University of Groningen Membrane reconstitution and functional

University of Groningen
Membrane reconstitution and functional analysis of a sugar transport system
Knol, Jan
IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to
cite from it. Please check the document version below.
Document Version
Publisher's PDF, also known as Version of record
Publication date:
1999
Link to publication in University of Groningen/UMCG research database
Citation for published version (APA):
Knol, J. (1999). Membrane reconstitution and functional analysis of a sugar transport system Groningen:
s.n.
Copyright
Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the
author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons).
Take-down policy
If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately
and investigate your claim.
Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the
number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum.
Download date: 18-07-2017
Samenvatting voor niet-biologen (Dutch)
Alhoewel bacteriën vaak negatief in de publiciteit komen als ziekteverwekkers zijn ze van
essentieel belang voor al het leven op aarde. Ons lichaam bijvoorbeeld bevat 10-100 keer meer
bacteriële cellen dan lichaamscellen en deze bacteriën (meer dan 400 soorten) zijn van groot belang
voor onze gezondheid. Ook worden bacteriën al eeuwenlang ingezet voor het maken van
voedingsproducten, zoals bijvoorbeeld: yoghurt, kaas, en wijn. Omdat bacteriën eencellig zijn, over
het algemeen snel groeien, en een relatief eenvoudige celopbouw hebben, worden ze door veel
onderzoekers gebruikt voor het bestuderen van belangrijke biologische processen, en in een aantal
biochemische opzichten verschillen bacteriën niet eens zo veel van bijvoorbeeld de mens.
Ook bacteriën moeten eten. Voedingsstoffen moeten worden opgenomen om te voorzien in de
energiebehoefte en biosynthese, en de eindproducten moeten worden uitgescheiden. Streptococcus
thermophilus en Lactobacillus bulgaricus bijvoorbeeld groeien bij voorkeur in melk, waar melksuiker
(lactose) in relatief hoge concentraties aanwezig is. Dit melksuiker wordt opgenomen en omgezet in
melkzuur wat vervolgens door de cel wordt uitgescheiden. Het omzetten van lactose levert de energie
voor het groeien (delen) van de bacteriën. Door de verzuring van de melk beginnen de eiwitten in de
melk te klonteren en ontstaat de specifieke textuur van yoghurt. Aangezien de bacteriën ook de
aanwezige eiwitten gedeeltelijk afbreken ontstaat bovendien de smaak die yoghurt zo populair heeft
gemaakt.
Bacteriën bestaan uit een omhulsel (een membraan en een soort celwand) met daarin alle erfelijke
informatie (het DNA) en de enzymen (eiwitten die biochemische reacties uitvoeren) die het mogelijk
maken om te overleven en te groeien. Hoe bacteriën voedsel de cel in transporteren is een belangrijk
onderwerp van studie. Het is bekend dat in de cytoplasma-membraan transporteiwitten aanwezig zijn
die stoffen (bijvoorbeeld lactose) van buiten naar binnen kunnen transporteren en eiwitten die
afvalproducten weer kunnen uitscheiden.
Een eiwit is opgebouwd uit specifieke bouwstenen (aminozuren) die in een door het DNA
bepaalde volgorde aan elkaar worden gezet als een soort kralenketting. Deze aminozuurvolgorde en de
manier waarop de streng van aminozuren is opgevouwen zijn bepalend voor de structuur, de
specificiteit en de activiteit van het eiwit. Hoe transporteiwitten precies werken is nog onduidelijk. Van
veel eiwitten die aanwezig zijn in de cel hebben we een veel beter idee hoe ze werken en dat komt
omdat we van deze eiwitten kristallen kunnen maken. Kristallen zijn geordende structuren (denk aan
kristalsuiker of de ijsbloemen die in de winter op de ramen staan) waarin alle eiwitten op dezelfde
manier zijn gestapeld. Door deze grote regelmaat kunnen we met behulp van moderne technieken
achterhalen wat de exacte structuur van het eiwit is (manier waarop de streng van aminozuren is
opgevouwen). Als we weten wat de structuur is kunnen we vaak ook bepalen hoe het eiwit zijn
specifieke functie uitvoert. Voor membraaneiwitten bestaat er echter een groot probleem en dat is dat
deze eiwitten zeer moeilijk te kristalliseren zijn. Membraaneiwitten zitten in de vetlaag die de cellen
omsluit en hebben daardoor andere eigenschappen dan eiwitten die in de cel in een waterige oplossing
voorkomen.
Het eiwit dat zorgt voor het opnemen van lactose door S. thermophilus (en andere bacteriën) is
een aantal jaren geleden ontdekt en werd LacS genoemd. Dit eiwit bleek anders te zijn dan alle tot dan
toe bekende transporteiwitten omdat het bestaat uit twee delen. Het ene deel zit in de membraan en
zorgt voor het transporteren van lactose terwijl het andere domein, wat aan de binnenkant van de cel
zit, de snelheid van transport blijkt te regelen. Het lactose transporteiwit is niet alleen verantwoordelijk
voor het opnemen van lactose maar bovendien ook voor het uitscheiden van galactose (afvalproduct).
