder is de gemeten groeicurve
van bij 42°C en pH = 6.0 weergegeven.
Figuur 19 De groeicurve van Lactobacillus delbrueckii bij pH = 6,0 en T= 42°C
4. Hoeveel uur duurt het voordat de stationaire fase is bereikt?
Tabel 1 (zie route -1) Laat zien dat de opbrengst in een fed-batch proces voor Lactobacillus
delbrueckii met melasse als substraat 90,0 g L-1 is en dat de productie snelheid tijdens de
stationaire fase 3,8 g L-1h-1
48
5. Neem aan dat de melkzuurproductie tijdens de groeifase te verwaarlozen is. Bereken
uit bovenstaande gegevens de tijdsduur van de stationaire fase bij pH = 6,0 en T =
42°C.
Het schoonmaken van de fed-batch reactor en opnieuw vullen met medium voor een nieuwe
cyclus kost 6 uur.
6. Hoeveel cycli kan je maximaal per jaar doorlopen in één batchreactor?
7. Bereken het minimale volume wat de fed-batchreactor moet hebben om een productie van 600 ton calciumlactaat per jaar te halen.
De pH in het reactiemengsel mag niet onder de pH = 6,0 komen omdat anders de bacteriën
minder melkzuur gaan produceren.
8. Laat m.b.v. van een berekening zien dat de pH van een melkzuur oplossing van
90,0 gram per liter inderdaad lager is dan pH = 6,0. Gebruik hiervoor het gegeven
dat de pKz van melkzuur 3,95 is.
Tijdens de stationaire fase wordt calciumcarbonaat toegevoegd om de pH constant te houden.
Melkzuur wordt hierbij omgezet in calciumlactaat wat bij pH 6,0 goed oplosbaar is.
Door het ontwijken van CO2 is de reactie aflopend.
9. Geef de reactievergelijking voor de reactie tussen melkzuur en calciumcarbonaat
10. Bereken hoeveel ton kalk je voor pH- regulatie nodig hebt om 600 ton calciumlactaat
te produceren.
De productie van melkzuur wordt gestopt door het verhogen van de zuurgraad tot pH = 10
m.b.v. calciumcarbonaat gevolgd door verhitten. De hoge pH doodt de bacteriën, en de calciumionen laten de eiwitten en cellen samenklonteren zodat ze sneller neerslaan. Verhitten
zorgt ook voor het neerslaan van een eventuele overmaat aan calciumcarbonaat. Na verhitten wordt het fermentatiemengsel gefilterd.
11. Bereken hoeveel kg kalk moet worden toegevoegd om in een reactor met een inhoud
van 25 m3 de pH van 6,0 naar pH = 10,00 te brengen. Neem hierbij aan dat elk toegevoegd carbonaation anderhalf hydroxide-ion oplevert.
12. Bereken hoeveel kg kalk nodig is om voor de jaarproductie van 600 ton calciumlactaat in de fed-batchreactor de pH van 6,0 naar 10,00 te brengen. Neem hierbij weer
aan dat elk toegevoegd carbonaation anderhalf hydroxide-ion oplevert.
Om zuiver calciumlactaat te produceren wordt eerst het filtraat ingedampt. Daarbij kristalliseert het calciumlactaat uit. Om de zuiverheid te vergroten wordt daarna een herkristallisatie
van het calciumlactaat uitgevoerd. Daartoe wordt het calciumlactaat met 98 % zwavelzuur
weer omgezet in melkzuur. De bij de reactie gevormde sulfaationen slaan met de calciumionen neer als calciumsulfaat. Kleur en geur stoffen worden verwijderd met behulp van actieve
kool. Daarna worden door middel van filtratie de actieve kool en het calciumsulfaat verwijderd. Vervolgens wordt met zuiver calciumcarbonaat het melkzuur weer omgezet in calciumlactaat en dit kristalliseert bij pH> 7 uit tot Ca(C3H5O3)2 (s).
De efficiëntie van deze kristallisatiestap is 96%
49
13. Hoeveel liter 98% zwavelzuur is er nodig om 600 ton calciumlactaat te produceren?
Gebruik Binas tabel 43A
De totale efficiëntie van de productie van het lactaat kan berekend worden door de totale
massa van de gebruikte grondstoffen per kg geproduceerd zuiver calciumlactaat te berekenen.
14. Bereken hoeveel kg grondstoffen nodig is voor de productie van 1,0 kg calciumlactaat. Neem als grondstoffen calciumcarbonaat, glucose en zwavelzuur.
15. Bereken de efficiëntie van het proces.
16. Zwavelzuur (98 %) kost ongeveer 90 euro per ton, melasse 20 eurocent per kg, calciumcarbonaat (87,5 massa %) 35 euro per ton, en zuiver calciumcarbonaat (98%)
270 euro per ton.
Bereken de grondstofprijs per kg geproduceerd calciumlactaat. Neem aan dat de
87,5 % calciumcarbonaat gebruikt wordt in de fed-batch reactor en de 98% calciumcarbonaat voor de herkristallisatie.
Opgave 2: Polymelkzuur
Van melkzuur (2-hydroxypropaanzuur) bestaan twee stereo-isomeren, die respectievelijk
D- en L-melkzuur worden genoemd.
L-melkzuur speelt een rol in de stofwisseling in het menselijk lichaam.
Hieronder is weergegeven hoe de bindingen rondom een asymmetrisch koolstofatoom zijn
georiënteerd:
In deze structuur liggen de bindingen die zijn getekend met – in het vlak van tekening; de
komt uit het vlak van tekening naar voren en de binding die
binding die is getekend met
is getekend met ••• ligt achter het vlak van tekening.
Op de uitwerkbijlage bij deze opgave is deze ruimtelijke structuur nog tweemaal opgenomen.
1. Teken op de uitwerkbijlage onderaan deze opgave de ruimtelijke structuurformules
van beide stereo-isomeren van melkzuur, door het tekenen van een waterstofatoom,
een methylgroep, een alcoholgroep en een carbonzuurgroep aan de bindingen in elk
van de gegeven structuren. Noteer hierin het waterstofatoom als H, de methylgroep
als CH3, de alcoholgroep als OH en de carbonzuurgroep als COOH.
Het polymeer van melkzuur, het zogenoemde polymelkzuur, wordt onder meer gebruikt als
chirurgisch hechtdraad. Hieronder is een uiteinde van een polymelkzuurmolecuul weergegeven:
50
In het lichaam wordt polymelkzuur, bijvoorbeeld na gebruik als hechtdraad, geleidelijk door
hydrolyse afgebroken tot melkzuur.
2. Geef de reactievergelijking van de hydrolyse van het hierboven weergegeven fragment waarbij uit dit fragment onder andere twee melkzuurmoleculen ontstaan. Noteer
hierin de organische stoffen in structuurformules.
Polymelkzuur wordt vaak gemaakt uit het zogenoemde dilactide:
Het dilactidemolecuul is op te vatten als een koppelingsproduct (verestering), dat is ontstaan
uit twee melkzuurmoleculen.
3. Het dilactide kan ontstaan omdat bij verestering van twee melkzuurmoleculen de vrije
hydroxyl-groep en carboxyl-groep gemakkelijk met elkaar kunnen reageren. Laat
m.b.v. een tekening met structuurformules zien dat dit inderdaad het geval is.
4. Leg uit dat van het dilactide 3 stereo-isomeren voorkomen. Maak bij je uitleg gebruik
van het feit dat een dilactide molecuul uit twee moleculen L-melkzuur , D-melkzuur of
uit een mengsel van D en L-melkzuur moleculen gevormd kan worden.
5. Als grondstof voor kristallijn PLA met een hoog smeltpunt, wordt D- melkzuur gebruikt. Welke ruwe grondstoffen kunnen hiervoor gebruikt worden? Combineer hiervoor de gegevens uit de tabellen 1 en 2 van Route -1 uit paragraaf 4.4. 6. Een nadeel van kristallijn PLA is dat het veel slechter biologisch afbreekbaar is dan
amorf PLA. Amorf PLA wordt gemaakt uit een mengsel van D en L-melkzuur. Welke
ruwe grondstoffen kunnen nu gebruikt worden? Uit een dilactide kunnen behalve polymeren van melkzuur ook zogenoemde oligomeren van
melkzuur worden gevormd. Oligomeren van melkzuur zijn opgebouwd uit veel minder melkzuureenheden dan polymeren. Oligomeren van melkzuur kunnen worden gemaakt via reactie 1:
reactie 1
Stof A en het dilactide worden, samen met een katalysator, verwarmd tot 130 °C. In het
vloeibare mengsel treedt dan de vorming van oligomeren op. Het aantal melkzuureenheden
51
per oligomeermolecuul wordt de polymerisatiegraad genoemd. Bij reactie 1 ontstaat een
mengsel van oligomeren. De gemiddelde polymerisatiegraad van de oligomeren in dit
mengsel wordt bepaald door de gekozen molverhouding tussen stof A en het dilactide.
7. Bereken hoeveel mmol stof A nodig is om 69 mmol (10 g) dilactide volledig om te
zetten tot oligomeren met een gemiddeld aantal van 10 melkzuureenheden per oligomeermolecuul. Ga ervan uit dat ook stof A volledig reageert en dat geen andere
reactie optreedt dan reactie 1.
Na de synthese van oligomeren van melkzuur uit stof A en het dilactide is het mengsel van
de ontstane oligomeren onderzocht met behulp van een bepaalde methode van massaspectrometrie. Hierbij vallen de moleculen niet uiteen in brokstukken. Ze blijven intact, maar worden voorzien van een positieve lading door ze te behandelen met een oplossing waarin H+
ionen, NH4+ ionen en Na+ ionen voorkomen. Zo’n positief geladen oligomeerion ontstaat
doordat een ongeladen oligomeermolecuul een H+ ion of een NH4+ ion of een Na+ ion bindt.
In het massaspectrum dat zo wordt verkregen, is een regelmatig patroon te zien van steeds
groepjes van drie pieken. Dit is duidelijk te zien in figuur 14 waarin een deel is weergegeven
van het massaspectrum van een mengsel van oligomeren.
De eerste piek in elk groepje van drie is toe te kennen aan een oligomeermolecuul dat een
H+ ion heeft gebonden. De andere twee pieken zijn toe te kennen aan oligomeermoleculen
die een NH4+ ion respectievelijk een Na+ ion hebben gebonden.
Figuur 20: massaspectrum oligomeren
Uit het massaspectrum blijkt dat bij de synthese zowel oligomeren zijn ontstaan met een
even als met een oneven aantal melkzuureenheden per oligomeermolecuul.
8. Bereken de polymerisatiegraad van de oligomeer waaraan de piek bij m/z = 575
moet worden toegekend.
9. Leg uit dat uit figuur 14 de conclusie over het even en oneven aantal melkzuureenheden per oligomeermolecuul kan worden getrokken.
De onderzoeker die deze synthese uitvoerde, verbaasde zich over het feit dat ook oligomeren met oneven aantallen melkzuureenheden waren ontstaan.
10. Stel een hypothese op waarmee het ontstaan van oligomeren met oneven aantallen
melkzuureenheden kan worden verklaard.
52
Uitwerkbijlage
Wat je nu moet weten
•
•
•
•
Toepassingen melkzuur
o Levensmiddelen industrie
o Cosmetische industrie
o Farmaceutische/ medische industrie
o Grondstof voor de productie van o.a. polymelkzuur
o Chemische industrie
Productie van melkzuur
o Chemisch
o Melkzuurbacteriën
De groeicurve heeft 4 fasen
Fed-batch proces
Zuivering melkzuur
o Filtratie
o Extractie
o Tegenstroom wassen
o Reactieve extractie
o Indampen
o Destillatie
o Elektrodialyse
Productie polymelkzuur (PLA)
o Twee productieprocessen
o Azeotrope destillatie
o Gefractioneerde destillatie
53
Hoofdstuk 5
Moderne biotechnologie: de productie van 1,3-propaandiol
1,3-Propaandiol
Eigenschappen
1,3-Propaandiol is een halfproduct met molecuulformule C3H8O2. Bij kamertemperatuur is de
stof vloeibaar: dit betekent dus ook dat 1,3-propaandiol verkocht wordt als vloeistof. De stof
behoort met twee hydroxylgroepen tot de alcoholen.
Tabel 1. Eigenschappen van 1,3-propaandiol
Molecuulformule
C3H8O2
Molaire massa
76,09 g/mol
Dichtheid
1,0597 g/cm³
Smeltpunt
-28 °C
Kookpunt
211 °C
Structuurformule
HO
OH
Toepassingen
1,3-Propaandiol kent verschillende toepassingen. De monomeer 1,3-propaandiol wordt onder andere gebruikt als koelvloeistof en als antivriesmiddel in bijvoorbeeld ruitensproeiervloeistof, daarnaast wordt de stof verwerkt in make-up en deodorants.
Figuur 1: Materialen waarin 1,3-propaandiol verwerkt is.
Zuiver 1,3-propaandiol wordt met name gebruikt voor de productie van polymeren. Deze
polymeren zijn copolymeren, dat wil zeggen dat ze door condensatiepolymerisatie ontstaan
uit 1,3-propaandiol en nog een andere monomeer.
54
De andere monomeer kan bijvoorbeeld tereftaalzuur zijn. Deze polymeren worden onder
andere gebruikt in tapijten, onderdelen voor auto’s en vliegtuigen, coatings, lijm en verf.
Figuur 2: Toepassingen van 1,3-propaandiol.
5.1 Synthese van 1,3-propaandiol
1,3-Propaandiol kan via een chemische synthese gemaakt worden uit aardolie, maar kan
ook met behulp van micro-organismen via een biosynthetische route gemaakt worden. Vanwege economische redenen wordt 1,3-propaandiol tegenwoordig alleen nog maar biosynthetisch geproduceerd.
Dit is echter niet altijd zo geweest. Shell was tot voor kort de grootste producent van 1,3propaandiol uit aardolie en is pas in het begin van de 21e eeuw gestopt met de productie.
Tegenwoordig wordt de bulk van de 1,3-propaandiol via biosynthese geproduceerd door
DuPont, een Amerikaans chemiebedrijf, dat onder andere verschillende textielsoorten produceert. DuPont heeft ook een vestiging in Nederland.
In de loop van de tijd is het steeds voordeliger geworden 1,3-propaandiol op biosynthetische
wijze te gaan produceren. Dit komt onder andere doordat de olieprijs enorm is gestegen:
voor de chemische synthese zijn de grondstoffen voor het maken van 1,3-propaandiol dus
relatief duur geworden.
De prijzen voor het biosynthetisch produceren zijn ongeveer gelijk gebleven. Net als voor
melkzuur (zie hoofdstuk 4, tabel 1), zijn er in de afgelopen jaren zelfs nieuwe grondstoffen
beschikbaar gekomen. Met verschillende bewerkingen kan men van allerlei soorten bioafval
een waardevolle grondstof voor de productie van 1,3-propaandiol maken.
55
Figuur 3: voorbeelden van bioafval: wei, papier en hout.
Naast het feit dat chemisch gesynthetiseerd 1,3-propaandiol relatief duur geworden is om te
produceren, is het zo dat er voor de biosynthese een stuk minder extreme reactiecondities
nodig zijn. Waar men bij de chemische synthese werkt met hoge druk en temperatuur, gebruikt men bij de biosynthese micro-organismen die dezelfde reactie kunnen uitvoeren bij
kamertemperatuur en standaarddruk.
Vraag
1. Leg uit waarom werken bij hoge temperatuur en druk relatief kostbaar is.
Een ander voordeel van het biosynthetisch produceren van 1,3-propaandiol is dat men niet
afhankelijk is van olie. Met de oprakende olievoorraden is het aan te raden naar productieprocessen te zoeken, waarbij geen gebruik wordt gemaakt van olie. Bovendien is de koolstofkringloop op deze manier in balans.
Vraag
2. Waarom is de koolstofkringloop in balans bij de productie van 1,3-propaandiol via biosynthese? Licht je antwoord duidelijk toe.
Chemische synthese van 1,3-propaandiol
1,3-Propaandiol werd chemisch geproduceerd (door Shell) uit acroleïne en uit etheen, zie
voor de reactieschema’s figuur 4.
Acroleïne is een halfproduct dat in de industrie grootschalig wordt gebruikt voor het produceren van allerlei bulkchemicaliën, zoals het aminozuur methionine. Daarnaast kennen we
acroleïne als een schadelijke stof, die onder andere in sigarettenrook voorkomt.
Etheen is een restproduct van het kraken van olie, het is uitgaande van aardolie de meest
geproduceerde chemische stof ter wereld!
De reactieomstandigheden waaronder 1,3-propaandiol uit etheen of acroleïne gevormd kan
worden, zijn zeer extreem. Dit betekent dat je de mogelijkheid moet hebben zeer hoge temperatuur of druk te kunnen bereiken, zonder dat dit schadelijk is voor de omgeving.
Een hoge druk betekend dat alle reactoren leidingen en afsluiters dikken wanden moeten
hebben, de besturing vanuit een bunker moet plaatsvinden en dat de fabriek ver van de bebouwde kom moet staan. Hoge temperaturen kosten veel energie. Daarom werd
1,3-Propaandiol dan ook aanvankelijk geproduceerd in fabrieken waar al zware chemische
industrie plaatsvond.
56
O
etheen
acroleine
H
O2
H2O
etheenoxide
O
O
.......
3-hydroxypropanal
H
HO
H2
O
3-hydroxypropanal
H
HO
H2
HO
1,3-propaandiol
OH
HO
A
OH
1,3-propaandiol
B
Figuur 4: Reactieschema van (A) acroleïne naar 1,3-propaandiol en van (B) etheen naar 1,3propaandiol.
Vragen
3. Geef de systematische naam voor acroleïne.
4. Geef de reactievergelijking in molecuulformules voor de vorming van 3hydroxypropanal uit acroleïne.
5. Geef de reactievergelijking in molecuulformules voor de vorming van 1,3-propaandiol
uit 3-hydroxypropanal.
6. Geef de totaalreactie van de reacties uit vraag 4) en 5) in molecuulformules.
7. Geef in structuurformules de reactievergelijking voor de omzetting van etheen in
etheenoxide.
8. Leg met behulp van een reactievergelijking in structuurformules uit met welke stof
etheenoxide reageert bij de vorming van 3-hydroxypropanal.
Opdracht 1
a) Bestudeer de onderstaande tekst over de biosynthese van 1,3-propaandiol en
geef de juiste stofnamen voor de lege vakjes op de kaart met biosynthetische
routes van figuur 7.
b) Geef de structuurformules bij de stofnamen en geef de reactievergelijkingen
in structuurformules van alle reacties voor de vorming van 1,3-propaandiol uit
DHAP.
57
Biosynthese van 1,3-propaandiol
De productie van 1,3-propaandiol door micro-organismen werd voor het eerst beschreven in
1881. Verschillende micro-organismen werden ontdekt, zoals Clostridium, Enterobacterium
en andere soorten. Deze organismen maken 1,3-propaandiol uit glycerol (1,2,3-propaantriol). In de evolutie hebben deze organismen zich zo ontwikkeld, dat ze van nature kunnen
leven op glycerol. Ze gebruiken glycerol als bouwsteen voor de opbouw van hun eigen cel,
voor onderhoud en voor het produceren van andere stoffen.
Omdat de grondstoffen voor de chemische synthese van 1,3-propaandiol, acroleïne en
etheen, in de loop der tijd erg duur zijn geworden, is er daarom gezocht naar een organisme
dat 1,3-propaandiol kan maken uit goedkope en gemakkelijk verkrijgbare stoffen.
In eerste instantie beschikte men natuurlijk over de micro-organismen die van nature al 1,3propaandiol produceren: Clostridium en Enterobacterium. Deze organismen hebben voor de
productie van 1,3-propaandiol twee omzettingstappen nodig: van glycerol naar 3hydroxypropanal (3HPA) en van 3-hydroxypropanal naar 1,3-propaandiol. In de cel is voor
iedere omzetting minstens één enzym nodig. Voor de eerste omzetting maakt de cel gebruik
van het enzym glycerol dehydratase, dat een watermolecuul aan glycerol onttrekt. Hierbij
ontstaat 3-hydroxypropanal. De volgende omzetting wordt gekatalyseerd door het enzym
1,3-propaandiol oxidoreductase en zorgt ervoor dat 3-hydroxypropanal, in aanwezigheid van
NADH, omgezet wordt in 1,3-propaandiol.
Clostridium en Enterobacterium gebruiken echter glycerol als voedingsbron, ze kunnen dus
niet groeien op goedkoop verkrijgbare stoffen als glucose. Men ging op zoek naar een organisme dat uit glucose 1,3-propaandiol kan produceren en dat glucose tevens kan gebruiken
voor zijn cellulaire processen. Deze micro-organismen waren er echter niet. Daarom heeft
men uiteindelijk de bacterie Escherichia coli (E.coli) genetisch zo gemodificeerd dat de
nieuwe stam 1,3-propaandiol uit glucose kan maken.
In het DNA van E.Coli moet dus een aantal veranderingen worden aangebracht, zodat de bacterie
met behulp van de biosynthetische routes die het
van oorsprong al gebruikt, nieuwe producten kan
maken. In dit geval is dat nieuwe product 1,3propaandiol.
E. coli maakt gebruik van de glycolyse om glucose
af te breken en zo zijn cel te voorzien van energie
en van de benodigde stoffen voor de cellulaire processen. We willen de bacterie nu zo aanpassen,
dat deze naast de voor de levenscyclus benodigde
stoffen zoveel mogelijk 1,3-propaandiol uit glucose
gaat maken.
Uitgangspunt bij genetische modificaties is dat het
niet te complex moet worden. Je zoekt dus naar
een stof waarvan de structuur verwant is aan de te Figuur 5: Escherichia coli
produceren stof. We weten al dat bacteriën 1,3propaandiol uit glycerol maken. We moeten dus nu op zoek naar een stof uit een al bestaande biosynthetische route in E.coli, die veel op glycerol lijkt.
Dit is dihydroxyacetonfosfaat (DHAP)uit de glycolyse zoals in de volgende pagina beschreven staat.
58
Figuur 9 uit hoofdstuk 3: De 10 stappen van de glycolyse. Bij de moleculen is alleen het aantal
C-atomen (zwarte bolletjes) en de posities van de fosfaatgroepen (gele P) weergegeven.
Als de fosfaatgroep van dihydroxyacetonfosfaat wordt verwijderd en de
dubbelgebonden O aan het tweede koolstofatoom wordt vervangen door
een hydroxylgroep ontstaat er glycerol. In de praktijk gebeurt dit door een
tweetal omzettingen:
1. In de eerste stap wordt dihydroxyacetonfosfaat omgezet in
glyceraldehyde.
2. In de tweede stap wordt uit glyceraldehyde glycerol gevormd.
Voor deze omzettingen moeten er ook weer een aantal enzymen aanwezig
zijn, die de reactie kunnen katalyseren.
Figuur 6:
DHAP
Dit is dus de totale biosynthetische route om van glucose 1,3-propaandiol te
maken. Om deze afbraakroute daadwerkelijk te laten verlopen, moet er
voor gezorgd worden dat alle enzymen die daar voor nodig zijn ook in de cel aanwezig zijn.
Hiertoe moet het DNA van de bacterie worden aangepast.
In figuur 7 staat de overzichtskaart met biosynthetische routes met daarin getekend de route
naar 1,3-propaandiol.
59
Figuur 7: Biosynthetische routes in de cel met de route van glucose naar 1,3-propandiol.
60
5.2 Opbrengst van de 1,3-propaandiol productie verhogen
Het is natuurlijk de bedoeling dat de nieuwe E. coli-stam zoveel mogelijk 1,3-propaandiol uit zo
weinig mogelijk glucose maakt, de aanschafkosten van de grondstof (suiker) moeten zo laag mogelijk blijven. Om de 1,3-propaandiol productie zo optimaal mogelijk te maken, moeten we weer
inzoomen op de metabole routes van de E.coli (zie figuur 7).
Zoals we in hoofdstuk 3 (figuur 9) al besproken
hebben kan de cel glucose (een molecuul met 6
C-atomen) tijdens de glycolyse omzetten in dihydroxy-acetonfosfaat (DHAP, 3 C-atomen) en glyceraldehyde-3-fosfaat (GAD-3P, 3 C-atomen).
Voor de cel is het mogelijk om GAD-3P om te
zetten in DHAP en andersom. Dit zou betekenen
dat ieder koolstofatoom uit glucose via DHAP in
1,3-propaandiol terecht zou kunnen komen. Er zit
echter een addertje onder het gras.
Figuur 8: GAD-3P kan omgezet worden in DHAP
Om de glucose te kunnen verwerken, moet deze
in de cel aanwezig zijn. E.coli gebruikt het Fosfo-Transferase Systeem (PTS) om glucose via actief
transport in de cel te krijgen. Voor dit transport gebruikt de cel de ATP die gevormd wordt tijdens
de glycolyse bij de omzetting van fosfo-enolpyruvaat (PEP) naar pyruvaat (zie figuur 9). De ATP
wordt dan gebruikt om glucose naar glucose-6-fosfaat om te zetten en tegelijkertijd over het celmembraan heen te transporteren.
GLYCOLYSE
1,3-propaandiol
Gluco se
2
Pyruvaa t
ATP
2
ATP
ADP
2ADP
Glucose-6-fosfaa t
P
2
P
Fos foenolpyruva at
2H2 O
Fruc tose-6-fosfaat
P
2
P
2-Fo sfogly ce ra at
P
2
P
3-Fosfoglyceraat
ATP
ADP
Fructose1,6-difosfaat
P
2 ATP
2NAD+
2 NADH + 2H +
2ADP
P
Dihydroxyac etonfosfaat
2
P
Glyceraldehyde3-fos faat
2 Pi
P
P
1,3-Difosfoglyceraat
Figuur 9: de vorming van dihydroxyacetonfosfaat in de glycolyse