- 90 -
Nederlandse Samenvatting
Voor het bestuderen van transportprocessen is een bacterie eigenlijk nog te complex en daarom
zijn technieken ontwikkeld die het mogelijk maken de membraan te scheiden van de rest van de cel. Er
ontstaan zo membraanblaasjes (zogenaamde vesicles) waarvan al het DNA en alle wateroplosbare
eiwitten zijn verwijderd. Met behulp van radioactief lactose zijn transportstudies gedaan in deze
vesicles en is duidelijk geworden hoe de energie voor het transport van lactose wordt geleverd.
Bacteriën zetten de energie die wordt verkregen door het afbreken van stoffen uit het medium (bijv.
lactose) om in een zogenaamde protonen drijvende kracht. Door positief geladen protonen naar buiten
te pompen ontstaat er een verschil in elektrische lading en pH (zuurgraad) tussen de binnen- en
buitenzijde van de bacteriën. Door dit verschil hebben protonen de sterke neiging om weer naar binnen
te willen. Het lactose transporteiwit maakt hiervan gebruik door alleen een proton naar binnen te laten
gaan als deze tevens een lactose mee naar binnen neemt. Het transporteiwit is een beetje vergelijkbaar
met een sluis in een kanaal. Door de hoge waterstand aan de ene kant ontstaat een stroom naar de
andere kant waar een vaartuig gebruik van kan maken om de sluis te passeren. Dit kan alleen als de
sluiswachter de sluis op de juiste manier open zet. LacS is een zeer efficiënt sluisje en het transport
van het proton en de suiker is strikt aan elkaar gekoppeld. Ook kan dezelfde waterdruk worden
gebruikt om een vaartuig van de lage waterstand omhoog te brengen waardoor de sluis in omgekeerde
richting gepasseerd kan worden. Hetzelfde geldt voor een cel die de hoge concentratie protonen kan
gebruiken om met behulp van sluisjes in het membraan specifiek stoffen door te laten. Een
membraaneiwit is echter een erg klein sluisje en om het exacte werkingsmechanisme van deze eiwitten
toch te kunnen bestuderen zijn een aantal specifieke technieken ontwikkeld waarvan een aantal in dit
proefschrift worden beschreven.
In de eerste plaats kunnen uit de literatuur bekende transporteiwitten met een overeenkomstige
aminozuurvolgorde en een soortgelijke functie met elkaar worden vergeleken. Uit bepaalde
overeenkomsten en verschillen kunnen we afleiden welke delen van het eiwit betrokken zullen zijn bij
de functie van elk specifiek eiwit. In hoofdstuk 2 worden een aantal eiwitten beschreven die allemaal
suikers (of daar sterk op lijkende stoffen) transporteren. Het valt op dat de verschillende eiwitten op
bepaalde posities dezelfde bouwstenen (aminozuren) gebruiken. Op basis van deze waarnemingen
worden een aantal uitspraken gedaan over de mogelijke rol van deze zogenoemde geconserveerde
aminozuurresiduen.
Het is bovendien mogelijk om met recombinant DNA technieken de aminozuurvolgorde van een
bepaald eiwit te muteren (veranderen) om vervolgens te bepalen wat het effect van deze verandering
op de eiwitactiviteit is. In hoofdstuk drie worden een aantal mutanten beschreven die allemaal een
afwijkende transportactiviteit hebben. Op basis van de vaak verstoorde activiteit kunnen we
concluderen wat de rol is van de betreffende aminozuren in de transportactiviteit van het eiwit. Op
basis van de verkregen informatie wordt in hoofdstuk 3 een model beschreven voor de binding van
protonen door LacS.
Om het LacS eiwit in meer detail te kunnen bestuderen is het noodzakelijk het eiwit in zuivere
vorm in handen te krijgen. Dit betekent dat het eiwit uit de membraan moet worden gehaald, van alle
andere componenten moet worden gescheiden, en vervolgens weer moet worden ingebouwd in een
artificiële membraan. Deze gedefinieerde membraanblaasjes met daarin een specifiek membraaneiwit
noemen we proteoliposomen en deze proteoliposomen zijn uitermate geschikt om de transportactiviteit
van het betreffende eiwit te bestuderen.