Het is dus noodzakelijk dat de gewone glycolyse blijft doorgaan om nieuwe glucose in de cel te
krijgen. Dat betekent dat niet alle GAD-3P omgezet kan worden in DHAP (en dus in 1,3propaandiol), maar dat de GAD-3P gebruikt moet worden om fosfo-enolpyruvaat van te maken. Je
61
kunt dus per molecuul glucose niet 2 moleculen 1,3-propaandiol maken, maar slechts één! De opbrengst van deze reactie is dus hoogstens 50% (mol/mol).
Om de opbrengst van 1,3-propaandiol te verhogen, is in de gemodificeerde E.coli stam het gehele
PTS uit het organisme verwijderd. Men heeft alle genen die bij de productie van de verschillende
eiwitten van het PTS horen, opgespoord. Daarna heeft men deze genen verwijderd en vervangen
door een systeem dat glucose de cel in brengt, zonder dat dit energie kost. Dit systeem is van origine niet aanwezig, omdat de bacterie niet gewend is onder glucoserijke omstandigheden te leven.
De normale leefomgeving van de bacterie is een veel gevarieerdere omgeving, waar veel meer
voedselbronnen aanwezig zijn dan alleen glucose.
In plaats van ATP te gebruiken uit de omzetting van fosfo-enolpyruvaat naar pyruvaat om nieuwe
glucose in de cel te krijgen, kan glucose nu "kostenloos" de cel in worden getranspor-teerd.
Dit leidt tot de volgende situatie:
A
B
Glucose
Fosfoenolpyruvaat
3
Glucose
Pyruvaat
2
4
1
Glucose-6-fosfaat
GAD-3P
Glucose
Glucose-6-fosfaat
Cytoplasma
Cytoplasma
Figuur 10: (A) Fosfo-Transferase Systeem. (B) Nieuw (gemodificeerd) glucose transport systeem, waarbij
glucose passief de cel in getransporteerd wordt.
Vragen
9. Bestudeer figuur 10A en 10B. Welke stoffen horen bij de pijlen 1, 2, 3 en 4 te staan? (zie
ook figuur 10)
10. Hoeveel mol GAD-3P wordt omgezet in 1,3-propaandiol per mol binnengebracht glucose?
(zie figuur 9)
Afsluiting
We hebben er nu voor gezorgd dat glucose de cel in kan, onafhankelijk van de glycolyse. Om ervoor te zorgen dat de bacterie nog efficiënter 1,3-propaandiol produceert, moet er nog een laatste
modificatie worden gedaan.
We hebben een nieuw gen in de bacterie gezet, om ervoor te zorgen dat er glycerol wordt gemaakt, maar E.coli heeft in een normale situatie niet te maken met zoveel glycerol in zijn cel. De
bacterie zou dit als ongewenst beschouwen en de glycerol dus gaan afbreken. Hiervoor heeft de
bacterie een tweetal enzymen nodig, namelijk glycerol kinase en glycerol dehydrogenase. In de
gemodificeerde stam zijn de genen voor deze twee enzymen verwijderd, zodat glycerol enkel met
het nieuwe enzym glycerol dehydratase tot 1,3-propaandiol afgebroken kan worden.
Er is nu met succes een E.coli-stam gemaakt die zoveel 1,3-propaandiol produceert, dat de bacterie voor een industrieel proces kan worden gebruikt.
62
5.3 De productie van 1,3-propaandiol voor Sorona®
Keuze- en verdiepingsopdracht
Figuur 11: Schematisch overzicht van het productieproces van Sorona®
Figuur 12: Fabriek van DuPont in Loudon, USA, waar de Sorona® wordt geproduceerd.
Opdracht: De productie van 1,3-propaandiol voor Sorona®
De directie van DuPont is in gesprek met Nederlandse investeerders over een nieuw te bouwen
fabriek voor Sorona® Tijdens de gesprekken blijken er nog vragen te zijn. Ook heeft de directie
onderstaand blokschema ontvangen en wil weten welke stoffen bij de pijlen vervoerd worden.
De directie is nu aan het lunchen met de investeerders en wil de antwoorden na de lunch hebben.
Als team van bedrijfschemici moeten jullie voor de antwoorden zorgen.
63
Maak teams van 8 personen en vraag je aan de docent het werkblad “De productie van 1,3propaandiol voor Sorona®”. Wijs een voorzitter aan die ervoor zorgt dat het werk goed verdeeld
wordt. Zorg ervoor dat je als team voor het einde van de les heldere antwoorden op alle vragen
hebt en dat het blokschema compleet is. De antwoorden kan je bijna allemaal in hoofdstuk 5 vinden. Bespreek daarna de antwoorden met elkaar zodat een ieder van jullie de antwoorden kan
toelichten.(aan de directie).
Vragen van Directie
Vraag 1 Metabolic engineering E.coli. Hoe gaat het inbrengen van
genen precies te werk? Kan kort maar duidelijk uitgelegd worden
wat de functies van plasmiden en promotoren zijn? Zie bron 1.
Vraag 2 Is glucose de werkelijke grondstof? Welke grondstoffen
zijn in Nederland beschikbaar? Vraag 3 De reactor is een aërobe (bio)reactor. Er is dus zuurstof
nodig. Hoe wordt die in de reactor gebracht? Geef een schematische afbeelding van een aërobe (bio)reactor die geschikt zou zijn
voor de productie van 1,3-propaandiol. Zie bron 2.
Vraag 4 Waarom is het nodig te verhitten? De micro-organismen
verdwijnen door filtratie toch al uit het product? Zie bron 3 + 4.
Vraag 5 Hoeveel kJ per kg geproduceerd 1,3-propaandiol kost het
verhitten, als in een batch 1,3-propaandiol een concentratie heeft
van 135 g/L? Zie bron 4.
Vraag 6 Wat zijn eigenlijk de afmetingen van de poriën bij microfiltratie, bij utrafiltratie en bij nanofiltratie? Waarom na elkaar in drie
stappen Micro-,Ultra- en Nanofiltratie? Waarom niet in 1 stap? Zijn
Micro-,Ultra- en Nanofiltratie geschikt om te gebruiken op industriele schaal en hoe dan? Zie bron 5.
Vraag 7 Hoe werkt een industriële ionenwisselaar. En wat wordt er
gescheiden? Waarom moet er een stof toegevoegd worden. Zie
bron 6.
Vraag 8 Waarom een dubbele destillatie? Waarom moet de 1,3propaandiol een zuiverheid van 99,992 % hebben? Zie bron 7 + 8.
Vraag 9 Welke grondstof(fen) is/zijn, naast 1,3-propaandiol, nog
meer nodig voor de productie van Sorona®.? Hoeveel ton van die
grondstof is nodig per ton geproduceerde Sorona® ? Zie bron 8.
Figuur 13: blokschema voor de productie van Sorona
®
64
Informatiebronnen bij de opdracht:
“De productie van 1,3-propaandiol voor Sorona®”
Bron 1: Metabolic engineering van E.coli
Om te zorgen dat het organisme uiteindelijk de enzymen gaat maken, die als katalysator dienen
voor de reacties waarbij dihydroxyacetonfosfaat wordt omgezet in 1,3-propaandiol, moeten er
nieuwe genen op het plasmide geplaatst worden.
Plasmiden zijn kleine ringvormige stukken DNA, die bacteriën onderling kunnen uitwisselen.
De plasmiden worden door biotechnologen gebruikt om de genetische informatie van een ander
organisme op te slaan. De plasmide bevat dan een stukje DNA van een ander organisme. Hoe dat
precies werkt is in onderstaande tekening te zien.
*
DNA wat in het plasmide moet
worden ingebouwd
*
*
*
AT
G A TA AT C
T
G
C
GA
C T AT T
TA C
AG
*
*
G A AT T C
C T TA A G
Plasmide
DNA wordt geknipt bij
de oranje pijlen
G
C TA A
TA
*
TC
T AG
TC
T AG
G
C TA A
TA
Plasmide met nieuw DNA
Figuur 14: inbouw van vreemd DNA in een plasmide
65
Het cirkelvormig plasmide wordt uit de cel gehaald en daarna opengeknipt met speciale enzymen,
zogenaamde restrictie enzymen. Deze restrictie enzymen knippen slechts in één bepaalde volgorde van nucleotiden. In figuur 14 knipt het restrictie enzym, EcoR1, altijd tussen G en A in de sequentie –G*AATTC– (zie de oranje pijlen). Als het in te brengen stukje DNA ook met dit restrictie
enzym geknipt wordt, zullen de knipplaatsen van het plasmide en het in te brengen DNA precies
aan elkaar passen.
Na het knippen worden de opengeknipte plasmide en het in te brengen stukje DNA bij elkaar gebracht. Door toevoeging van DNA ligase wordt het DNA weer aan elkaar geplakt. Je krijgt dan een
plasmide met daarin nieuwe genen. Dit genetisch gemodificeerde plasmide, het recombinant
plasmide, kan weer door bacteriën worden opgenomen. Het ingebrachte nieuwe DNA wordt tot
expressie gebracht in de bacterie.
Het plasmide in Escherichia coli is op hierboven beschreven manier gemodificeerd. In tabel 2
staan de namen van de nieuwe genen die in het plasmide van Escherichia coli zijn geplaatst om
de productie van 1,3-propaandiol mogelijk te maken.
De nieuwe genen zullen via transcriptie (DNA RNA) en translatie (RNA eiwit) zorg dragen
voor de productie van de eiwitten, die als enzymen de reacties katalyseren voor de vorming van
1,3-propaandiol. Ieder enzym heeft een eigen gen, dus er zal een aantal verschillende genen in
het plasmide gezet moeten worden.
Tabel 2: Genen die nodig zijn voor de productie van eiwitten voor de omzettingen van dihydroxyacetonfosfaat (DHAP) naar 1,3-propaandiol.
Omzetting
DHAP glyceraldehyde
Glyceraldehyde glycerol
Glycerol 3hydroxypropanal
3-hydroxypropanal 1,3-propaandiol
Naam enzym
Fosfaat dehydrogenase
Glycerol-3-fosfaat fosfatase
Naam bijbehorende gen
DAR1
GPP2
Glycerol dehydratase
dhaB1-3
Propaandiol oxidoreductase
dhaT
Opdracht 2
Bekijk onderstaande videofragmenten
http://www.youtube.com/watch?v=aA5fyWJh5S0
video over de werking van een restrictie enzym
http://www.youtube.com/watch?v=acKWdNj936o
plaatsen van vreemd DNA in E.coli
In de animatie heb je gezien hoe een restrictie enzym over een DNA-streng “glijdt” en daarbij zoekt
naar een bepaalde sequentie (= een specifieke volgorde van baseparen). Wanneer het enzym de
specifieke volgorde heeft gevonden, zal hij het DNA hier knippen. Neem bijvoorbeeld het enzym
EcoR1, dat knipt bij de sequentie –G*AATTC– (het sterretje geeft de plaats aan waar de knip
komt). Stel, je gaat de volgende DNA-sequentie knippen met behulp van EcoR1.
66
5’ GCATTGGAATTCGTCGAT 3’
3’ CGTAACCTTAAGCAGCTA 5’
EcoR1 gaat nu op zoek naar de sequentie –G*AATTC– en knipt daar het DNA. Er ontstaat dus
5’ GCATTGG 3’
3’ CGTAACCTTAA 5’
+
5’ AATTCGTCGAT 3’
3’
GCAGCTA 5’
Merk op dat als je van de 5’-kant van het DNA naar de 3’-kant glijdt, je zowel in de bovenste als in
de onderste streng AATT tegenkomt. EcoR1 knipt zowel onder als boven: het DNA komt dus ook
van elkaar los! (let op: het plasmide DNA is circulair, dus de uiteinden van dit DNA zitten eigenlijk
aan elkaar!):
Wanneer je zowel het plasmide-DNA als je gen, dat je in de plasmide wilt opnemen, met hetzelfde
restrictie-enzym knipt, krijg je twee uiteinden die je aan elkaar kunt plakken. We bekijken weer het
voorbeeld van EcoR1:
Een deel van het onderstaande gen, het gen van interesse, willen we in de plasmide plaatsen:
5' AAGCCGAATTCATTAGGCGCGAATTCCTACCGGTGACCGG 3'
3' TTCGGCTTAAGTAATCCGCGCTTAAGGATGGCCACTGGCC 5'
Als we het gen knippen met EcoR1 (let op: er zitten twee GAATTC-sequenties in het gen, dus
EcoR1 zal twee keer knippen!) krijgen we de onderstaande fragmenten:
5' AAGCCG 3'
3' TTCGGCTTAA 5'
5' AATTCATTAGGCGCG 3'
3' GTAATCCGCGCTTAA 5'
5' AATTCCTACCGGTGACCGG 3'
3' GGATGGCCACTGGCC 5'
Wanneer je nu de opengeknipte plasmide en het gen van interesse bekijkt, zie je dat deze in elkaar passen:
5’ GCATTGG 3’
3’ CGTAACCTTAA 5’
5' AATTCATTAGGCGCG 3'
3' GTAATCCGCGCTTAA 5'
5’ AATTCGTCGAT 3’
3’ GCAGCTA 5’
Voor het aan elkaar zetten van de stukken DNA, hebben we ook weer een enzym nodig: DNA ligase. Dit enzym ligeert (plakt aan elkaar) de stukken DNA, tot één geheel.
Wanneer je bovenstaande drie stukken DNA aan elkaar gaat plakken krijg je dus de volgende situatie:
5’ GCATTGG
3’ CGTAACCTTAA
AATTCATTAGGCGCG
GTAATCCGCGCTTAA
AATTCGTCGAT 5’
GCAGCTA 3’
5’ GCATTGGAATTCATTAGGCGCGAATTCGTCGAT 5’
3’ CGTAACCTTAAGTAATCCGCGCTTAAGCAGCTA 3’
We weten nu dus hoe je een stuk DNA in een plasmide moet plakken. Het is van essentieel belang
dat je gen een sequentie bevat, dat door het restrictie-enzym geknipt kan worden. Er bestaan een
groot aantal verschillende restrictie-enzymen, die allemaal verschillende sequenties knippen.
Sommige restrictie-enzymen zoeken sequenties van 4 baseparen, sommige van 6 of zelfs 8 baseparen.
67
Om er zeker van te zijn, dat je nieuw ingebrachte genen ook daadwerkelijk in de cel afgelezen
worden, moet je ook dit proces regelen. In de cel worden genen pas verwerkt tot eiwitten op het
moment dat ze afgelezen worden. Dit is afhankelijk van een zogenaamde promotor, een DNAsequentie die zegt dat het DNA vanaf een bepaalde plaats (het begin van het gen dus) afgelezen
moet worden. Zonder deze promotor-sequentie wordt je gen niet afgelezen. Het is dus essentieel
dat je deze ook in de plasmide plakt!
Alle genen uit tabel 2 worden dus in de plasmide geplakt. De plasmide is nu klaar om in de natuurlijke cel gebracht te worden. Wanneer het plasmide-DNA gemengd is met het natuurlijke DNA, is
E.coli in staat glucose om te zetten in 1,3-propaandiol.
We hebben dus nu een micro-organisme gemaakt, dat in staat is suikers om te zetten in 1,3propaandiol.
Bron 2: Aerobe fed-batch reactor
De productie van 1,3-propaandiol vindt plaats in een fed-batch reactor onder aerobe condities.
Het meeste 1,3-propaandiol wordt geproduceerd tijdens de groeifase van de bacterie. E.coli is een
snel groeiende bacterie, dus de productie vindt plaats in kortdurende batches (zie paragraaf 4.2).
In het fermentatiemengsel zitten de volgende stoffen:
1,3-propaandiol
water (de bacteriën worden gekweekt in een vloeibaar mengsel)
biomassa (de bacteriën zelf) en de daarbij behorende eiwitten
glycerol (niet alle glycerol wordt omgezet in 1,3-propaandiol, dus er blijft nog iets over)
andere bijproducten (van alle tussenproducten, zoals 3-hydroxypropanal, geldt dat niet alles reageert, er blijft dus altijd wat over)
allerhande soorten voeding voor de bacteriën
We willen uiteindelijk alleen 1,3-propaandiol overhouden, dus het fermentatiemengsel moet, net
als bij de melkzuurproductie, een aantal zuiveringsstappen doorlopen om 1,3-propaandiol zuiver te
verkrijgen.
68
Bron 3: Wet en regelgeving gemodificeerde organismen
Allereerst gaan we uit het fermentatiemedium de biomassa halen. In Nederland is er een wetgeving die stelt, dat als er met genetisch gemodificeerde organismen (GGO) gewerkt wordt, dat de
biomassa afgedood moet worden voordat deze in de natuur terecht komt.
69
Bron 4: Afdoden micro-organismen door verhitten met een warmtewisselaar
Biomassa mag dus niet in het milieu komen; de bacteriën moeten eerst afgedood worden door
verhitting (met behulp van een warmtewisselaar). Het fermentatiemengsel wordt zo hoog verhit dat
alle bacteriën afsterven. Daarna wordt het hele mengsel weer afgekoeld, om in vervolgstappen te
kunnen zuiveren. Het voordeel van een warmtewisselaar is dat er zeer weinig energie verloren
gaat.
De warmtewisselaar is een lange
buis, waarin het fermentatiemengsel rondgepompt wordt.
Koud
Allereerst wordt het nog koude
Heet
mengsel opgewarmd. De temperatuur van het mengsel in de
1 = fermentatiemengsel
buis stijgt, zodat de bacteriën het
2 = Fermentatiemengsel
(afgedood)
steeds moeilijker krijgen. Op een
gegeven moment is de temperatuur zo hoog dat de bacteriën
zullen sterven. Niet alle bacteriën
sterven tegelijk, maar geleidelijk
gaan ze allemaal dood. Het ge1
heel wordt nog steeds rondgepompt, het fermentatiemengsel
2
komt nu in een lang, geïsoleerd
Loop met isolatie
Warmtewisselaar
traject terecht, waar de temperatuur constant blijft. Hier wordt het
Figuur 15: Schematische voorstelling van een warmtewisselaar
mengsel de tijd gegund alle bacom de bacteriën af te doden.
teriën af te doden. Aan het einde
van deze geïsoleerde buis zijn
alle bacteriën dood en wordt het mengsel weer afgekoeld. Het is dus erg belangrijk dat de buis
lang genoeg is om alle bacteriën te kunnen doden.
De warmte die vrijkomt bij het afkoelen van het fermentatiemengsel kan weer worden gebruikt om
een nieuwe lading fermentatiemengsel op te warmen. Dit hergebruik van warmte is het grote voordeel van een warmtewisselaar. Hierdoor hoeft slechts weinig energie toe gevoegd te worden en
kunnen de kosten voor het afdoden van de biomassa laag blijven.
In de industrie gebruikte warmtewisselaars verwarmen het fermentatiemengsel tot 95 graden Celsius, waarbij het mengsel zo'n 5 minuten verblijft, voordat het weer afgekoeld wordt. Tot wel 85%
van de warmte wordt op deze manier hergebruikt.
Bij het berekenen (schatten) van voor het afdoden benodigde energie wordt vaak aangenomen dat
de warmtecapaciteit (soortelijke warmte) van het 1,3-propaandiolmengsel gelijk is aan die van water en dat de temperatuur van het fermentatiemengsel 25°C is.
70
Bron 5: Microfiltratie, ultrafiltratie, nanofiltratie
Na het afdoden van de bacteriën in de warmtewisselaar doorloopt het fermentatiemengsel een
aantal filtratiestappen. Achtereenvolgens wordt er een microfiltratie, ultrafiltratie en een nanofiltratie
uitgevoerd. In onderstaand schema staan een aantal gegevens over deze filtratiemethoden.
Figuur 16: filtratieschema
Een logische vraag zou zijn: waarom wordt niet meteen een nanofiltratie membraan gebruikt, dan
worden alle stoffen in één keer uit de oplossing verwijderd? Dit zou inderdaad kunnen, ware het
niet dat de membranen de eigenschap hebben heel snel dicht te slibben. Als de membranen dichtgeslibd zijn, kan er niets meer door het membraan. Daarom is ervoor gekozen de filtratie in drie
stappen te doen: micro-, ultra- en nanofiltratie.
Filtratie
Ook met gescheiden filtratiestappen slibben de membranen dicht, er stromen immers nog steeds
dezelfde stoffen langs. Dit is niet te voorkomen. Men moet daarom de membranen regelmatig
schoonmaken. Om dit geautomatiseerd te kunnen doen, heeft men een systeem bedacht van 6
verschillende zuiveringsinstallaties met membranen die om de beurt gebruikt en vervolgens
schoongemaakt worden. Wanneer het membraan is dichtgeslibd, draait de hele installatie door en
wordt een vers schoongemaakt membraan gebruikt. Je verkrijgt een onderstaande situatie, die
constant ronddraait.
71
Figuur 17: Schematische voorstelling van een roterend filtratiesysteem. In iedere stap worden twee filtratieopstellingen tegelijk gebruikt. Zodra deze zijn dichtgeslibd draait het geheel door, worden de volgende twee
filtratieopstellingen gebruikt. In de tussentijd worden de filtratiesystemen die niet gebruikt worden schoongemaakt.
Figuur 18: Voorbeeld van een filtratiecaroussel zoals boven beschreven. Elke zak is een filtratiesysteem
72
Bron 6: Ionenwisselaar
Na de nanofiltratie wordt het overgebleven fermentatiemengsel in een ionenwisselaar gebracht om
de kleine, geladen deeltjes uit de oplossing halen. Dit zijn met name de zuren en basen die nog in
de oplossing zitten, aminozuren en voedingsstoffen. Deze zijn nog niet met behulp van nanofiltratie
uit de oplossing gehaald.
Een ionenwisselaar, het woord zegt het al, bestaat uit een vaste stof waarop ionen kunnen wisselen. De werking van de ionenwisselaar is gebaseerd op het feit dat concentraties in een oplossing
altijd overal gelijk willen zijn. Opgeloste stoffen proberen zich zoveel mogelijk in een oplossing te
verdelen.
Begin
Begin
Eind
Eind
+
+
H
H+
+
+
H+
+
H
OH
OH-
OH
OH-
OH
-
- -- -
H+
H+
OHOH+ + +
OH
OHOH
OH
OHOH-
+ + +
+ + +
OH-
OHOH
+
- -- -
+
+
+
+
- - -
-
- - -
+
H
OH
OH-
+ +
+
H
H+
H+
+ + +
+
+
+
H
-
OHOHOH+ +
+
OH
OH-
+ + +
+
+
H
H+
H+
+
H
+
H
- - - -
+
+
H
H+
+
H+ H
H+
H
+
H+ H
- - -
+
H
- - -
+
H
H+
+
H
+
+ H
H+ H
+
- - -H H+
+
H - -
+ +
+
H
OH-
OH
+
H+
H+
OH-
H+
Kolom 1 (positieve ionen wisselaar)
H+
+
H
Kolom 2 (negatieve ionen wisselaar)
Figuur 19: ionenwisselaar
Stel je een ionenwisselaar voor als een buis met allemaal kleine bolletjes, waarlangs de oplossing
geleid wordt. Als je inzoomt op deze bolletjes, zie je dat ze allemaal geladen zijn met ionen. Een
bolletje heeft als het ware een schil van ionen, die gebonden zijn aan de oppervlakte van het bolletje. Vaak wordt als positief ion bijvoorbeeld het H+-ion gebruikt aan de oppervlakte van deze bolletjes. Wanneer de oplossing langs de bolletjes stroomt, zal er sprake zijn van een verstoorde evenwichtssituatie: de H+-ionen worden uitgewisseld met de positieve ionen in de oplossing.
Zo komt het dat de bolletjes in de ionenwisselaar na gebruik niet omringd zijn door H+-ionen, maar
door de positief geladen ionen die eerst in de oplossing zaten.
Wanneer je maar genoeg bolletjes met positieve ionen gebruikt, houd je uiteindelijk een oplossing
over waarbij alle positieve ionen zijn vervangen door H+-ionen.
73
Er zijn in de oplossing echter ook negatieve ionen te vinden. Deze worden eruit gehaald met behulp van dezelfde techniek, alleen zitten er nu andere bolletjes in de buis. We hebben nu een type
bolletjes nodig waarbij negatief geladen ionen (meestal OH-) aan de oppervlakte zijn gebonden.
Deze kunnen dan uitgewisseld worden met de negatieve ionen die door de oplossing zweven.
De negatieve ionenwisselaar heeft nog een extra voordeel. Behalve dat er met deze zuiveringsmethode negatieve ionen uit de oplossing gehaald kunnen worden, bezitten organische zuren ook
een negatieve carboxylgroep. Deze worden ook aangetrokken door de bolletjes met OH--ionen.
Ook zuren worden dus door middel van ionenwisseling uit de oplossing gehaald.
Op een gegeven moment zijn alle bindingplaatsen bezet door de verwijderde ionen en zal niet
meer in staat zijn de ionen uit de oplossing te verwijderen. De kolom moet nu geregenereerd worden. Bij regeneratie vindt het omgekeerde proces plaatst. OH- en H+ worden nu op de bolletjes
gebracht. De truc daarbij is dat OH- en H+ ionen in grote overmaat en hoge concentratie door de
kolom worden geleid zodat de geadsorbeerde ionen worden verdrongen worden.
Bron 7: Dubbele Destillatie
De oplossing die we nu overhouden, bevat nog glycerol, propaandiol en water. Dit zijn bij kamertemperatuur alle drie vloeistoffen: ze lenen zich dus uitstekend voor een scheidingsmethode als
destillatie. De kookpunten van de stoffen zijn hieronder weergegeven.
Tabel 3. Kookpunten van de verschillende te destilleren stoffen.
Stof
1,3-propaandiol
Glycerol
Water
Kookpunt (°C)
211
290
100
In plaats van een conventionele scheiding met twee verschillende stoffen, zoals bij een mengsel
van alcohol en water, gaan we nu destilleren met drie verschillende stoffen. Dit betekent dat je niet
één, maar twee destillaties moet uitvoeren. Een schematische voorstelling van de destillatie is getekend in figuur 20.
Figuur 20: Schematische voorstelling van de destillatie.
74
Het mengsel van glycerol, water en 1,3-propaandiol wordt in de eerste destillatiekolom gebracht,
waar het geheel verwarmd wordt. Het residu uit de tweede destillatiekolom is zuiver 1,3propaandiol.
Je kunt je deze destillatiekolommen voorstellen als reusachtige, rechtopstaande buizen. Er geldt
namelijk hoe groter de kolom, hoe nauwkeuriger de scheiding.
Bron 8: Productie Sorona®
Het 1,3-propaandiol dat met de beschreven zuiveringsstappen wordt verkregen is geschikt voor