Voor het zuiveren van een membraaneiwit is het vaak noodzakelijk de expressie van het
betreffende eiwit te verhogen. Dit betekent dat cellen meer van het eiwit gaan maken dan dat het van
nature geneigd is. Met behulp van moderne DNA technologie is het mogelijk eiwitten en varianten
daarvan tot verhoogde expressie te brengen. LacS werd in Escherichia coli (een van de meest favoriete
Nederlandse Samenvatting - 91 bacteriën voor veel onderzoekers) en S. thermophilus (onze meest favoriete bacterie) tot overexpressie
gebracht. In de membraan van S. thermophilus bleek ongeveer 25% van alle eiwitten LacS te zijn wat
misschien wel 10 keer meer is dan normaal. Bovendien werd het eiwit verlengd met een aantal
aminozuren (histidines) wat de zuivering aanzienlijk vergemakkelijkt. Deze extra histidines binden
namelijk erg sterk aan een bepaald materiaal dat nikkel ionen bevat waardoor het gescheiden kan
worden van alle andere eiwitten die normaal aanwezig zijn in een cel (hoofdstuk 4).
Een extra complicatie voor het zuiveren van membraaneiwitten is de membraan. De structuur van
membraaneiwitten blijft alleen intact in een lipide (vettige)-omgeving en de activiteit gaat over het
algemeen verloren als de lipiden worden verwijderd. Er zijn echter stoffen die de rol van lipiden
kunnen overnemen en die het eiwit toch in een wateroplosbare vorm kunnen houden. Dit zijn de
zogenaamde detergentia. Met de waterafstotende kant (hydrofoob) binden detergentia aan
membraaneiwitten en met de waterminnende kant (hydrofiel) blijven ze in oplossing waardoor
detergentia in staat zijn membraaneiwitten uit de lipidenmembraan in oplossing te brengen
(solubiliseren). Er zijn veel verschillende detergentia beschikbaar die allemaal subtiel van elkaar
verschillende eigenschappen hebben. Een optimaal detergens zorgt dat al het gewenste eiwit uit de
membraan in oplossing komt en bovendien dat het eiwit zijn oorspronkelijke structuur behoudt. Niet
alleen het detergens maar ook andere factoren zijn vaak bepalend voor de activiteit van het eiwit in de
gesolubiliseerde vorm zoals bijvoorbeeld: temperatuur, pH, concentratie van bepaalde zouten, etc.
Deze condities zijn in detail bestudeerd voor het LacS eiwit en het is nu mogelijk het eiwit lange
periodes actief te houden in de gesolubiliseerde vorm (hoofdstuk 4 en 5).
Om de eigenlijke transportactiviteit te kunnen bestuderen moeten de eiwitten weer worden
teruggeplaatst in membraanblaasjes. Er zijn een aantal procedures ontwikkeld maar vaak is deze
zogenaamde reconstitutie verre van efficiënt en het exacte mechanisme niet bekend. Meestal worden
eiwit en lipiden opgelost in detergens waarna het detergens wordt verwijderd en er spontaan
membraanvorming optreedt. Hierbij wordt het eiwit vaak niet correct geïnserteerd in de te vormen
membraan en dit kan leiden tot aanzienlijk activiteitsverlies. Daarom is voor LacS de reconstitutie
geoptimaliseerd met behulp van een meer fundamentele aanpak. Hiervoor werden eerst liposomen
gemaakt (membraanblaasjes bestaande uit zuivere lipiden) die vervolgens werden gedestabiliseerd met
exact bepaalde hoeveelheden detergens. Dit destabiliseert de lipidenlaag en geeft het eiwit (aanwezig
in detergens) de kans om in de membraan te inserteren (hoofdstuk 4).
Het blijkt dat verschillende detergentia verschillende optimum condities hebben voor het
reconstitueren van bepaalde membraaneiwitten. De in deze studies meest gebruikte detergentia, DDM
en Triton X-100, blijken bijvoorbeeld volkomen anders te reageren met liposomen. Beide detergentia
zijn in staat de membraanbolletjes op te lossen en bij een voldoende hoge concentratie worden de
lipiden waaruit de liposomen bestaan opgelost in detergens. Echter, bij lagere concentraties detergens
zijn er verschillen te zien in de structuren die gevormd wordt tussen de lipiden en het detergens.
Wanneer Triton X-100 wordt gebruikt blijven de liposomen intact en worden lipiden deeltjes als het
ware uit de membraan geweekt. Het gevolg is wel dat de liposomen steeds kleiner worden maar dat
deze nog steeds een min of meer normale membraan hebben. Voor Triton X-100 is de concentratie
detergens die gebruikt wordt voor de reconstitutie van LacS niet kritisch omdat altijd de essentiële
membraanstructuur over een breed concentratiegebied intact blijft (hoofdstuk 5).
Wanneer DDM wordt gebruikt voor de solubilisatie van liposomen blijken, bij vergelijkbare
concentraties detergens, hele andere structuren gevormd te worden. Deze structuren zijn in detail
bekeken met behulp van elektronenmicroscopie (microscoop voor extreme vergrotingen), en er is
waargenomen dat de lipiden en DDM onder andere lange, draadachtige, structuren kunnen vormen.