verdere verwerking tot eindproducten. Met deze zuiveringstechnieken kan men een zuiverheid
verkrijgen van 99,992%. We noemen dit zuiver 1,3-propaandiol.
Het zuivere 1,3-propaandiol wordt onder andere gebruikt voor de productie van een polymeer die
wordt gebruikt voor het maken van textiel. Sorona® is een voorbeeld van zo’n polymeer. De polymeer Sorona®, geproduceerd door de Amerikaanse firma DuPont, wordt als vezel geleverd aan
met name de textielindustrie. Het dient als grondstof voor bijvoorbeeld vloerbedekking, de matjes
die je in de auto onder je voeten vindt, maar ook kleding.
Voor het maken van de polymeer Sorona® laten we het verkregen zuivere 1,3-propaandiol reageren met tereftaalzuur (een aromatisch dicarbonzuur). 1,3-Propaandiol en tereftaalzuur reageren
hierbij in de verhouding 1:1 onder vorming van poly(trimethyleentereftelaat). Dit is een verestering:
de alcoholgroepen van 1,3-propaandiol reageren met de carboxylgroepen van het tereftaalzuur.
Je kunt je voorstellen, dat als de 1,3-propaandiol niet goed zuiver aangeleverd wordt, de polymerisatiereactie niet goed zal verlopen. Meestal is het zo, dat als een grondstof niet helemaal zuiver is,
er stoffen in het mengsel aanwezig zijn die veel op de grondstof lijken. Bij 1,3-propaandiol kunnen
dat bijvoorbeeld glycerol of 1-propanol zijn. Bij de productie van Sorona® moeten lange, lineaire
ketens gevormd worden, dit zijn namelijk de vezels die nodig zijn voor de textielindustrie. Op het
moment dat je met behulp van glycerol of 1-propanol gaat polymeriseren, krijg je structuren in je
vezel die zeer ongewenst zijn. Zie daarvoor onderstaande figuren.
75
Figuur 22: Schematische voorstelling van de polymere eigenschappen van 1-propanol, 1,3-propaandiol en
glycerol. Het rechthoekje stelt het C3-molecuul voor, de pijl een oorspronkelijke OH-groep. De gele lijn is een
weergave van het polymeer.
Je ziet dat 1-propanol en glycerol beiden een verschillende invloed hebben op het polymeer.
1-Propanol zorgt ervoor dat het wel bindt aan het polymeer, maar dat het aan de andere kant geen
nieuw tereftaalzuur meer kan binden. 1-Propanol stopt dus de vorming van de keten. We noemen
deze stof daarom een "chain terminator".
Glycerol daarentegen zorgt er wél voor dat er nieuw tereftaalzuur kan binden, het polymeer kan
dus wel langer worden bij binding van een molecuul glyercol. Glycerol heeft echter niet twee bindingsplaatsen, maar drie. Als op alle drie de bindingsplaatsen een nieuwe keten aangroeit, zie je
dat het oorspronkelijke polymeer vertakt. We noemen deze stof daarom een "chain brancher", een
stof die een lineaire keten vertakt. Vertakte ketens verzwakken de vezels.
Om deze effecten te voorkomen moet dus zuiver 1,3-propaandiol aangeleverd worden.
76
5.4 Oefenopgave
In deze oefenopgave gaan we rekenen aan de productie van 1,3-propaandiol. Kijk voordat je aan
de opgaven begint welke rekenstappen je in oefenopgave 4.5 hebt gemaakt.
Chemisch technologen rekenen vaak met geschatte waarden van de kosten en opbrengsten van
het productieproces. Hieronder is een dergelijke tabel gegeven.
Tabel 1: De opbrengst, verdunningsfactor en de extra kosten per kilogram eindproduct per
zuiveringsstap onder industriële condities.
Opbrengst
(kg/kg)
afdoden
1,00
extractie
0,98
Ionen wisselaar (negatief) 0,99
Ionen wisselaar (positief) 0,99
Ultrafiltratie
0,98
Microfiltratie
0,99
Nanofiltratie
0,99
Destillatie
0,99
verdunningsfactor Extra kosten
(€/kg product)
1,0
0,005
1,5
0,03
1,0
0,01
1,0
0,01
1,2
0,05
1,0
0,02
1,0
0,05
1,0
0,03
1. Laat zien met een berekening dat de totale opbrengst van 1,3-propaandiol 0,93 kg/kg is.
2. Ultra- en Nanofiltratie zijn relatief kostbaar t.o.v. extractie. Waarom is het toch aantrekkelijk
Ultra- en Nanofiltratie te gebruiken i.p.v. extractie?
In Ommen staat een bedrijf dat hightech exclusieve sportkleding wil gaan maken. Daarvoor is 1,3propaandiol nodig. Daarom wordt, toevallig naast de calciumlactaat fabriek, ook een 1,3propaandiol fabriek gebouwd. De grondstof is weer melasse wat door de aanwezigheid van een
grote suikerfabriek in Groningen ruim beschikbaar is.
Tabel 2: Maximale concentratie, opbrengst en productiviteit van 1,3-propaandiol door gemodificeerde E-coli onder industriële condities.
1,3-PDO concentratie
1,3-PDO opbrengst uit glucose
Maximale productiviteit
Duur van één batch (exclusief onderhoud en schoonmaak)
135 g L-1
0,51 g g-1
35 g L-1h-1
6h
3. Bereken hoeveel ton melasse er nodig is voor de productie van 1000 ton zuiver 1,3propaandiol. Melasse bestaat ongeveer voor 50% uit sacharose dat in water gemakkelijk
hydrolyseert tot twee moleculen glucose. Gebruik de totale opbrengst van opgave 1.
4. Bereken het minimale volume dat de fed-batch reactor moet hebben voor de productie van
1000 ton 1,3-PD per jaar. Neem aan dat 15% van de reactortijd gebruikt wordt voor het
schoonmaken van de reactor tussen batches en voor onderhoud.
5. Bereken uit de totale opbrengst en met de gegevens uit tabel 1 de prijs per kg 1,3propaandiol. Neem als de kostprijs van de melasse 20 eurocent per kg.
6. Vergelijk die prijs uit de vorige opgave met die van calciumlactaat uit hoofdstuk 4. Kijk
daarbij naar de verschillen in kosten van de grondstoffen en kosten van de zuivering. Geef
een verklaring voor het gevonden prijsverschil. Maak daarbij onderscheid tussen grondstofkosten en kosten voor de zuivering.
77
Vanwege de grote vraag naar 1,3-propaandiol besluit de fabriek in Ommen zijn productie op te
schalen om uiteindelijk 100.000 ton 1,3-propaandiol te produceren. Er komt een nieuwe fed-batch
reactor met een volume van 500.000 L. De totale duur van een batch blijft hetzelfde als bij de kleine fermentor (zie tabel 2).
Ook het nanofiltratiesysteem wordt vernieuwd. Het nieuwe roterende systeem bestaat uit zes nanofiltratieinstallaties per carrousel, zoals in informatie 4 wordt beschreven. Eén nanofiltratieinstallatie heeft een volume van 2 m3. Een volledige draai van de filtratiecarrousel duurt 3 uur. Het
totale reactorvolume moet in de nanofiltratieopstelling passen.
7. Bereken hoeveel nanofiltratiecarrousels er nodig zijn, zodat de fabriek perfect continu kan
draaien. Ga er vanuit dat het roteren van de opstellingen 5 % extra volumecapaciteit kost.
Verwerk in je berekening ook de verdunning die optreedt bij de zuiveringsstappen (zie tabel
1).
8
Het reactiemengsel dat gefiltreerd wordt bestaat uit water, cellen, eiwitten, DNA, polysachariden, glycerol en 1,3-propaandiol. Geef in onderstaande tabel aan welke deeltjes in de
verschillende filtratiestappen in micro-,ultra- en nanofiltratie verwijderd worden. Gebruik BINAS tabel 78A. microfiltratie
9
ultrafiltratie
nanofiltratie
Leg uit waarom in een ionenwisselaar gekozen wordt voor H+-ionen om de positieve ionen
te verwijderen en voor OH¯-ionen om de negatieve ionen te verwijderen.
Tereftaalzuur is de andere grondstof voor Sorona® naast 1,3-propaandiol
10 Geef de structuurformule op van tereftaalzuur. 11 Geef in structuurformules de reactie van 1,3-propaandiol met tereftaalzuur.
12 Geef een gedeelte van het polymeer Sorona® in structuurformule weer. Neem hiervoor 4
monomeer eenheden uit het midden van een polymeerketen.
78
Afsluiting
In dit hoofdstuk hebben we de metabole routes van E.coli aangepast. Zoals we gezien hebben zijn
metabole routes een ingewikkeld stelsel van evenwichtsreacties en stofstromen. Omzettingen binnen de metabole routes kunnen de bacterie energie kosten of juist energie opleveren. Om de invloed van energie op de ligging van evenwichtsreacties en stofstromen beter te kunnen begrijpen
introduceren we in het volgende hoofdstuk een nieuwe grootheid; de Gibbs energie.
Wat je nu moet weten
•
•
•
•
•
•
Chemische synthese van 1,3-propaandiol
Biosynthese van 1,3-propaandiol
o Koppeling met de glycolyse
Metabolic Engineering van E.coli
o Werking van een restrictie enzym
o Inbouw van vreemd DNA en een plasmide
o Fosfo-Transferase Systeem
Productie van 1,3-propaandiol
o Afdoden van bacteriën met een warmtewisselaar
Zuivering van 1,3-propaandiol
o Microfiltratie
o Ultrafiltratie
o Nanofiltratie
o Destillatie
Productie Sorona
o Productieschema
o Polycondensatie polymerisatie
79
Hoofdstuk 6
Gibbs energie
In de derde klas heb je de begrippen exotherm en endotherm leren kennen. Bij exotherme reacties
wordt energie afgestaan aan de omgeving. Een voorbeeld is het verbranden van aardgas, hierbij
komt veel energie vrij. Bij een endotherme reactie wordt juist energie aan de omgeving onttrokken.
Een voorbeeld is de oplosreactie van kaliumnitraat. Bij het oplossen wordt het water koud. Er wordt
energie aan het water onttrokken.
De woorden endotherm en exotherm laten eigenlijk zien dat, wat je tot nu toe onder exotherm en
endotherm verstaan hebt, alleen geldig is als het gaat om warmte. Of een reactie endotherm of
exotherm is, zegt niet zoveel over het daadwerkelijke energieverschil van een reactie. De voor de
hand liggende reden is dat energie in meer vormen voorkomt dan alleen als warmte (bijv. elektriciteit, licht). Bovendien is het zo dat het energieverschil van een reactie van de omstandigheden
afhangt. De druk en temperatuur zijn altijd belangrijk, maar de concentraties van de reagerende
stoffen en de samenstelling van een reactiemengsel kunnen ook het energieverschil beïnvloeden.
Het energieverschil van een reactie hangt ook af van welke omstandigheden tijdens de reactie
constant blijven en welke omstandigheden veranderen. Het energieverschil van een reactie die
uitgevoerd wordt bij constant volume en bij een oplopende druk is niet gelijk aan het energieverschil van de reactie, als deze uitgevoerd wordt bij constante druk en oplopend volume.
Dit effect is erg belangrijk en speelt een grote rol bij het ontwerpen van stoommachines en verbrandingsmotoren.
Vraag
1. Moderne, hoog rendement, benzinemotoren werken met veel hogere drukken dan oude
benzinemotoren met een lager rendement. Beredeneer hoe het energieverschil van verbranding van benzine van de druk afhangt.
Voor biologen en chemici is het energieverschil van een reactie die verloopt bij constante temperatuur en constante druk een belangrijke grootheid. Het verschil van energie bij deze omstandigheden bepaalt namelijk of reacties spontaan kunnen verlopen en bij evenwichtsreacties bepaalt het
de ligging van het evenwicht. Deze energie wordt de Gibbs energie (G) genoemd. Het verschil in
Gibbs energie voor en na de reactie heeft als symbool ∆G .
Een reactie zal spontaan verlopen als de Gibbs energie afneemt ∆G < 0 . Er moet energie bij als
de Gibbs energie van de reagerende stoffen toeneemt ∆G > 0 . Bij chemisch evenwicht veranderen de concentraties van de reagerende stoffen niet meer en blijft de Gibbs energie gelijk ∆G = 0 .
Voorbeelden:
Verbranding van aardgas is een spontaan verlopende reactie:
CH4 (g)+2O2 (g) → CO2 (g) + 2H2O(l)
∆G < 0
Zilverchloride lost niet spontaan (slecht) op in water
AgCl(s) 
→ Ag+ (aq)+Cl- (aq)
∆G > 0
In een verzadigde oplossing van kaliumchloride is vast kaliumchloride
in evenwicht met de opgeloste fase.

→ K + (aq) + Cl- (aq)
KCl(s) ←
∆G = 0

Vraag
2. Biologen rekenen bij reacties in levende cellen bijna altijd met de Gibbs energie. Leg uit
waarom juist de Gibbs energie het energieverschil bij reacties in een cel goed beschrijft
80
6.1 Berekening ∆G0
In het speciale geval dat reacties verlopen bij standaard omstandigheden wordt de standaard
Gibbs energie met symbool ∆G 0 gebruikt. De verandering in ∆G 0 is het verschil van de Gibbs
energie van de uitgangsstoffen en de Gibbs energie van de reactie producten onder standaardomstandigheden ∆G 0 = Gna – Gvoor .
Onder standaardomstandigheden verstaan we een druk van p = p0 , een temperatuur van T = 273
K en alle stoffen aanwezig in zuivere vorm en in een concentratie van 1 mol L-1. Deze voorwaarden ben je eerder tegengekomen bij de standaardelektrodepotentiaal (Binas tabel 48)
Voorbeeld berekening 1 ∆G0
Onderstaande reactie geeft het uitharden van cement weer.
Ca ( OH)2 (s)+CO2 (g) 
→ CaCO3 (s)+H2 O(l)
Vormingsenergie (KJ mol-1)
Om ∆G 0 te berekenen moet je de Gibbs energieën van Ca(OH)2, CO2, CaCO3 en H2O kennen.
Echter van geen enkele stof is de Gibbs energie bekend. In tabellen worden geen Gibbs energieën
maar ∆G ∅ waarden gegeven. De grootheid ∆G ∅ wordt de vormingsenergie genoemd en geeft aan
hoeveel de standaard Gibbs energie van een stof verschilt met die van de elementen waaruit deze
gevormd is. Er is namelijk afgesproken dat bij de elementen onder standaard omstandigheden G =
0. Voor berekeningen maakt dit niet uit, je kunt met ∆G ∅ rekenen alsof het standaard Gibbs energieën zijn. Een tabel met vormingsenergieën van een aantal stoffen staat achteraan dit hoofdstuk
(tabel 1).
0
Ca, C, H2, O2 (T = 298 K en p = p0)
∆G ∅ = 394,2 kJ mol -1
H 2O (l)
CO2 (g)
∆G ∅ = −897,5 kJ mol-1
Ca(OH)2 (s)
Figuur 1: De vormingsenergieën (
elementen
∅
∆G = −237,1 kJ mol
-1
∆G ∅ = −1128,8 kJ mol -1
CaCO3 (s)
) van CO2, Ca(OH)2, H2O en CaCO3 uit de
We gaan nu even terug naar de reactie Ca ( OH)2 (s)+CO2 (g) → CaCO3 (s)+H2O(l)
De Gibbs energie voor de reactie is ∆G ∅Ca (OH )2 + ∆G ∅ CO2 = -897,5+(-394,2)=-1291,7 kJmol-1
De Gibbs energie na de reactie is ∆G ∅CaCO3 + ∆G ∅ H2O = -1128,8+(-237,1)=-1365,9 kJmol-1
(
) (
∆G 0 = Gna - Gvoor = ∆G ∅CaCO3 + ∆G ∅ H2O − ∆G ∅Ca(OH )2 + ∆G ∅ CO2
) = -1365,9-(-1291,7)=-74,2 kJmol
-1
De berekening geeft aan dat het uitharden van cement een spontaan proces is, waarbij energie
vrijkomt. Dit klopt, want bijvoorbeeld bij de aanleg van de betonnen Hooverdam in de VS werd tijdens de bouw het uithardende beton binnen in de dam gekoeld om te voorkomen dat er scheuren
in het beton zouden ontstaan.
81
Gibbs energie (KJ mol -1)
Figuur 2 geeft de berekening in een diagram weer.
0
Ca, C, H2, O2 (T = 298 K en p = p0)
∆G ∅ = −1291,7 kJ mol-1
∆G ∅ = −1365,9 kJ mol -1
Ca(OH)2 (s)+ CO2 (g)
∆G 0 = − 74,2 kJ mol-1
CaCO3 (s) + H2O (l)
Figuur 2: De verandering in standaard Gibbs energie van de reactie
berekend uit de
de reagerende stoffen. Uit de figuur volgt dat
waarden van
-1
= -74,2 kJmol
Voorbeeld berekening 2 ∆G0
Is de verbranding van glucose een spontaan proces?
De reactievergelijking is
C6H12O6 (s)+6O2 (g) 
→ 6CO2 (g)+6H2O(l)
Let op! De reactie coëfficiënten zijn nu ongelijk aan 1:
∆G 0 = Gna - Gvoor
∆G 0 = ( 6 × −394,2 ) + ( 6 × −237,1) − ( −910,5 + (6 × 0)) = −2877,3 kJmol-1
∆G0 < 0 dus de verbranding is een spontaan proces.
Vragen
3.
Waarom is ∆G ∅ zuurstof = 0 bij 278 K en p = p0 ?
4.
Bereken ∆G 0 voor de vorming van CO2 uit grafiet en zuurstof.
5. Bereken ∆G 0 voor de verbranding van propaan waarbij enige tijd na de reactie de producten weer op kamertemperatuur zijn.
6. Bij het oplossen van ammoniumnitraat is de oploswarmte +25.7 kJ mol-1. Wordt de oplossing warm of koud door het oplossen van ammoniumnitraat?
Bereken m.b.v. tabel 1 of het oplossen van ammoniumnitraat een spontaan proces is.
82
6.2 ∆G0 en reactiesnelheid.
De snelheid van een reactie hangt onder andere af van de activeringsenergie. De reactiesnelheid
wordt niet voorspeld door ∆G 0 . Dit komt omdat ∆G 0 alleen iets zegt over het verschil in energie
tussen de beginstoffen en de reactie producten. ∆G 0 is onafhankelijk van het reactiemechanisme
en zegt daarom niets over de activeringsenergie.
Voorbeeld berekening 3 ∆G0
Bereken ∆G 0 voor de omzetting van diamant in grafiet.
diamant: ∆G ∅ = 2,9 kJmol-1 en grafiet: ∆G ∅ = 0 (zie tabel 1)
∅
∅
∆G 0 = ∆Ggrafiet
− ∆Gdiamant
= 0 − 2,9 = -2,9 kJmol-1
Dus de omzetting van diamant in grafiet is een spontane reactie. Gelukkig is de activeringsenergie
zo hoog dat onder normale omstandigheden deze omzetting niet plaatsvindt.
Vraag
7. Waaruit kan je concluderen dat bijvoorbeeld de verbrandingsreacties van grafiet en propaan een hoge activeringsenergie moeten hebben?
6.3 ∆G0 bij evenwichten
Bekijk de evenwichtsreactie

→ C+D
A+B ←

De evenwichtsvoorwaarde voor een homogeen evenwicht wordt gegeven door
K=
[C ][D ]
[ A][B ]
Waarbij [A], [B, [C] en [D] de concentraties van beginstoffen en producten in het evenwichtmengsel
zijn. Nu is het belangrijk te beseffen dat op twee manieren afgeweken wordt van standaardomstandigheden.
1 De stoffen zijn niet in zuivere vorm aanwezig
2 De concentraties zijn hoogstwaarschijnlijk anders dan 1 mol L-1.
In de inleiding is gegeven dat bij evenwicht de Gibbs energie gelijk blijft dus ∆G = 0 . Maar omdat
er geen standaardomstandigheden heersen zullen de Gibbs energie en de standaard Gibbs energie van elkaar verschillen dus ∆G 0 ≠ ∆G .
Nu is er iets bijzonders aan de hand. Het is namelijk zo dat de waarde van K berekend kan worden
uit de ∆G 0 van de reactie via
∆G 0 = −2,303RT log K
waarin R de gasconstante is (8,31 J K-1 mol-1) en T de temperatuur (in K). Dus bij evenwicht blijft
de Gibbs energie gelijk daarom is ∆G = 0 , maar ∆G 0 ≠ 0 . Bovendien bepaalt de waarde van ∆G 0
de ligging van het evenwicht. Daarom is ∆G 0 een belangrijke grootheid in de scheikunde.
83
Vragen
8.
1
9.