Deze structuren zijn niet te vergelijken met een normale membraan en kunnen hierdoor ook geen
- 92 -
Nederlandse Samenvatting
membraaneiwitten bevatten. Voor de reconstitutie van membraaneiwitten zijn deze structuren dan ook
ongeschikt. Wanneer voor de reconstitutie het LacS eiwit wordt toegevoegd aan liposomen die
behandeld zijn met verschillende concentraties DDM, wordt de hoogste activiteit gemeten wanneer
liposomen worden gebruikt die verzadigd zijn met DDM. Op dit punt zijn de liposomen niet meer
intact maar vallen er gaten in de liposomen en ontstaan er ook “platte”, uitgestrekte, structuren die nog
wel uit normale membranen bestaan (hoofdstuk 5).
De genoemde structuren zijn belangrijk voor de manier waarop een membraaneiwit inserteert in
de membraan tijdens de reconstitutie. Membraaneiwitten zijn vaak niet symmetrisch en omdat het
eiwit moet inserteren in een intacte membraan heeft deze vaak de neiging om op de meest
“makkelijke” manier te inserteren; weg van de minste weerstand. Dat deel van het eiwit dat de
membraan het makkelijkst kan passeren komt uiteindelijk aan de binnenkant en het domein dat de
membraan niet passeert komt aan de buitenzijde van de proteoliposomen. Dit kan betekenen dat alle
eiwitdeeltjes met eenzelfde oriëntatie in de proteoliposomen belanden. Dit is met name het geval als
voor de reconstitutie Triton X-100 wordt gebruikt omdat hierbij de liposomen intact blijven. Door deze
unidirectionele oriëntatie kunnen voor beide zijden van het eiwit de eigenschappen worden bepaald;
dat wil zeggen de zijde die in de bacterie aan de binnen- dan wel aan de buitenkant zit. Inderdaad is
gebleken uit studies met deze proteoliposomen dat de binding van lactose erg verschilt voor de
“binnen”- en “buitenkant” van het LacS eiwit (hoofdstuk 4 en 5).
Wanneer DDM gebruikt wordt ontstaan open structuren waardoor het eiwit van beide kanten kan
inserteren. Hierdoor ontstaat een willekeurige oriëntatie. Omdat het eiwit niet in beide richtingen
dezelfde eigenschappen heeft is dit erg belangrijk voor de interpretatie van de transportstudies met de
proteoliposomen. De willekeurige oriëntatie verklaart voor een deel de lagere transportactiviteit in
proteoliposomen gemaakt met DDM in vergelijking met proteoliposomen gemaakt met Triton X-100.
In de Triton X-100 proteoliposomen heeft het eiwit zijn meest efficiënte kant aan de buitenzijde
georiënteerd. Omdat de transportproeven worden uitgevoerd met lage concentraties lactose is dit erg
belangrijk. In het geval van DDM heeft de helft van de eiwitten de minder efficiënte kant aan de
buitenzijde georiënteerd en hierdoor levert 50% van het eiwit geen significante bijdrage aan het
gemeten lactose transport (hoofdstuk 5).
Een andere reden voor de lagere transportactiviteit in de DDM proteoliposomen is de belangrijke
rol van de verhouding tussen lipiden en eiwit (Hoofdstuk 6). Het is gebleken dat wanneer relatief meer
eiwit wordt gereconstitueerd in dezelfde hoeveelheid lipiden de transportactiviteit per eiwit deeltje
dramatisch afneemt. Omdat er in het geval van DDM een aanzienlijk verlies van lipiden optreedt
tijdens de reconstitutie ontstaan er proteoliposomen met een minder gunstige verhouding tussen eiwit
en lipiden. In het geval van Triton X-100 is dit lipiden verlies verwaarloosbaar en blijft de activiteit
van de proteoliposomen maximaal.
Het belang van de reconstitutie studies is nogmaals weergegeven in hoofdstuk 7 waarbij een
overzicht wordt gegeven van de huidige kennis op het gebied van membraanreconstitutie. Een
structurele aanpak en het controleren van elke stap is van groot belang voor het opzetten van
reconstitutieprotocollen. Dit is uitermate belangrijk want proteoliposomen zijn immers essentieel voor
het bestuderen van gezuiverde membraaneiwitten in hun natuurlijke omgeving. Het efficiënte protocol
voor de reconstitutie van LacS zal in de toekomst ongetwijfeld nog zijn vruchten afwerpen en leiden
tot nieuwe inzichten in de werking van LacS en andere membraaneiwitten. De kennis opgedaan tijdens
de zuivering en reconstitutie van LacS kan tevens worden gebruikt voor het ontwikkelen van nieuwe
strategieën voor het kristalliseren van membraaneiwitten.