→ 2CO(g) is gegeven dat ∆G 0 = 120 kJ molVoor een evenwichtsreactie C(s)+CO2 (g) ←

bij 298 K. Bereken K. Ligt het evenwicht naar links of rechts?

→ 2NO2 ( g) is gegeven dat ∆G 0 = -2,93
Voor een evenwichtsreactie 2NO ( g) +O2 ( g) ←

kJ mol-1 bij 750 K. Bereken K.
6.4 ∆G in steady state
Als bij een reactie de uitgangsstoffen voortdurend worden aangevoerd en de reactieproducten
voortdurend worden afgevoerd kan een situatie ontstaan, waarbij de reactie doorgaat maar de
concentraties van de reagerende stoffen niet meer veranderen. Dit wordt een steady state genoemd.
Omdat we nu met een mengsel van stoffen in plaats van zuivere stoffen te maken hebben, mogen
we formeel niet meer rekenen met ∆G 0 . Om toch het verschil in Gibbs energie uit te kunnen rekenen, maken we gebruik van het feit dat in evenwicht, ongeacht de samenstelling van een mengsel,
altijd geldt dat ∆G = 0 . Ook maken we gebruik van het feit dat zowel bij steady state als bij evenwichtsreacties de concentraties constant zijn.
Afleiding

→ C+D
We gaan weer terug naar evenwichtsreactie A+B ←

0
In de vorige paragraaf is gegeven dat ∆G = −2,303RT log K of anders geschreven;
∆G 0 + 2,303RT log K = 0 .
Bovenstaande vergelijking invullen in ∆G = 0 levert
∆G = ∆G 0 + 2,303RT log K .
De evenwichtsvoorwaarde voor de reactie invullen in bovenstaande vergelijking levert
 [ C][D] 
∆G = ∆G 0 + 2,303RT log 
 [ A ][B] 


Met bovenstaande vergelijking kan ∆G in een mengsel van uitgangsstoffen en reactieproducten
uitgerekend worden. De vergelijking laat verder zien dat hoe verder een steady state reactie uit
evenwicht is, hoe groter het verschil in Gibbs energie wordt.
Voorbeeld berekening 4 ∆G in steady state
In levende organismen vinden veel steady state omzettingen plaats. We nemen als voorbeeld de
verbranding van glucose
C6H12O6 (aq)+6O2 (aq) 
→ 6CO2 (aq)+6H2O(l)
Met steady state concentraties [glucose] = 1,0 mmol L-1, [O2] = 0,23 mmol L-1 en [CO2] = 0,16
mmol L-1, T= 298 K en p = p0.
(Voor de ∆G0 van deze reactie, zie voorbeeldberekening 2).
84
Onder deze voorwaarden wordt de Gibbs energie die vrijkomt per mol glucose gegeven door
6


CO2 ]
[


∆G = ∆G + 2,303RT log
6
 [ glucose ][ O ] 
2


0
(
)
6

1,6 × 10 −4
∆G = −2870,3 × 10 + 2,303 × 8,31× 298 × log 
 1,0 × 10 −3 × 2,3 × 10−4

3
(
) (
)
6




∆G = -2859 kJ mol-1
Vragen
10. Stel dat een organisme veel efficiënter is in het afvoeren van de CO2 die gevormd wordt bij
de reactie, waardoor de concentratie van CO2 100 keer lager wordt dan in bovenstaand
voorbeeld Bereken nu hoeveel Gibbs energie vrijkomt per mol glucose.
11. Zoek in tabel 49 BINAS de Kb voor NH3 (aq) op en bereken ∆G 0 voor de reactie van NH3
met water:

→ NH4 + (aq)+OH- (aq)
NH3 (aq)+ H2O(l) ←

12. Bereken ∆G voor de reactie uit de vraag 11) als in steady state [NH3] = 100 mmol L-1,
[NH4+] = 1,00 mmol L-1 en [OH- =1,50 mmol L-1. Welke reactie zal onder deze omstandigheden verlopen. De reactie naar links of de reactie naar rechts? Licht je antwoord toe.
85
6.5 Oefenopgave bij Gibbs energie
Gibbs energie in melkzuurproductie
Voor de productie van D-lactaat wordt wel Lactobacillus delbrueckii gebruikt. Deze bacteriesoort
kan erg veel melkzuur produceren en daarom moet, om tijdens de productie de pH boven pH = 6,0
te houden, calciumcarbonaat aan de fed-batch reactor worden toegevoegd. Een neveneffect is dat
daarbij vrijwel al het aanwezige melkzuur omgezet wordt in calciumlactaat.
Calciumlactaat is veel minder goed oplosbaar in water dan melkzuur. De hoge melkzuur concentraties kunnen voor problemen zorgen, omdat na toevoeging van calciumcarbonaat het opgeloste
melkzuur gedeeltelijk kan neerslaan als calciumlactaat. Dit leidt tot een lagere efficiëntie van het
productieproces. (zie hoofdstuk 4-route 4)
Marianne wordt als bedrijfschemicus gevraagd te onderzoeken of een neerslag van calciumlactaat
te verwachten is. Zij begint met een literatuuronderzoek, maar in de literatuur kan zij het oplosbaarheidproduct van D-calciumlactaat niet vinden. Wel vindt zij ∆Gø waarden voor D-melkzuur, Dlactaat (aq) en D-calciumlactaat (zie onderstaande tabel).
Om de betrouwbaarheid van onderstaande data te controleren, berekent Marianne met behulp van
deze data de pKz van melkzuur. Als deze correspondeert met de al bekende pKz voor melkzuur
zullen de ∆Gø waarden wel correct zijn.
ø
Tabel ∆G – waarden voor enkele lactaten
Stof
D-melkzuur
D-melkzuur
D-lactaat
D-calciumlactaat
∆Gø (kJmol-1)
CH3CHOHCOOH (s)
-522,9
CH3CHOHCOOH (aq)
-540,3
CH3CHOHCOO¯ (aq)
-517,8
Ca(CH3CHOHCOO)2(s) -1584,0

→ H+ (aq)+CH3 CHOHCOO- (aq)
1. Bereken ∆G0 voor de reactie CH3 CHOHCOOH(aq) ←

Gebruik daarbij ook tabel 1 uit dit hoofdstuk.
2. Laat met een berekening zien dat de pKz berekend uit de ∆G0 overeenkomt met de bekende
pKz = 3,95 van melkzuur.
De ∆Gø waarden lijken betrouwbaar dus gaat Marianne deze gebruiken voor het berekenen van de
oplosbaarheid van calciumlactaat.
3. Geef de reactievergelijking voor het oplossen van calciumlactaat.
4. Bereken ∆G0 voor de oplosreactie van calciumlactaat
5. Geef de evenwichtvoorwaarde voor bovenstaande reactie.
6. Bereken Ks voor bovenstaande reactie.
7. Laat met een berekening zien of alle lactaat in oplossing blijft als in een melkzuuroplossing
van 90,0 g L-1 alle melkzuur wordt omgezet in calciumlactaat(aq)
86
Enigszins geschrokken van het resultaat van de berekening uit opgave 6 realiseert Marianne zich
dat de temperatuur in de fed-batch reactor 42°C is, terwijl de gevonden waarde voor Ks geldig is
bij 298 K . Bij een hogere temperatuur zal de oplosbaarheid meestal groter zijn. Een nieuwe
speurtocht in de literatuur levert de oplosbaarheid van L-calciumlactaat als functie van de temperatuur.
Figuur 3: De oplosbaarheid van L-calciumlactaat als functie van de temperatuur.
8. Hoeveel procent van het oorspronkelijke melkzuur blijft als lactaat in oplossing als bij 42°C
in een 90,0 g L-1 oplossing alle melkzuur wordt omgezet in calciumlactaat(aq)? Neem daarbij aan dat de relatieve toename van de oplosbaarheid met toenemende temperatuur voor
D-calciumlactaat en L-calciumlactaat gelijk zijn.
9. Hoe hoog moet de temperatuur in de fed-batch reactor worden om alle calciumlactaat in oplossing te houden?
10. Bedenk een andere manier om de neerslagvorming te voorkomen.
87
Tabel 1 Vormingsenergieën
Stof
Ag (s)
Ag+ (aq)
AgBr (s)
AgCl (s)
AgNO3 (s)
Ba (s)
Ba2+ (aq)
BaCl2 (s)
C(s) diamant
C(s) grafiet
Ca (s)
Ca(OH)2 (s)
Ca2+ (aq)
CaCl2 (s)
CaCO3 (s)
CaO (s)
Cl- (aq)
Cl2 (g)
CO (g)
CO2 (aq)
CO2 (g)
CO32- (aq)
H+ (aq)
H2 (g)
H2CO3 (aq)
H2O (g)
H2O (l)
H2O2 (l)
H2S (g)
H2SO4(l)
HCl (g)
HCO3- (aq)
HNO3 (l)
HS- (aq)
HSO4- (aq)
I- (aq)
I2 (g)
I2 (s)
K (s)
K+ (aq)
KBr (s)
KCl (s)
KI (s)
KOH (s)
N2 (g)
N2O (g)
N2O4 (g)
Na (s)
bij T=298 K en p=p0
∆G ∅ (kJ mol-1)
0
+77,1
-96,9
-109,8
-33,4
0
-560,8
-810,4
+2,9
0
0
-897,5
-553,6
-748,1
-1128,8
-604,0
-131,2
0
-137,2
-386,0
-394,2
-527,8
0
0
-623,1
-228,6
-237,1
-120,4
-33,6
-690,0
-95,3
-586,8
-80,7
-27,8
-755,9
-51,6
+19,3
0
0
-283,27
-380,7
-409,1
-324,9
-379,1
0
+104,2
+97,9
0
Na+
NaBr (s)
NaCl (s)
NaI (s)
NaOH (s)
NH3 (aq)
NH3 (g)
NH4+ (aq)
NH4NO3 (s)
NO (g)
NO2 (g)
NO3- (aq)
O2 (g)
O3 (g)
OH- (aq)
S(s) (S8)
S2- (aq)
SO2 (g)
SO3 (g)
SO42- (aq)
-261,9
-349,0
-384,1
-286,1
-379,5
-26,5
-16,5
-79,3
-183,9
+86,6
+51,3
-108,7
0
+163,2
-157,2
0
+85,8
-300,2
-371,1
-744,5
Koolwaterstoffen
CH4 (g) (methaan)
C2H2 (g) (ethyn)
C2H4 (g) (etheen)
C2H6 (g) (ethaan)
C3H8 (g) (propaan)
C4H10 (g) (butaan)
C5H12 (g) (pentaan)
C6H6 (l) (benzeen)
C6H12 (l) (cyclohex.)
C6H8 (l) (hexaan)
Alcoholen
CH3OH (l) (methanol)
C2H5OH (l) (ethanol)
Carbonzuren
HCOOH (l)
CH3COOH (l)
CH3COOH (aq)
CH3COO- (aq)
-361,4
-390,0
-396,5
-369,3
Suikers
C6H12O6 (s) (glucose)
C6H12O6 (aq)
-910,5
-917,5
-50,7
+209,2
+68,15
-32,82
-23,5
-17,0
-8,20
-124,3
+26,8
-0,25
-166,3
-174,8
88
Hoofdstuk 7
Gibbs energie en de dissimilatie van glucose
In dit hoofdstuk koppelen we onze kennis over Gibbs energie uit hoofdstuk 6 aan de dissimilatie
van glucose uit hoofdstuk 3.
Als we de processen bekijken die in een bacterie verlopen, kunnen we stellen dat over een periode
van enkele minuten er in de cel sprake is van homeostase (Grieks voor constante toestand). Tijdens homeostase zijn veel reacties in steady state: de reacties vinden plaats maar de concentraties van de reagerende stoffen veranderen niet. Dit komt doordat de uitgangsstoffen doorlopend
worden aangevoerd en de reactieproducten afgevoerd. Zo wordt in de glycolyse in steady state
evenveel pyruvaat gemaakt als afgestaan en evenveel glucose omgezet als er door de bacterie
netto wordt opgenomen uit zijn omgeving. Het handhaven van een balans voor ATP en NADH is
gezien hun centrale rol extra belangrijk. ATP en NADH kunnen de cel niet in of uit getransporteerd
worden. Dit houdt overigens niet in dat er geen ATP gemaakt of afgebroken kan worden in de
steady state, maar wel dat de totale snelheid van de ATP vorming in steady state gelijk moet zijn
aan de totale snelheid van de ATP afbraak (hydrolyse).
Aangezien de glycolyse een centrale rol speelt in het metabolisme en daarom ook in het handhaven van homeostase moet deze route goed gereguleerd worden. Allereerst gaan we kijken naar de
rol van de Gibbs energie in de energieopbrengst en de regulatie van de glycolyse.
7.1 Gibbs energie en de regulering van de glycolyse
Gibbs energie is de bruikbare energie die uit moleculen gehaald kan worden en in de cel kan worden overgedragen naar ADP + Pi. Zoals we in hoofdstuk 6 gezien hebben is de Gibbs energie die
bij een reactie beschikbaar komt gelijk aan het verschil in Gibbs energie tussen de beginstoffen en
de producten:
De reacties in een cel zijn altijd evenwichtsreacties die in een bepaalde richting moeten verlopen
om efficiënt een biosynthetische route te vormen. De verandering van Gibbs energie geeft informatie over
1. Of er energie beschikbaar komt (∆G is negatief) of nodig is (∆G is positief);
2. Hoe de ligging is van het evenwicht. Als de ∆G0 negatief is, ligt het evenwicht naar rechts,
als de ∆G0 positief is, ligt het evenwicht naar links.
Er zijn drie reacties in de glycolyse die onder normale omstandigheden niet omkeerbaar zijn. Hierdoor kan de glycolyse maar in één richting verlopen. Het gaat hierbij om de stappen 1, 3 en 10 en
respectievelijk de enzymen hexokinase, fosfofructokinase en pyruvaatkinase (zie figuur 1 hieronder). Deze reacties zijn niet omkeerbaar doordat ze een sterk negatieve ∆G hebben.
89
Figuur 1: de 10 stappen van de glycolyse
Tabel 1: De Gibbs energie van de glycolyse onder standaardomstandigheden. De nummers in deze tabel
corresponderen met de stappen in figuur 1.
Nummer
Enzym
∆G0 (kJ/mol)
∆G (kJ/mol)*
1
Hexokinase
-16,7
-33,5
2
Fosfohexose-isomerase
+1,7
-2,5
3
Fosfofructokinase
-14,2
-22,2
4
Aldolase
+23,9
-1,3
5
Triosefosfaat-isomerase
+7,6
+2,5
6
Glyceraldehyde-3-fosfaat-dehydrogenase
+12,6
-3,4
7
Fosfoglyceraatkinase
-37,6
+2,6
8
Fosfoglyceraatmutase
+8,8
+1,6
9
Enolase
+3,4
-6,6
10
Pyruvaatkinase
-62,8
-33,4
*gemeten in spierweefsel van konijnen
90
Een reactie met een hoge positieve ∆G0 waarde (bijv.aldolase) zal normaal gesproken alleen naar
links verlopen. Hoe kan het dan dat deze reacties in de cel toch naar rechts verlopen? Dat kan
bijvoorbeeld doordat onder steady state voortdurend het gevormde product van een reactie wordt
verbruikt. Een tweede mogelijkheid is dat de reactie met een positieve ∆G0 gekoppeld is aan een
reactie met een negatieve ∆G0. De eerste reactie in de glycolyse (figuur 1) is hiervan een goed
voorbeeld. De reactie heeft een sterk negatieve ∆G0. Dit wordt veroorzaakt door de koppeling van
de fosforylering van glucose (eerste deelreactie) aan de hydrolyse van ATP (tweede deelreactie).
Door de koppeling van deze twee reacties wordt een energetisch gunstige totaalreactie verkregen:
1e deelreactie: Glucose + HPO42-+ H+ Glucose-6-phosphate + H20 ∆G0 = +14 kJ/mol
2e deelreactie: ATP + H2O
ADP + Pi + H+
∆G0 = -30,5 kJ/mol
Totaalreactie: Glucose + ATP
Glucose-6-phosphate + ADP ∆G0 = -16,5 kJ/mol
Opdracht
1. Maak met behulp van tabel 1 een grafiek waarbij je de stappen van de glycolyse uitzet tegen de ∆G0 en de ∆G.
a. Vergelijk de grafieken en geef aan welke verschillen je het meest opvallen.
b. Verklaar de verschillen tussen de twee grafieken.
Vragen
1. Bereken met behulp van tabel 1 en de vergelijking ∆G0 = - 2,303 RTlogK de waarden van
de evenwichtsconstante voor de reacties die gekatalyseerd worden door fosfofructokinase
en aldolase.
2
a. Bereken met behulp van ∆G0 uit tabel 1 de evenwichtsconstante voor stap 10.
b. Bereken met behulp van de ∆G0 en ∆G waarden uit tabel 1 met behulp van de vergelijking voor ∆G in steady state de verhouding van de beginstoffen en de reactieproducten bij de in tabel 1 gegeven ∆G.
7.2 ∆G0 en de standaardelektrode potentiaal
Bacteriën gebruiken verschillende stoffen om energie uit te halen en ATP te vormen. Een aantal
van deze stoffen, bijvoorbeeld nitriet en sulfide, leveren energie via een redoxreactie. Ook de vorming van NADH en de reacties van de ademhalingsketens zijn redoxreacties. Bij een redoxreactie
is het vaak eenvoudiger om de standaardelektrode potentiaal V0 in plaats van ∆G0 te gebruiken om
te voorspellen of een reactie kan plaatsvinden.
De energie die vrijkomt door overdracht van elektronen bij een redoxreactie zorgt voor het ontstaan van een potentiaalverschil:
∆V = Velektronenacceptor − Velektronendonor .
De maximale hoeveelheid elektrische arbeid (W) die verricht kan worden door het gevormde potentiaalverschil wordt gegeven door de vergelijking
W = q∆V
(q is de lading in Coulomb (C), en ∆V is het potentiaalverschil in Volt (V).
De Gibbs energie komt overeen met de negatieve waarde van de maximale hoeveelheid elektrische arbeid:
∆G = −W .
91
Aangezien q = nF (n is het aantal elektronen die van de reductor overgaan naar de oxidator en F
is de constante van Faraday (Binas tabel 7)) kunnen we bovenstaande vergelijking omzetten naar
∆G = −nF ∆V of onder standaardomstandigheden
∆G° = −nF ∆V ° .
Uit deze vergelijking kunnen we afleiden dat
∆V0 > 0 de reactie loopt naar rechts
∆V0 < 0 de reactie loopt naar links
∆V0 = 0 evenwicht
Tabel 1 geeft de standaardelektrode potentialen van een aantal reacties die je bent tegengekomen
in hoofdstuk 3. Een belangrijke toepassing van het gebruik van ∆V0 waarden is om te voorspellen
of bepaalde bacteriën geschikt zijn om bijvoorbeeld nitriet, nitraat en sulfaten in afvalwater af te
breken.
Tabel 2: Standaard elektrodepotentialen voor enkele reacties (298 K en pH = 7)
Halfreactie
V0 (V)
O2 + 4H+ + 4e- 2H2O
+0,816
NO3- + 2H+ + 2e- NO2- + H2O
+0,421
Fumarate2- + 2H+ + 2e- succinate2-
+0,031
FAD + 2H+ + 2e- FADH2
-0,219
S + 2H+ + 2e- H2S
-0,243
NAD+ + 2H+ + 2e- NADH + H+
-0,320
Vragen
3 Hoeveel moleculen ATP kunnen maximaal geproduceerd worden door de oxidatie van 1
molecuul succinaat met zuurstof? Gebruik tabel 2.
4
In hoofdstuk 3 heb je gezien dat er uit NADH en FADH2 via een redoxreactie ATP gevormd
kan worden.
a. Hoeveel ATP kan er theoretisch uit 1 molecuul NADH of FADH2 gevormd worden
met zuurstof als elektronenacceptor?
b. Waarom kan er meer ATP gevormd worden uit NADH dan uit FADH2?
5
In levende cellen is via nauwkeurige metingen vastgesteld dat er uit 1 mol NADH gemiddeld 2,5 mol ATP gevormd wordt. Geef een verklaring voor het verschil tussen deze waarde en de theoretische waarde die je in de vorige vraag hebt berekend.
92
6
De “Anammox” reactie (anaerobe ammonia oxidatie) wordt uitgevoerd door verschillende
bacteriën. Via het Anammox-proces wordt
ammonium en nitriet in afvalwater direct omgezet in stikstofgas:
NH4+ (aq) + NO2- (aq) → N2 (g) + 2H2O(l)
De halfreactie met NH4+ als reductor is:
2 NH4+ → N2 + 8H+ + 6e-
a. Stel de andere halfreactie op.
b. De Anammox reactie zoals boven beschreven
heeft een ∆G°van –357 kJ/mol.
Wat is de ∆V° van deze reactie?
Figuur 2: Anammoxbacterie onder de
microscoop.
7.3 Andere regulatie mechanismen
Hoewel de Gibbs energie dus veel informatie geeft over de richting van de reactie of de ligging van
een evenwicht, is de Gibbs energie onafhankelijk van het reactiemechanisme. De Gibbs energie
zegt dus niet via welke tussenproducten of met welke snelheid een reactie verloopt. Daarom heeft
bijvoorbeeld een katalysator zoals een enzym geen invloed op de Gibbs energie.
De activiteiten van bijvoorbeeld hexokinase, fosfofructokinase en pyruvaatkinase worden nauwkeurig geregeld door de concentraties van deze enzymen en hun substraten op het juiste niveau te
houden
Een goed voorbeeld van de regulering van de activiteit van de enzymen zelf, is de wijze waarop de
activiteit van fosfofructokinase wordt beïnvloed door de aanwezigheid van ATP en AMP. Fosfofructokinase katalyseert de snelheidsbepalende stap in de glycolyse. ATP remt dit enzym terwijl
AMP deze remmende werking juist tegengaat.
Als de ATP concentratie in de cel toeneemt, verloopt de glycolyse dus langzamer en als de ATP
concentratie afneemt, verloopt de glycolyse sneller. Onder normale omstandigheden verandert de
ATP concentratie echter niet zo veel, maar de AMP concentratie kan juist wel snel toenemen. Dit
komt doordat het enzym adenylaatkinase de reactie 2 ADP ATP + AMP katalyseert. De verhoudingen tussen ATP, ADP en AMP concentraties zijn gewoonlijk 100:10:1. Hierdoor zal een kleine
verandering in de concentratie van ATP een grote verandering in de concentratie van AMP tot gevolg hebben. AMP is daardoor de belangrijkste regulerende factor voor fosfofructokinase.
Vraag
7 Bereken met behulp van de evenwichtsvoorwaarde de verandering in de AMP concentratie
die plaatsvindt wanneer 8% van de ATP in een cel plotseling wordt gehydrolyseerd tot
ADP. De K voor deze reactie is 0,44 (298 K). De beginconcentraties voor ATP, ADP en
AMP zijn 1800 µM, 180 µM, 20 µM.
Wat je nu moet weten
•
•
•
Gibbs energie en de regulering van de glycolyse
Het verband tussen ∆G0 en V0
De rol van ∆V0 bij biosynthetische reacties in de cel.
93
94